Effect of high temperature stress on intestinal tissues morphology and transcriptome of Procambarus clarkii
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摘要:
为探究克氏原螯虾 (Procambarus clarkii) 肠道在接近其生理极限的高温胁迫下的作用机制，对其进行32 和37 ℃的高温胁迫实验，分别于胁迫24、72 h后收集肠道组织，进行组织切片观察和转录组学分析。结果表明，高温对克氏原螯虾的肠道组织结构造成了明显损伤，且随着胁迫温度和胁迫时间的增加，损伤加剧。与对照组 (26 ℃) 相比，在32 ℃胁迫24和72 h条件下，分别鉴定到2 462和4 619个差异基因；在37 ℃胁迫24和72 h条件下，分别鉴定到1 825和7 298个差异基因。KEGG富集分析结果显示，差异基因在内质网蛋白加工、代谢途径等通路中显著富集，其中在同一胁迫时间内胁迫温度从32 ℃升至37 ℃时，内质网蛋白加工通路富集频率升高，表明其在应对高温胁迫中发挥重要作用；GO功能注释显示，差异基因主要在碳水化合物代谢、蛋白质折叠等相关过程中显著富集。
Abstract:To explore the mechanism of the intestinal tract of red swamp crayfish (Procambarus clarkii) under high temperature stress close to its physiological limit, we conducted the high-temperature stress experiments at 32 ℃ and 37 ℃, and collected the intestinal tissues after 24 h and 72 h of stress, for tissue sectioning observation and transcriptomic analysis. The results show that high temperature caused significant damages to the intestinal tissue structure of crayfish, and the damage increased with the increase of stress temperature and stress time. Compared with the control group (26 ℃), 2 462 and 4 619 differentially expressed genes (DEGs) were identified during 32 ℃ stress for 24 h and 72 h, respectively. During 37 ℃ stress for 24 h and 72 h, 1 825 and 7 298 DEGs were identified, respectively. KEGG enrichment analysis shows that the DEGs were significantly enriched in the endoplasmic reticulum protein processing and metabolic pathways, and the enrichment frequency of endoplasmic reticulum protein processing pathways increased when the stress temperature increased from 32 ℃ to 37 ℃ during the same stress time, which indicates that they played an important role in coping with high temperature stress. According to the GO functional annotation, DEGs were mainly enriched in the energy metabolism-related processes such as carbohydrate metabolism and protein folding.
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Keywords:
- Procambarus clarkii /
- High-temperature stress /
- Transcriptome /
- Intestine /
- Paraffin section
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花鲈 (Lateolabrax maculatus) 广泛分布于中国沿海、日本西部沿海以及朝鲜半岛海域，为太平洋西北沿海特有品种[1]。因其适宜陆基工厂化、池塘、深远海网箱等多种养殖模式，在山东、福建、广东等沿海地区的繁育与养殖体系均较为完善，现已成为中国水产养殖的重要经济鱼类之一。然而随着养殖规模的不断壮大，花鲈幼鱼在养殖过程中细菌性、病毒性和寄生虫性疾病频发[2-3]，严重影响了其产业的健康、可持续发展。
在饲料中添加低聚木糖、壳寡糖、果寡糖、甘露寡糖等低聚糖类益生元可有效提升鱼类的生长和免疫相关性能。已有研究表明，添加适宜的低聚木糖不仅能够有效促进虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 幼鱼生长，提高机体免疫性能[4]，还可增强花鲈幼鱼的免疫功能，降低肠道有害菌群相对丰度，改善肠道健康[5]。壳寡糖可明显增强尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 抗菌和抗氧化水平[6]，提高杂交黄颡鱼 (Tachysurus fulvidraco♀×T. vachelli♂) 白细胞吞噬和淋巴细胞转化能力[7]，且下调珍珠龙胆石斑鱼 (Epinephelus fuscoguttatus♀×E. lanceolatus♂) 促炎细胞因子和细胞凋亡相关基因的表达，增强其免疫能力[8]。饲料中添加适宜的果寡糖可显著提升斜带石斑鱼 (E. coioides) 非特异性免疫酶以及肠道消化酶的活性[9-10]，并且对奥尼罗非鱼 (O. niloticus×O. aureus) 肠道中益生菌群相对丰度具有显著的提升效果[11]。甘露寡糖还可作为免疫诱导剂使大菱鲆 (Scophthalmus maximus) 具有更强的细菌清除能力，从而减轻肝损伤风险[12]。此外，甘露寡糖还可显著上调杂交红罗非鱼 (O. niloticus×O. mossambicus) 生殖相关基因的表达，提高其繁殖性能[13]。
与之相比，从海洋褐藻胶中提取的褐藻寡糖，在水产养殖动物生长和免疫性能改善方面也发挥了重要作用[14-15]。van Doan等[16-17]研究发现，褐藻寡糖可以显著提高尼罗罗非鱼的生长与免疫性能、饲料转化率。Hu等[18]在草鱼 (Ctenopharyngodon idella) 饲料中添加褐藻寡糖后鱼体生长性能和非特异性免疫性能均得到显著改善。黄健彬等[19]指出，褐藻寡糖的添加能够有效提升卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus) 幼鱼生长、血浆免疫和肝脏抗氧化性能，对肠道组织形态结构也具有一定的改善效果。此外，褐藻寡糖能够提高尖吻鲈 (Lates calcarifer) 肠道胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性[20]。可见，褐藻寡糖不仅可以增强水生生物的免疫水平和抗病性能，还能够改善肠道形态，提高成活率。但是，目前尚未见关于褐藻寡糖在花鲈养殖过程中应用效果的研究报道。因此，本研究通过对花鲈生长表型数据、消化酶和免疫相关酶活性、生长相关基因表达及肠道组织形态等评价指标进行对比分析，综合评价褐藻寡糖对其幼鱼生长性能和免疫水平的影响，并获得褐藻寡糖在花鲈幼鱼中的适宜添加量，为褐藻寡糖在花鲈健康养殖中的应用和安全评估提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 实验用鱼来源
实验用花鲈幼鱼购于山东省烟台市经海海洋渔业有限公司海上网箱养殖基地，平均体长为 (13.34±0.88) cm，平均体质量为 (44.19±1.44) g，将实验幼鱼运至山东省海阳市黄海水产有限公司的工厂化养殖车间水泥池 (水体积约为20 m3) 内暂养，以备实验使用。
1.2 实验用饲料的制备
实验用基础饲料为山东升索饲料科技有限公司所生产的配合颗粒饲料 [主要成分包括鱼粉、虾粉、豆柏、鱼油、小麦粉、维生素、矿物元素等；其中 (质量分数)，粗蛋白≥50.0%，粗脂肪≥8.0%，粗灰分≤17.0%，粗纤维≤6.0%，钙≤5.0%，总磷 ≥1.2%，赖氨酸 ≥2.0%]。称取适量褐藻寡糖溶于纯水中，通过喷涂方式均匀喷洒于基础饲料颗粒表面，通风、阴凉处晾干后存放于4 ℃冰箱中。其中，每千克基础饲料中褐藻寡糖的添加量分别为0、50、100和200 mg。实验用褐藻寡糖由潍坊麦卡阿吉生物科技有限公司生产，纯度为90%。实验所用褐藻寡糖不同添加量的饲料均为提前1 d制备的饲料。
1.3 实验用鱼养殖管理方法与实验设计
实验于2022年9—10月在山东省海阳市黄海水产有限公司的工厂化养殖车间完成，使用有效水体积为0.7 m3的圆形玻璃钢水桶，实验为期42 d。随机捞取300尾幼鱼，按照实验饲料的设置分为4组 (B0、B1、B2和B3组)，每组3个平行，每个平行随机放置25尾。其中，B0组为对照组，投喂褐藻寡糖添加量为0 mg·kg−1的饲料；B1、B2和B3组分别投喂褐藻寡糖添加量为50、100和200 mg·kg−1的饲料。实验开始前将实验鱼进行称质量并饥饿处理24 h，实验开始后分别投喂对应的实验饲料，每天投喂2次。日换水率为200%~300%，实验过程中水温为18~22 ℃，盐度为31‰~32‰，pH 7.9~8.2，溶解氧质量浓度>7 mg·L−1，氨氮质量浓度<0.03 mg·L−1，亚硝酸盐质量浓度<0.006 mg·L−1。
1.4 样品采集与处理
实验结束后，先将各组幼鱼进行24 h饥饿处理，每个平行组中随机捞取3尾，经MS-222充分麻醉后测量并记录体质量、体长等数据。随后将实验结束的幼鱼进行解剖，剪取肝脏和肠道样品。其中，一部分肝脏样品采用无RNA酶的离心管保存于液氮中，用于生长相关基因的定量表达分析；另一部分样品采用冻存管保存于 −20 ℃冰箱中，用于抗氧化、免疫和转氨酶活性分析。一部分肠道样品采用冻存管保存于 −20 ℃冰箱中，用于消化相关酶活性分析；另一部分肠道样品剪取中肠部位采用Davis固定液保存于冻存管中，用于组织结构分析。
1.5 生长指标的测定
生长指标包括体质量增长率 (Weight gain rate, WGR, %)、特定生长率 (Specific growth rate, SGR,%·d−1)、肥满度 (Condition factor, CF, g·cm−3)，计算公式分别为：
$$ \mathrm{WGR}{\text{=}}\left[\left(W_2{\text{−}}W_1\right) / W_1\right] \times 100 {\text{%}} $$ (1) $$ \mathrm{SGR}{\text{=}}\left[\left(\ln W_2{\text{−}}\ln W_1\right) / D\right] \times 100 {\text{%}} $$ (2) $$ \mathrm{CF}{\text{=}}W_2 / L^3$$ (3) 式中：W1和W2分别为实验开始和结束时的平均体质量 (湿质量，g)；D为实验周期 (d)；L为平均体长 (cm)。
1.6 生理生化指标的测定
各组幼鱼生理生化指标均采用南京建成生物研究所研制的试剂盒测定。其中，肠道的脂肪酶 (LPS)、淀粉酶 (AMS) 和胰蛋白酶 (TRY) 活性检测试剂盒货号分别为：A054-2-1 (微板法)、C016-1-1 (淀粉-碘比色法)、A080-2-2 (紫外比色法)；肝脏的超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 、溶菌酶 (LZM) 活性和丙二醛 (MDA) 含量检测试剂盒货号分别为：A001-3-2 (WST-1法)、A007-1-1 (钼酸铵法)、A005-1-2 (比色法)、A050-1-1 (比浊法)、A003-1-2 (TBA法)。
1.7 生长相关基因 Insulin-like growth factor 1 (igf-1)和Growth hormone (gh) 相对表达量的检测
采用RNAiso Plus试剂盒 (TaKaRa，日本) 提取花鲈幼鱼肝脏组织总RNA，经浓度与纯度检测合格后，使用反转录试剂盒合成cDNA第一链，保存于 −20 ℃冰箱中备用。目的基因和内参 (β-actin) 基因的实时荧光定量PCR引物序列如表1所示。本研究采用的PCR扩增条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃延伸5 s，60 ℃退火20 s，共45个循环，使用的仪器是Lightcycler 480 II Real-time PCR仪 (Roche，瑞士)。反应体系为20 μL：TB Green PremiEx Taq II (TaKaRa，日本) 10 μL，上、下游引物 (10 μmol·L−1) 各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL，cDNA模板2 μL，通过熔解曲线验证产物特异性，目的基因和内参基因的标准曲线相关系数 (R2)：0.99<R2<0.999，扩增效率 (E)：0.9<E<1.1。采用2–ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。
表 1 花鲈幼鱼实时荧光定量PCR引物序列信息Table 1. Primer sequences used in qRT-PCR of L. maculatus juvenile引物
Primer引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'−3')igf-1-F CGCAATGGAACAAAGTCGGAATAT igf-1-R GTGAGAGGGTGTGGCTACAGGAGA gh-F GAGCAGCGTCAACTCAACAA gh-R TCAAACGATACGAGATAGACAACA β-actin-F CAACTGGGATGACATGGAGAAG β-actin-R TTGGCTTTGGGGTTCAGG 1.8 肠道组织形态学观察
将存放于Davis固定液中的中肠样品分别采用不同体积分数的乙醇进行脱水，使用二甲苯溶液透明处理，石蜡包埋后进行组织切片制作，通过苏木精-伊红 (HE) 染色后采用中性树胶封片。采用Pannoramic MIDI II数字切片扫描仪 (丹吉尔，匈牙利) 对制备好的组织切片进行图像扫描，Case Viewer 2.4.0W软件测量肠绒毛的高度和宽度、肠道肌层的厚度。
1.9 数据统计与分析
所有数据均以“平均值±标准误 ($\overline { x}\pm s_{\overline { x}} $)”表示。采用SPSS Statistics 26.0 软件对数据进行单因素方差分析 (One-way ANOVA)，通过Duncan's检验对同一评价指标在不同处理组间的差异性进行多重比较，显著性水平α 设为0.05。
2. 结果
2.1 花鲈幼鱼生长指标
随着褐藻寡糖添加量的升高，各组花鲈幼鱼的WGR和SGR呈现出先升高后下降的趋势；B2组的WGR和SGR最大，分别为 (96.50±7.95)%和 (1.73±0.09)%·d−1 (表2)。此外，B0组的CF均高于褐藻寡糖添加组，但差异均不显著 (P>0.05)。
表 2 不同添加量褐藻寡糖对花鲈幼鱼生长性能的影响Table 2. Effects of different additions of alginate oligosaccharide on growth indicators of L. maculatus juvenile指标 Indicator 组别 Group B0 B1 B2 B3 终末体质量 Final body mass/g 83.38±4.14 83.67±3.58 86.83±3.51 85.87±4.22 体质量增长率 WGR/% 88.69±9.38 89.34±8.10 96.50±7.95 94.31±9.56 特定生长率 SGR/(%·d−1) 1.62±0.12 1.64±0.10 1.73±0.09 1.70±0.11 肥满度CF/(g·cm−3) 1.97±0.05 1.81±0.06 1.92±0.07 1.83±0.04 注：同行不同小写字母表示组间有显著性差异 (P<0.05)。 Note: Different superscript lowercase letters within the same low represent significant differences among groups (P<0.05). 2.2 花鲈幼鱼肠道消化酶活性
添加褐藻寡糖组幼鱼肠道的AMS活性差异不显著 (P>0.05)，但均高于对照组 (图1-a)。B1和B2组花鲈幼鱼肠道的LPS活性显著高于B0和B3组 (P<0.05)；其中，B1组活性最高，为 (16.63±0.12) U·g−1，且与B2组的差异不显著 (P>0.05) (图1-b)。随着褐藻寡糖添加量的升高，除B1组外，幼鱼肠道的TRY活性呈现上升趋势，但差异不显著 (P>0.05)，B3组活性最高 (图1-c)。
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图 1 褐藻寡糖的不同添加量对花鲈幼鱼肠道消化酶活性的影响注：方柱上不同小写字母表示组间差异显著 (P<0.05)。Figure 1. Effects of different additions of alginate oligosaccharide on intestinal digestive enzyme activities of L. maculatus juvenileNote: Different lowercase letters on the bar indicate that significant differences among groups (P<0.05).2.3 花鲈幼鱼肝脏非特异性免疫酶活性
随着褐藻寡糖添加量的升高，花鲈幼鱼肝脏的CAT、SOD、GSH-Px和LZM活性整体呈显著上升趋势 (P<0.05)，且在B3组活性最高，分别为 (26.07±0.20) U·mg−1 (图2-a)、(21.84±0.17) U·mg −1 (图2-b)、(45.05±0.30) U·mg−1 (图2-c) 和 (26.07±0.20) μg·mg−1 (图2-e) 。肝脏内MDA水平随着褐藻寡糖添加量的增加而显著下降 (P<0.05)，B3组的MDA质量摩尔浓度最低，为 (2.23±0.22) nmol·mg−1 (图2-d)。
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图 2 褐藻寡糖的不同添加量对花鲈幼鱼肝脏非特异性免疫酶活性的影响注：方柱上不同小写字母表示组间有显著性差异 (P<0.05)。Figure 2. Effects of different additions of alginate oligosaccharide on non-specific immunizing enzyme activities in liver of L. maculatus juvenileNote: Different lowercase letters on the bar represent significant differences among groups (P<0.05).2.4 花鲈幼鱼肝脏中igf-1、gh基因的表达特性
随着褐藻寡糖添加量的升高，上调igf-1基因的表达，B3组igf-1基因相对表达量显著高于其他组 (P<0.05)，其他组间差异不显著 (P>0.05) (图3-a)。与B0组相比，添加褐藻寡糖组花鲈幼鱼肝脏的gh基因相对表达量显著上调 (P<0.05)，但添加褐藻寡糖组间gh基因相对表达量差异不显著 (P>0.05)；其中B2组的gh基因相对表达量最高 (图3-b)。
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图 3 igf-1、gh基因在花鲈幼鱼肝脏中的相对表达量注：方柱上不同小写字母表示组间有显著性差异 (P<0.05)。Figure 3. Relative expression levels of igf-1 and gh genes in liver of L. maculatus juvenileNote: Different lowercase letters on the bar represent significant differences among groups (P<0.05).2.5 褐藻寡糖对花鲈肠道形态的影响
与B0组相比，添加褐藻寡糖后，实验组花鲈幼鱼肠道肌层厚度增加，且肠绒毛整体增大 (图4)。随着褐藻寡糖添加量的升高，花鲈幼鱼肠道的肌层厚度、绒毛高度和绒毛宽度整体呈现显著的先升后降趋势 (P<0.05)，均为B2组指标最高 (表3)。其中，B2和B3组的肌层厚度显著优于对照组 (P<0.05)，B2组的绒毛高度显著高于对照组 (P<0.05)，B1、B2、B3组的肠道绒毛宽度均显著优于B0组 (P<0.05)。
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图 4 饲料中不同添加量褐藻寡糖对花鲈肠道形态的影响 (HE染色)Figure 4. Effects of different additions of alginate oligosaccharides on intestinal morphology of L. maculatus juvenile (HE staining)表 3 不同添加量褐藻寡糖对花鲈幼鱼肠道组织形态学的影响Table 3. Effects of different additions of alginate oligosaccharide on intestinal morphology of L. maculatus juvenile指标
Indicator组别 Group B0 B1 B2 B3 肌层厚度 Muscular thickness/μm 190.43±3.17a 201.23±8.57ab 227.03±7.36c 220.50±8.63bc 绒毛高度 Villus height/μm 787.52±11.98a 803.45±8.30a 846.20±16.78b 816.52±9.38ab 绒毛宽度 Villus width/μm 27.88±0.90a 30.53±0.91b 39.37±0.69c 37.20±0.87c 注：同行不同小写字母表示组间有显著性差异 (P<0.05)。 Note: Different superscript lowercase letters within the same low represent significant differences among groups (P<0.05). 3. 讨论
3.1 不同水平褐藻寡糖对花鲈幼鱼生长性能的影响
褐藻寡糖是天然高分子酸性多糖褐藻胶的降解产物，具有改善机体生长性能、提高机体抗氧化和免疫能力等多种生理活性，在水产养殖中的应用前景广阔[14]。研究发现，以饲料为载体添加褐藻寡糖，对尼罗罗非鱼、草鱼和卵形鲳鲹的WGR和SGR具有显著提升效果[16-19]，但对大菱鲆WGR和SGR的影响不显著[21]。本研究中，各生长指标与对照组相比均有一定的上升趋势，但差异不显著。
下丘脑-垂体-肝脏轴是调控机体生长发育的中心轴，GH和IGF家族是这一中心轴上的关键调控因子[22]。通过对gh和igf-1基因相对表达量的测定有助于从分子水平上更加深入地解释鱼类生长的机理[23]。本研究中，添加褐藻寡糖上调了花鲈幼鱼的gh和igf-1基因相对表达量，其中gh基因相对表达量显著上调，而igf-1基因相对表达量仅在B3组显著上调。然而反映在生长表型上的WGR和SGR呈现一定的上升趋势，但差异不显著，说明褐藻寡糖的添加对花鲈幼鱼的生长具有一定的促进作用；同时，机体的生长是多个通路、调控基因转录与翻译水平等综合调控的结果，这可能是造成生长指标差异不显著的主要原因。
3.2 不同水平褐藻寡糖对花鲈幼鱼肠道组织形态结构和消化酶活性的影响
肠道是鱼体消化吸收营养物质的主要器官，在机体生长发育过程中其形态结构发挥了重要作用[24-25]。肠绒毛由肠道上皮细胞特化而成，能够有效增加肠黏膜与肠腔内食糜接触的表面积，是营养物质被肠道吸收的重要结构，其形态与对营养物质吸收能力的强弱有关[11,26]。鱼类肠道肌层的增厚则使肠道蠕动能力增强，有利于营养物质的吸收与利用[27-29]。研究发现，饲料中褐藻寡糖添加量升高后显著增加了卵形鲳鲹幼鱼[19]、尖吻鲈[20]以及斜带石斑鱼[30]的肠绒毛高度。此外，添加适宜的低聚糖能够增加奥尼罗非鱼肠道的绒毛高度、肌层厚度，提升鱼体消化吸收能力[31]。与上述研究结果相似，本研究中，饲料中添加褐藻寡糖显著增加了花鲈幼鱼肠肌层厚度、绒毛高度与宽度，有效改善了肠道组织形态。由此推测，褐藻寡糖进入花鲈幼鱼肠道后，可能促进了肠绒毛增殖和发育，从而优化了肠道的形态结构。
鱼类肠道消化酶活性是反映机体生长发育的重要生理指标[32-33]，在饲料中添加营养物质是影响肠道消化酶活性高低的重要外源性因素之一。有研究表明，褐藻寡糖促进暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)[34]肠道淀粉酶、脂肪酶等消化酶活性的升高。潘金露等[35]发现，饲料中添加0.02% (w) 和0.05% (w) 的褐藻寡糖，大菱鲆肠道的脂肪酶活性显著高于对照组，但淀粉酶活性变化不显著。李玉芬[36]在饲料中添加褐藻寡糖后发现大黄鱼 (Larimichthys crocea) 和石斑鱼体内蛋白酶活性显著升高。本研究中，添加褐藻寡糖后，花鲈幼鱼肠道的脂肪酶、淀粉酶和胰蛋白酶活性均出现一定的升高趋势，说明添加褐藻寡糖在一定程度上提升了机体对营养物质的消化吸收能力。这可能是因为褐藻寡糖显著改善了肠道组织结构，增加食靡与肠道绒毛间的接触面积，使更多的消化酶分泌后被激活，从而使其活性也得到一定提升。添加褐藻寡糖实验组的花鲈幼鱼肠道的淀粉酶和胰蛋白酶活性虽得到了一定提升，但不同添加量组间差异不显著；且仅B1和B2组的脂肪酶活性显著高于B0组，这可能也是造成生长差异不显著的主要原因。
3.3 不同水平褐藻寡糖对花鲈幼鱼肝脏非特异性免疫酶活性的影响
鱼类因代谢异常而产生多余的活性氧 (ROS) 时会对其机体细胞造成损伤。机体内存在的抗氧化酶，在修复ROS介导的损伤中发挥重要作用，从而维持机体抗氧化性能和氧化平衡状态[37]。SOD在消除生物体新陈代谢产生的自由基过程中至关重要，其活力与机体自由基的消除能力成正相关关系[38]。CAT则起到保护细胞、抗衰老、调节体内分泌系统的作用[39]。GSH-Px是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂[40]。MDA是氧自由基产生过多脂质过氧化物过程中的主要分解产物，具有很强的生物毒性，可对机体造成严重损害[41]。在一个完整的抗氧化体系中，以上几种酶活性或物质含量是评估机体抗氧化应激能力的重要指标。本研究中，实验组幼鱼肝脏中SOD、CAT和GSH-Px的活性与褐藻寡糖添加量呈正相关关系，而MDA的含量随着褐藻寡糖添加量的增加呈下降趋势，说明褐藻寡糖的添加使机体抗氧化酶活性和清除自由基的能力增强，并导致细胞膜脂质过氧化程度下降。这与刺参 (Apostichopus japonicus) [42]和草鱼[16]的研究结果相似。舒昊明[30]指出，海藻降解的褐藻寡糖是天然抗氧化活性化合物的重要来源，拥有天然良好的抗氧化作用。而其分子质量较低、易于吸收的特性则更有助于提升机体的抗氧化酶活性，从而减少机体细胞的损伤并促进已受损细胞的修复，可有效增强机体的抗氧化能力。LZM是水产动物机体的一种非特异性防御因子，能够分解细菌细胞壁上的黏多糖，促进细菌细胞壁破裂进而导致其死亡[43]。本研究中，添加褐藻寡糖的各实验组幼鱼肝脏的LZM活性均显著高于对照组，且褐藻寡糖添加量越高，LZM活性越强，说明褐藻寡糖在提升幼鱼自身的非特异性免疫性能方面的效果更显著。这与江晓路等[42]和黄健彬等[19]的研究结果一致。
4. 结论
综上所述，饲料中添加褐藻寡糖能够显著改善花鲈幼鱼肠道组织形态结构，上调生长相关基因表达，从而对幼鱼生长产生一定的促进作用；同时，褐藻寡糖能够显著提升花鲈幼鱼抗氧化和免疫水平。当褐藻寡糖添加量为100 mg·kg−1时，褐藻寡糖对花鲈幼鱼的促生长效果较好；添加量为200 mg·kg−1时，对花鲈幼鱼免疫水平的提升效果最佳。
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图 1 对照组及高温处理组中克氏原螯虾的肠道组织(200×)
注：a. C (26 ℃)；b. M1 (32 ℃, 24 h)；c. H1 (37 ℃, 24 h)；d. M2 (32 ℃, 72 h)；e. H2 (37 ℃, 72 h)。
Figure 1. Intestinal tissues of P. clarkii in control group and high-temperature treatment group (200×)
Note: a. C (26 ℃); b. M1 (32 ℃, 24 h); c. H1 (37 ℃, 24 h); d. M2 (32 ℃, 72 h); e. H2 (37 ℃, 72 h).
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图 2 差异基因火山图
注：对照组 (26 ℃) 以C 表示，高温处理组 (32 ℃ 和37 ℃ 组) 分别以M 和H 表示；胁迫后的第24 小时以1 表示，第72 小时以2 表示。
Figure 2. Volcano map of differentially expressed genes
Note: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress.
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图 3 差异基因聚类图
注：对照组 (26 ℃) 以C表示，高温处理组 (32 ℃ 和37 ℃ 组) 分别以M 和H 表示；胁迫后的第24 小时以1 表示，第72 小时以2 表示。横坐标表示样品名称及层次聚类结果，纵坐标表示差异基因及层次聚类结果，红色表示高表达，蓝色表示低表达。
Figure 3. Cluster map of differentially expressed genes
Note: In the samples, C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress. The horizontal axis represents the sample name and hierarchical clustering results; the vertical axis represents the differentially expressed genes and hierarchical clustering results; red represents high expression, and blue represents low expression.
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图 4 差异基因 GO 富集分析 (前15)
注：对照组 (26 ℃) 以C 表示，高温处理组 (32 ℃ 和37 ℃ 组) 分别以M 和H 表示；胁迫后的第24 小时以1 表示，第72 小时以2 表示。横坐标表示注释到该条目的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标表示GO条目的名称。
Figure 4. Go enrichment analysis (Top 15)
Note: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress. The horizontal axis represents the ratio of the number of differential genes annotated to an entry to the total number of differential genes, and the vertical axis represents the name of the GO entry.
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图 5 差异基因 KEGG 富集分析 (前20)
注：对照组 (26 ℃) 以C 表示，高温处理组 (32 ℃ 和37 ℃ 组) 分别以M 和H 表示；胁迫后的第24 小时以1 表示，第72 小时以2 表示。横坐标Rich factor 越大，富集的程度越大；纵坐标表示 KEGG 通路；点越大，通路富集的差异基因的数量越多；颜色越红，代表富集越显著。
Figure 5. KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes (Top 20)
Note: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress. The larger the rich factor on the x-axis, the greater the degree of enrichment; the vertical axis represents the KEGG pathway; the larger the dot, the more differentially expressed genes are enriched in the pathway; the redder the color, the more significant the enrichment.
表 1 实验所用的引物
Table 1 Primer sequences used in this experiment
基因
Gene引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')基因ID
Gene IDHSP71D F: CCTCCTTGATGTGGCACCTCTG LOC123759425 R: AGTGACCGCTGGTTGGTTATCTG HSP70 F: TGGCGGCTCCAGTAATTGGTATC LOC123774884 R: TGAGTCGTTCTGTGTCGGTGAAG HSP71 F: CCTACGGTGCGGCTGTTCAG LOC123759427 R: AAGACAGAGGTGCCACATCAAGG HSP90 F: GTGACCTCTCCGTGCTGTATCG LOC123770521 R: CTCGCAGTGCCTGAGCCTTC HSP7D F: CAGTCTGAGGGCGTGAAGGATG LOC123762431 R: TGAATACTTGCTGTTGCTTGGTTGG PD2 F: TGATCTGGTGAACAGGGTGCTAAC LOC123765724 R: ATGGATTCAACCGTGGCATTTGTG PN1AS F: TAGTGTGGGAGAAGGAGGAGAAGG LOC123756333 R: TGGCGGGCGAGATAGGAGTC PLP F: TGCGGTCATCGTTGGTGGTG LOC123755895 R: CATTAAGAGGCGGAGCGTTGTTC β-actin F: CACTGCCGCCTCATCCTCTTC LOC123745344 R: GAACCTCTCGTTGCCAATGGTAATG 
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表 2 转录组测序数据
Table 2 Data statistics of transcriptome
肠道样品
Intestinal sample测序数量
Raw reads/Gb过滤数量
Clean reads/Gb测序错误率
Error rateQ20占比
Q20 ratio/%Q30占比
Q30 ratio/%GC含量百分比
GC content/%C-1 53 149 186 51 496 446 0.03 97.33 92.50 44.37 C-2 51 693 424 49 938 434 0.03 97.20 92.21 42.72 C-3 51 340 602 49 503 334 0.03 97.18 92.22 43.79 M1-1 34 865 712 33 806 092 0.03 97.21 92.00 35.17 M1-2 43 523 082 42 563 458 0.03 97.25 92.06 35.93 M1-3 48 777 006 47 336 584 0.03 97.39 92.56 42.35 H1-1 49 274 690 48 127 640 0.03 97.43 92.57 40.25 H1-2 50 644 580 48 940 152 0.03 97.53 92.93 44.35 H1-3 51 066 558 49 289 724 0.03 97.56 93.01 44.62 M2-1 50 832 894 48 694 324 0.03 97.23 92.23 38.48 M2-2 49 202 048 46 946 612 0.03 97.26 92.31 35.95 M2-3 44 643 114 42 951 032 0.03 97.22 92.04 31.32 H2-1 48 783 458 46 894 270 0.03 97.35 92.52 39.70 H2-2 45 102 546 42 541 374 0.03 97.26 92.36 36.61 H2-3 51 312 374 48 790 394 0.03 97.30 92.45 36.66 注：对照组 (26 ℃)以C表示，高温处理组 (32 ℃和37 ℃组)分别以M和H表示；胁迫后的第24小时以1表示，第72 小时以2表示。 Note: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress.
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表 3 Mapped Reads和Clean Reads比对情况统计
Table 3 Comparison statistics of Mapped Reads and Clean Reads
肠道样品
Intestinal sample总比对reads数
Total reads单一位点比
对率 (占比)
Unique mapped (Percentage)多位点比对率 (占比)
Multi mapped (Percentage)肠道样品
Intestinal sample总比对reads数
Total reads单一位点比
对率 (占比)
Unique mapped (Percentage)多位点比对率 (占比)
Multi mapped (Percentage)C-1 51 496 446 44 995 200 (87.38%) 2 204 550 (4.28%) H1-3 48 790 394 43 699 471 (89.57%) 2 232 553 (4.58%) C-2 49 938 434 44 427 790 (88.97%) 1 922 134 (3.85%) M2-1 33 806 092 30 711 261 (90.85%) 1 213 220 (3.59%) C-3 49 503 334 43 635 708 (88.15%) 1 943 516 (3.93%) M2-2 42 563 458 37 676 548 (88.52%) 3 365 504 (7.91%) M1-1 48 127 640 44 205 767 (91.85%) 1 418 030 (2.95%) M2-3 47 336 584 42 467 851 (89.71%) 1 908 883 (4.03%) M1-2 48 94 0152 43 851 068 (89.60%) 2 015 786 (4.12%) H2-1 48 694 324 43 573 397 (89.48%) 1 735 983 (3.57%) M1-3 49 289 724 43 822 561 (88.91%) 2 171 548 (4.41%) H2-2 46 946 612 41 788 201 (89.01%) 2 421 600 (5.16%) H1-1 46 894 270 42 198 853 (89.99%) 1 827 334 (3.90%) H2-3 42 951 032 38 155 003 (88.83%) 2 179 920 (5.08%) H1-2 42 541 374 37 729 522 (88.69%) 2 076 681 (4.88%) 注：对照组 (26 ℃)以C表示，高温处理组 (32 ℃和37 ℃组)分别以M和H表示；胁迫后的第24小时以1表示，第72 小时以2表示。 Note: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress.
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