Effects of disinfectants on population growth of Fabrea salina
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摘要:
盐蚕豆虫 (Fabrea salina) 可作为海水经济动物的开口饵料。为探究高锰酸钾、聚维酮碘、二溴海因3种消毒剂对盐蚕豆虫产生的毒性效应和种群动力学影响,采用静水实验法测定盐蚕豆虫在不同浓度的3种消毒剂下,种群的生长率 (r) 和世代时间 (G) 变化。结果表明,高锰酸钾、二溴海因、聚维酮碘对盐蚕豆虫的24 h 半数致死浓度 (Lethal concentration 50, LC50) 分别为1.182、1.067、18.451 mg∙L−1,48 h LC50分别为0.925、0.748、19.620 mg∙L−1;安全浓度 (Safe concentration, SC) 分别为0.170、0.110、6.655 mg∙L−1。盐蚕豆虫对3种消毒剂的敏感性依次为二溴海因>高锰酸钾>聚维酮碘。二溴海因、聚维酮碘、高锰酸钾的质量浓度分别为0.074 8、1.962 0、0.092 5 mg∙L−1时,对盐蚕豆虫的种群生长抑制最显著 (p<0.01),r分别为 (0.57±0.009)、(0.57±0.005)、(0.47±0.007) d−1,G分别为 (1.23±0.2)、(1.22±0.011)、(1.30±0.078) d。研究获得的高锰酸钾、聚维酮碘、二溴海因的安全浓度均低于水产养殖中的施药量,因此当以盐蚕豆虫作为开口饵料时,应注意消毒剂的使用剂量。
Abstract:Fabrea salina can be used as a first feed for marine economic animals. In order to investigate the toxic effects and population dynamics of three disinfectants (Potassium permanganate, povidoneiodine and dibromohydantoin) on F. salina, we conducted a static water test to study the growth rate (r) and generation time (G) changes of F. salina by different concentrations of these three disinfectants. The results show that the 24 h LC50 values of potassium permanganate, dibromo hydantoin and povidone iodine were 1.182, 1.067 and 18.451 mg∙L−1, respectively; the 48 h LC50 values were 0.925, 0.748 and 19.620 mg∙L−1, respectively; the safe concentrations (SC) were 0.170, 0.110 and 6.655 mg∙L−1, respectively. The sensitivity of F. salina to these disinfectants followed a descending order of dibromohydantoin > potassium permanganate > povidone iodine. Besides, the most significant inhibition for F. salina growth was observed at 0.074 8 mg∙L−1 of dibromo hydantoin, 1.962 mg∙L−1 of povidone iodine and 0.092 5 mg∙L−1 of potassium permanganate (p<0.01), with corresponding growth rates (r) of (0.57±0.009), (0.57±0.005) and (0.47±0.007) d−1, and generation times (G) of (1.23±0.2), (1.22±0.011) and (1.30±0.078) d, respectively. The safe concentrations of potassium permanganate, povidone iodine and dibromo hydantoin obtained in this test were all lower than the dosages employed in aquaculture. Thus, attention should be paied to the dosage of these disinfectants when using F. salina as a first feed.
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Keywords:
- Fabrea salina /
- Dibromo hydantoin /
- Potassium permanganate /
- Povidone iodine /
- Toxic effects
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罗非鱼 (Oreochromis mossambicus) 具有食性杂、繁殖迅速、生长快等优点,是世界主要经济养殖鱼类[1]。2017年中国罗非鱼养殖产量超过158万吨[2],主要产品是冻罗非鱼和冻罗非鱼片。在罗非鱼精深加工过程中产生许多下脚料,约占加工使用鱼品质量的70%[3],如不能充分利用这类资源,将造成巨大的资源浪费和经济损失。
生物分子氧化导致自由基生成是生物体中必然发生的反应[4-5]。自由基是一种能够引发机体氧化的物质,过多会通过破坏蛋白质、脂类和DNA削弱机体抵抗力,引发炎症、感染、加速机体衰老[6]。目前研究人员已获得多种能够抑制大分子氧化损伤和清除自由基的多肽物质,如坛紫菜多肽[7]、赤贝多肽[8]。多肽还能够促进矿物元素钙 (Ca)[9]、锌 (Zn)[10]、铁 (Fe)[11]等的吸收。Ca是人体必需的营养元素之一,对骨量维持、神经递质传递、肌肉收缩和心脏调控有重要影响[12]。据营养调查报告[13]显示,中国人均Ca摄入量仅达391 mg,远不达标。同时,由于长期食用含有草酸、纤维素、植酸盐等物质的植物性膳食导致其与钙离子 (Ca2+) 形成沉淀而降低钙的生物利用率。Peng等[14]发现太平洋鳕鱼骨肽能明显提高小鼠的股骨Ca含量,提高Ca的生物利用率。小肽不仅能提高机体对Ca2+的储留量、增大钙的生物利用率[15],还具有抗氧化活性。
本文以罗非鱼皮为原材料,研究其酶解产物的Ca2+结合活性,探究罗非鱼皮酶解物 (tilapia skin hydrolysate,TSH) 和钙离子结合物 (TSH-Ca) 的抗氧化能力,为开发罗非鱼皮抗氧化产品、补钙剂从而实现罗非鱼皮的高值化利用提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
罗非鱼皮购于广东百维生物科技有限公司。氯化钙、七水合硫酸亚铁、过氧化氢、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、六水合三氯化铁和三氯乙酸为分析纯 (广州齐云生物有限公司)。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH),溴化钾 (KBr) 为色谱级 (美国Sigma公司)。中性蛋白酶 (105 U·g−1)、碱性蛋白酶 (2×105 U·g−1,合肥博美生物科技有限公司);Protamex1.5L (1.5 AU·g−1,丹麦诺维信公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 基本成分分析
利用恒重法测定罗非鱼皮的水分含量 (GB/T 5009.3—2016);凯氏定氮法测定粗蛋白含量 (GB 5009.5—2016);高温灼烧法测定灰分含量 (GB 5009.4—2016);索氏提取法测定粗脂肪含量 (GB 5009.6—2016)。
1.2.2 前处理
取罗非鱼皮、解冻。参考夏光华等[16]的方法并稍作改动。取一定质量的罗非鱼皮,剪成约1 cm×1 cm的小块,按1∶10 (m∶V)的比例加入0.1%氢氧化钠,4 ℃浸泡过夜,用水洗涤2 h,盐酸调节pH,再用蒸馏水洗至中性。4 ℃低温保存。
1.2.3 酶解物的制备
取一定质量处理后的罗非鱼皮,将其与去离子水以1∶2 (m∶V) 比例混匀,沸水煮1 h,冷却后按照表1的条件调节pH,分别加入3种酶,在酶最优条件下酶解1、2、4、6和8 h,并水浴振荡,酶解完成后煮沸灭酶20 min,冷却后先抽滤,再10 000 r·min−1低温离心20 min,即得罗非鱼皮蛋白酶解液,冷冻干燥后得到TSH。
表 1 最优的酶解条件Table 1 Optimal enzymatic conditions种类
type酶活力
enzyme activitypH 温度/℃
temperature加酶量/(U·g−1)
enzyme amount中性蛋白酶
neutral protease1×105 U·g−1 7.0 50 4 000 Protamex 1.5L 1.5 AU·g−1 7.0 50 4 000 碱性蛋白酶
alkaline protease2×105 U·g−1 8.5 50 4 000 1.2.4 水解度 (degree of hydrolysis,DH) 的测定
采用凯氏定氮法测定罗非鱼皮中总氮质量M1 (g),电位滴定法测定酶解液中氨态氮质量M2 (g)。
$$ {\rm{DH}}= \frac{{M_2}}{{M_1}} \times 100{\text{%}} $$ (1) 1.2.5 Ca2+结合物的制备
参考范鸿冰等[17]方法并稍作修改。取不同时间的TSH与Ca2+进行实验。称量一定质量的TSH,加入5 mg·mL−1氯化钙溶液 (钙盐与TSH质量比为1∶20),在37 ℃水浴锅中反应40 min。再将结合液全部转移到100 Da的透析袋中透析24 h。测定透析液的体积,冷冻干燥得TSH-Ca。
1.2.6 结合率的测定
参考张金杨等[18]的方法。取一定透析液置于消化管 (质量分数为10%硝酸浸泡),加入10 mL浓硝酸微波消解,用超纯水标定到50 mL。将上述溶液稀释后过0.22 μm微孔滤膜,用电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS) 测定溶液中的Ca2+浓度。
$$ {\text{结合率}} = \frac{{C \times V \times n}}{m} \times 100{\text{%}} $$ (2) 其中C为透析后Ca2+的质量浓度 (mg·L−1);V为总体积 (L);m为加入钙的总质量 (mg);n为稀释倍数。
1.2.7 DPPH自由基清除率
参照Chi等[19]方法并稍作修改。在样液中加入等体积DPPH溶液 (95%乙醇溶解),避光反应30 min,在517 nm处测吸光值A1。对照组为不含样品的DPPH溶液A0。空白组是DPPH溶液用95%乙醇代替A2。
$$ {\rm{DPPH}}{\text{清除率}} = \left( {1 - \frac{{A_1 - A_2}}{{A_0}}} \right) \times 100{\text{%}} $$ (3) 1.2.8 ·OH自由基清除率
参照胡晓等[20]方法并稍作修改。依次加入0.3 mL 5 mmol·L−1邻二氮菲 (无水乙醇溶解),0.2 mL 0.5 mmol·L−1 pH 7.40的PBS缓冲液和0.3 mL 0.75 mmol·L−1的硫酸亚铁铵于1 mL样品中,混匀后加入0.2 mL质量分数为0.1%过氧化氢,37 ℃温浴60 min,在510 nm处测其吸光度A1;以超纯水代替样品和过氧化氢测得A2;以超纯水代替样品测定A0。
$$ \cdot {\rm{OH}}{\text{清除率}} = \frac{{A_1 - A_0}}{{A_2 - A_0}} \times 100{\text{%}} $$ (4) 1.2.9 还原力
参考Morales-Medina等[21]方法并稍作修改。取1 mL样液与1 mL 0.2 mmol·L−1磷酸盐缓冲液 (pH 6.60) 和1 mL质量分数为1%铁氰化钾混合均匀,50 ℃水浴20 min。加入1 mL质量分数为10%的三氯乙酸,12 000 r·min−1离心10 min。将1 mL超纯水和0.2 mL质量分数为0.1%氯化铁加入到1 mL上清液中,50 ℃水浴15 min,在700 nm下测量吸光度。空白组用超纯水代替。吸光度越大,样品的还原能力越强[22]。
1.2.10 傅里叶红外光谱 (FT-IR)
利用压片法测定TSH和TSH-Ca的红外光谱,扫描范围为4 000~400 cm−1。
2. 结果与讨论
2.1 基本成分
罗非鱼皮 (湿质量) 的基本成分中,蛋白质量分数较高(36.14%),水分质量分数为67.22%,脂肪质量分数为0.25%。相较于红旗东方鲀 (Takifugu rubripes) 鱼皮[23]和鮟鱇 (Lophius litulon) 鱼皮[24],罗非鱼皮富含蛋白质,是制备肽的理想原料。
2.2 DH
酶解条件的差异导致蛋白水解程度的不同,DH的差异又会影响酶解多肽分子量排布和氨基酸组成,使得酶解多肽存在不同的生物活性,由此获得有差异的生物活性肽。Hou等[25]通过酶解南极磷虾 (Euphausia superba) 蛋白解析出多肽与Ca2+之间的结合位点。为探究肽的Ca2+结合能力,对罗非鱼皮酶解物的DH进行了研究。
在使用不同蛋白酶酶解罗非鱼皮的过程中,DH随时间增加均呈上升趋势,中性蛋白酶、Protamex1.5L和碱性蛋白酶均在酶解第8小时达到最大,分别为12.19%、9.11%和8.68% (图1-a)。酶解时间较短时,酶活高,罗非鱼皮蛋白酶切位点多,水解较快。但随着水解时间的延长,酶切位点减少,水解变慢。获取不同的生物活性肽需要适当的水解,即时间短不能完全酶解蛋白,而时间太长会使多肽继续水解成游离氨基酸,降低生物活性。
2.3 Ca2+结合能力
3种蛋白酶的TSH均具有Ca2+结合活性 (图1-b),这与其他研究结果一致。杨伊然等[26]发现蓝圆鲹 (Decapterus maruadsi) 酶解物能与Ca、Zn和Fe结合,其螯合率分别为96.78%、94.28%和96.63%;Wu等[27]发现猪骨蛋白的酶解产物具有Ca2+结合能力。同时3种蛋白酶的TSH的Ca2+结合能力均先升后降,中性蛋白酶和Protamex1.5L的TSH均在酶解第2小时具有最高的Ca2+结合活性,而碱性蛋白酶的TSH在第6小时具有较高的Ca2+结合能力。Protamex1.5L酶解2 h所得TSH-Ca的Ca2+结合活性最高,结合率可达87.79%。可能是罗非鱼皮经Protamex1.5L酶解后得到的产物更容易与Ca2+形成结合物,酶解时间越长,TSH的Ca2+结合能力越低,原因可能是罗非鱼皮蛋白被酶解成小分子量肽或者游离氨基酸,结合Ca2+的能力减弱。
2.4 抗氧化能力
2.4.1 DPPH自由基清除能力
中性蛋白酶的TSH的DPPH自由基清除能力最强,在酶解第1小时达到最大 (67.22%),碱性蛋白酶和Protamex1.5L的TSH则分别在酶解第6和第4小时获较高的DPPH自由基清除率 (分别为53.37%和51.46%,图2)。这可能是由于不同酶对罗非鱼皮蛋白作用的酶切位点不同,TSH间存在差别,故清除能力不同。
Protamex1.5L酶解产物的Ca2+结合率较高,因此分别对TSH和TSH-Ca进行抗氧化指标的测定,探究Ca2+结合后的抗氧化变化。Protamex1.5L不同酶解时间得到的TSH与TSH-Ca的DPPH自由基清除率差异显著 (P<0.05,图3-a),TSH的DPPH自由基清除率较强,这与张金杨等[18]的研究结果一致。Protamex1.5L前2 h间TSH-Ca的DPPH自由基清除率无差异,在第6小时较高,第8小时降低。相比较,TSH-Ca的DPPH自由基清除率活性明显比TSH低,可能是因为Ca2+与氨基酸基团结合,占据了自由基的连接位点,降低了接受自由基的能力。
2.4.2 ·OH自由基清除能力
Protamex1.5L酶解得到的TSH的·OH自由基清除能力先减弱再增强,在第8小时达到最大清除率。TSH-Ca的·OH自由基清除率先减弱再增强,在第2小时达到最低 (4.70%,图3-b),此时Ca2+结合率最大,可能是因为Ca2+与氨基酸基团结合,占据了自由基的连接位点;第8小时TSH-Ca的·OH自由基清除率最高 (17.29%,图3-b),此时Ca2+结合率较低,可能是因为随着酶解时间的延长,罗非鱼皮蛋白质被水解成更小的肽链,暴露出疏水性氨基酸基团。研究表明,某些氨基酸如半胱氨酸、苯丙氨酸、组氨酸等也具有抗氧化作用[28-29]。
2.4.3 还原力
抗氧化剂通过释放清除自由基的电子发挥抗氧化能力,根据吸光值的大小来反映样品的还原力[30]。Protamex1.5L酶解得到的TSH的还原力变化不大。随着时间的延长,TSH-Ca的还原力先减弱再增强,酶解第2小时最低 (图3-c),可能是因为空间结合位点被Ca2+占据。随着时间的增加,TSH-Ca的还原力增强,第8小时达到最大 (0.16,图3-c)。TSH-Ca的还原力比相应的TSH强 (P<0.05),可能是因为TSH-Ca透析后,部分游离氨基酸被除去而大分子结合铁离子 (Fe3+) 的能力增强,导致还原力增大。
2.5 FT-IR分析
FT-IR可以反映配体基团在酶解多肽结合Ca2+前后的变化[31] (图4)。多肽与钙结合的部位主要是肽段中氨基酸残基之间的酰胺键、侧链和末端氨基和羧基[32]。酰胺键的2种最重要的振动模式是酰胺-Ⅰ振动和酰胺-Ⅱ振动;前者主要是由于C=O键的伸展,后者归因于N-H键的变形和C-N键的伸展。TSH-Ca红外图中,3 307 cm−1处的吸收峰强度的变化由NH伸缩振动引起的,表明Ca2+与N-H发生了结合,Ca-N键取代了N-H。TSH-Ca的红外图谱中,3 070 cm−1处的吸收峰移动到3 080 cm−1;1 701 cm−1的吸收峰消失,吸收峰从1 666 cm−1移动到1 664 cm−1,这是由COO-的伸缩和对称振动引起。另外,在1 000~1 200 cm−1处观察到的峰1 161 cm−1和1 201 cm−1分别移动到1 163 cm−1和1 203 cm−1处,这可能是结合后C-N键发生伸缩振动。指纹区中540 cm−1吸收峰消失,这是由于单键的振动引起。FT-IR表明,Ca2+与TSH中氨基氮原子和羧基氧原子发生结合。在南极磷虾肽-钙结合物中发现了FT-IR的类似变化[25]。
3. 结论
本文以罗非鱼皮为研究对象,对TSH的Ca2+结合活性及其结合物的抗氧化活性进行了研究。结果表明,不同蛋白酶对罗非鱼皮的酶解效果存在差异。随着酶解时间的延长,TSH的DH不断增大,结果与侯小琴等[33]的结论一致。其中中性蛋白酶酶解产物的DH较大,酶解第8小时DH达12.19%;而碱性蛋白酶酶解所得的DH较低。肽与矿物元素结合时与肽的分子量大小、氨基酸组成和特定的氨基酸基团等[34-35]有关。罗非鱼皮经Protamex1.5L酶解2 h得到的TSH与Ca2+的结合能力最高 (87.79%),这与张金杨等[18]的实验结果一致。
抗氧化结果显示,3种酶酶解得到的TSH均有抗氧化活性。中性蛋白酶酶解所得TSH的DPPH自由基清除率最高,碱性蛋白酶的最低,可能是因为中性蛋白酶TSH的DH较高,罗非鱼皮酶解充分。Protamex1.5L水解罗非鱼皮第2小时的酶解产物其DPPH自由基清除率、·OH自由基清除率和还原力分别为49.08%、9.03%和0.09;TSH结合Ca2+后,TSH-Ca的DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率减弱,这与杨伊然[36]还原力增强的结论一致。TSH结合Ca2+后抗氧化活性发生明显改变,可能是因为自由基与肽反应的位点被Ca2+占据。FT-IR结果表明,Ca2+可能与TSH中氨基氮原子和羰基氧原子结合。
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图 4 二溴海因对盐蚕豆虫的种群生长率和世代时间的影响
注:相同字母为组间无显著性差异 (p>0.05),不同字母为组间有显著性差异 (p<0.05),生长率用小写字母表示,世代时间用大写字母表示。
Figure 4. Effect of dibromo hydantoin on population growth rate and generation time of F. salina
Note: The same letters represent insignificant differences among the groups (p>0.05), while different letters represent significant differences among the groups (p<0.05). Growth rates are represented by lowercase letters, while generation time are represented by uppercase letters.
图 7 聚维酮碘对盐蚕豆虫的种群生长率和世代时间的影响
注:相同字母为组间无显著性差异 (p>0.05),不同字母为组间有显著性差异 (p<0.05),生长率用小写字母表示,世代时间用大写字母表示。
Figure 7. Effect of povidone iodine on population growth rate and generation time of F. salina
Note: The same letters represent insignificant differences among the groups (p>0.05), while different letters represent significant differences among the groups (p<0.05). Growth rates are represented by lowercase letters, while generation time are represented by uppercase letters.
图 10 高锰酸钾对盐蚕豆虫的种群生长率和世代时间的影响
注:相同字母为组间无显著性差异 (p>0.05),不同字母为组间有显著性差异 (p<0.05),生长率用小写字母表示,世代时间用大写字母表示。
Figure 10. Effect of potassium permanganate on population growth rate and generation time of F. salina
Note: The same letters represent insignificant differences among the groups (p>0.05), while different letters represent significant differences among the groups (p<0.05). Growth rates are represented by lowercase letters, while generation time are represented by uppercase letters.
表 1 3种消毒药物急性毒性试验质量浓度
Table 1 Mass concentration of three disinfectant drugs in acute toxicity test
药物名称
Drug name质量浓度
Mass concentration/(mg∙L−1)二溴海因
Dibromo hydantoin0 0.50 0.71 1.00 1.41 2.00 聚维酮碘
Povidone iodine0 14.45 16.60 19.05 21.90 25.00 高锰酸钾
Potassium permanganate0 0.52 0.63 0.76 0.90 1.10 表 2 3种消毒药物慢性毒性试验质量浓度
Table 2 Mass concentration of three disinfectant drugs in chronic toxicity test
药物名称
Drug name质量浓度
Mass concentration/(mg∙L−1)二溴海因
Dibromo
hydantoin0 0.015 0 0.018 7 0.024 9 0.037 4 0.074 8 聚维酮碘
Povidone iodine0 0.392 0 0.490 5 0.654 0 0.981 0 1.962 0 高锰酸钾
Potassium permanganate0 0.018 5 0.023 1 0.030 8 0.046 25 0.092 5 -
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