HcTLR1通过MyD88-NF-κB信号通路参与三角帆蚌抗菌免疫应答

路俊怡, 姜立妍, 龙凯, 王韬, 吴正理, 李艳红

路俊怡, 姜立妍, 龙凯, 王韬, 吴正理, 李艳红. HcTLR1通过MyD88-NF-κB信号通路参与三角帆蚌抗菌免疫应答[J]. 南方水产科学, 2024, 20(6): 19-30. DOI: 10.12131/20240093
引用本文: 路俊怡, 姜立妍, 龙凯, 王韬, 吴正理, 李艳红. HcTLR1通过MyD88-NF-κB信号通路参与三角帆蚌抗菌免疫应答[J]. 南方水产科学, 2024, 20(6): 19-30. DOI: 10.12131/20240093
LU Junyi, JIANG Liyan, LONG Kai, WANG Tao, WU Zhengli, LI Yanhong. HcTLR1 involved in antimicrobial immune response by MyD88-NF-κB signaling pathway in Hyriopsis cumingii[J]. South China Fisheries Science, 2024, 20(6): 19-30. DOI: 10.12131/20240093
Citation: LU Junyi, JIANG Liyan, LONG Kai, WANG Tao, WU Zhengli, LI Yanhong. HcTLR1 involved in antimicrobial immune response by MyD88-NF-κB signaling pathway in Hyriopsis cumingii[J]. South China Fisheries Science, 2024, 20(6): 19-30. DOI: 10.12131/20240093

HcTLR1通过MyD88-NF-κB信号通路参与三角帆蚌抗菌免疫应答

基金项目: 重庆市自然科学基金面上项目 (cstc2021jcyj-msxmX1202);重庆市生态渔业产业技术体系 (CQMAITS202315);重庆市水产科技重点攻关项目 (CQFTIU2024-09)
详细信息
    作者简介:

    路俊怡 (2000—),女,硕士研究生,研究方向为水产动物疾病与免疫。E-mail: 1475088509@qq.com

    通讯作者:

    李艳红 (1980—),女,副教授,博士,研究方向为水产动物疾病与免疫。E-mail: lyhong08@126.com

  • 中图分类号: S 917.4

HcTLR1 involved in antimicrobial immune response by MyD88-NF-κB signaling pathway in Hyriopsis cumingii

  • 摘要:

    Toll样受体 (Toll-like receptors, TLR) 家族是一类进化保守的病原体识别受体,在检测和防御微生物病原体的先天免疫中发挥着重要作用。为了探究HcTLR1基因在三角帆蚌 (Hyriopsis cumingii) 抗菌应答中的作用,使用cDNA末端快速克隆技术 (Rapid-amplification of cDNA ends, RACE) 获得HcTLR1基因cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR分析比较HcTLR1基因在三角帆蚌不同组织和不同免疫刺激后的表达水平,利用双链RNA干扰技术分析敲低该基因后MyD88依赖性通路及相关免疫基因的变化。结果显示,HcTLR1基因开放阅读框全长为3 687 bp,编码1 228个氨基酸。预测的HcTLR1蛋白结构包含多个亮氨酸富集的重复序列 (Leucine-rich repeat, LRR) 结构域、1个跨膜结构域和1个胞内Toll/白细胞介素-1 (Toll-IL-1 receptor domain, TIR) 受体。此外,HcTLR1基因在血细胞中表达量最高,且对维氏气单胞菌GL1 (Aeromonas veronii GL1) 和病原体相关分子模式 (Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) 刺激呈现出差异显著的时间依赖性变化。敲低HcTLR1基因后,维氏气单胞菌GL1刺激所激活的MyD88相关通路基因、抗菌肽、溶菌酶、防御素、乳清酸性蛋白、脂多糖结合蛋白/杀菌通透性增加蛋白2和白细胞介素17等基因的表达水平显著降低。结果表明,HcTLR1参与了三角帆蚌在微生物感染过程中MyD88依赖性信号通路的活化,并促进了血细胞抵抗机制。

    Abstract:

    Toll-like receptor (TLR) family is an evolutionarily conserved pathogen recognition receptor, playing an important role in detecting and defending against microbial pathogens. To study the role of HcTLR1 gene in the antimicrobial response of Hyriopsis cumingii, the full-length cDNA sequence of HcTLR1 gene was cloned using rapid-amplification of cDNA ends (RACE) technology; real-time fluorescence quantitative PCR analysis was employed to compare the expression levels of HcTLR1 gene in various tissues of H. cumingii challenged with different stimuli; double-stranded RNA interference technology was used to analyze the changes in MyD88-dependent pathway and related immune genes after the knockdown of the gene. The results show that the open reading frame (ORF) of HcTLR1 gene was 3 687 bp, encoding 1 228 amino acids. The predicted structure of HcTLR1 protein contained multiple Leucine-rich repeat domains, a transmembrane domain and an intracellular Toll/interleukin-1 receptor. Furthermore, the mRNA expression of HcTLR1 gene was highest in hemocytes and exhibited significant changes in response to Aeromonas veronii GL1 and pathogen-associated molecular patterns stimulation at different time points. Moreover, the knockdown of HcTLR1 gene significantly reduced the expression levels of genes in MyD88-related pathway, antibacterial peptides, lysozyme, defensins, lactoferrin, LPS1-binding protein/bactericidal permeability-increasing protein 2, and interleukin 17 stimulated by A. veronii GL1. In conclusion, it is suggested that HcTLR1 activates MyD88-dependent signaling pathways in H. cumingii during microbial infection and promotes resistance mechanisms in hemocytes.

  • 三角帆蚌 (Hyriopsis cumingii) 是中国南方一种重要的经济淡水蚌类。根据《2024中国渔业统计年鉴》,2023年中国淡水珍珠养殖产量为754 920 kg[1],而三角帆蚌珍珠产量在人工养殖淡水育珠蚌中占据重要地位。此外,三角帆蚌可通过高强度的滤食增加水体透明度,直接或间接地改变浮游植物和沉水植物的群落结构。因此,养殖三角帆蚌具有重要的经济价值和生态意义[2-4]。然而,近年来细菌和病毒感染导致贝类大规模死亡的现象时有发生,给珍珠养殖产业造成重大损失[5]。此外,养殖环境的恶化导致水生动物的发病率不断上升,污染物通过诱导免疫抑制,严重破坏了宿主先天免疫对病原体的防御[6]。因此,在集约化养殖条件下如何有效地防治贝类病害已成为产业发展面临的新一轮挑战。了解贝类先天性免疫机制和抗菌作用将有助于制定贝类病害治理方法,有利于推动贝类健康养殖和珍珠产业的可持续发展。

    先天免疫系统是脊椎动物和无脊椎动物抵抗微生物入侵的第一道防线[7]。其中,Toll样受体 (Toll-like receptors, TLR) 作为先天免疫中的关键组分,在识别和应对多种病原体中发挥着至关重要的作用[8]。TLR1通过直接招募并结合髓样分化因子88 (Myeloid differentiation factor 88, MyD88) 蛋白,引发自身活化并募集下游信号转导相关蛋白白细胞介素-1受体相关激酶 (Interleukin-1 receptor-associated kinases, IRAKs),活化的IRAKs驱动自体磷酸化并募集肿瘤坏死因子受体相关因子6 (Tumour-necrosis factor receptor-associated factor 6, TRAF6)[9-11],TRAF6进而激活转化生长因子-β激活激酶1 (Transforming growth factor-β-activated kinase 1, TAK1),TAK1进一步刺激IkB激酶 (Inhibitor of kappa B kinase, IKK) 介导的核因子κB (Nuclear factor kappa-B, NF-κB) 和丝裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinase, MAPK) 介导的激活蛋白1 (Activating protein-1, AP-1) 的转录反应,从而诱导炎性细胞因子的活化和表达[12-13]。目前已在三角帆蚌中鉴定了11个TLRs。在病原菌刺激下,三角帆蚌肝胰腺中Toll1基因的表达量升高,且过表达可以激活S2细胞中的Toll信号通路,从而上调抗真菌肽 (Drosomycin, DRS) 的表达[14]。然而并无研究证明在受到病原菌刺激时,TLR1是否直接激活MyD88信号通路,并调节下游相关免疫基因发挥抗菌应答作用。HcToll2参与诱导抗真菌肽表达以进行抗菌免疫[15];HcToll3介导调节乳清酸蛋白 (Whey acidic protein, WAP) 和溶菌酶 (Lysozyme, Lys) 的表达,参与了三角帆蚌对弧菌的防御[16];HcToll4和HcToll5则能够识别金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus)、副溶血弧菌 (Vibrio parahemolyticus)、白斑综合征病毒 (White Spot Syndrome Virus) 和聚肌胞苷酸 (Polyinosinic acid-polycytidylic acid, poly I:C),并参与调节三角帆蚌抗菌肽 (Theromacin, Ther) 和乳清酸蛋白的表达[17];此外,HcToll6和HcToll7介导鳃中溶菌酶和防御素 (Defensins, Def) 的表达,参与了副溶血弧菌刺激后机体的抗菌应答过程[18];HcTLRn[19]、HcToll9和HcToll10可通过NF-κB信号通路参与三角帆蚌的抗菌免疫应答[20]。由此可见,在三角帆蚌体内存在多种不同功能的TLRs,它们在对抗不同病原微生物感染中发挥着重要作用。

    为探讨三角帆蚌HcTLR1基因在先天性免疫中的作用机制,本研究从感染维氏气单胞菌 (Aeromonas veronii)的三角帆蚌肝胰腺转录组数据库[21]中筛选并克隆了三角帆蚌HcTLR1基因的全长cDNA。采用实时荧光定量分析技术和dsRNA干扰技术研究了HcTLR1基因在不同组织中的表达情况,以及HcTLR1-MyD88信号通路对不同免疫刺激物和维氏气单胞菌的免疫响应情况。为进一步了解TLRs在软体动物先天免疫防御和抗菌应答中的作用奠定了基础。

    选用2龄三角帆蚌250只,体质量约为 (75±10) g。实验前,将蚌置于含过滤淡水和空气泵的15 L水循环系统中养殖1周左右,养殖水温 (23.0±1.0) ℃。每天喂食1次小球藻液 (5.6×105 个·mL−1)。暂养期间剔除不健康个体,选取健康个体用于后续实验。

    从构建的三角帆蚌肝胰腺转录组文库中,筛选出TLR1基因片段 (数据未发表)[22]。使用SMARTer® RACE 5'/3' Kit试剂盒 (TaKaRa,日本),结合特异性和通用引物 (表1),以肝胰腺为模板,进行cDNA末端快速克隆 (RACE),扩增两端序列。PCR反应体系为:12 μL LA taq (TaKaRa,日本),1 μL 特异性引物 (Gene specific primer, GSP, 10 μmol·L−1),1 μL 通用引物 (Universal primer, UPM, 10 μmol·L−1),3 μL cDNA,8 μL ddH2O。PCR扩增程序为:98 ℃ 10 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,30个循环。将回收的PCR扩增产物连接到pMD19T质粒 (TaKaRa,日本) 载体中,并转化至大肠杆菌感受态DH5α细胞 (擎科生物,中国) 中进行菌液PCR和测序。最后,通过拼接HcTLR1的两端序列,获得基因全长序列。

    表  1  引物序列
    Table  1  Sequences of primers
    引物名称
    Primer name
    引物序列 (5'—3')
    Primers sequence (5'−3')
    用途
    Application
    来源
    Source
       HcTLR1-3'race-F TGCCATGCTGTACAGACTTGCTACCGAA 基因克隆 本研究
       HcTLR1-5'race-R CGTGCACTTCTCGGGACATCTGTGT 本研究
       UPM Long CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 本研究
       UPM Short CTAATACGACTCACTATAGGGC 本研究
       TLR1-iF+T7 TAATACGACTCACTATAGGGTAAAGTTCGGATGGCGAATC RNA干扰 本研究
       TLR1-iR TTTTCCCAAAACCAAGCATC 本研究
       GFP-iF+T7 TAATACGACTCACTATAGGGAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG 本研究
       GFP-iR CAGCAGGACCATGTGATCGCGC 本研究
       HcTLR1-qPCR-F TGCCATGCTGTACAGACTTGCT qPCR 本研究
       HcTLR1-qPCR-R    CGTGCACTTCTCGGGACATCTGT 本研究
       MyD88-qPCR-F GAACGCCACCCTTGGGAAAC 本研究
       MyD88-qPCR-R TCCACGACAGCACCCTCAAG 本研究
       TRAF6-qPCR-F CGCAGTGTGGTCATCGCTTC 本研究
       TRAF6-qPCR-R TGGCACACGAGTTAGGGCAT 本研究
       IRAK4-qPCR-F TCGCAAGTGGTACAGGCCAT 本研究
       IRAK4-qPCR-R TGACGTGCCAATTACGAGCG 本研究
       WAP-qPCR-F TGTAATGTTGACGGGAGTG [22]
       WAP-qPCR-R CTGTTTTGTTTTGATGGCT
       LBP/BPI1-qPCR-F TGGAGAACAGAGTCAGAAAGA [23]
       LBP/BPI1-qPCR-R CGATAGTCAAGCAGGAAATG
       LBP/BPI2-qPCR-F TATCAGTGTCAGCGGTAGTG [23]
       LBP/BPI2-qPCR-R CATCAGCGTAAAGAGGGA
       p65-qPCR-F TGGCAAGGACTGTAAGAAAGG [23]
       p65-qPCR-R CTTGTGCTTAAATCCAGTCTGA
       P105-qPCR-F TGTTGTATCCACTCCCATCT [23]
       P105-qPCR-R TCTTGCTCAACGAACTTCAC
       Lys-qPCR-F CACAGTTGGTGGTTCAGTAA 本研究
       Lys-qPCR-R CGAATCCTTCAGTAGATGGT 本研究
       IL17-qPCR-F CCATCCACGATCCTCAACG 本研究
       IL17-qPCR-R CGCAAGTGTATCCAACAGCAA 本研究
       Def-qPCR-F GGTGTCGTCTATCTTGCTTC [19]
       Def-qPCR-R AGGTTATTTGGTCATCTATTTTG
       Ther-qPCR-F CACAGTTGGTGGTTCAGTAA [18]
       Ther-qPCR-R CGAATCCTTCAGTAGATGGT
       EF1α-qPCR-F GGAACTTCCCAGGCAGACTGTGC [3]
       EF1α-qPCR-R TCAAAACGGGCCGCAGAGAAT
    注:下划线部分引物序列为T7启动子序列。 Note: The underlined primer sequence is T7 promoter sequence.
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    使用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中ORF Finder对基因序列开放阅读框 (Open reading frame, ORF) 与编码氨基酸序列进行预测;用Smart Blast对氨基酸序列进行同源性分析;通过Simple Modular Architecture Research Tool SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) 预测氨基酸所包含的结构域;利用Protparam (http://www.expasy.org/tools/protparam.html) 线上工具获取氨基酸序列组成、分子质量大小、等电点等物理参数信息;利用MEGA 11的邻接法 (Neighbor-Joining, NJ) 构建系统进化树,Bootstrap分析其可靠性,重复1 000次。

    分别取三角帆蚌的肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜、鳃、性腺、血细胞、肾脏和肠组织,并采用心脏取血的方式收集血淋巴,1 000×g离心5 min,收集血细胞。共9只蚌,每3只的组织混合作为1个样品,根据RNAiso plus提取试剂盒 (TaKaRa,日本) 说明书提取组织RNA。参照Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (Yeasen,中国) 说明书合成cDNA。以EF-1α基因为内参,以不同组织的cDNA为模板,结合特定的荧光定量引物 (表1),通过BIORAD CFX ConnectTM荧光定量仪 (Bio-Rad Laboratories,美国),检测了2龄三角帆蚌不同组织中HcTLR1基因的相对表达量。反应体系为:10 μL SYBR Green Mix (Yeasen,中国)、0.4 μL q-F (10 μmol·L−1)、0.4 μL q-R (10 μmol·L−1)、2 μL cDNA和7.2 μL ddH2O。反应程序为:95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 10 s,39个循环。使用2−ΔΔCt法计算基因的相对表达量,每组3个重复,计算平均值。

    脂多糖 (Lipopolysaccharides, LPS)、肽聚糖 (Peptidoglycan, PGN) 和poly I:C 3种刺激物代表不同的病原体相关分子模式 (Pathogen-associated molecular pattern, PAMP),均购自麦克林公司;维氏气单胞菌GL1由本实验室前期从患病三角帆蚌中分离[23]。将健康三角帆蚌随机分为5组,其中4组向闭壳肌中分别注射200 μL维氏气单胞菌GL1 (107 CFU·mL−1)、LPS、PGN和poly I:C (0.5 mg·mL−1,溶于pH 7.4的PBS),另一组注射相同体积的磷酸盐缓冲溶液 (PBS, pH 7.4) 作为阴性对照。未经处理的三角帆蚌作为空白对照组。在注射后的第6、第12、第24、第48小时,分别收集9只三角帆蚌的血细胞、肝胰腺和鳃组织。每3只蚌的组织混合作为1个样品,用于RNA提取。

    使用Primer 5.0软件设计1对含有T7启动子的基因特异性引物:TLR1-iF+T7、TLR1-iR (表1)。以血细胞cDNA为模板,采用rTaq DNA聚合酶 (TaKaRa,日本) 进行特异性DNA片段的扩增。同时,绿色荧光蛋白 (Green fluorescent protein, GFP) 片段用于阴性对照dsRNA的合成。根据T7 High Yield RNA Transcription Kit (Beyotime Biotechnology,中国) 试剂盒操作,合成并纯化相应的dsRNA。

    挑选健康的三角帆蚌个体暂养后收集血细胞。血细胞培养于含10% (φ) FBS (Gibico,美国)、2% (φ) 青链霉素 (Beyotime Biotechnology,中国) 的DMEM培养基 (Gibico,美国) 中,培养条件为27 ℃、5% (φ) CO2,并定期观察细胞状态。按照每毫升106个细胞的密度,向细胞中同时加入40 μg的dsRNA及灭活后的维氏气单胞菌GL1。每个时间点的不同处理组各设置3个重复。将上述处理的细胞置于27 ℃、5% (φ) CO2培养箱中静置培养。在培养后的第6、第12和第24小时,分别收集不同处理组的血细胞,以便进行后续的RNA提取和qPCR分析。

    所有数据均以“平均值±标准差 ($ \overline x \pm s $)”表示。采用SPSS 26.0软件进行单因素方差 (One-Way ANOVA) 分析及Tukey氏多重检验,显著性水平α为0.05 (n=3)。

    通过测序、拼接获得HcTLR1基因全长序列 (GenBank登录号:PP051478) 3 969 bp,包含45 bp的5'非翻译区 (Untranslated region, UTR)、237 bp的3'UTR和3 687 bp的ORF,共编码1 228个氨基酸 (图1),预测分子质量为139 kD,理论等电点为5.54。SMART结构域分析预测HcTLR1蛋白包含14个LRR结构域、3个LRR亚家族结构域、2个C端LRR结构域、1个LRR-NT结构域、1个跨膜结构域和1个胞内TIR结构域 (图2)。

    图  1  HcTLR1核苷酸序列和预测的氨基酸序列
    注:红色碱基代表起始密码子 (ATG) 和终止密码子 (TAA);富含亮氨酸的重复序列 (LRR) 结构域用下划线标出;富含亮氨酸的重复序列典型的亚家族 (LRR TYP) 用双下划线标出;富含亮氨酸重复C-末端结构域 (LRR CT) 用波浪线标出;富含亮氨酸重复N-末端结构域 (LRR NT) 用虚线标出;跨膜结构域 (TM) 用灰色标出;白细胞介素-1受体 (TIR) 结构域用蓝色标出。
    Fig. 1  Nucleotide sequences and predicted amino acid sequences of HcTLR1
    Note: Red bases represent the initiation codon (ATG) and stop codon (TAA); the Leucine-rich repeats (LRR) domains were underlined; the Leucine-rich repeats typical subfamily (LRR TYP) was double underlined; the Leucine rich repeat C-terminal domain (LRR CT) was marked with wavy lines; the Leucine rich repeat N-terminal domain (LRR NT) was marked with dotted line; the transmembrane domain (TM) was marked with gray and the Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain was marked with blue.
    图  2  HcTLR1结构域预测
    Fig. 2  Prediction of HcTLR1 domain

    将三角帆蚌HcTLR1蛋白的功能结构域序列与其他物种功能结构域序列进行多重序列比对,发现不同物种 (包括脊椎动物和无脊椎动物) 的TIR结构域序列具有较高的同源性 (图3)。基于三角帆蚌氨基酸全长序列的系统进化树分析显示,HcTLR1与三角帆蚌Toll 1及栉孔扇贝 (Azumapecten farreri) Toll、长牡蛎 (Crassostrea gigas) TLR1聚为一支,其中与三角帆蚌Toll 1的亲缘关系最近 (图4)。

    图  3  三角帆蚌与其他物种TIR结构域的氨基酸多序列比对
    注:黑色阴影表示氨基酸相同,其他阴影表示氨基酸部分相同;用于多重序列比对的其他物种的氨基酸序列分别是智人 (CAG38593.1),小鼠 (AAG35062.1),大鼠 (XP_038947854.1),原鸡 (BAD67422.1),斑马鱼 (NP_001124065.1),三角帆蚌 (Toll 2: AIA66467.1, Toll 4: AVR52705.1, Toll 5: AVR52704.1, Toll 6: QCR63936.1, Toll 7: QCR63937.1),紫贻贝 (AFU48614.1),虾夷扇贝 (XP_021346851.1),海湾扇贝 (AVP74315.1),巨海扇蛤 (XP_033755286.1)。
    Fig. 3  Multiple sequence alignment of TIR domain between H. cumingii and other species
    Note: Black shading represents amino acid identity, and other shading represents partial amino acid identity. The amino acid sequences used for multiple alignment include Homo sapians (CAG38593.1), Mus musculus (AAG35062.1), Rattus norvegicus (XP_038947854.1), Gallus gallus (BAD67422.1), Danio rerio (NP_001124065.1), Hyriopsis cumingii (Toll 2: AIA66467.1, Toll 4: AVR52705.1, Toll 5: AVR52704.1, Toll 6: QCR63936.1, Toll 7: QCR63937.1), Mytilus galloprovincialis (AFU48614.1), Mizuhopecten yessoensis (XP_021346851.1), Argopecten irradians (AVP74315.1) and Pecten maximus (XP_033755286.1).
    图  4  三角帆蚌HcTLR1与其他物种氨基酸全长序列构建的系统发育树
    Fig. 4  Phylogenetic tree of HcTLR1 full-length sequence of amino acid between H. cumingii and other species

    实时荧光定量PCR结果显示,HcTLR1基因在所有检测的组织中均有表达,且表达程度各异 (图5)。其中,血细胞中HcTLR1的表达量最高,并显著高于其他组织 (p<0.05)。其在血细胞中的表达量分别为肝胰腺的13.67倍、斧足的23.27倍、闭壳肌的19.06倍、外套膜的7.1倍、鳃的11.45倍、性腺的18.63倍、肾脏的2.5倍和肠的2.07倍。

    图  5  HcTLR1 mRNA在三角帆蚌组织中的相对表达量
    注:1. 肝胰腺;2. 斧足;3. 闭壳肌;4. 外套膜;5. 鳃;6. 性腺;7. 血细胞;8. 肾脏;9. 肠;所标字母不同表示差异显著 (p<0.05)。
    Fig. 5  Relative mRNA expression of HcTLR1 in different tissues from H. cumingii
    Note: 1. Hepatopancreas; 2. Foot; 3. Adductor; 4. Mantle; 5. Gill; 6. Gonad; 7. Hemocyte; 8. Kidney; 9. Intestine. Different letters represent significant differences (p<0.05).

    在2 龄三角帆蚌受到维氏气单胞菌和不同PAMPs刺激后,采用qPCR技术检测了不同时间点三角帆蚌各组织中HcTLR1基因的相对表达量。结果显示,在鳃组织中,经维氏气单胞菌GL1和poly I:C刺激后,HcTLR1基因表达量呈先上升后下降的趋势。刺激后第12 和第24小时,其表达量显著增加 (p<0.05),分别为PBS组的5.2和4.5倍。而LPS、PNG刺激后,其表达量呈下降趋势,但在刺激后第6小时,与PBS组相比,其表达量显著增加 (p<0.05),分别为4.2和5.4倍 (图6-a)。在肝胰腺中,经维氏气单胞菌GL1、LPS、PNG、poly I:C刺激后,HcTLR1基因的表达量也呈先上升后下降的趋势,且在刺激后第24小时表达量显著上调 (p<0.05),分别为PBS组的14、5.8、8和4.9倍 (图6-b)。在血细胞中,维氏气单胞菌GL1刺激后第6、第12和第24小时,HcTLR1基因的表达量显著上调 (p<0.05),分别为PBS组的2.1、2和2.4倍 (图6-c)。然而,在LPS、PNG、poly I:C刺激后,其表达量先下降后上升,但无显著性差异 (p>0.05)。由此可见,当三角帆蚌经过维氏气单胞菌GL1、LPS、PNG和poly I:C刺激后,HcTLR1基因在不同组织和时间点的表达水平存在显著差异。

    图  6  免疫刺激后三角帆蚌鳃 (a)、肝胰腺 (b) 和血细胞 (c) 中HcTLR1 mRNA在不同时间点的相对表达量
    注:同一处理时间下不同字母表示差异显著 (p<0.05),相同字母表示差异不显著 (p>0.05)。
    Fig. 6  Relative mRNA expression of HcTLR1 after immune challenges in gill (a), hepatopancreas (b) and hemocyte (c) of H. cumingii at different time point
    Note: Different letters at the same treatment time represent significant differences (p<0.05), while the same letters represent insignificant differences (p>0.05).

    为了探究三角帆蚌HcTLR1基因对TLR信号通路的激活作用,采用dsRNA干扰方法来抑制血细胞中HcTLR1基因的表达。通过qPCR检测HcTLR1及其介导的MyD88依赖性信号通路中多个关键基因的表达变化,包括MyD88IRAK4TRAF6、核因子-κB/Rel转录因子p65 (NF-κB/RELA p65, p65)、核因子-κB/Rel 蛋白1 p105 (NF-κB/RELA 1 p105, p105) 和下游免疫相关基因TherLysDefWap、脂多糖结合蛋白/杀菌通透性增加蛋白 (LPS binding protein/bactericidal permeability increasing protein, LBP/BPI) 1、2和白细胞介素17 (Interleukin-17, IL-17)。结果显示,与未处理组和阴性对照dsGFP组相比,dsTLR1组在干扰后的第6、第12和第24小时,HcTLR1 基因的表达量显著下降,干扰效果显著 (p<0.05,图7-a)。在此基础上,进一步在干扰后使用维氏气单胞菌GL1刺激血细胞发现,dsTLR1组的HcTLR1基因表达量在第6、第12和第24小时均显著降低 (p<0.05,图7-b)。此外,与未处理组相比,维氏气单胞菌GL1刺激血细胞12 h后检测发现,dsTLR1组中MyD88依赖性通路相关基因MyD88IRAK4TRAF6p65p105的表达量分别下降87.8%、97.7%、94.6%、93%和96.3% (p<0.05,图8-a—e)。同时,通路下游抗菌免疫相关基因TherDefLysWAPLBP/BPI 2IL-17的表达量分别下降97.4%、98.3%、99.7%、91.7%、91.2%和94.4% (p<0.05,图8-f—i,8-k—l)。然而,LBP/BPI 1基因的表达量与对照组相比无显著性差异 (p>0.05,图8-j)。上述结果表明,HcTLR1基因参与三角帆蚌TLR1-MyD88-NF-κB信号通路的激活,并通过激活下游免疫相关基因发挥抗菌应答作用。

    图  7  HcTLR1干扰及免疫刺激后血细胞中HcTLR1 mRNA的相对表达量
    注:a. dsRNA干扰后血细胞中HcTLR1 mRNA的表达水平;b. dsRNA干扰后并经维氏气单胞菌GL1刺激血细胞中HcTLR1 mRNA的表达水平。同一处理时间下不同字母表示差异显著 (p<0.05),相同字母表示差异不显著 (p>0.05)。
    Fig. 7  mRNA expression levels in hemocytes of H. cumingii after HcTLR1 interference and immune challenges
    Note: a. HcTLR1 mRNA expression levels in hemocytes after dsRNA interference; b. HcTLR1 mRNA expression levels in hemocytes after dsRNA interference in A. veronii GL1 stimulation. Different letters at the same treatment time represent significant differences (p<0.05), while the same letters represent insignificant differences (p>0.05).
    图  8  HcTLR1 基因干扰及免疫刺激后血细胞中TLR1-MyD88-NF-κB信号通路及下游抗菌相关基因的相对表达量
    注:不同字母表示差异显著 (p<0.05),相同字母表示差异不显著 (p>0.05)。
    Fig. 8  Relative expression of TLR1-MyD88-NF-κB signaling pathway and downstream antimicrobial-associated gene in hemocytes after HcTLR1 gene interference and immune challenges
    Note: Different letters represent significant differences (p<0.05), while the same letters represent insignificant differences (p>0.05).

    本研究克隆了三角帆蚌HcTLR1基因的cDNA序列,编码一个长为3 687 bp的ORF。蛋白质结构预测分析显示,HcTLR1蛋白中含有多个LRR结构域、1个跨膜结构域和1个胞内Toll/白细胞介素-1受体 (TIR),表现出典型的Toll样受体结构。其中,Toll样受体胞外结构域由LRR组成,每个LRR被疏水性的氨基酸间隔开,在识别多种病原体相关的分子模式中发挥重要作用[24-25];而胞内结构域由TIR构成,具有3个保守的氨基酸序列框,负责C端信号传导,并能与含有TIR结构域的接头蛋白MyD88发生相互作用以激活下游信号通路[26-28]。这表明HcTLR1能够识别多种病原体相关分子模式并启动天然免疫反应,参与三角帆蚌的抗菌应答过程。在维氏气单胞菌GL1、LPS、PNG和poly I:C刺激下,三角帆蚌鳃、肝胰腺和血细胞中HcTLR1基因的表达量在不同时间点呈现显著性差异。同时,不同刺激诱导下,免疫持续时效也存在差异。这一发现与已报道的贝类研究结果相符。例如,在副溶血弧菌刺激后,香港牡蛎 (C. hongkongensis) 鳃和血细胞中TLR4基因表达量显著性升高[29];在溶藻弧菌 (V. alginolyticus)、LPS、PGN和poly I:C刺激后,合浦珠母贝 (Pinctada fucata) 肝胰腺中PfTLR3和PfTLR13基因的表达量在不同时间点出现显著性差异[30-31];在LPS、PGN和poly I:C刺激后,三角帆蚌肝胰腺和鳃中TLRn基因的表达水平在不同时间点均显著性升高[20]。以上研究结果均证实了贝类TLRs在应对病原体和PAMPs的刺激时扮演着重要的免疫识别作用[32]。因此,推测HcTLR1分子具有广泛的识别谱,能够识别多种病原体及不同类型的PAMPs,并可能引起一系列级联反应,参与生物体防御功能。

    三角帆蚌各组织HcTLR1基因定量结果显示,其在肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜、鳃、性腺、血细胞、肾脏和肠等9种组织中均有不同程度的表达,特别是在血细胞中的表达量显著高于其他组织。而在贝类抵御外来病原微生物的过程中,血细胞起到了至关重要的作用,既是细胞免疫的主体,又是体液免疫的提供者[33]。已有研究发现,长牡蛎的TLR2TLR3基因[34-35]及厚壳贻贝 (Mytilus coruscus) 的TLR-like1基因[36]均在血细胞中高表达,并在贝类的免疫应答中发挥关键作用。这与本研究的结果相似,提示HcTLR1在三角帆蚌抗菌应答中同样扮演着重要角色。

    鉴于血细胞在贝类免疫系统中的中心地位[37-38],本研究在血细胞内进行RNA干扰实验。结果显示,HcTLR1的干扰导致多个基因 (如MyD88IRAK4TRAF6p65p105等) 的表达量明显下调,同时下游抗菌免疫基因 (如TherLysDefWAPLBP/BPI 2IL-17) 的表达量也显著降低。这一结果与厚壳贻贝中干扰McTLRw导致McMyD88McIRAK4McTRAF6基因的表达受到显著抑制[39],青蛤 (Cyclina sinensis) 中干扰CsTLR13导致CsMyD88CsIRAK4CsTRAF6CsIKKaCsIkBCsNF-kBCsC-LYZCsAMP基因[40]表达显著下调,以及三角帆蚌中干扰HcTLRn导致NF-κB (p65p105) 及LysTherWAPLBP/BPI 1LBP/BPI 2的表达显著下降[20]等研究结果相一致,这提示HcTLR1可能参与TLR信号通路的激活,且TLR1-MyD88-NF-κB信号通路在三角帆蚌先天免疫应答中起重要作用。Toll信号通路是宿主抗菌应答重要的信号转导通路之一[17],TLR1属于跨膜蛋白,位于信号通路最上游,当受到病原体刺激时,其胞内TIR结构域与包含TIR结构域的接头蛋白MyD88直接相互作用,并经过刺激将IRAK4吸引到TLRs,进而活化IKK复合体、MAPKs和NF-κB等级联反应,最终调节免疫相关基因的表达以发挥多种生物学功能[41]。因此,在三角帆蚌血细胞中,干扰HcTLR1 基因从而导致MyD88依赖性信号通路基因的表达受到抑制,表明HcTLR1可能通过激活MyD88-NF-κB依赖性信号通路来调节下游免疫相关基因的表达,从而发挥抗菌应答作用,但下游MAPK信号通路是否参与三角帆蚌的抗菌应答仍未可知。本研究结果对于深入了解Toll信号通路及HcTLR1在生物体内的抗菌应答机制具有积极意义。

  • 图  1   HcTLR1核苷酸序列和预测的氨基酸序列

    注:红色碱基代表起始密码子 (ATG) 和终止密码子 (TAA);富含亮氨酸的重复序列 (LRR) 结构域用下划线标出;富含亮氨酸的重复序列典型的亚家族 (LRR TYP) 用双下划线标出;富含亮氨酸重复C-末端结构域 (LRR CT) 用波浪线标出;富含亮氨酸重复N-末端结构域 (LRR NT) 用虚线标出;跨膜结构域 (TM) 用灰色标出;白细胞介素-1受体 (TIR) 结构域用蓝色标出。

    Figure  1.   Nucleotide sequences and predicted amino acid sequences of HcTLR1

    Note: Red bases represent the initiation codon (ATG) and stop codon (TAA); the Leucine-rich repeats (LRR) domains were underlined; the Leucine-rich repeats typical subfamily (LRR TYP) was double underlined; the Leucine rich repeat C-terminal domain (LRR CT) was marked with wavy lines; the Leucine rich repeat N-terminal domain (LRR NT) was marked with dotted line; the transmembrane domain (TM) was marked with gray and the Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain was marked with blue.

    图  2   HcTLR1结构域预测

    Figure  2.   Prediction of HcTLR1 domain

    图  3   三角帆蚌与其他物种TIR结构域的氨基酸多序列比对

    注:黑色阴影表示氨基酸相同,其他阴影表示氨基酸部分相同;用于多重序列比对的其他物种的氨基酸序列分别是智人 (CAG38593.1),小鼠 (AAG35062.1),大鼠 (XP_038947854.1),原鸡 (BAD67422.1),斑马鱼 (NP_001124065.1),三角帆蚌 (Toll 2: AIA66467.1, Toll 4: AVR52705.1, Toll 5: AVR52704.1, Toll 6: QCR63936.1, Toll 7: QCR63937.1),紫贻贝 (AFU48614.1),虾夷扇贝 (XP_021346851.1),海湾扇贝 (AVP74315.1),巨海扇蛤 (XP_033755286.1)。

    Figure  3.   Multiple sequence alignment of TIR domain between H. cumingii and other species

    Note: Black shading represents amino acid identity, and other shading represents partial amino acid identity. The amino acid sequences used for multiple alignment include Homo sapians (CAG38593.1), Mus musculus (AAG35062.1), Rattus norvegicus (XP_038947854.1), Gallus gallus (BAD67422.1), Danio rerio (NP_001124065.1), Hyriopsis cumingii (Toll 2: AIA66467.1, Toll 4: AVR52705.1, Toll 5: AVR52704.1, Toll 6: QCR63936.1, Toll 7: QCR63937.1), Mytilus galloprovincialis (AFU48614.1), Mizuhopecten yessoensis (XP_021346851.1), Argopecten irradians (AVP74315.1) and Pecten maximus (XP_033755286.1).

    图  4   三角帆蚌HcTLR1与其他物种氨基酸全长序列构建的系统发育树

    Figure  4.   Phylogenetic tree of HcTLR1 full-length sequence of amino acid between H. cumingii and other species

    图  5   HcTLR1 mRNA在三角帆蚌组织中的相对表达量

    注:1. 肝胰腺;2. 斧足;3. 闭壳肌;4. 外套膜;5. 鳃;6. 性腺;7. 血细胞;8. 肾脏;9. 肠;所标字母不同表示差异显著 (p<0.05)。

    Figure  5.   Relative mRNA expression of HcTLR1 in different tissues from H. cumingii

    Note: 1. Hepatopancreas; 2. Foot; 3. Adductor; 4. Mantle; 5. Gill; 6. Gonad; 7. Hemocyte; 8. Kidney; 9. Intestine. Different letters represent significant differences (p<0.05).

    图  6   免疫刺激后三角帆蚌鳃 (a)、肝胰腺 (b) 和血细胞 (c) 中HcTLR1 mRNA在不同时间点的相对表达量

    注:同一处理时间下不同字母表示差异显著 (p<0.05),相同字母表示差异不显著 (p>0.05)。

    Figure  6.   Relative mRNA expression of HcTLR1 after immune challenges in gill (a), hepatopancreas (b) and hemocyte (c) of H. cumingii at different time point

    Note: Different letters at the same treatment time represent significant differences (p<0.05), while the same letters represent insignificant differences (p>0.05).

    图  7   HcTLR1干扰及免疫刺激后血细胞中HcTLR1 mRNA的相对表达量

    注:a. dsRNA干扰后血细胞中HcTLR1 mRNA的表达水平;b. dsRNA干扰后并经维氏气单胞菌GL1刺激血细胞中HcTLR1 mRNA的表达水平。同一处理时间下不同字母表示差异显著 (p<0.05),相同字母表示差异不显著 (p>0.05)。

    Figure  7.   mRNA expression levels in hemocytes of H. cumingii after HcTLR1 interference and immune challenges

    Note: a. HcTLR1 mRNA expression levels in hemocytes after dsRNA interference; b. HcTLR1 mRNA expression levels in hemocytes after dsRNA interference in A. veronii GL1 stimulation. Different letters at the same treatment time represent significant differences (p<0.05), while the same letters represent insignificant differences (p>0.05).

    图  8   HcTLR1 基因干扰及免疫刺激后血细胞中TLR1-MyD88-NF-κB信号通路及下游抗菌相关基因的相对表达量

    注:不同字母表示差异显著 (p<0.05),相同字母表示差异不显著 (p>0.05)。

    Figure  8.   Relative expression of TLR1-MyD88-NF-κB signaling pathway and downstream antimicrobial-associated gene in hemocytes after HcTLR1 gene interference and immune challenges

    Note: Different letters represent significant differences (p<0.05), while the same letters represent insignificant differences (p>0.05).

    表  1   引物序列

    Table  1   Sequences of primers

    引物名称
    Primer name
    引物序列 (5'—3')
    Primers sequence (5'−3')
    用途
    Application
    来源
    Source
       HcTLR1-3'race-F TGCCATGCTGTACAGACTTGCTACCGAA 基因克隆 本研究
       HcTLR1-5'race-R CGTGCACTTCTCGGGACATCTGTGT 本研究
       UPM Long CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 本研究
       UPM Short CTAATACGACTCACTATAGGGC 本研究
       TLR1-iF+T7 TAATACGACTCACTATAGGGTAAAGTTCGGATGGCGAATC RNA干扰 本研究
       TLR1-iR TTTTCCCAAAACCAAGCATC 本研究
       GFP-iF+T7 TAATACGACTCACTATAGGGAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG 本研究
       GFP-iR CAGCAGGACCATGTGATCGCGC 本研究
       HcTLR1-qPCR-F TGCCATGCTGTACAGACTTGCT qPCR 本研究
       HcTLR1-qPCR-R    CGTGCACTTCTCGGGACATCTGT 本研究
       MyD88-qPCR-F GAACGCCACCCTTGGGAAAC 本研究
       MyD88-qPCR-R TCCACGACAGCACCCTCAAG 本研究
       TRAF6-qPCR-F CGCAGTGTGGTCATCGCTTC 本研究
       TRAF6-qPCR-R TGGCACACGAGTTAGGGCAT 本研究
       IRAK4-qPCR-F TCGCAAGTGGTACAGGCCAT 本研究
       IRAK4-qPCR-R TGACGTGCCAATTACGAGCG 本研究
       WAP-qPCR-F TGTAATGTTGACGGGAGTG [22]
       WAP-qPCR-R CTGTTTTGTTTTGATGGCT
       LBP/BPI1-qPCR-F TGGAGAACAGAGTCAGAAAGA [23]
       LBP/BPI1-qPCR-R CGATAGTCAAGCAGGAAATG
       LBP/BPI2-qPCR-F TATCAGTGTCAGCGGTAGTG [23]
       LBP/BPI2-qPCR-R CATCAGCGTAAAGAGGGA
       p65-qPCR-F TGGCAAGGACTGTAAGAAAGG [23]
       p65-qPCR-R CTTGTGCTTAAATCCAGTCTGA
       P105-qPCR-F TGTTGTATCCACTCCCATCT [23]
       P105-qPCR-R TCTTGCTCAACGAACTTCAC
       Lys-qPCR-F CACAGTTGGTGGTTCAGTAA 本研究
       Lys-qPCR-R CGAATCCTTCAGTAGATGGT 本研究
       IL17-qPCR-F CCATCCACGATCCTCAACG 本研究
       IL17-qPCR-R CGCAAGTGTATCCAACAGCAA 本研究
       Def-qPCR-F GGTGTCGTCTATCTTGCTTC [19]
       Def-qPCR-R AGGTTATTTGGTCATCTATTTTG
       Ther-qPCR-F CACAGTTGGTGGTTCAGTAA [18]
       Ther-qPCR-R CGAATCCTTCAGTAGATGGT
       EF1α-qPCR-F GGAACTTCCCAGGCAGACTGTGC [3]
       EF1α-qPCR-R TCAAAACGGGCCGCAGAGAAT
    注:下划线部分引物序列为T7启动子序列。 Note: The underlined primer sequence is T7 promoter sequence.
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出版历程
  • 收稿日期:  2024-04-29
  • 修回日期:  2024-07-16
  • 录用日期:  2024-09-03
  • 网络出版日期:  2024-09-20
  • 刊出日期:  2024-12-04

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