Characterization of proteinase-producing strain Bacillus tropicalis BTZB2 from source of fish in reef of South China Sea
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摘要:
深远海及南海岛礁海域较近海海域受人类活动的影响小，微生物资源丰富。金带齿颌鲷 (Gnathodentex aurolineatus) 是南海典型的珊瑚礁食肉鱼类之一，其肠道微生物群落具有较高的碳源代谢能力。为挖掘南海典型岛礁鱼类肠道微生物中可培养蛋白酶的菌株资源，从南海渚碧礁海域金带齿颌鲷肠道样品中富集筛选到产蛋白酶菌株BTZB2，其在酪蛋白平板上具有明显水解圈，水解圈直径与菌落直径的比值在第24小时达3.0。从分子水平结合细菌形态学特征及生理生化特性分析，确定该菌株为热带芽孢杆菌 (Bacillus tropicus)。该菌株最优产蛋白酶条件为：pH 8、盐度15‰、温度30 ℃、培养时间48 h、初始菌量105 CFU·mL−1。优化后该菌株发酵48 h后的蛋白酶活力可达319.48 U·mL−1，较筛选时菌株的酶活力 (124.55 U·mL−1) 提高了156.5%。在组合1 (pH 7、盐度22‰、温度30 ℃、初始接种量105 CFU·mL−1) 和组合2 (pH 8、盐度15‰、温度 30 ℃、初始接种量105 CFU·mL−1) 2种优化条件下，发酵第24小时粗酶液的比活力分别达 975.34和 889.97 U·mg−1，第48小时粗酶液的比活力分别达1 836.51和2 400.83 U·mg−1。结果表明，热带芽孢杆菌BTZB2具有良好的产蛋白酶能力，可作为南海鱼源功能微生物菌剂资源的备选菌株。
Abstract:Deep sea and islands and reefs in the South China Sea with abundant microbial resources are less affected by human activities than the nearshore waters. As one of the typical coral reef carnivorous fish in the South China Sea, Gnathodentex aurolineatus' intestinal microbiota has a high ability to metabolize carbon sources. To explore cultivable proteinase-producing strains from the intestinal microbiota of typical reef fish in the South China Sea, we selected the proteinase-producing strains from the intestinal microbiota of G. aurolineatus in Zhubi Reef of the South China Sea, and isolated the strain BTZB2. It had a clear hydrolysis circle on the casein plate, and the ratio of hydrolysis circle diameter to colony diameter reached 3.0 at 24th hour. The strain was identified as Bacillus tropicus on molecular level, combining with morphological and physiological characteristics of bacteria. The optimal conditions for the protease production of this strain were pH of 8.0, salinity of 15‰, temperature of 30 ℃, cultivation time of 48 h and initial bacterial count of 105 CFU·mL−1. After fermentation for 48 h, the protease production activity of this strain reached 319.48 U·mL−1, 156.5% higher than that of the screened strain (124.55 U·mL−1). Under the two optimal conditions: Combination 1 (pH of 7, salinity of 22‰, temperature of 30 ℃, initial inoculation volume of 105 CFU·mL−1) and Combination 2 (pH of 8, salinity of 15‰, temperature of 30 ℃, initial inoculation volume of 105 CFU·mL−1), the specific activities of crude enzyme solution for 24 h were 975.34 and 889.97 U·mg−1, and those for 48 h were 1 836.51 and 2 400.83 U·mg−1, respectively. The results indicate that B. tropicus BTZB2 has a good proteinase production ability, and it can be used as a candidate strain of functional microbial resource from fish in the South China Sea.
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自20世纪70年代末以来，对虾池塘养殖在世界广大沿海地区得到了迅猛发展，但对虾养殖所带来的环境问题也日趋严重，成为沿岸水域富营养化的重要污染源之一，并已引起了人们的广泛关注[1-6]。而要使对虾养殖在不产生环境公害的前提下，以最低的成本达到最大的效益，则基于生态养殖而建立的虾藻混养模式无疑是集经济、环境和社会效益于一体的最佳选择，这一模式在世界范围内得到了广泛肯定[7-10]。但虾藻混养模式效益的发挥是否充分，混养结构是否合理，经济效益和环境效益是否显著等问题都有待作深入的研究。
江蓠-对虾混养系统是一种受气候、海水化学和生物等多种因素共同影响的复杂生态系统，各因素间也存在着极其复杂的非线性关系。因此，在对整个养殖系统的生态动力学过程缺乏较全面的了解和充足的数据资料的情况下，想通过建立复杂的江蓠-对虾混养系统生态动力学模型，模拟虾藻混养与环境因子之间的关系，从而构建混养优化模型是不现实的。
人工神经网络是20世纪80年代以来获得迅速发展和被广泛应用于众多学科的非线性模拟技术，对于处理非线性系统非常有效，因此，在生态学研究中也被广泛应用[11-15]。本文根据对广东省海丰县联安镇江蓠与对虾鱼塭混养的调查资料，尝试采用神经-模糊系统(neuro-fuzzy system)作为非线性逼近工具，来模拟虾藻混养过程与其他环境因子之间的非线性关系，从而初步探讨建立基于满足一定环境条件的虾藻混养优化模型，旨在为进一步优化我国海水虾藻混养模式提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验设计
2003年4月~2004年9月，在广东省海丰县联安镇对虾鱼塭养殖示范区选择新塭(26.7 hm2)作为虾藻混合养殖试验塭，另选新塭和西塭之间的13.3 hm2鱼塭作为对照塭进行了2造养殖生产试验。试验塭和对照塭皆于每年的4月下旬投放体长约1cm的斑节对虾虾苗，投放密度为4.5万尾·hm-2，其中在试验塭浅滩水域底播种植江蓠约2 hm2，种植初始密度为230 g · m-2，而对照塭不种植江蓠。
对虾放养1个月后开始投喂人工配合饲料，投喂量为虾体重的3%~5%。每10 d进行1次对虾的生物学测定，每月月末对江蓠的生长密度进行1次调查，了解单位面积月增重情况，并据情况进行适当的收获。此外，与江蓠生长密度调查的同时，对鱼塭中的水环境因子也进行跟踪监测，监测项目有水温、盐度、透明度、溶解氧(DO)和可溶性无机氮(DIN)。
1.2 建模工具
神经-模糊系统是在模糊模型中用神经网络作为工具的建模方法。它集成了神经网络与模糊系统2方面的长处，即神经网络的连接式结构与学习能力和模糊逻辑系统的思维与推理能力。神经网络与模糊系统都属于无模型的预报器(model-free estimator)，即不需要数学模型来描述输入输出的非线性关系，而从数值实例中进行学习。在不确定、不精确和噪声环境中它们都有改善系统性能的能力。
本文应用Matlab 6.5软件，采用一种一阶Takagi-Sugeno模型的神经模糊系统，即基于自适应网格的模糊推理系统(adaptive-network-based fuzzy inference system，简称ANFIS)作为建模工具。
2. 神经-模糊系统模型的构建
一个典型的建模问题包括结构辩识与参数辩识2部分。模糊建模的结构辩识包括以下几个主要方面：输入变量的选择；初试结构的确定，如输入空间的划分，模糊规则与每个输入变量隶属函数个数的确定，以及模糊规则的前提与结论部分的确定等；隶属函数初试值的选择。参数辩识即在网络结构已经确定的情况下，对系统的前提与结论参数进行调节。
2.1 数据与特征量
收集2003年4月~2004年9月试验塭和对照塭2造养殖生产中所得的22组现场调查和测定数据(表 1)。选择其中15组数据作为训练数据集，用于模型的训练；其余7组数据作为测试数据集，用来测试模型的精度。
表 1 构建模型的数据集Table 1. Data for model construction
时间time鱼塭
pond温度/℃
temperature盐度
salinity透明度/m
transparencyDO
/mg·L-1对虾体长/cm
shrimp length江蓠月增长量/g·m-2
monthly increasing biomassDIN
/mg·L-1训练数据集 training data 2003-5 对照塭 26.1 19.5 0.8 6.3 4.8 0 0.310 2003-6 试验塭 28.2 18.7 0.8 6.5 8.3 180 0.322 2003-6 对照塭 28.5 18.4 0.7 6.3 7 0 0.312 2003-7 对照塭 27.5 16.8 0.8 6.2 12.6 0 0.246 2003-8 试验塭 28.3 12.4 0.8 6.7 15.4 350 0.175 2003-9 对照塭 28.8 15.2 0.7 6.3 14.4 0 0.244 2004-4 对照塭 24.7 20.9 0.7 6.5 1.7 0 0.248 2004-5 对照塭 25.9 19.1 0.7 6.6 5 0 0.264 2004-6 试验塭 27.8 18.4 0.7 6.4 8.2 540 0.101 2004-6 对照塭 28.2 18.2 0.7 6.3 7.1 0 0.259 2004-7 试验塭 27.4 15.6 0.6 6.5 14.6 570 0.103 2004-7 对照塭 27.2 15.7 0.7 6.3 12.4 0 0.269 2004-8 试验塭 28.2 11.7 0.6 6.6 15.3 570 0.086 2004-9 试验塭 29.0 15.1 0.6 6.6 16.5 600 0.099 2004-9 对照塭 28.7 14.8 0.6 6.8 14.3 0 0.267 测试数据集 checking data 2003-5 试验塭 26.5 19.2 0.7 6.4 5.2 230 0.295 2003-7 试验塭 27.6 16.5 0.8 6.2 14.2 640 0.194 2003-8 对照塭 28.6 11.7 0.8 6.1 13.2 0 0.252 2003-9 试验塭 28.9 15.4 0.8 7.1 16.3 350 0.182 2004-4 试验塭 25.3 21.2 0.8 6.6 1.7 610 0.092 2004-5 试验塭 26.1 18.5 0.7 6.2 5.2 600 0.099 2004-8 对照塭 28.5 11.9 0.8 5.8 13.3 0 0.237 以DIN表征水体富营养化的主要因子作为模型的输出变量。模型输入变量选择了水温、盐度、溶解氧(DO)、透明度(Trans)、对虾生物学参数的体长和江蓠单位面积月增长量，其中，水温和盐度表征气候特征，透明度、溶解氧、对虾体长和江蓠单位面积月生长量表征化学因子和生物因子的作用。
2.2 神经-模糊系统模型的生成
由于以DIN为输出时的输入变量有6个之多, 因此本研究采用了基于减法聚类的模糊推理系统的建模方法，即首先对输入输出数据进行减法聚类，以决定变量的隶属函数与模糊规则的个数，并用最小二乘法估计结论参数。
3. 结果与讨论
将训练数据集导入模型，按混合学习算法来调节模型的参数，为避免过度训练，采用交叉校验得到最佳训练时间步数。结果所得模型的DIN输出值与实测值有很好的吻合性，误差仅为2.6×10-6。
将测试数据集导入模型，结果模型所模拟的鱼G8965水体中DIN值与实测值也有较好的吻合性，误差为0.032。成对样本t-检验表明，模拟值与实测值没有显著差异(P>0.05，t < 2.45)，即t=0.63。图 1给出模型对DIN的7个测试数据集的模型计算值与实测值的比较，由图也可见，测试数据集中的实测值与模型计算值呈极显著的正相关关系(P < 0.01)，可见，模型对鱼G8965水体中DIN的模拟计算结果有较高的精度。
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图 1 模型对应测试数据集的DIN模拟结果与实测值的比较Figure 1. Comparison of DIN from model calculated and field survey将试验塭和对照塭水体中各生物与环境因子在2造养殖生产试验中各阶段调查结果的平均值作为模型的输入，以海水DIN≤0.2 mg · L-1作为海水富营养化限制标准[16-17]，并作为模型的固定输出量，则通过模型可以模拟出在对虾不同养殖阶段，混合养殖的江蓠最低理论月生长量，结果见表 2。
表 2 模型模拟出的对虾不同养殖阶段江蓠最低理论月生长量与实际生长量的比较Table 2. Comparison of the theory lowest monthly growth rates from model simulating and field survey of sea moss during different shrimp culture periodg · m-2 月份
month对虾体长/cm
shrimp length最低理论月生长量
theoretic lowest monthly growth rate2003年实际月增长量
autual monthly growth rate in 20032004年实际增长量
autual monthly growth rate in 20044 2.0 500 - 610 5 5.2 329 230 600 6 8.3 319 190 540 7 14.4 364 640 570 8 15.4 360 350 570 9 16.4 254 350 600 根据表 2所列不同养殖阶段江蓠的最低理论月生长量，对2003和2004年相应的江蓠-对虾混养阶段江蓠的实际月生长量和水环境中DIN的变化情况进行分析，结果可看出，在2003年试验塭对虾体长小于8.3 cm的养殖阶段，江蓠月生长量均小于模型模拟出的最低理论月生长量，此时，试验塭水环境中DIN均大于设定的富营养化标准限定值0.2 mg · L-1；其他养殖阶段江蓠的实际月生长量均大于或约等于模型模拟出的最低理论月生长量，此时，试验塭中海水DIN浓度则均低于0.2 mg · L-1；此外，没有种植江蓠的对照塭中，水环境中DIN均高于0.2 mg · L-1(表 1)。这些均说明，该模型可以较好地模拟江蓠-对虾池塘混养混养系统中江蓠生长对水环境中DIN的影响，其结果与实际也较为相符，因此，对江蓠-对虾混养模式的优化能起到较好的指导意义。
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图 2 不同pH 条件下菌株BTZB2 的菌量及酶活力
Figure 2. Bacterial quantity and proteolytic activity of strain BTZB2 with different pH
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图 3 不同盐度条件下菌株BTZB2的菌量及酶活力
Figure 3. Bacterial quantity and proteolytic activity of strain BTZB2 with different salinity
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图 4 不同温度条件下菌株BTZB2的菌量及酶活力
Figure 4. Bacterial quantity and proteolytic activity of strain BTZB2 with different temperature
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图 5 不同初始菌量发酵液发酵48 h的菌量与酶活力
注：不同大写字母表示不同初始菌量条件下的酶活力差异显著 (p<0.05)；不同小写字母表示不同初始菌量条件下的菌量差异显著 (p<0.05)。
Figure 5. Bacterial quantity and proteolytic activity of strain BTZB2 with different initial bacterial quantity after 48 h
Note: Different uppercase letters represent significant difference in proteolytic activity with different initial bacterial quantity (p<0.05); different lowercase letters represent significant difference in bacterial quantity with different initial bacterial quantity (p<0.05).
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