Isolation, identification and drug sensitivity of Edwardsiella tarda from Pelteobagrus fulvidraco
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摘要:
为确定重庆市荣昌区某养殖场黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco) 疾病爆发的原因，从患病黄颡鱼肝脏中分离到一株优势菌，命名为ET230818。通过形态学观察、生理生化鉴定和16S rRNA、gyrB、rpoB、cpn60基因序列分析确定ET230818为迟缓爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda)。通过人工感染试验计算出菌株ET230818对黄颡鱼 [平均体质量 (17.5±2.5) g、平均体长 (15.0±1.2) cm] 的半数致死量 (LD50) 为2.51×106 CFU·mL−1。毒力基因检测结果显示，该菌株携带sodB、katB、esrB、gadB、fimA、citC和mukF毒力基因。组织病理学观察发现，患病黄颡鱼肝细胞排列杂乱、肿胀，脾组织中含血铁黄素聚集，肾小管收缩变窄且结构松散、萎缩；肠道黏膜细胞排列杂乱、坏死脱落，肠绒毛崩解，鳃小片明显变性弯折。抗菌药物敏感性试验与中草药抑菌试验发现，菌株ET230818对多西环素、恩诺沙星等11种抗菌药物高度敏感，丁香、五倍子等中草药对其具有较强的抑菌效果，研究可为黄颡鱼源迟缓爱德华氏菌的诊断和药物防治提供参考依据。
Abstract:To determine the cause of Pelteobagrus fulvidraco's disease outbreak on a breeding farm in Rongchang, Chongqing, we isolated a dominant bacterium from the liver of diseased fish and named it as ET230818. Based on morphological observation, physiological and biochemical identification and through the analysis of 16S rRNA, gyrB, rpoB and cpn60 gene sequences, we confirmed ET230818 as Edwardsiella tarda. The artificial infection experiment finds out the median lethal dose (LD50) of strain ET230818 to P. fulvidraco [Average body mass of (17.5±2.5) g, average body length of (15.0±1.2) cm] was 2.51×106 CFU·mL−1. Virulence gene test results show that the strain carried sodB, katB, esrB, gadB, fimA, citC and mukF virulence genes. Histopathological observation reveals that the infected P. fulvidraco had disordered and swollen hepatocytes, with hemosiderin concentration in spleen tissue; the renal tubules contracted and narrowed, and the structure of the renal tubules became loose and atrophied; the arrangement of intestinal mucosal cells was disorderly, necrotic and shedding; the intestinal villi disintegrated; and the branchial lamella was obviously deformed and bent. The antimicrobial susceptibility test and Chinese herbal antibacterial experiment show that strain ET230818 was highly sensitive to 11 western medicines such as Doxycycline and Enrofloxacin, and Chinese herbs like Syzygium aromaticum and Galla chinensis had strong bacteriostatic effects on E. tarda. This study can provide references for the diagnosis and drug control of E. tarda from P. fulvidraco.
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Keywords:
- Pelteobagrus fulvidraco /
- Edwardsiella tarda /
- Identification /
- Virulence gene /
- Drug sensitivity
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食物的消耗与脊椎动物包括鱼类的胃容量直接相关，鱼类的胃排空情况反映了其摄食后的胃饱满程度和消化吸收的时空间隔，有助于充分了解鱼类的摄食频率、日摄食量和能量收支等情况。胃排空率 (Gastric evacuation rate, GER) 是指动物摄食后食物从胃排至肠道的速率或胃内容物质量占总摄食量百分比的下降比例[1]，直接反映了鱼类的消化功能和食物的可消化性，同时间接影响了鱼类的食欲恢复进程[2]。在鱼类食欲高峰期投喂可提高饲料转化效率，促进其生长发育，节本降耗，提高养殖生产效能。研究发现，在16:00—20:00投喂许氏平鲉 (Sebastes schlegelii) 仔、稚鱼能有效提高其饵料利用率[3]；锈色黄盖鲽 (Limanda ferruginea) 幼鱼在上午的摄食量明显高于下午[4]，在大西洋鲷 (Sparusaurata) 和虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 的摄食投喂研究中也得到类似结果[5-6]。胃排空除了受鱼类自身生理状况影响外，还与种属、摄食水平、饲养温度、生活习性、饥饿时间及饲料种类等因素密切相关[7]。鱼类的胃排空方式复杂多样，主要包含直线下降型、先快后慢型和先慢后快再慢型3种，不同食性鱼类的胃排空方式差异较大，所对应的数学拟合模型也不相同。通过数学模型拟合最佳胃排空方式，可进一步了解其食欲恢复程度，当前较为常用的有平方根模型、线性模型和立方模型。因此，系统分析鱼类胃排空过程，查明GER，构建最佳胃排空数学模型，将有助于制定和优化养殖鱼类的投喂策略。
鱼类食欲主要受中枢神经系统调控，中枢神经细胞感受血液中葡萄糖或脂类浓度的变化后，通过神经元信号传递，刺激下丘脑分泌摄食或抑食因子调控摄食行为，以满足鱼类的营养需求[8]。而消化则是由消化腺分泌各种消化酶来完成，主要包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等，消化酶的活性反映了机体对营养物质的吸收和利用能力，从而决定了鱼类的胃排空类型。消化酶在摄食消化过程中扮演重要角色，淀粉酶参与葡萄糖代谢，脂肪酶参与脂质合成，蛋白酶指示生物体如何利用蛋白质，因此食物的营养成分差异显著影响了鱼类的消化酶活性。研究发现，高碳水化合物日粮可提高淀粉酶、脂肪酶和糜蛋白酶的活性[9]。同时消化酶活性反映了在特定生境条件下的摄食、生理状况和营养状态，其活性直接影响了鱼类对营养物质的吸收利用程度，决定了鱼类的胃排空类型[10]。
大泷六线鱼 (Hexagrammos otakii) 俗称“黄鱼”，为冷温性海洋鱼类，全年生活在沿岸及岛屿的岩礁附近，属于典型的恋礁鱼类，在中国主要分布于黄海、渤海海域。大泷六线鱼的肉质细嫩、鲜美，有“北方石斑”之称，经济价值较高，深受广大消费者和养殖者青睐。目前大泷六线鱼的养殖方式主要以深水网箱养殖为主，也有少量室内工厂化循环水养殖，饲料营养是影响其生长性状的重要因素之一，而适宜的投喂频率是提高其养殖生产效能的重要前提，一方面可有效节省饲料投入，另一方面可显著提高养殖群体的生长性状，显著影响大泷六线鱼的成活率、饲料转化率和生长率。目前，对大泷六线鱼的研究主要集中在繁殖学[11]、疾病学[12]、生理特性、形态和行为学[13]及苗种培育等方面；在生理特性方面，主要研究了温度和盐度对大泷六线鱼生长与存活的影响[14]，对其摄食投喂的研究鲜有报道。基于此，本研究通过明确大泷六线鱼摄食后的胃排空特征，比较平方根模型、立方模型和线性模型对大泷六线鱼胃排空曲线的拟合程度，得出其胃排空最佳数学模型；同时评价了大泷六线鱼胃排空过程中肠道和肝脏消化酶 (淀粉酶、糜蛋白酶和脂肪酶) 活性、血清葡萄糖、皮质醇含量的变化，分析其变化规律，并解析出了大泷六线鱼胃排空与相关消化酶活性变化之间的关系；进而有助于准确预测其最佳投喂时间间隔及次数并提高饲料利用效率，为进一步实现大泷六线鱼的高效养殖提供理论依据和数据支撑。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验用大泷六线鱼 (1龄) 由烟台开发区天源水产有限公司提供，共96尾，平均体质量为 (73.19±6.68) g，平均体长为 (17.63±2.14) cm。实验前将实验鱼置于3个实验水槽中 (1.5 m×1.0 m×0.5 m) 暂养1周，使其适应养殖环境，暂养期间保持流水正常，溶氧充足，暂养水温 (17±1) ℃、盐度30‰、pH 7.85、溶解氧质量浓度>7 mg·L−1、氨氮质量浓度<0.1 mg·L−1，自然光照610~630 lx。每天饱食投喂商品化颗粒饲料2次 [新大海，日本林兼产业株式会社，质量分数：粗蛋白≥48%，粗脂肪≥10%，粗灰分≤17.0%，钙 (Ca)≤4.0%，赖氨酸≥2.5%，总磷≥1.5%~3.0%]。
1.2 实验设计与取样
实验鱼暂养1周后开始进行实验 (饲养条件如上所述)，开始实验前禁食24 h，保证消化道完全排空。实验开始时，上午9:00用商品颗粒饲料进行一次性饱食投喂，投喂1 h后清除残饵。在投喂后的第0、第3、第6、第9、第12、第15、第18和第21 小时依次从每个养殖水槽中随机取2尾鱼，共6尾，采用MS-222 (200 mg·L−1) 深度麻醉，尾静脉采血，解剖收集胃内容、肝脏和肠道组织样本。血液置于1.5 mL的EP管中，4 ℃下静置1 h，待血液分层后，4 ℃条件下3 000 r·min−1离心10 min，取上清于 −80 ℃保存[15]，用于血清皮质醇和葡萄糖含量测定。解剖取出胃，用滤纸吸干胃表面水分并称质量，然后将胃内容物清洗干净，滤纸吸干、称质量，所得质量量差即为胃内容物质量 (湿质量)；收集肝脏和中肠组织，−80 ℃下保存，用于检测脂肪酶、淀粉酶和糜蛋白酶活性。
1.3 指标检测
1.3.1 消化酶活性检测
准确称取肝脏和肠组织，置于1.5 mL EP管中，按照质量 (g)∶体积 (mL)=1∶9的比例加入生理盐水，冰浴条件下进行机械匀浆，匀浆后4 ℃下3 000 r·min−1 离心10 min，取上清用生理盐水以1∶9的比例稀释成1% 的组织匀浆备用。肝脏和肠组织总蛋白浓度，淀粉酶、糜蛋白酶、脂肪酶活性均采用南京建成公司试剂盒检测，实验步骤参照说明书进行，分别在波长为595、540、660和580 nm下用多功能酶标仪 (上海闪谱，SuPerMax 3100) 进行吸光值测定。
1.3.2 血清中葡萄糖和皮质醇含量测定
血清中的葡萄糖含量采用南京建成公司试剂盒检测，血清中的葡萄糖经葡萄糖氧化酶的作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶的作用下，将还原性4-氨基安替比林与酚偶联缩合成一种在505 nm下可被多功能酶标仪测定的醌类化合物，单位为mmol·L−1。血清中皮质醇含量采用竞争法检测，向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本，再加入生物素标记的识别抗原，在37 ℃下孵育30 min，经PBST洗涤5次后，加入亲和素HRP，37 ℃下再孵育30 min，洗涤后加入显色液，37 ℃显色10 min，再加入终止液，在450 nm波长下检测吸光值，单位为ng·mL−1。
1.4 GER计算和模型的建立
大泷六线鱼胃内容物残余百分比计算公式为：
$$ \mathrm{GER}{\mathrm{=}} \mathit{W} _{ \mathrm{0}} \mathrm{/} \mathit{W} _{ \mathrm{1}} \mathrm{\times 100{\text{%}} } $$ (1) 式中：GER为不同取样时间胃内容物质量占总摄食量的百分比；W0为不同取样时间胃内容物的质量；W1为实验鱼饱食状态下的总摄食量。
计算得出大泷六线鱼剩余胃内容物比例后可用平方根模型、立方模型和线性模型拟合验证。各数学模型公式为：
$$ \mathrm{线性模型：} \mathit{Y} \mathrm{=A} {\text{−}}{\mathrm{B}}\mathit{t} $$ (2) $$ \mathrm{平方根模型：} \mathit{Y} \mathrm{=A} \mathit{t} ^{ \mathrm{2}} {\text{−}}\mathrm{B} \mathit{t} \mathrm{+C} $$ (3) $$ \mathrm{立方模型：} \mathit{Y} \mathrm{=A} \mathit{t} ^{ \mathrm{3}} {\text{−}}\mathrm{B} \mathit{t} ^{ \mathrm{2}} {\text{−}}\mathrm{C} \mathit{t} \mathrm{+D} $$ (4) 式中：Y为剩余胃内容物的质量 (湿质量)；A、B、C、D为常数；t为摄食后的时间 (h)。
采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 9.5软件进行数据统计分析及绘图。通过比较分析3种拟合模型的相关系数 (r2)、残差标准差 (SDR)、残差平方和 (RSS) ，确定大泷六线鱼的最佳胃排空模型。
以连续2次取样胃内容物含量之差 (St) 的自然对数值与所对应的取样时间 (t) 进行线性回归，其方程为：
$$ \mathrm{ln} {S} _{ \mathit{t} } {\mathrm{=}} \mathit{at} \mathrm+ \mathit{b} $$ (5) 式中：所得线性方程的斜率a即为大泷六线鱼的瞬时胃排空率。
1.5 数据分析
对实验数据进行均一化处理，所得结果均以“平均值±标准差 ($\bar x $±s)”表示，以SPSS 22.0软件进行单因素方差分析 (One-way ANOVA) 和Duncan氏多重比较及Pearson相关性分析，显著性水平α为0.05。3种数学模型的参数A、B、C、D均由GraphPad Prism 9.5统计软件进行曲线拟合得到。
2. 结果
2.1 大泷六线鱼的胃排空特征
大泷六线鱼饱食投喂后，其胃内容物含量百分比随时间变化呈逐渐下降的趋势 (图1)，在摄食后6 h内，胃内容物百分比迅速降低，由100% 降至60.31% (p<0.05)；摄食后6~12 h，胃内容物百分比下降速率变缓 (p<0.05)；在摄食后第12 小时，胃内容物百分比下降速率再次加快，到第18小时后胃内容物百分比降低到2.3% (p<0.05)，胃内容物基本排空，属于典型的直线下降类型。
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图 1 大泷六线鱼胃排空变化注：显著性差异用小写字母表示 (p<0.05, n=9)。Figure 1. Changes of gastric evacuation of H. otakiiNote: Significant differences are represented by lowercase letters (p<0.05, n=9).2.2 大泷六线鱼的胃排空模型
利用GraphPad Prism 9.5对大泷六线鱼的胃排空数据与相关数学模型进行拟合，发现线性模型、平方根模型和立方模型均能很好地拟合大泷六线鱼的胃排空数据 (图2)。相关系数r2为立方模型>平方根模型>线性模型；残差平方和 (RSS) 和残差标准差 (SDR) 均为线性模型>平方根模型>立方模型；综合r2、RSS、SDR结果发现立方模型对大泷六线鱼胃排空率的拟合程度最佳 (表1)，其公式为y=0.008x3−
0.1964 x2−4.0808 x+99.163，根据公式可得，80% 胃排空时间约为15 h，投喂后第19.7 小时，胃内容物完全排空。![]()
图 2 大泷六线鱼胃排空曲线的3种数学模型拟合Figure 2. Fitting with three types of mathematical models for gastric emptying of H. otakii表 1 大泷六线鱼胃排空曲线3种数学模型拟合Table 1. Fitting with three types of mathematical models for gastric emptying of H. otakii模型Model 公式 Equation 相关系数r2 残差平方和RSS 残差标准差SDR 线性模型Linear model y=−4.508 2x+95.19 0.957 5 487.268 1 7.804 391 平方根模型Square root model y=0.090 3x2− 6.6756 x+102.780.975 2 283.569 3 5.953 668 立方模型Cubic model y=0.008x3−0.196 4x2−4.080 8x+99.163 0.981 0 217.766 5 5.217 356 2.3 大泷六线鱼消化酶活性
大泷六线鱼饱食投喂后0~21 h，肝脏淀粉酶活性呈先降后升再降的趋势，糜蛋白酶和脂肪酶活性呈“N”型变化。饱食投喂3 h内，肝脏淀粉酶活性显著下降 (p<0.05)，随后在3~6 h呈急剧上升趋势，并在投喂后的第6 小时达到最高值 (p<0.05)，之后则呈渐进式下降趋势 (图3-a)。肝脏中糜蛋白酶和脂肪酶活性在6 h内均显著上升达到最大值 (p<0.05)，随后在投喂后的6~18 h呈下降趋势，并在第18 小时恢复至初始水平 (p>0.05)，在18~21 h又呈上升趋势 (图3-b—3-c)。肠道淀粉酶活性变化趋势也呈“N”型变化，投喂后0~6 h肠道淀粉酶活性显著上升 (p<0.05)，6~15 h呈下降趋势，至投喂后的第15 小时，肠道内淀粉酶活性恢复至初始水平 (p>0.05)，在15~21 h又显著上升 (p<0.05，图4-a)。肠道中糜蛋白酶和脂肪酶活性变化趋势表现出一致性，均在投喂后0~6 h显著上升并达到最大值 (p<0.05)，随后在6~21 h呈显著下降趋势(p<0.05，图4-b—4-c)。同时，对比图3和图4发现大泷六线鱼肠道靡蛋白酶和脂肪酶活性均高于肝脏靡蛋白酶和脂肪酶活性。
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图 3 大泷六线鱼摄食21 h内肝脏淀粉酶、糜蛋白酶和脂肪酶活性变化注： 显著性差异用小写字母表示 (p<0.05, n=6)。Figure 3. Changes of liver amylase, chymotrypsin and lipase activities of H. otakii within 21-hour feedingNote: Significant differences are represented by lowercase letters (p<0.05, n=6).![]()
图 4 大泷六线鱼摄食21 h内肠道淀粉酶、糜蛋白酶和脂肪酶的活性变化注：显著性差异用小写字母表示 (p<0.05, n=6)。Figure 4. Changes of intestinal amylase, chymotrypsin and lipase activities of H. otakii within 21-hour feedingNote: Significant differences are represented by lowercase letters (p<0.05, n=6).2.4 大泷六线鱼血清葡萄糖和皮质醇的变化
大泷六线鱼血清中的葡萄糖和皮质醇含量均呈先升后降的变化趋势。饱食投喂后0~6 h，血清葡萄糖浓度急剧升高，并在第6 小时达到最高值 (17.499 mmol·L−1, p <0.05)，之后，血清中的葡萄糖浓度呈显著下降趋势 (p<0.05)，到第18小时下降至初始水平，之后无显著性变化 (p>0.05，图5-a)。血清皮质醇质量浓度在饱食投喂后0~3 h内逐渐升高，在3~6 h内急剧升高并达到最高值 (217.847 ng·mL−1, p<0.05)，在6~21 h呈匀速下降趋势 (图5-b)。
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图 5 大泷六线鱼摄食21 h内血清中葡萄糖和皮质醇的含量变化注：显著性差异用小写字母表示 (p<0.05, n=6)。Figure 5. Changes of glucose and cortisol in serum levels of H. otakii within 21-hour feedingNote: The significant differences are represented by lowercase letters (p<0.05, n=6).2.5 大泷六线鱼瞬时排空率与消化酶相关性分析
利用Pearson相关性分析大泷六线鱼瞬时胃排空率、葡萄糖、皮质醇、肠道和肝脏消化酶活性的相关性 (表2)。结果表明大泷六线鱼瞬时胃排空率与葡萄糖、皮质醇、肠道和肝脏消化酶活性均呈正相关，其中与血浆葡萄糖浓度、肝脏糜蛋白酶和脂肪酶及肠道淀粉酶和脂肪酶呈显著正相关 (p<0.05)，同时肠道消化酶与肝脏消化酶之间也存在显著相关性 (p<0.05)。
表 2 大泷六线鱼瞬时胃排空率与消化酶、血浆葡萄糖和皮质醇相关性分析Table 2. Correlation analysis between instantaneous gastric emptying rate and digestive enzymes, glucose and cortisol of H. otakii瞬时胃排空率
Instantaneous
gastric emptying
rate肝脏 Liver 肠道 Intestine 葡萄糖
Glucose皮质醇
Cortisol淀粉酶
Amylase糜蛋白酶
Chymotrypsin脂肪酶
Lipase淀粉酶
Amylase糜蛋白酶
Chymotrypsin脂肪酶
Lipase瞬时胃排空率
Instantaneous gastric
emptying rate1 0.334* 0.024 0.101 0.566** 0.607** 0.581** 0.203 0.663** 葡萄糖
Glucose1 0.875** 0.600 0.706 0.686 0.482 0.695 0.634 皮质醇
Cortisol1 0.401 0.345 0.311 0.133 0.462 0.234 肝脏淀粉酶
Liver amylase1 0.768* 0.698* 0.615** 0.948* 0.753* 肝脏糜蛋白酶
Liver chymotrypsin1 0.962* 0.796* 0.856** 0.917* 肝脏脂肪酶
Liver lipase1 0.804* 0.786* 0.904** 肠道淀粉酶
Intestine amylase1 0.670* 0.841* 肠道糜蛋白酶
Intestine chymotrypsin1 0.801* 肠道脂肪酶
Intestine lipase1 注：*. 相关性在0.05水平显著 (单尾)；**. 相关性在0.01水平显著 (双尾)。 Note: *. The correlation is significant at 0.05 (Single tailed); **. The correlation is significant at 0.01 (Two-tailed). 3. 讨论
3.1 大泷六线鱼胃排空特征
鱼类胃排空方式因物种而异，也受环境因素、鱼体大小、饲料种类和投喂频率的影响，因此鱼类胃排空方式繁杂多样，不同胃排空方式是鱼类对其摄食习性和不同食物种类适应的集中表现。如黄条鰤 (Seriola aureovittata)[16]、拟红石首鱼 (Sciaenops ocellatus)[17]等以肉为食或摄食不易消化食物的鱼类，胃排空通常呈直线下降型；瓦氏黄颡鱼 (Pelteobagrus vachelli)[18]、尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus)[19]、斑鰶 (Clupanodon punctatus) 和赤鼻棱鳀 (Thryssa kammalensis)[20] 等摄食小而易消化食物的鱼类，胃排空速率呈先快后慢型；云龙石斑鱼 (Epinephelus moara♀ × E. lanceolatus♂)[21]、南方鲇 (Silurus meridionalis)[22] 等常摄食甲壳类或摄食饲料中含有较多几丁质的鱼类的胃排空速率常呈先慢后快再慢型。此外，鱼类的胃排空时间还与其规格密切相关，研究发现小规格鱼类的胃排空时间比大规格的短。刘荣欣等[23]研究了2种不同规格大西洋鲑 (Salmo salar) 的胃排空特征，发现小规格大西洋鲑胃排速率空比大规格更快，进一步分析发现2种大西洋鲑胃含物相对质量在摄食后6 h内出现显著性差距，表明2种规格大西洋鲑胃排空速率的差距是在摄食后0~6 h内产生的，证明规格越小的鱼类，其代谢速率更快，对食物的消化吸收速率更快，因此胃排空速率越快；黄铭等[6]在对不同规格虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 胃排空模型研究中也发现了类似结果。本研究中的大泷六线鱼属于肉食性鱼类，胃内容量较大，其排空特征具体表现为80% 胃排空时间约为15 h，投喂后第19.7 小时胃内容物完全排空，且摄食开始至摄食后第18小时胃排空呈匀速状态，由此可认为大泷六线鱼摄食后的胃排空类型为直线下降型。
3.2 大泷六线鱼胃排空最优模型
鱼类胃排空方式复杂多样，与此相应的胃排空数学拟合模型也不同，目前已报道的数学拟合模型约有10种，但常采用的主要为平方根模型、线性模型和指数模型3种[24]。由于环境和食性的不同，不同鱼类的胃排空最优拟合模型存在较大差异，Jobling[25]认为指数模型比较适用于描述草食性或杂食性鱼类的胃排空模型，而线性模型比较适用于描述肉食性鱼类，如双斑伴丽鱼 (Hemichromis bimaculatus)[26]、银大马哈鱼 (O. kisutch)[27]胃排空拟合模型为指数模型；拟红石首鱼 [17]、黄鳍金枪鱼 (Thunnus albacares)[28]胃排空模型为线性模型；而方氏云鳚 (Enedrias fangi)[29]、鲇 (S. asotus)[30]胃排空模型则为平方根模型。本研究通过对比3种数学拟合模型的相关系数、残差平方和及残差标准差发现，立方模型与大泷六线鱼 [体质量为 (73.19±6.68) g] 胃排空率的拟合程度最佳，为大泷六线鱼胃排空最优模型，其次为平方根模型，最后为线性模型。李明月等[16]在对黄条鰤胃排空特征的研究中也发现了相同结果，且计算得出黄条鰤在摄食后14.5 h (80% 胃排空) 食欲基本恢复，表明在此时进行再投喂效果最佳。但张鹏飞等[31]认为养殖生产中不能完全按照鱼类胃排空时间来确定投喂的时间间隔，还应该联系生产实际，如鱼类的摄食节律；崔超等[32]研究了投喂频率对俄罗斯鲟 (Acipenser gueldenstaedti) 幼鱼生长的影响，发现高投饲频率 (6 h投喂1次) 下幼鱼的生长最佳。
3.3 消化酶活性分析
肠道是鱼类摄取营养物质的主要器官，主要通过各种消化酶对食物进行消化吸收，进而调控鱼类的生长发育。消化酶代表了摄入营养与吸收进入机体以进一步用于基础代谢和生长的营养要素间的重要联系，包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等[33]，其活性主要受食物类型和组成的影响。此外，鱼类的食欲会进化，鱼类的肠道消化酶在其生命周期中会发生变化。冯硕恒等[34]研究发现大规格草食性鱼类较小规格草食性鱼类可以更好地利用碳水化合物，表明了肠道消化酶活性随着鱼类生长时期的不同而改变。且不同食性鱼类其肠道消化酶活性也存在差异，肉食性鱼类较草食性鱼类摄入更多的脂质和蛋白质，肠道中的蛋白酶和脂肪酶活性远高于草食性鱼类[35]。本研究中大泷六线鱼摄食后其肠道和肝脏中的消化酶活性均呈先升后降的规律性变化，且均在摄食后的第6 小时到达峰值，表明大泷六线鱼经过停食，消化酶活性逐渐下降，此时机体更需获取营养物质，当再次摄食时，机体通过增强胃肠道消化酶分泌的方式来强化对营养物质的消化吸收，因此消化酶活性在前期 (第6 小时) 达到峰值，后期由于营养物质的积累和胃肠内容物的减少，消化酶分泌减弱，所以消化酶活性呈现下降趋势[36]；丛湘明等[37]在对大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 的胃排空研究中也发现了类似结果。本研究还发现，糜蛋白酶和脂肪酶在大泷六线鱼肝脏和肠道中的分布不同，同一时间内，肠道糜蛋白酶和脂肪酶的活性显著高于肝脏糜蛋白酶和脂肪酶。付新华等[38]在对大菱鲆 (Scophalmus maximus) 消化酶活性的研究中也发现了相似的糜蛋白酶活性变化特征，吴婷婷和朱晓鸣[39]在对鲢 (Hypophthalmichthys molitrix) 的相关研究中也发现了肠道靡蛋白酶活性显著高于肝脏糜蛋白酶，而Fish[40]在对罗非鱼 (Oreochromis mossambicus) 消化道消化酶的比较研究中发现其肝脏蛋白酶活性高于肠道蛋白酶。脂肪酶在鱼类消化中起到重要作用，崔爱君等[41]在对高体鰤 (S. dumerili)、黄条鰤和五条鰤 (S. quinqueradiata) 消化酶活性的对比研究中也发现肠道脂肪酶活性显著高于肝脏，刘永士等[42]在对不同养殖密度下刀鲚 (Coilia macrognathos Bleeker) 消化酶活性的分析中也发现了相似结果。由此可见，鱼类的种属差异必然会导致其消化酶分布部位及表达活性的差异。大泷六线鱼为肉食性鱼类，而肠道作为主要的消化器官，其糜蛋白酶和脂肪酶活性均显著高于淀粉酶，同时胃排空速率与肝肠消化酶活性呈显著正相关关系。
3.4 血液生理学变化
皮质醇和葡萄糖是鱼类血液中的主要生化指标，被广泛用于评价鱼类的生理状态[43]。皮质醇是鱼类中的主要糖皮质激素，其响应于不同的应激而直接刺激胚胎发生、蛋白质和脂肪分解[44]；此外，皮质醇也参与维持硬骨鱼类的厌食反应，其特定的糖皮质激素受体充当介质参与鱼类的摄食调控[45]。本研究发现大泷六线鱼摄食6 h后血清皮质醇显著升高，9 ~15 h显著降低，表明皮质醇升高主要抑制摄食，Jia等[2]在对斑石鲷 (Spotted knifejaw) 胃排空的研究中也发现了类似结果。葡萄糖在消化道中分解并通过肠黏膜被吸收，为组织提供能量，满足生理需要并维持体内平衡；杨丽萍等[46]研究发现鱼类葡萄糖感应器与哺乳动物类似，通过葡萄糖感应器感应血糖变化调控摄食。大泷六线鱼摄食6 h后血清葡萄糖含量变化与皮质醇相似，在第6 小时达到峰值，表明葡萄糖与皮质醇具有协同作用，共同参与了鱼类的摄食调控，但其具体协同机制尚不清楚，有待进一步研究。
4. 结论
本研究发现，在养殖水温为 (17±1) ℃、溶解氧质量浓度>7 mg·L−1的饲养条件下，饲喂商品化颗粒饲料的大泷六线鱼[体质量为 (73.19±6.68) g] 胃排空属于典型的直线下降型，饱食后其肝脏和肠道内消化酶活性、血清皮质醇和葡萄糖浓度均出现显著的规律性变化。通过数学模型拟合发现，立方模型拟合度最优，并根据最优模型计算得出大泷六线鱼在摄食后15 h (80% 胃排空) 食欲基本恢复，因此其最适投喂频率为每天2次，研究结果可为科学制定大泷六线鱼的摄食投喂策略提供理论依据和技术支撑。
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图 1 自然患病黄颡鱼临床症状
注：a. 鳍条基部充血；b. 腹部膨大、眼球突出；c. 肛门红肿；d. 有腹水、内脏出血。
Figure 1. Clinical signs of naturally diseased P. fulvidraco
Note: a. Hyperemia at the base of the fin rays; b. Abdominal enlargement, exophthalmos; c. Redness and swelling of the anus; d. Ascites, internal bleeding.
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图 2 菌株ET230818的菌落形态
注：a. 培养基生长形态；b. 革兰氏染色镜检 (100×)。
Figure 2. Colony morphology of strain ET230818
Note: a. Medium growth morphology; b. Gram's staining microscopy (100×).
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图 3 菌株16S rRNA、gyrB、cpn60和rpoB基因扩增结果
注：M. DL2000 DNA marker；1、3、5、7为对照组；2、4、6、8分别为 16S rRNA、 gyrB、rpoB、cpn60。
Figure 3. Gene amplification results of Strain 16S rRNA, gyrB, cpn60 and rpoB
Note: M. DL2000 DNA marker; 1, 3, 5, 7. Control group; 2. 16S rRNA; 4. gyrB; 6. rpoB; 8. cpn60.
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图 4 基于菌株ET230818的16S rRNA基因所构建的系统发育树
Figure 4. Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene of ET230818
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图 5 基于菌株ET230818的gyrB、rpoB、cpn60联合基因所构建的系统发育树
Figure 5. Phylogenetic tree based on gyrB, rpoB and cpn60 genes of ET230818
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图 6 迟缓爱德华细菌ET230818菌株的毒力基因检测
注：M. DL2000 DNA marker；1、3、5、7、9、11和13为对照组；2、4、6、8、10、12、14分别为sodB、katB、esrB、gadB、fimA、citC、mukF。
Figure 6. Virulence gene detection of ET230818 strain of E. tarda
Note: M. DL2000 DNA marker; 1, 3, 5, 7, 9, 11 and 13 were control group; 2. sodB; 4. katB; 6. esrB; 8. gadB; 10. fimA; 12. citC; 14. mukF.
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图 7 健康黄颡鱼和患病黄颡鱼组织病理学观察
注：a. 健康鱼肝脏 (40×)；b. 箭头位置患病鱼肝脏中央静脉扩张 (100×)；c. 健康鱼脾脏 (40×)；d. 箭头位置患病鱼脾脏出现大范围含铁血黄素聚集 (40×)；e. 健康鱼肾脏 (100×)；f. 箭头位置患病鱼肾小管管腔阻塞 (100×)；g. 健康鱼肠 (40×)；h. 箭头位置患病鱼肠上皮细胞排列紊乱、坏死、破碎、脱落 (40×)；i. 健康鱼胃 (40×)；j. 箭头位置患病鱼胃黏膜坏死、破碎、脱落于胃腔中，肌层纤维呈空泡状排列紊乱 (40×)；k. 健康鱼鳃 (40×)；l. 箭头位置患病鱼鳃小片弯曲，上皮细胞杂乱无序、少量细胞脱落 (40×)。
Figure 7. Histopathological observation of healthy and diseased P. fulvidraco
Note : a. Healthy P. fulvidraco liver (40×); b. Dilatation of central liver vein in diseased P. fulvidraco (Arrow) (100×); c. Healthy P. fulvidraco spleen (40×); d. Extensive accumulation of hemosiderin in the spleen of diseased P. fulvidraco (Arrow) (40×); e. Healthy P. fulvidraco kidney(100×); f. Obstruction of renal tubule in diseased P. fulvidraco (Arrow) (100×); g. Healthy P. fulvidraco intestine (40×); h. Intestinal epithelial cells of diseased P. fulvidraco were disordered, necrotic, broken and shed (Arrow) (40×); i. Healthy P. fulvidraco stomach (40×); j. The gastric mucosa of diseased P. fulvidraco was necrotic, broken and detached in the stomach cavity, and the muscular fibers were arranged in a vacuolar pattern (Arrow) (40×); k. Healthy P. fulvidraco gills (40×); l. The gill plates of diseased P. fulvidraco were curved, the epithelial cells were disordered and a few cells fell off (Arrow) (40×).
表 1 各目的基因的退火温度及片段大小
Table 1 Annealing temperature and fragment size of each target gene
目的基因
Target DNA引物
Primer退火温度
Annealing temperature/℃片段大小
Fragment size/bp参考文献
Reference16S rRNA 27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT55.0 1407 [17] gyrB gyrB-F: GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA
gyrB-R: AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC61.3 1042 [18] rpoB rpoB-F: GAAAGACCAGGAACGGATCA
rpoB-R: AGGTCGTCACGGTAACAAGG54.1 1003 [19] cpn60 cpn60-R: GAAATTGAACTGGAAGACAA
cpn60-F: GTTGCTTTTTCCAGCTCCA56.0 740 [20] sodB sodB-F: ATGTCATTCGAATTACCTGC
sodB-R: TCGATGTAATAAGCGTGTTCCCA53.0 490 [21] katB katB-F: GATGCGATCAAGTTCCCGGA
katB-R: ACCTGGATGTACAGATCCCAT54.7 377 [15] esrB esrB-F: GATCATGCCTTGCTAGCC
esrB-R: TCGGCGACCAGCTTGAGA53.3 454 [22] gadB gadB-F: ATTCCCGCTTTGGTTCAGA
gadB-R: GGAGGAGCCGATAGTATTGGTA53.5 308 GenBank AY078505 fimA fimA-F: ACAGCCTGGAAGAGTCCTAC
fimA-R: TTGAGAGTCGCTGCTTAC51.8 839 [23] citC citC-F: TTTCCGTTTGTGAATCAGGTC
citC-R: AATGTTTCGGCATAGCGTTG53.0 553 [24] mukF mukF-F: TTTGGACGGTGAAATGAGC
mukF-R: CGTTGCGGTGCCAGTGAA54.0 303 GenBank AY078510 
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表 2 菌株ET230818的生化鉴定
Table 2 Biochemical identification of strain ET230818
生化项目
Biochemical itemET230818 标准菌株
Standard strain生化项目
Biochemical itemET230818 标准菌株
Standard strain接触酶Contact enzyme + + 蔗糖Sucrose − − 氧化酶Oxidase − − 海藻糖Trehalose − − β-半乳糖苷酶 β-Galactosidase − − 柠檬酸盐Citrate + − 葡萄糖产气 Glucose production + + 葡萄酸盐Gluconate − − KCN试验KCN test − − 丙二酸盐Maltose − − 粘酸盐Clay acid salt − − d-酒石酸盐D-tartrate − − 硝酸盐还原 Nitrate reduction + + M.R (Methyl-Red test) + + 阿东醇Ribitol − − V.P (Voges-Proskauer test) − − 阿拉伯糖Arabinose − − 精氨酸Arginine − − 卫矛醇Galactitol − − 明胶水解Gelatin hydrolysis − − 七叶灵Esculin − − H2S试验 Hydrogen sulfide test + + 木糖Xylose − − 吲哚Indole + + 肌醇Inositol − − 赖氨酸脱羧 Lysine decarboxylation + + 麦芽糖Maltose + + 鸟氨酸脱羧Ornithine decarboxylation + + 甘露醇Mannitol − − 尿素水解Urea hydrolysis − − 柳醇Saligenin − − 谷氨酸Glutamic acid − − 山梨醇Sorbitol − − 苯丙氨酸Phenylalanine − −
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表 3 菌株ET230818的人工感染试验结果
Table 3 Artificial infection test results of strain ET230818
菌量
Concentration/
(CFU·mL−1)注射剂量
Injection dose/mL试验数
Number of tests观察时间及死亡数量
Observation time and number of deaths死亡总数
Total deaths/尾累积死亡率
Cumulative
mortality/%1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 1.0×109 0.2 30 23 7 0 0 0 0 0 30 100 1.0×108 0.2 30 9 11 4 1 0 0 0 25 83.3 1.0×107 0.2 30 0 9 6 3 1 1 0 20 66.7 1.0×106 0.2 30 0 6 3 2 1 1 0 13 43.3 1.0×105 0.2 30 0 0 2 1 1 1 0 5 16.7 0.65% (w) NaCl 0.2 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0.0
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表 4 菌株ET230818的抗菌药物敏感性试验
Table 4 Antimicrobial susceptibility test for strain ET230818
抗菌药物
Antibacterial drug药物名称
Drug判断标准
Assessment criteria/mm抑菌圈直径
Diameter of inhibition/mm敏感性
SensitivityR M S 大环内酯类
Macrolides group红霉素 ≤13 14~16 ≥23 10.4 R 麦迪霉素 ≤13 14~17 ≥18 0.0 R 利福平 ≤16 17~19 ≥20 22.4 S β-内酰胺类
β-lactam group头孢他啶 ≤14 15~17 ≥18 0.0 R 头孢哌酮 ≤15 16~20 ≥21 17.4 M 氨曲南 ≤15 16~21 ≥22 0.0 R 青霉素 ≤19 20~27 ≥28 8.7 R 头孢氨苄 ≤14 15~17 ≥18 15.0 M 头孢曲松 ≤25 25~26 ≥27 14.5 R 羧苄西林 ≤19 20~22 ≥23 8.1 R 哌拉西林 ≤17 18~20 ≥21 27.8 S 四环素类
Tetracyclines group四环素 ≤14 15~20 ≥21 15.9 M 多西环素 ≤12 13~15 ≥16 28.9 S 米诺环素 ≤14 15~17 ≥18 27.6 S 硝基呋喃类
Nitrofurans group呋喃唑酮 ≤14 15~16 ≥17 16.3 M 呋喃妥因 ≤14 15~16 ≥17 15.9 M 磺胺类
Sulfonamides group复方新诺明 ≤23 24~32 ≥33 0.0 R 磺胺异恶唑 ≤14 15~23 ≥24 8.4 R 氨基糖苷类
Aminoglycosides group庆大霉素 ≤12 13~14 ≥15 24.6 S 妥布霉素 ≤12 13~14 ≥15 22.0 S 新霉素 ≤12 13~16 ≥17 19.1 S 丁胺卡那 ≤14 15~16 ≥17 22.3 S 卡那霉素 ≤13 14~17 ≥18 17.8 S 喹诺酮类
Quinolones group恩诺沙星 ≤12 13~15 ≥16 24.6 S 培氟沙星 ≤23 24~25 ≥26 19.0 M 氧氟沙星 ≤12 13~16 ≥17 21.4 S 环丙沙星 ≤15 16~20 ≥21 16.9 M 吡哌酸 ≤21 22~28 ≥29 13.2 R 左氧氟沙星 ≤13 14~16 ≥17 23.1 S 氯霉素类
Chloromycetins group氯霉素 ≤12 13~17 ≥18 32.1 S 氟苯尼考 ≤12 13~17 ≥18 26.6 S 其他抗菌药物
Other antibacterial drugs杆菌肽 ≤8 9~12 ≥13 0 R 多粘菌素B ≤8 9~11 ≥12 9.4 M 注：R. 耐药；M. 中度敏感；S. 高度敏感。 Note: R. Resistant; M. Moderate sensitive; S. Highly sensitive.
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表 5 各抗菌药物对菌株ET230818的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度
Table 5 MIC and MBC of antibacterial drugs on strain ET230818
药物名称
Drug最小抑菌浓度
MIC/(μg·mL−1)最小杀菌浓度
MBC/(μg·mL−1)多西环素Doxycycline 1 16 恩诺沙星Enrofloxacin 1 16 氟苯尼考 Florfenicol 2 32 新霉素Neomycin 32 128
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表 6 中草药提取液对菌株ET230818的抑菌效果
Table 6 Antibacterial effect of Chinese herbal medicines on strain ET230818
中草药名称
Chinese herbal medicine抑菌圈直径
Diameter of inhibition/mm抑菌等级
Sensitivity最小抑菌浓度
MIC/(mg·mL−1)最小杀菌浓度
MBC/(mg·mL−1)丁香 Syzygium aromaticum 25.66±0.46 ++++ 1.95 3.91 山楂 Fructuscrataegi 24.35±0.15 ++++ 3.91 3.91 诃子 Terminalia chebula 22.48±0.48 ++++ 0.98 1.95 石榴皮 Punica granatum 22.14±0.30 ++++ 3.91 3.91 玫瑰花 Rosa rugosa 21.78±0.44 ++++ 0.98 1.95 五倍子 Galla chinensis 20.84±0.34 ++++ 7.81 15.63 乌梅 Prunnus mume 18.41±0.11 +++ 15.63 31.25 五味子 Schisandra chinensis 14.68±0.44 ++ 125.00 125.00 夏枯草 Prunella vulgaris 14.58±0.48 ++ >250.00 >250.00 虎杖 Polygonum cuspidatum 13.88±0.26 ++ 250.00 250.00 香加皮 Periploca sepium 13.62±0.44 ++ 125.00 250.00 牡丹皮 Paeonia suffruticosa 13.14±0.08 ++ 125.00 250.00 白头翁 Pulsatilla chinensis 12.79±0.21 ++ 250.00 250.00 鸡血藤 Polygala tenuifolia 12.36±0.24 ++ 125.00 125.00 大黄 Rheum palmatum 12.02±0.38 ++ 62.50 62.50 鹿衔草 Pyrola calliantha 12.01±0.51 ++ 62.50 125.00 柴胡 Bupleurum chinense 11.75±0.23 ++ 125.00 125.00 防风 Saposhnikovia divaricata 9.74±0.24 + 决明子 Cassia obtusifolia 9.57±0.35 + 黄芩 Sastellaria baicalensis 9.53±0.32 + 女贞子 Ligustrum lucidum 9.44±0.18 + 白芍 Angelica dahurica 9.37±0.26 + 当归 Angelica sinensis 9.03±0.21 + 独活 Heracleum hemsleyanum Diels 8.54±0.52 + 龙胆草 Gentiana scabra 8.32±0.64 + 白芷 Angelica dahurica 8.28±0.26 + 桑树叶 Morus alba Linn 7.89±0.10 + 何首乌 Fallopia multiflora 0.00 − 石斛 Dendrobium sp. 0.00 − 陈皮 Citrus reticulata Blanco 0.00 − 厚朴 Magnolia officinalis 0.00 − 栀子 Gardenia jasminoides 0.00 − 肉桂 Cinnamomum cassia Presl 0.00 − 苦参 Sophora flavescens 0.00 − 艾叶 Artemisia argyi Levl 0.00 − 川楝子 Toosendan fructus 0.00 − 青蒿 Artemisia annua 0.00 − 干姜 Zingiberis rhizoma 0.00 − 蒲公英 Taraxacum mongolicum 0.00 − 合欢皮 Albizia julibrissin Durazz. 0.00 − 党参 Codonopsis pilosula 0.00 − 茯苓 Wolfiporia cocos 0.00 − 重楼 Paris polyphylla 0.00 − 板蓝根 Isatis tinctoria 0.00 − 地榆 Sanguisorba officinalis 0.00 − 葛根 Radix Puerariae 0.00 − 黄柏 Cortex Phellodendri 0.00 − 草果 Amomum tsaoko 0.00 − 菊花 Chrysanthemum morifolium 0.00 − 蛇床子 Cnidium Monnier 0.00 − 姜黄 Curcuma longa 0.00 − 射干 Belamcanda chinensis 0.00 − 地肤子 Kochiae fructus 0.00 − 紫荆 Cercis chinensis 0.00 − 羌活 Notopterygium incisum 0.00 − 金银花 Lonicera japonica 0.00 − 三七 Radix Notoginseng 0.00 − 青皮 Vatica mangachapoi 0.00 − 玉竹 Polygonatum odoratum 0.00 − 鱼腥草 Houttuynia cordata 0.00 − 注：++++. 抑菌作用极强；+++. 抑菌作用强；++. 抑菌作用中等；+. 抑菌作用弱；−. 无抑菌作用。 Note: ++++. Very strong antibacterial effect; +++. Strong antibacterial effect; ++. Moderate antibacterial effect; +. Weak antibacterial effect; −. No antibacterial effect.
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