Transcriptome analysis of liver anti-MSRV responses in juvenile largemouth bass (Micropterus salmoides)
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摘要:
为探究大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 对大口黑鲈弹状病毒 (Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV) 的抗病反应和代谢调控网络，揭示其抗病的免疫分子机制并为后续大口黑鲈的分子生物学研究提供基础数据，利用Illumina NovaSeq 6000测序平台，对MSRV感染的大口黑鲈易感组、抗病组和对照组的肝脏组织进行转录组测序分析，对所得基因的功能注释发现，被注释的差异基因主要与细胞过程、细胞、结合和催化活性等功能有关。KEGG通路富集分析结果显示，大口黑鲈肝脏组织在MSRV感染下高表达的差异基因富集在药物代谢-细胞色素P450、细胞色素P450对外源性药物的代谢作用、蛋白酶体、抗坏血酸和醛酸盐代谢、脂肪酸降解等代谢相关通路；进一步筛选免疫相关基因进行通路分析发现，与抗MSRV免疫应答相关的通路主要为NOD样受体信号传导、C型凝集素受体信号、细胞溶质DNA传感途径、Toll样受体信号传导和RIG-I样受体信号传导等。最后，通过qRT-PCR验证了差异基因的变化趋势与转录组测序分析结果的一致性，证明了转录组数据的可靠性。获得的差异基因和调控通路可为大口黑鲈抗MSRV免疫的分子机制和疾病防控研究提供理论基础。
Abstract:In order to investigate the disease resistance and metabolic regulatory network of Micropterus salmoides to M. salmoides rhabdovirus (MSRV), uncover the immunomolecular mechanism of its disease resistance, and provide genetic data references for subsequent molecular biology investigation of M. salmoides, we used the Illumina NovaSeq
6000 sequencing platform to analyze the transcriptome sequencing of liver tissues from susceptible group, disease-resistant group and control group of M. salmoides infected with MSRV. Functional annotation of obtained genes reveals that the annotated differentially expressed genes were mainly associated with functions such as cellular process, cell, binding and catalytic activity, etc. The KEGG pathway enrichment analysis indicates that the differentially expressed genes with high expression levels in M. salmoides liver tissue with MSRV infection were enriched in metabolic pathways, including drug metabolism-cytochrome P450, metabolism of xenobiotics by cytochrome P450, proteasome, ascorbate and aldarate metabolism, fatty acid degradation, as well as other metabolic processes. Further screening of immune-related genes for pathway analysis shows that the main pathways associated with the immune response against MSRV were NOD-like receptor signaling pathway, C-type lectireceptor signaling pathway, cytosolic DNA-sensing pathway, Toll-like receptor signaling pathway, RIG-I-like receptor signaling pathway, etc. Finally, we verified the consistency of the differential gene trends with the results of transcriptome sequencing analysis by qRT-PCR, demonstrating the reliability of the transcriptome data. The differential genes and regulatory pathways identified in this study will provide a theoretical basis for research on the molecular mechanism of M. salmoides immunity against MSRV as well as disease prevention and control. -
湿地与森林、海洋并称为全球3大生态系统，有多种功能，素有“地球之肾”之称。浮游植物是湿地生态系统中重要组成部分，是湿地食物链的基础环节，水环境有机物的生产者，其组成与多样性的变化将直接影响到生态系统的结构与功能[1-2]，同时又是重要的环境指示物，可以反映环境的污染状况[3-5]，在湿地生态系统的结构和功能中起着重要的调控作用。通过研究安邦河湿地浮游植物，目的在于了解其动态特征，为保护和管理提供依据，为进一步研究其生态系统动力学和富营养化等环境问题提供基础资料。
1. 研究区域与方法
1.1 研究区域概况
安邦河湿地地处东经131°06′~131°32′，北纬46°53′~47°03′，是三江平原湿地的重要组成部分；地貌类型为低河河滩，西高东低；气候属温带大陆性季风气候，年平均气温2.5℃，太阳总辐射量为4 600.5 MJ·m-2，年降水量为560 mm，无霜期145 d。植被以水生、沼生植物为主，主要优势种为挺水植物的芦苇(Phragmites communis)、狭叶香蒲(Typha angustifolia)、荆三棱(Scripus yagaar)，浮水植物的萍蓬草(Nuphar pumilum)、浮萍(Lemna minor)、槐叶萍(Salvinia natans)，沉水植物的眼子菜(Potamogeton distinctus)、穗花狐尾藻(Myriophyllum spicatum)等。
1.2 样品采集与分析
由于安邦河湿地水域面积较小，因此，本研究站位不以断面为单位设置，而是均匀设置了10个站位(图 1)，于2005年7月采样。浮游植物样品用2.5 L有机玻璃采水器于水面下0.5 m处取4次水样，共计10 L，混合后取2 L用1.5%的碘液固定，沉淀48 h，浓缩为30 mL保存。显微镜检计数时充分摇匀，吸取0.1 mL滴入0.1 mL计数框内，在10×40倍下用视野法计数各种的个体数，计数100~300个视野，对量小而个体大的种类在100倍下全片计数，鉴定依据文献[6]。
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图 1 安邦河湿地浮游植物采样站位图Fig. 1 A map of sampling spots of phytoplankton in Anbang River wetland1.3 数据处理
1.3.1 集群划分
浮游植物集群的划分应用多元统计分析方法的聚类分析(cluster analysis)和多维定标分析(nor-matric multidimentional scaling，MDS)进行，所有分析均在SPSS 13.0软件包上运行。聚类分析、多维定标分析均以Bray-Cartis相似性系数SB为基础进行计算，在计算相似性系数SB时，为了平衡优势物和稀有种对整个群落影响的权重，首先将原始数据进行开方[7]，然后再计算Bray-Cartis相似性系数SB：
$$ S_B=100 \times\left\{1-\frac{\sum\limits_{i=1}^{s}\left|x_{i j}-x_{i k}\right|}{\sum\limits_{i=1}^{s}\left(x_{i j}-x_{i k}\right)}\right\} $$ 式中，xij是第i物种在第j站位的数量经变换后的数值，xik是第i物种在第k个站位中数量经变换后的数值。
检验MDS分析结果的好坏采用胁强系数(stress)来检验，通常认为stress < 0.2时，可用MDS的二维散点图来表示，其图形有一定的可信度；stress < 0.1时，可以认为是一个好的排序，stress < 0.05，具有很好的代表性[8]。
1.3.2 指示种和优势种
指标种的确定根据各种类在集群中出现频率fi及该种类在各集群数量百分比进行。种类的数量百分比计算式为:
$$ Y_{i j}=100 X_{i j} / \sum\limits_{j=1}^n X_{i j} $$ 式中，Xij为第i种类集群j中的数量，n为集群数，Yij为数量百分比。只有100×fi和Yij均大于50时，确定为该集群的指标种[9]。
优势种是根据物种的出现频率及个体数量来确定，用优势度来表示[10]：
$$ y=f_i \times p_i $$ 式中，y为优势度，fi为第i种的出现频率，pi为第i种个体数量在总个体数量中的比例，fi为该种在各取样时间出现的频率，当y ﹥0.02时，定为优势种。
2. 结果
2.1 种类组成
调查期间，共采到浮游植物7门82种，其中绿藻最多，44种，蓝藻次之，19种，硅藻12种，其它7种。浮游植物数量平均268.45×104 ind·L-1，优势种共6种，分别为蓝藻3种、硅藻2种、绿藻1种，优势度以鱼腥藻(Anabaena sp.)最高，为0.102，钝脆杆藻(Fragilaria capucina)最低，为0.063(表 1)。
表 1 安邦河湿地夏季浮游植物组成Table 1 Phytoplankton composition in Anbang River wetland in summer种类
species出现次数
occurrence优势种优势度
dominance of predominant species指示集群
indicator group种类
species出现次数
occurrence优势种优势度
dominance of predominant species指示集群
indicator group蓝藻门 Cyanophyta 月牙新月藻 Closterium cynthia 5 n 鱼腥藻 Anabaena sp. 16 0.102 AMC 纤细新月藻 C.gracile 12 n MMM 水华束丝藻 Aphanizomenon flos-aquae 14 n AMC 项节月藻 C.nematodes 4 n 小型色球藻 Chroococcus minor 11 n 膨胀新月藻 C.tumidum 7 n 腔球藻 Coelosphaerium sp. 8 n 新月藻 C.subscoticum 5 n 池生胶球藻 Gloeocapsa limnetica 9 n 小新月藻 C.venus 14 n 胶球藻 Gloeocapsa sp. 10 n 鼓藻 Cosmarium sp. 12 n MMM 粘杆藻 Gloeothece sp. 9 n 四角十字藻 Crucigenia quadrata 14 n 湖生束球藻 Gomphosphaeria lacustris 11 n 角丝鼓藻 Desmidium sp. 14 n 湖生鞘丝藻 Lyngbya limnetica 13 n 空球藻 Endorina elegans 13 n 优美平裂藻 Merismopedia elegans 16 n 基纳棒形鼓藻 Gonatozygon kinahani 12 n 银灰平裂藻 M.glauca 13 0.069 MMM 棒形鼓藻 G.monotaenium 16 n 粉末微囊藻 Microcystis incerta 6 n 裂开圆丝鼓藻 Hyalotheca dissiliens 14 n MMM 铜绿微囊藻 M.aeruginosa 12 0.091 AMC 棘接鼓藻 Onychonema sp. 5 n 浮游念球藻 Nostoc planctonicum 4 n 湖生卵囊藻 Oocystis lacustris 7 n 巨颤藻 Oscillatoria princes 14 n 四集藻 Palmella sp. 2 n 美丽颤藻 O.formosa 12 n 集球藻 Palmellococcus sp. 14 n 弱细颤藻 O.tenuis 6 n 双射盘星藻 Pediastrum biradiatum 6 n MMM 窝形席藻 Phormidium foveolarum 12 n 短棘盘星藻 P.boryanum 7 n PPP 弯曲尖头藻 Raphidiopsis curvata 4 n 整齐盘星藻 P.integrum 9 n 金藻门 Chrysophyta 四角盘星藻 P.tetras 20 0.095 PPP 单鞭金藻 Chromulina pascheri 6 n MMM 浮游藻 Planktosphaeria gelatinosa 12 n 分歧锥囊藻 Dinobryon divergens 12 n 宽带鼓藻 Pleurotaenium sp. 13 n 黄藻门 Xanthophyta 弯曲栅藻 Scenedesmus arcuatus 5 n AMC 小刺角绿藻 Goniochloris brevispinosa 14 n 双列栅藻 S.bijuga 3 n AMC 黄丝藻 Tribonema sp. 6 n 龙骨栅藻 S.carinatus 4 n 硅藻门 Bacillariophyta 斜生栅列藻 S.obliquus 6 n 美丽星杆藻 Asterionella formosa 12 n 扁平栅藻 S.platydiscus 8 n 细星杆藻 A.gracillima 7 n 四尾栅藻 S.quadricauda 4 n 梅尼小环藻 Cyclotella meneghiniana 14 0.074 AMC 被甲栅藻 S.armatus 3 n 钝脆杆藻 Fragilaria capucina 16 0.063 纤细月牙藻 Selenastrum gracile 4 n 中间异极藻 Gomphonema intricatum 12 n 瘤接鼓藻 Sphaerozosma sp. 9 n 颗粒直链藻 Melosira granulata 5 n 钝齿角星鼓藻 Staurastrum crenulatum 15 n PPP 放射舟形藻 Navicula radiosa 8 n 项圈顶接鼓藻 Spondylosium moniliforme 7 n 大羽纹藻 Pinnularia major 10 n 规则四角藻 Tetraёdron regulare 9 n 头状针杆藻 Synedra acus 20 n AMC 四球藻 Tetrachlorella alternans 3 n 近缘针杆藻 S.affinis 19 n 四月藻 Tetrallantos lagerkeimii 5 n 尺骨针杆藻 S.ulna 3 n 韦斯藻 Westella botryoides 14 n 绒毛平板藻 Tabellaria flocculosa 6 n 多棘鼓藻 Xanthidium sp. 15 n PPP 绿藻门 Chlorophyta 裸藻门 Euglenophyta 集星藻 Actinastrum hantzschii 5 n 绿色裸藻 Euglena viridis 5 n 空星藻 Ceolastrum sphaericum 7 n 隐藻门 Cryphophyta 艾氏衣藻 Chlamydomonas olifanii 6 n AMC 马氏隐藻 Cryptomonas marssonii 3 n AMC 小球藻 Chlorella vulgaris 12 n 卵形隐藻 C.ovata 5 n 柯氏藻 Chodatella chodati 4 n 注：n表示非优势种
Note：n Represents the non-dominant species.2.2 集群结构
2.2.1 聚类分析
在Bray-Curtis相似矩阵的基础上，采用组间平均聚类法对安邦河湿地浮游植物集群进行分层聚类(hierarchical cluster)分析，结果表明，调查站位分为3组(图 2)，5#、9#和1#等3个站位为一组；7#、8#、2#、3#、4#、6#等6个站位为另一组，10#站位单独为一组。这些站位的聚类表明，组内各站位浮游植物群落的相似性较高，组间群落差异大。
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图 2 安邦河湿地夏季浮游植物集群聚类图Fig. 2 The hierarchical cluster dendrogram of phytoplankton assemblage in Anbang River wetland in summer2.2.2 多维定标分析(MDS)
图 3为各站位的多维定标分析的二维散点图，Stress值为0.019，小于0.05，说明得到的MDS图是一个很好的排序，可以正确解释站位间的相似关系。从图中可知，安邦河湿地10个站位的浮游植物群落可以分成3个不同的组，第1组包括6#、8#、4#、3#、2#、7#等6个站位，第2组包括1#、5#、9#等3个站位，10#站位为第3组。从站位划分结果看，多维定标分析支持了聚类分析结果，同时表明，同一集群的站位对应散点具有较强的聚集性。可见，MDS图不仅可以清楚显示各站位浮游植物群落的距离(即相似性)，而且表明各集群浮游植物群落的组成存在明显的差异。
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图 3 夏季10个站位浮游植物集群二维定标排序图Fig. 3 The 2-dimentional MDS ordinal configuration of phytoplankton assemblage at ten sampling localities in summer2.3.3 集群命名
聚类分析和多维定标分析均把10个站位分为3个集群，依据指示种划分原则确定指示种，结果表见表 1。结合各集群指标种和优势种对3组进行命名，第一组包括6#、8#、4#、3#、2#、7#等6个站位，指示种和优势种均有四角盘星藻(P.tetras)，可命名为四角盘星藻集群(简称PPP)，位于在核心区。第二组包括1#、5#、9#等3个站位，指示种和优势种均有鱼腥藻(Anabaena sp.)、铜绿微囊藻(M.aeruginosa)、梅尼小环藻(C.meneghiniana)，可命名为鱼腥藻-铜绿微囊藻-梅尼小环藻集群(简称AMC)，位于沿岸。第三组只有10#站位，指示种和优势种均出现的是银灰平裂藻(M.glauca)，可命名为银灰平裂藻集群(简称MMM)，位于莲花池。
3. 讨论与结论
依Bray-Curtis相似系数进行分层聚类分析方法在群落生态研究中常被采用[11-14]。MDS被认为是最好的排序技术之一，它用于分析不同样方中群落结构的距离关系(即相似性)十分适宜，可以直观地将群落标于多维坐标中。本研究的2种分析方法的分析结果表明，在一定的相似性水平下，聚类分析把各个不同的站位分为几组，而MDS却以样本实体构成分离的点阵并提供生态学分析，即各站位的生物群落以及它们之间的生态距离在MDS图中形成直观的疏密的点阵，群落组成越相近的2个站位，在MDS图上代表它们的点距离越近；群落组成相差越远的2个站位，则代表它们的点在图上的距离就越远。从结果可见，MDS分析的Stress值小于0.05，吻合极好。对照各季节的聚类分析图和MDS图，可以看出，MDS分析结果和聚类分析结果十分相似，表明MDS分析支持了聚类分析的结果，而且更直观地显示了这3组之间的距离关系(即相似程度)，可以较好地显示安邦河湿地浮游植物群落结构。
指示种反映了各个集群营养水平的差异，主要与氮和磷相关。氮和磷是浮游植物生长最重要的营养物质，又是常见的限制营养元素[15-17]。对安邦河湿地浮游植物数量与无机氮(DIN)、总磷(TP)含量(表 2)进行回归分析(图 4)，结果表明，浮游植物数量与DIN呈显著的负相关(R2>R0.012，P < 0.01，n=10)，与TP含量呈显著正相关(R2>R0.012，P < 0.01，n=10)，可见，DIN和TP显著影响安邦河湿地的浮游植物数量。对各站位的氮磷比计算结果显示，氮磷比均大于典型的藻类重量比(7.2：1)[18]，说明TP是安邦河湿地浮游植物生长的限制因子。
表 2 安邦河湿地夏季浮游植物数量与营养盐含量Table 2 Phytoplankton quantities and nutrient contents in Anbang River wetland in summer站位
sampling stations1# 2# 3# 4# 5# 6# 7# 8# 9# 10# 数量/×104 ind·L-1
quantity375.68 378.46 250.48 239.37 388.45 207.02 186.96 163.43 396.57 98.04 无机氮/mg·L-1
DIN0.78 0.85 0.80 1.09 0.66 1.08 0.87 1.11 0.84 1.23 总磷/mg·L-1
TP0.072 0.059 0.057 0.052 0.084 0.055 0.05 0.052 0.085 0.056 ![]()
图 4 浮游植物数量与营养盐含量回归分析Fig. 4 Regressive analysis between phytoplankton quantities and nutrient contents调查发现，沿岸的鱼腥藻-铜绿微囊藻-梅尼小环藻集群(AMC)站位总磷平均含量为0.080 mg·L-1，远高于核心区的四角盘星藻集群(PPP)站位(0.054 mg·L-1)和莲花池的银灰平裂藻集群(MMM)站位(0.056 mg·L-1)。这与AMC站位所地的地理位置相关，1#站位离入水口最近，得到的外来营养物质较高；5#、9#站位靠近农田、保护区生活区，因为夏季降雨量大，通过地表径流可以为它们从农田、保护区生活区带来丰富的营养物质，此外，夏季是安邦河湿地的旅游旺季，游客数量大，大量的生活污水排放到9#站位中，也使其获得大量的外源营养物质，从而体现出高营养盐含量的特征。从优势种来看，AMC的3个优势种，即鱼腥藻、铜绿微囊藻和梅尼小环藻，均喜欢生活在营养较丰富的水体中[19]，与AMC站位较高的营养盐含量相适应。由此可见，营养盐的差异可以解释AMC与其它集群的差异。但MMM站位的营养盐(TP为0.054 mg·L-1)与PPP站位(TP为0.056 mg·L-1)相差不大，2集群存在很大的差异，又如何解释呢？影响浮游植物组成的因子很多，包括营养盐、pH、光、温度、水生植物等[20-21]。10#站位与其它站位不同的是其水生维管束植物几乎全部是莲(Nelumbo nucifera)，盖度达到95%以上，如此之高的盖度使得莲花池的水体形成低光强环境，不适合其它藻类生活，而属于蓝藻的银灰平裂藻则能适应，因为其对光强适应范围较宽，低光强也能适应；除此之外，单一的水生维管束植物使得莲花池水体较稳定，也适合银灰平裂藻生活[19]。
综上分析，安邦河湿地浮游植物可划分为3个集群：核心区的四角盘星藻集群(PPP)、沿岸的鱼腥藻-铜绿微囊藻-梅尼小环藻集群(AMC)和莲花池的银灰平裂藻集群(MMM)。各集群的指示种反映了各集群的营养水平的差异，与各站位的地理位置相关。
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图 1 各比较组差异表达基因统计图
注：CL. 对照组；RL. 抗病组；SL. 易感组。
Figure 1. Statistical chart of DEGs for each group
Note: CL. Control group; RL. Disease-resistant group; SL. Susceptible group.
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图 4 各比较组DEGs的KEGG通路富集分析 (富集排名前 20)
Figure 4. KEGG pathway function enrichment analysis of DEGs in each group (Top 20 of enrichment)
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图 5 免疫相关DEGs的KEGG通路富集分析 (p<0.01, TOP 5)
Figure 5. KEGG pathway function enrichment analysis of immune-related DEGs (p<0.01, TOP 5)
表 1 qRT-PCR验证基因及引物设计
Table 1 Gene selection and primer design for qRT-PCR
基因名称
Gene name引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'−3')LOC119899145 F: GCTGTGGCTGTGCTCAGTCTTC R: GCTGCTCTCTTCCCTGGATTTCAAG txnipa F: ACAGCGTGAGCAGCCAGGAG R: TTGGTCCAGGCGGCAGTCTC irf1b F: AGGGAGCCAGTGGAGTGAATCTTC R: GTGAGGTCTGAGCCCAAAGTTGTG psmb7 F: GGCATGGTGGTGGCAGACAAG R: AGGTTGGAGGAGATGATCTGAGTGG f13a1b F: GCCAATCACCAACAGAGGAGACC R: CCCACCAGCACACCTTCATCATC β-actin F: AGTGCTGGATTGGGTGTTCA R: CTGGATTCTTTGTGGCAGAGTAA 
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表 2 测序数据统计
Table 2 Summary of sequencing data
样品名称
Sample过滤后数据
Clean reads过滤后碱基
Clean baseGC含量
GC Content/%Q20/% Q30/% CL1 23 397 649 6 999 847 928 48.72 98.38 95.29 CL2 24 381 449 7 294 667 658 48.68 98.34 95.21 CL3 26 205 769 7 840 012 100 48.76 98.37 95.31 RL1 23 989 032 7 180 334 774 48.59 98.39 95.28 RL2 20 024 010 5 993 917 232 49.10 98.33 95.15 RL3 22 668 844 6 783 389 398 48.71 98.28 95.03 SL1 20 875 161 6 245 826 768 48.27 98.44 95.42 SL2 23 111 479 6 915 706 788 48.33 98.41 95.34 SL3 20 557 039 6 151 902 784 48.18 98.34 95.13 注：CL. 对照组；RL. 抗病组；SL. 易感组。
Note: CL. Control group; RL. Disease-resistant group; SL. Susceptible group.
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