Isolation, identification and drug sensitivity of Edwardsiella tarda from Pelteobagrus fulvidraco
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摘要:
为确定重庆市荣昌区某养殖场黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco) 疾病爆发的原因，从患病黄颡鱼肝脏中分离到一株优势菌，命名为ET230818。通过形态学观察、生理生化鉴定和16S rRNA、gyrB、rpoB、cpn60基因序列分析确定ET230818为迟缓爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda)。通过人工感染试验计算出菌株ET230818对黄颡鱼 [平均体质量 (17.5±2.5) g、平均体长 (15.0±1.2) cm] 的半数致死量 (LD50) 为2.51×106 CFU·mL−1。毒力基因检测结果显示，该菌株携带sodB、katB、esrB、gadB、fimA、citC和mukF毒力基因。组织病理学观察发现，患病黄颡鱼肝细胞排列杂乱、肿胀，脾组织中含血铁黄素聚集，肾小管收缩变窄且结构松散、萎缩；肠道黏膜细胞排列杂乱、坏死脱落，肠绒毛崩解，鳃小片明显变性弯折。抗菌药物敏感性试验与中草药抑菌试验发现，菌株ET230818对多西环素、恩诺沙星等11种抗菌药物高度敏感，丁香、五倍子等中草药对其具有较强的抑菌效果，研究可为黄颡鱼源迟缓爱德华氏菌的诊断和药物防治提供参考依据。
Abstract:To determine the cause of Pelteobagrus fulvidraco's disease outbreak on a breeding farm in Rongchang, Chongqing, we isolated a dominant bacterium from the liver of diseased fish and named it as ET230818. Based on morphological observation, physiological and biochemical identification and through the analysis of 16S rRNA, gyrB, rpoB and cpn60 gene sequences, we confirmed ET230818 as Edwardsiella tarda. The artificial infection experiment finds out the median lethal dose (LD50) of strain ET230818 to P. fulvidraco [Average body mass of (17.5±2.5) g, average body length of (15.0±1.2) cm] was 2.51×106 CFU·mL−1. Virulence gene test results show that the strain carried sodB, katB, esrB, gadB, fimA, citC and mukF virulence genes. Histopathological observation reveals that the infected P. fulvidraco had disordered and swollen hepatocytes, with hemosiderin concentration in spleen tissue; the renal tubules contracted and narrowed, and the structure of the renal tubules became loose and atrophied; the arrangement of intestinal mucosal cells was disorderly, necrotic and shedding; the intestinal villi disintegrated; and the branchial lamella was obviously deformed and bent. The antimicrobial susceptibility test and Chinese herbal antibacterial experiment show that strain ET230818 was highly sensitive to 11 western medicines such as Doxycycline and Enrofloxacin, and Chinese herbs like Syzygium aromaticum and Galla chinensis had strong bacteriostatic effects on E. tarda. This study can provide references for the diagnosis and drug control of E. tarda from P. fulvidraco.
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Keywords:
- Pelteobagrus fulvidraco /
- Edwardsiella tarda /
- Identification /
- Virulence gene /
- Drug sensitivity
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鱼类生长激素(growth hormone，GH)是由脑垂体细胞合成和分泌的一种单链多肽，其分子量在22 kDa左右，可分为信号肽和成熟肽2个部分，信号肽一般由16~17个氨基酸残基组成，成熟蛋白由173~190个氨基酸组成。GH对鱼类最明显的作用是刺激鱼体重和体长的增长，促进发育，参与鱼体代谢调节，还可以调节海河洄游性鱼类的渗透压，并促进其对海水适应能力[1]。GH不但可以作为激素对鱼类的生长发育和生殖起重要作用，而且可以作为一种细胞分裂素，在免疫反应起作用，同时还参与调节蛋白质，糖和脂肪等的合成和释放，从而影响蛋白质、糖和脂肪的代谢[2-4]。深入研究鱼类生长激素的表达调控规律，弄清鱼类生长发育的调控机理，可为人工调控鱼类生长发育，促进水产养殖业的发展提供理论依据。
鲮(Cirrhinus molitorella)隶属鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)中的野鲮亚科(Labeoninae)，广泛分布于中国华南地区，东南亚和非洲的热带及亚热带地区[5]。鲮是中国华南地区重要的淡水养殖品种之一，其产量占广东、广西池塘养殖鱼类总产量的35%左右，具有产量高、抗病力强和肉质鲜美的特点，其适合制作罐装食品和鱼丸，是中国淡水鱼加工附加值最高的品种之一。但是鲮生长速度慢，且不耐低温，是目前制约鲮养殖产业发展的因素之一。与哺乳动物类似，鱼类生长发育主要受GH-IGF(胰岛素样生长因子)的调控，深入开展鲮生长激素表达调控机理的研究，以便为人工控制鲮的生长发育提供理论依据。目前该试验室已克隆了鲮生长激素cDNA并在大肠杆菌中进行了重组表达。为进一步研究在各种条件下鲮血液和脑垂体中生长激素蛋白的表达规律，必须要制备特异性强、灵敏度高的抗鲮生长激素抗体。因此，该研究在重组表达了鲮生长激素蛋白的基础上，制备了兔抗鲮生长激素多克隆抗体，并对其灵敏度和特异性进行了分析。
1. 材料和方法
1.1 材料
重组工程菌M15(pQE30-GH)由笔者实验室构建，新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus)购于广州中医药大学实验动物中心，鲮鱼购于广州鹭江市场，镍琼脂糖凝胶FF填料购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司，HRP标记的羊抗兔IgG购于Amersham公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，其它试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 鲮生长激素的重组融合表达以及包涵体的分离
取含有500 mL LB(100 μg · mL-1 Amp和25 μg · mL-1 Km)及种菌的烧瓶，最佳诱导条件参照江世贵等[6]对鲮生长激素cDNA的克隆及其重组表达产物的促生长活性的研究。在37℃加入浓度为100 mmol · L-1的IPTG溶液使其终浓度1 mmol ·L-1 250 rpm振荡培养诱导5 h，4℃保存。菌体经超声波破碎后，4℃，8 000 rpm离心20 min，离心收集到的包涵体经TE1(Tris-Cl 10 mmol · L-1，pH 8.0，EDTA 1 mmol · L-1)，TE2[1%TritonX-100(V/V)，Tris-Cl 10 mmol · L-1，pH 8.0，EDTA 1 mmol · L-1]和TE3(尿素2 mol · L-1，Tris-Cl 10 mmol · L-1 pH 8.0，EDTA 1 mmol · L-1)洗涤后，即可得到初步纯化的包涵体蛋白，然后将包涵体蛋白溶解在变性液(尿素8 mol · L-1，Tris-Cl 20 mmol ·L-1 pH 8.0，0.5 mol · L-1 NaCl，5 mmol · L-1 imidazole，1 mmol · L-1 2-mercaptoethanol)中。
1.2.2 重组蛋白的纯化、复性和浓缩
经过包涵体分离得到的包涵体蛋白，在4℃，8 000 rpm离心10 min后，上清液用0.2 μm的过滤器过滤，然后上样经镍琼脂糖凝胶FF(装填后柱床长5 cm，直径1.6 cm)亲合层析。上柱后以含20 mmol · L-1，500 mmol · L-1的咪唑以及ddH2O进行阶段洗脱，流速1.5 mL · min-1，手工收集洗脱峰。将收集后的样品进行SDS-PAGE分析，同时将纯化后的蛋白用稀释变性液(尿素8 mol · L-1，Tris-Cl 20 mmol · L-1 pH8.0，0.5 mol · L-1 NaCl)稀释到1 mg · mL-1装入处理好的透析袋中，采用逐步稀释的方法复性。具体操作如下，将装有蛋白的透析袋放到等体积的复性液(氧化型谷胱甘肽0.1 mmol · L-1，还原型谷胱甘肽0.9 mmol · L-1，Tris-Cl 20 mmol ·L-1，pH 8.0)中，4℃搅拌过夜，使尿素浓度由4~2.5 mol · L-1，再到0.8 mol · L-1逐步稀释，然后在ddH2O(pH 8.0)透析过夜以除去剩余的变性剂。最后，将复性后的蛋白用超滤离心管过滤浓缩。
1.2.3 抗血清的制备
将浓缩后的重组鲮GH作为抗原，采用改进的方法[7]免疫新西兰大白兔。在第1天和第3天，将1 mL样品A(300 μg · 500 μL-1纯化浓缩蛋白和500 μL Freund′s完全佐剂)采用多点注射到兔子的背部和腿部；第28天将1 mL样品B(300 μg · 500 μL-1纯化浓缩蛋白和500 μL Freund′s不完全佐剂)加强免疫1次。第35天，颈动脉取血，37℃放置2 h，4℃过夜，离心收集血清。
1.2.4 ELISA分析
采用间接ELISA检测抗血清效价。用pH 9.6，0.05 mol · L-1的碳酸盐缓冲液将纯化的重组鲮生长激素稀释为20 μg · mL-1，包被酶标板，每孔100 μL，4℃包被过夜。次日每孔加入100 μL 5%的脱脂奶粉，37℃封闭1 h后，用pH 7.4的PBST洗涤3次。然后每孔加入200~51 200倍稀释的兔抗血清100 μL，阴性对照为1：50倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释液(PBS)，每份样品均做1平行，37℃孵育1 h后，同上洗涤3次。再次每孔加入100 μL HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h后，同上洗涤3次。接下来每孔加入100 μL TMB显色液，37℃避光反应20 min后，每孔再加入50 μL 2 mol · L-1硫酸终止液。最后，在酶标仪上测450 nm下的OD值。
1.2.5 Western blotting分析
将抗原稀释为0.5、1、2、4和10 ng，经15% SDS-PAGE电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上。用稀释度1：500的抗血清作为一抗[8]，比例1：2 000作为二抗稀释度，DAB显色。标准分子量蛋白质转膜后用丽春红染色液染色。
鲮组织提取物中GH同源蛋白质的检测。取100 mg脑垂体组织加入到100 μL抽提液(4 M Urea，0.5% W/V SDS，10 mM EDTA和2 mM PMSF)中匀浆，94℃孵育10 min，10 000 g离心10 min后，用Bradford方法进行定量测定[9-10]。取鲮血4℃，6 500 rpm离心20 min分离血清，同样用Bradford方法进行定量测定。分别取1 μg脑垂体提取蛋白和1 μg血清蛋白进行Western blotting分析。
2. 结果和讨论
2.1 鲮生长激素的重组融合表达以及包涵体的分离、纯化和浓缩
如图 1所示，IPTG可诱导M15(pQE30-GH)在大肠杆菌中大量表达。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示，1条24.5 kDa的诱导表达重组鲮GH带。经过包涵体分离、纯化、浓缩得到纯度很高的蛋白。
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图 1 鲮鱼生长激素的重组融合表达，包涵体的分离，纯化和浓缩电泳图M. 低分子量蛋白标准；1. IPTG诱导生长激素的表达；2. 生长激素表达负对照；3. M15(pQE30)诱导表达；4. 包涵体分离后电泳图；5. 包涵体纯化后电泳图；6. 纯化蛋白浓缩后电泳图Fig. 1 The electrophoresis map of the recombinant expression and purification of mud carp growth hormoneM. low molecular weight protein marker; 1. the growth hormone induced by IPTG; 2. growth hormone expressed negative control; 3. M15(pQE30)expressed; 4. inclusion body; 5. purified inclusion body; 6. condensed protein2.2 ELISA分析结果
兔抗鲮生长激素的血清进行间接ELISA检测时，当(样品吸光值－空白吸光值)/(阴性吸光值－空白吸光值)＞2.1即认为是阳性[11]，经计算，此研究制备的兔抗血清效价为1 : 12 800(表 1)。
表 1 ELISA检测结果Table 1 The results of ELISA免疫血清稀释倍数
the antiserum dilution times免疫血清OD450
the antiserum OD450阴性对照血清OD450
normal rabbit serum OD450空白对照OD450
black control OD450P/N 1:200 1.186 0.336 0.175 + 1:400 1.138 0.336 0.175 + 1:800 1.180 0.336 0.175 + 1:1 600 1.029 0.336 0.175 + 1:3 200 0.872 0.336 0.175 + 1:6 400 0.656 0.336 0.175 + 1:12 800 0.533 0.336 0.175 + 1:25 600 0.464 0.336 0.175 － 1:51 200 0.379 0.336 0.175 － 2.3 Western blotting分析结果
将抗原稀释为0.5、1、2、4和10 ng，经15% PAGE电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜上。用稀释度1：500的抗血清作为一抗，比例1：2 000作为二抗稀释度，DAB显色。标准分子量蛋白质转膜后用丽春红染色液染色。结果显示，可检测到10 ng抗原量，表明此抗体灵敏度较高(图 2)。
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图 2 抗体灵敏度分析M. 低分子量蛋白标准；1. 10 ng抗原；2. 4 ng抗原；3. 2 ng抗原；4. 1 ng抗原；5. 0.5 ng抗原Fig. 2 The antibody sensitivety analysisM. low molecular weight protein marker; 1. 10 ng antigen; 2. 4 ng antigen; 3. 2 ng antigen; 4. 1 ng antigen; 5. 0.5 ng antigen为了解这一抗血清的特异性，取鲮脑垂体组织和血清进行Western blotting分析。结果显示，用此多抗可检测到1条大约为21.5 kDa的条带(图 3)，这说明这一多抗具有较好的免疫特性。
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图 3 抗体特性性分析M. 低分子量蛋白标准；1. 血清；2. 脑组织Fig. 3 The antibody specificity analysisM. low molecular weight protein marker; 1. serum; 2. pituitary此试验所表达的重组鲮生长激素主要以包涵体形式存在。另外，包涵体中的杂蛋白较少、且50%以上为重组蛋白，给重组蛋白的纯化带来便利。经过3次TE缓冲液洗涤，包涵体达到了较好的纯化效果，洗涤后重组蛋白纯度达到85%以上。初步纯化后的包涵体重组蛋白经镍琼脂糖凝胶FF亲和层析后，由含20 mmol · L-1，500 mmol · L-1的咪唑以及ddH2O进行阶段洗脱，进一步纯化该重组蛋白，纯度可达到95%以上。由于GH基因内Cys含量较高，分子内可形成2个二硫键，在复性时容易形成蛋白质聚集体，所以笔者利用GSH/GSSG氧化交换系统促使二硫键的正确配对，同时采用稀释复性和透析复性相结合的方式对纯化蛋白进行复性。在复性过程中融合蛋白的再聚合是令人棘手的问题。姚燕等[12]中华绒鳌蟹(Eriocheir japonica sinensis)蜕皮抑制激素基因的表达及抗体制备研究表明在可在复性液中加入甘油增加粘度来减少蛋白分子间的相互作用，从而阻止透析复性过程中蛋白的再聚合，并且L-精氨酸作为小分子促溶剂，使整个透析过程中蛋白的聚合几率降到最低。张傅山等[13]研究表明在复性液中加入10%无水乙醇可提高复性效率。另外，蛋白质浓度也是影响蛋白质复性的重要因素。当蛋白浓度超过1 mg · mL-1时，即使复性液中加入甘油和L-精氨酸，复性后透析时仍会出现浑浊现象。笔者在试验中并没有加入促溶剂，直接将纯化后的蛋白用复性稀释液稀释到1 mg · mL-1再进行复性也得到了较好的复性效果。
经过包涵体分离的蛋白通过镍琼脂糖凝胶FF填料来分离带His标签的重组蛋白，其纯度可达95%以上。分离纯化的蛋白质大小为24.5 kDa，这比GH成熟蛋白大了约3 kDa左右，这是因为6xHis标签的分子量约为3 kDa，而GH成熟蛋白的分子量约为22 kDa，所以该蛋白质带大小与预期大小一致。纯化的方法有很多，此试验采用的是亲和层析，该纯化方法简便，分离效果好，其纯化产物可达95%以上，且经过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色呈现均一的1条带。这说明该纯化产物可用于抗体的制备和后续的生化实验的需要。
用经改良的方法进行免疫新西兰大白兔，经过35 d免疫注射后，用间接ELISA方法检测其抗体滴度为12 800，可以用来Western blotting分析。用改良后的方法来免疫新西兰大白兔在时间上由原来的3~4个月缩短到35 d，大大缩短了制备高效抗血清的时间，且所制备抗血清均能用于ELISA和Western blotting分析。胡志红等[14]用改良的方法制备了猴(Macaca mulatta)Esc-615基因多克隆抗体的制备，其抗血清滴度达到100 000。冯浩等[8]制备了青鱼(Mylopharyngodon piceus)生长激素多克隆抗血清也能用于ELISA和Western blotting分析。从而表明了上诉方法制备抗鲮GH的多克隆抗体不仅简便，而且行之有效，可为生长激素活性及功能的研究提供有效免疫学鉴定工具。
此试验制备的兔抗鲮生长激素多克隆抗体，经ELISA检测其滴度为12 800，经Western blotting分析，可以检测到10 ng的抗原量，而且可以在脑垂体提取物和血清中检测到大小为21.5 kDa的蛋白质，充分说明该抗体具有较强的灵敏性和免疫原性，为进一步研究在不同条件下鲮血液和脑垂体中生长激素蛋白的表达规律奠定了基础。
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图 1 自然患病黄颡鱼临床症状
注：a. 鳍条基部充血；b. 腹部膨大、眼球突出；c. 肛门红肿；d. 有腹水、内脏出血。
Figure 1. Clinical signs of naturally diseased P. fulvidraco
Note: a. Hyperemia at the base of the fin rays; b. Abdominal enlargement, exophthalmos; c. Redness and swelling of the anus; d. Ascites, internal bleeding.
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图 2 菌株ET230818的菌落形态
注：a. 培养基生长形态；b. 革兰氏染色镜检 (100×)。
Figure 2. Colony morphology of strain ET230818
Note: a. Medium growth morphology; b. Gram's staining microscopy (100×).
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图 3 菌株16S rRNA、gyrB、cpn60和rpoB基因扩增结果
注：M. DL2000 DNA marker；1、3、5、7为对照组；2、4、6、8分别为 16S rRNA、 gyrB、rpoB、cpn60。
Figure 3. Gene amplification results of Strain 16S rRNA, gyrB, cpn60 and rpoB
Note: M. DL2000 DNA marker; 1, 3, 5, 7. Control group; 2. 16S rRNA; 4. gyrB; 6. rpoB; 8. cpn60.
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图 4 基于菌株ET230818的16S rRNA基因所构建的系统发育树
Figure 4. Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene of ET230818
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图 5 基于菌株ET230818的gyrB、rpoB、cpn60联合基因所构建的系统发育树
Figure 5. Phylogenetic tree based on gyrB, rpoB and cpn60 genes of ET230818
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图 6 迟缓爱德华细菌ET230818菌株的毒力基因检测
注：M. DL2000 DNA marker；1、3、5、7、9、11和13为对照组；2、4、6、8、10、12、14分别为sodB、katB、esrB、gadB、fimA、citC、mukF。
Figure 6. Virulence gene detection of ET230818 strain of E. tarda
Note: M. DL2000 DNA marker; 1, 3, 5, 7, 9, 11 and 13 were control group; 2. sodB; 4. katB; 6. esrB; 8. gadB; 10. fimA; 12. citC; 14. mukF.
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图 7 健康黄颡鱼和患病黄颡鱼组织病理学观察
注：a. 健康鱼肝脏 (40×)；b. 箭头位置患病鱼肝脏中央静脉扩张 (100×)；c. 健康鱼脾脏 (40×)；d. 箭头位置患病鱼脾脏出现大范围含铁血黄素聚集 (40×)；e. 健康鱼肾脏 (100×)；f. 箭头位置患病鱼肾小管管腔阻塞 (100×)；g. 健康鱼肠 (40×)；h. 箭头位置患病鱼肠上皮细胞排列紊乱、坏死、破碎、脱落 (40×)；i. 健康鱼胃 (40×)；j. 箭头位置患病鱼胃黏膜坏死、破碎、脱落于胃腔中，肌层纤维呈空泡状排列紊乱 (40×)；k. 健康鱼鳃 (40×)；l. 箭头位置患病鱼鳃小片弯曲，上皮细胞杂乱无序、少量细胞脱落 (40×)。
Figure 7. Histopathological observation of healthy and diseased P. fulvidraco
Note : a. Healthy P. fulvidraco liver (40×); b. Dilatation of central liver vein in diseased P. fulvidraco (Arrow) (100×); c. Healthy P. fulvidraco spleen (40×); d. Extensive accumulation of hemosiderin in the spleen of diseased P. fulvidraco (Arrow) (40×); e. Healthy P. fulvidraco kidney(100×); f. Obstruction of renal tubule in diseased P. fulvidraco (Arrow) (100×); g. Healthy P. fulvidraco intestine (40×); h. Intestinal epithelial cells of diseased P. fulvidraco were disordered, necrotic, broken and shed (Arrow) (40×); i. Healthy P. fulvidraco stomach (40×); j. The gastric mucosa of diseased P. fulvidraco was necrotic, broken and detached in the stomach cavity, and the muscular fibers were arranged in a vacuolar pattern (Arrow) (40×); k. Healthy P. fulvidraco gills (40×); l. The gill plates of diseased P. fulvidraco were curved, the epithelial cells were disordered and a few cells fell off (Arrow) (40×).
表 1 各目的基因的退火温度及片段大小
Table 1 Annealing temperature and fragment size of each target gene
目的基因
Target DNA引物
Primer退火温度
Annealing temperature/℃片段大小
Fragment size/bp参考文献
Reference16S rRNA 27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT55.0 1407 [17] gyrB gyrB-F: GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA
gyrB-R: AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC61.3 1042 [18] rpoB rpoB-F: GAAAGACCAGGAACGGATCA
rpoB-R: AGGTCGTCACGGTAACAAGG54.1 1003 [19] cpn60 cpn60-R: GAAATTGAACTGGAAGACAA
cpn60-F: GTTGCTTTTTCCAGCTCCA56.0 740 [20] sodB sodB-F: ATGTCATTCGAATTACCTGC
sodB-R: TCGATGTAATAAGCGTGTTCCCA53.0 490 [21] katB katB-F: GATGCGATCAAGTTCCCGGA
katB-R: ACCTGGATGTACAGATCCCAT54.7 377 [15] esrB esrB-F: GATCATGCCTTGCTAGCC
esrB-R: TCGGCGACCAGCTTGAGA53.3 454 [22] gadB gadB-F: ATTCCCGCTTTGGTTCAGA
gadB-R: GGAGGAGCCGATAGTATTGGTA53.5 308 GenBank AY078505 fimA fimA-F: ACAGCCTGGAAGAGTCCTAC
fimA-R: TTGAGAGTCGCTGCTTAC51.8 839 [23] citC citC-F: TTTCCGTTTGTGAATCAGGTC
citC-R: AATGTTTCGGCATAGCGTTG53.0 553 [24] mukF mukF-F: TTTGGACGGTGAAATGAGC
mukF-R: CGTTGCGGTGCCAGTGAA54.0 303 GenBank AY078510 
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表 2 菌株ET230818的生化鉴定
Table 2 Biochemical identification of strain ET230818
生化项目
Biochemical itemET230818 标准菌株
Standard strain生化项目
Biochemical itemET230818 标准菌株
Standard strain接触酶Contact enzyme + + 蔗糖Sucrose − − 氧化酶Oxidase − − 海藻糖Trehalose − − β-半乳糖苷酶 β-Galactosidase − − 柠檬酸盐Citrate + − 葡萄糖产气 Glucose production + + 葡萄酸盐Gluconate − − KCN试验KCN test − − 丙二酸盐Maltose − − 粘酸盐Clay acid salt − − d-酒石酸盐D-tartrate − − 硝酸盐还原 Nitrate reduction + + M.R (Methyl-Red test) + + 阿东醇Ribitol − − V.P (Voges-Proskauer test) − − 阿拉伯糖Arabinose − − 精氨酸Arginine − − 卫矛醇Galactitol − − 明胶水解Gelatin hydrolysis − − 七叶灵Esculin − − H2S试验 Hydrogen sulfide test + + 木糖Xylose − − 吲哚Indole + + 肌醇Inositol − − 赖氨酸脱羧 Lysine decarboxylation + + 麦芽糖Maltose + + 鸟氨酸脱羧Ornithine decarboxylation + + 甘露醇Mannitol − − 尿素水解Urea hydrolysis − − 柳醇Saligenin − − 谷氨酸Glutamic acid − − 山梨醇Sorbitol − − 苯丙氨酸Phenylalanine − −
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表 3 菌株ET230818的人工感染试验结果
Table 3 Artificial infection test results of strain ET230818
菌量
Concentration/
(CFU·mL−1)注射剂量
Injection dose/mL试验数
Number of tests观察时间及死亡数量
Observation time and number of deaths死亡总数
Total deaths/尾累积死亡率
Cumulative
mortality/%1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 1.0×109 0.2 30 23 7 0 0 0 0 0 30 100 1.0×108 0.2 30 9 11 4 1 0 0 0 25 83.3 1.0×107 0.2 30 0 9 6 3 1 1 0 20 66.7 1.0×106 0.2 30 0 6 3 2 1 1 0 13 43.3 1.0×105 0.2 30 0 0 2 1 1 1 0 5 16.7 0.65% (w) NaCl 0.2 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0.0
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表 4 菌株ET230818的抗菌药物敏感性试验
Table 4 Antimicrobial susceptibility test for strain ET230818
抗菌药物
Antibacterial drug药物名称
Drug判断标准
Assessment criteria/mm抑菌圈直径
Diameter of inhibition/mm敏感性
SensitivityR M S 大环内酯类
Macrolides group红霉素 ≤13 14~16 ≥23 10.4 R 麦迪霉素 ≤13 14~17 ≥18 0.0 R 利福平 ≤16 17~19 ≥20 22.4 S β-内酰胺类
β-lactam group头孢他啶 ≤14 15~17 ≥18 0.0 R 头孢哌酮 ≤15 16~20 ≥21 17.4 M 氨曲南 ≤15 16~21 ≥22 0.0 R 青霉素 ≤19 20~27 ≥28 8.7 R 头孢氨苄 ≤14 15~17 ≥18 15.0 M 头孢曲松 ≤25 25~26 ≥27 14.5 R 羧苄西林 ≤19 20~22 ≥23 8.1 R 哌拉西林 ≤17 18~20 ≥21 27.8 S 四环素类
Tetracyclines group四环素 ≤14 15~20 ≥21 15.9 M 多西环素 ≤12 13~15 ≥16 28.9 S 米诺环素 ≤14 15~17 ≥18 27.6 S 硝基呋喃类
Nitrofurans group呋喃唑酮 ≤14 15~16 ≥17 16.3 M 呋喃妥因 ≤14 15~16 ≥17 15.9 M 磺胺类
Sulfonamides group复方新诺明 ≤23 24~32 ≥33 0.0 R 磺胺异恶唑 ≤14 15~23 ≥24 8.4 R 氨基糖苷类
Aminoglycosides group庆大霉素 ≤12 13~14 ≥15 24.6 S 妥布霉素 ≤12 13~14 ≥15 22.0 S 新霉素 ≤12 13~16 ≥17 19.1 S 丁胺卡那 ≤14 15~16 ≥17 22.3 S 卡那霉素 ≤13 14~17 ≥18 17.8 S 喹诺酮类
Quinolones group恩诺沙星 ≤12 13~15 ≥16 24.6 S 培氟沙星 ≤23 24~25 ≥26 19.0 M 氧氟沙星 ≤12 13~16 ≥17 21.4 S 环丙沙星 ≤15 16~20 ≥21 16.9 M 吡哌酸 ≤21 22~28 ≥29 13.2 R 左氧氟沙星 ≤13 14~16 ≥17 23.1 S 氯霉素类
Chloromycetins group氯霉素 ≤12 13~17 ≥18 32.1 S 氟苯尼考 ≤12 13~17 ≥18 26.6 S 其他抗菌药物
Other antibacterial drugs杆菌肽 ≤8 9~12 ≥13 0 R 多粘菌素B ≤8 9~11 ≥12 9.4 M 注：R. 耐药；M. 中度敏感；S. 高度敏感。 Note: R. Resistant; M. Moderate sensitive; S. Highly sensitive.
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表 5 各抗菌药物对菌株ET230818的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度
Table 5 MIC and MBC of antibacterial drugs on strain ET230818
药物名称
Drug最小抑菌浓度
MIC/(μg·mL−1)最小杀菌浓度
MBC/(μg·mL−1)多西环素Doxycycline 1 16 恩诺沙星Enrofloxacin 1 16 氟苯尼考 Florfenicol 2 32 新霉素Neomycin 32 128
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表 6 中草药提取液对菌株ET230818的抑菌效果
Table 6 Antibacterial effect of Chinese herbal medicines on strain ET230818
中草药名称
Chinese herbal medicine抑菌圈直径
Diameter of inhibition/mm抑菌等级
Sensitivity最小抑菌浓度
MIC/(mg·mL−1)最小杀菌浓度
MBC/(mg·mL−1)丁香 Syzygium aromaticum 25.66±0.46 ++++ 1.95 3.91 山楂 Fructuscrataegi 24.35±0.15 ++++ 3.91 3.91 诃子 Terminalia chebula 22.48±0.48 ++++ 0.98 1.95 石榴皮 Punica granatum 22.14±0.30 ++++ 3.91 3.91 玫瑰花 Rosa rugosa 21.78±0.44 ++++ 0.98 1.95 五倍子 Galla chinensis 20.84±0.34 ++++ 7.81 15.63 乌梅 Prunnus mume 18.41±0.11 +++ 15.63 31.25 五味子 Schisandra chinensis 14.68±0.44 ++ 125.00 125.00 夏枯草 Prunella vulgaris 14.58±0.48 ++ >250.00 >250.00 虎杖 Polygonum cuspidatum 13.88±0.26 ++ 250.00 250.00 香加皮 Periploca sepium 13.62±0.44 ++ 125.00 250.00 牡丹皮 Paeonia suffruticosa 13.14±0.08 ++ 125.00 250.00 白头翁 Pulsatilla chinensis 12.79±0.21 ++ 250.00 250.00 鸡血藤 Polygala tenuifolia 12.36±0.24 ++ 125.00 125.00 大黄 Rheum palmatum 12.02±0.38 ++ 62.50 62.50 鹿衔草 Pyrola calliantha 12.01±0.51 ++ 62.50 125.00 柴胡 Bupleurum chinense 11.75±0.23 ++ 125.00 125.00 防风 Saposhnikovia divaricata 9.74±0.24 + 决明子 Cassia obtusifolia 9.57±0.35 + 黄芩 Sastellaria baicalensis 9.53±0.32 + 女贞子 Ligustrum lucidum 9.44±0.18 + 白芍 Angelica dahurica 9.37±0.26 + 当归 Angelica sinensis 9.03±0.21 + 独活 Heracleum hemsleyanum Diels 8.54±0.52 + 龙胆草 Gentiana scabra 8.32±0.64 + 白芷 Angelica dahurica 8.28±0.26 + 桑树叶 Morus alba Linn 7.89±0.10 + 何首乌 Fallopia multiflora 0.00 − 石斛 Dendrobium sp. 0.00 − 陈皮 Citrus reticulata Blanco 0.00 − 厚朴 Magnolia officinalis 0.00 − 栀子 Gardenia jasminoides 0.00 − 肉桂 Cinnamomum cassia Presl 0.00 − 苦参 Sophora flavescens 0.00 − 艾叶 Artemisia argyi Levl 0.00 − 川楝子 Toosendan fructus 0.00 − 青蒿 Artemisia annua 0.00 − 干姜 Zingiberis rhizoma 0.00 − 蒲公英 Taraxacum mongolicum 0.00 − 合欢皮 Albizia julibrissin Durazz. 0.00 − 党参 Codonopsis pilosula 0.00 − 茯苓 Wolfiporia cocos 0.00 − 重楼 Paris polyphylla 0.00 − 板蓝根 Isatis tinctoria 0.00 − 地榆 Sanguisorba officinalis 0.00 − 葛根 Radix Puerariae 0.00 − 黄柏 Cortex Phellodendri 0.00 − 草果 Amomum tsaoko 0.00 − 菊花 Chrysanthemum morifolium 0.00 − 蛇床子 Cnidium Monnier 0.00 − 姜黄 Curcuma longa 0.00 − 射干 Belamcanda chinensis 0.00 − 地肤子 Kochiae fructus 0.00 − 紫荆 Cercis chinensis 0.00 − 羌活 Notopterygium incisum 0.00 − 金银花 Lonicera japonica 0.00 − 三七 Radix Notoginseng 0.00 − 青皮 Vatica mangachapoi 0.00 − 玉竹 Polygonatum odoratum 0.00 − 鱼腥草 Houttuynia cordata 0.00 − 注：++++. 抑菌作用极强；+++. 抑菌作用强；++. 抑菌作用中等；+. 抑菌作用弱；−. 无抑菌作用。 Note: ++++. Very strong antibacterial effect; +++. Strong antibacterial effect; ++. Moderate antibacterial effect; +. Weak antibacterial effect; −. No antibacterial effect.
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