Relationship between diurnal feeding rhythm and agrp gene expression level in Cyprinus carpio rubrofuscus
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摘要:
鱼类的摄食节律表现出种间甚至种内差异。为阐明华南鲤 (Cyprinus carpio rubrofuscus) 的昼夜摄食节律，为其室内标准化养殖方法的建立提供科学依据，研究了在自然光照下华南鲤的昼夜摄食节律以及刺鼠相关蛋白 (Agouti-related protein, AgRP) 基因表达水平与摄食昼夜节律的关系。采用分段连续投喂的方法对春分和秋分时节广州地区华南鲤的昼夜摄食量进行测定，运用实时荧光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR) 技术检测agrp基因在华南鲤脑、前肠、中肠和后肠中的昼夜表达节律特点。结果显示，春分和秋分时节华南鲤摄食量有相似的昼夜节律。春分时华南鲤的摄食量在8:00最低，分别在12:00和24:00出现摄食高峰；秋分时华南鲤的摄食量也在8:00最低，分别在12:00和20:00出现摄食高峰。qRT-PCR结果表明，agrp1和agrp2基因的表达量都具有昼夜节律。agrp1和agrp2在脑中的表达量分别在8:00和20:00最高，24:00和4:00最低。agrp1基因在前肠、中肠和后肠的表达量分别在16:00、20:00和24:00最高，8:00最低；agrp2基因在前、中、后肠的表达量分别在16:00、24:00、24:00最高，在12:00、4:00、20:00最低。综上，华南鲤摄食量最低时agrp1基因在脑中的表达量最高以促进后续摄食行为，在2次摄食高峰之间 (12:00—20:00) agrp1基因在前、中、后肠的表达量依次出现最高点，其变化趋势与食物在肠道中的运动过程一致，推测agrp1基因可能参与了华南鲤摄食昼夜节律的调控；而agrp2基因的表达水平与摄食节律无相关的变化趋势，推测agrp2基因在进化过程中可能出现了功能分化。
Abstract:Feeding rhythms in fish show inter- and even intra-species variation. In order to detect the circadian feeding rhythm of Cyprinus carpio rubrofuscus and to provide a scientific basis for the establishment of standardized indoor aquaculture methods, we investigated the circadian feeding rhythm of C. carpio rubrofuscus and the relationship between the expression level of Agouti-related protein (AgRP) gene and circadian feeding rhythm under natural light. Besides, we measured the food intake of C. carpio rubrofuscus during the spring and autumn equinoxes in Guangzhou by segmented continuous feeding. We applied quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to characterize the circadian expression profile of agrp genes in its brain, foregut, midgut and hindgut. The results show that the food intake of C. carpio rubrofuscus had a similar circadian rhythm, lowest at 8:00 in both spring and autumn equinoxes. Two feeding peaks appeared at 12:00 and 24:00 in spring equinox, and appeared at 12:00 and 20:00 in the autumn equinox. The qRT-PCR results show that the expressions of agrp1 and agrp2 genes had circadian rhythms, highest at 8:00 and 20:00 but lowest at 24:00 and 4:00 in brain. In foregut, midgut and hindgut, the highest agrp1 expression levels were observed at 16:00, 20:00 and 24:00, respectively, but the lowest level was observed at 8:00. The highest agrp2 expression levels were observed at 16:00, 24:00 and 24:00, but the lowest levels were observed at 12:00, 4:00 and 20:00. In conclusion, when the feeding intake level of C. carpio rubrofuscus was the lowest, the agrp1 gene had the highest expression level in brain to promote subsequent feeding behavior. Between the two feeding peaks (12:00−20:00), the expression levels of agrp1 reached the maximum in foregut, midgut and hindgut in turn. This trend was consistent with the movement of food in intestines. Therefore, the results suggest that agrp1 might be involved in the regulation of circadian feeding rhythm in C. carpio rubrofuscus. However, there was no correlation between expression level of agrp2 and feeding rhythm. It is indicated that agrp2 might have different functions in the evolutionary process.
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下丘脑外周和中枢信号共同作用调控脊椎动物的摄食行为和食欲变化[1]。自然环境下，鱼类为适应外部环境的日周期性变化而形成有特定规律的摄食活动[2]，称昼夜摄食节律。根据鱼类摄食时间的不同，将鱼类摄食节律分成4种类型：晨昏摄食、白天摄食、夜间摄食和无明显摄食[3]。鱼类的摄食节律表现出种间甚至种内差异。例如，舌齿鲈 (Dicentrarchus labrax) 在白天和夜间都存在摄食行为[4]，金鱼 (Carassius auratus) 白天进食夜间活动[5]，大盖巨脂鲤 (Colossoma macropomum) 表现为夜间摄食[6]，而大口胭脂鱼 (Ictiobus cyprinellus) [7]和青海湖裸鲤 (Gymnocypris przewalskii)[8]白天的摄食量明显高于夜晚。
刺鼠相关蛋白 (Agouti-related protein, AgRP) 是一种与动物食欲调节和能量代谢相关的神经肽，于1997年在智人 (Homo sapiens) 中发现的一种与刺豚鼠信号肽 (Agouti signalling peptide，ASIP：具有调节刺豚鼠皮肤颜色的功能) 氨基酸序列相似性约为25%的新蛋白，被命名为刺鼠相关蛋白[9]。目前，对人类和哺乳动物的AgRP已有较深入研究，其由位于下丘脑弓状核腹侧部[10]的AgRP/NPY 神经元合成[11]，通过接收并整合外周及中枢的信息，完成对摄食行为的调控[12]。研究表明，AgRP神经元是智人和小鼠 (Mus musculus) 昼夜摄食节律的时钟，对该神经元中细胞类型特异性转录组数据的研究表明，下丘脑AgRP时钟对协调进食有关键作用[13]。目前，对硬骨鱼类AgRP的研究主要集中在禁食对基因表达水平的影响。如禁食处理后金鱼和斑马鱼 (Danio rerio) 下丘脑中agrp基因的mRNA水平升高[14-15]。而对鲤 (Cyprinus carpio) 禁食处理后，脑中agrp mRNA水平下调，重新喂食又可使agrp mRNA的表达水平显著增加[16]。
华南鲤 (C. carpio rubrofuscus) 隶属于鲤形目、鲤科、鲤属，为鲤的4个亚种之一，主要分布在珠江流域、云南元江水系以及海南岛等区域[17-18]，为华南地区重要的稻田养殖鱼类，但目前尚未见华南鲤摄食节律的研究报道。由于春分和秋分的昼夜等长，对于分析自然光照条件下鱼类形成的昼夜摄食节律具有代表性，故本研究选择春分 (2023-03-21) 和秋分 (2023-09-23) 对自然光照、室内循环水养殖条件下的华南鲤昼夜摄食节律进行测定，并对食欲调节基因agrp1和agrp2在华南鲤前、中、后肠和脑中的昼夜表达水平变化进行分析，旨在阐明华南鲤的昼夜摄食节律，并揭示agrp1和agrp2基因表达水平与昼夜摄食节律的潜在关系，为华南鲤室内标准化养殖方法的建立提供理论支撑，并为深入研究鱼类昼夜摄食节律分子机制提供新思路和基础数据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验用鱼是由中国水产科学研究院珠江水产研究所良种基地于2022年12月繁殖并培育的华南鲤。
1.2 实验方法
1.2.1 华南鲤摄食昼夜节律的测定
在春分 (2023-03-21) 和秋分 (2023-09-23) 挑选30尾平均体质量为 (22.18±4.78) 和 (184.72±16.15) g的实验鱼转入室内，分别放入3个约100 L水体的玻璃鱼缸 (67 cm×45 cm×35.5 cm)，每箱10尾。使用加热棒将水温保持在28 ℃左右，期间对鱼缸不间断充氧，保持鱼缸中一直有饲料，暂养7 d后进行昼夜摄食节律的测定。摄食节律测定时采用分段式连续投喂法[19]，每4 h饱食投喂1次，每次投喂量春分为2 g、秋分为5 g，周期均为24 h。每次投喂后约45 min迅速捞出剩余饲料烘干，称质量记录数据 [饲料溶失率为13.53%，摄食量=投饵量−剩余饲料/(1−饲料溶失率)]，计算华南鲤的摄食量。此方法避免了解剖鱼体，可实现对同一组鱼的连续监测。
1.2.2 总RNA提取及cDNA合成
在春分摄食节律测定实验完成后第二天的4:00、8:00、12:00、16:00、20:00和24:00时，分别从每个鱼缸中随机捞出1尾鱼，用MS-222 (100 mg·L−1) 进行麻醉，快速解剖，取其脑和前、中、后肠，迅速置于液氮中保存，用于检测基因表达的节律性。另外，在8:00时，每个鱼缸再捞取1尾鱼取下丘脑、垂体、鳃、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、肠和肌肉，迅速置于液氮中保存，用于检测目标基因的组织表达水平。使用HiPure Universal RNA Kit (Magen，中国) 试剂盒提取上述各组织总RNA，其质量经过1% (w) 的琼脂糖凝胶电泳进行检测，随后使用酶标仪Cytation5 (Biotek，美国) 测其浓度。使用Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa，日本) 反转录试剂盒合成cDNA。
1.2.3 agrp基因扩增和生物信息学分析
根据华南鲤下丘脑转录组中的agrp基因序列和NCBI数据库中agrp基因mRNA序列 (GenBank: FR726953; GenBank: FR726954)，用Primer premier 5.0软件设计引物agrp1-F/R、agrp2-F/R (表1)。以agrp1-F/R、agrp2-F/R为引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物测序后用DNAMAN软件预测其编码的氨基酸序列。用Bioedit软件进行氨基酸序列比对分析，MEGA 7.0软件 (Neighbor-joining法) 构建系统进化树，ProtParam在线工具 (https://web.expasy.org/protparam/) 分析蛋白质理化性质，NetPhos在线工具 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) 预测蛋白质磷酸化位点，SOPMA在线工具 (https://npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html) 预测蛋白二级结构，SWISS-MODEL在线工具 (https://swissmodel.expasy.org/) 进行蛋白三维结构同源建模。
表 1 华南鲤agrp基因PCR所用引物Table 1. Primers used for agrp gene PCR amplifing in C. carpio rubrofuscus引物
Primer序列 (5'—3')
Sequence (5'–3')用途
Usage长度
Length/bpagrp1-F GTGGCTGAAGTTTATCTTGTTTT 扩增CDS 610 agrp1-R TGCATTCTTTATGCTTTGTGC agrp2-F AATGACGACGGCAGTGATGAA 扩增CDS 506 agrp2-R TCTTTTTGGACGATAAACAACATTT β-actinF GCCGTGACCTGACTGACTACCT qRT-PCR 273 β-actinR CGCAAGATTCCATACCCAAGA agrp1-qF AATAAACTCAGCAGAAGAAAAGC qRT-PCR 201 agrp1-qR TAACAGAAAGCCTTGAAGAAACG agrp2-qF AATGACGACGGCAGTGATGAA qRT-PCR 202 agrp2-qR CAGATAGCGAGTCCTGGCAAA 1.2.4 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)
根据agrp基因测序的结果，设计引物agrp1-qF/R和agrp2-qF/R (表1) 用于目标基因表达水平检测。选择华南鲤的β-actin基因 (GenBank: M24113.1) 作为qRT-PCR的内参基因。反应总体系为20 µL，包括 10µL TB Green (SYBR酶)，0.5 µL上下游引物 (10 µmol·L−1)，7 µL ddH2O和2 µL模板cDNA。反应在LightCycler®96 Instrument荧光定量PCR仪上进行，反应程序为95 ℃预变性10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；溶解曲线，使用仪器默认采集程序。每个样品设置3个技术重复，采用2 −ΔΔCT 法计算目的基因在不同组织中的相对表达量。
1.2.5 数据分析
使用SPSS Statistics 24软件对华南鲤昼夜摄食量和基因的相对表达量数据进行单因素方差分析 (One-way ANOVA) 和Duncan's法进行组间多重比较，相关性分析采用双变量Pearson检验。结果用“平均值±标准差($\overline { x}\pm s $)”表示，显著性水平α为0.05。
2. 结果
2.1 华南鲤摄食昼夜节律
在广州地区自然光照人工养殖条件下，华南鲤摄食节律结果 (图1) 显示，春分和秋分时节，华南鲤摄食量均有较明显的昼夜节律。在检测的6个时间段中，春分时华南鲤的摄食量在8:00 (8:00表示8:00—8:45，摄食实验中各时间段均采用此方式表示) 最低，12:00达到最高峰，16:00为第1摄食低谷，20:00摄食量稍有增加，24:00出现第2个摄食高峰。经Duncan's多重比较分析，16:00、20:00、24:00、4:00这4个时间段的摄食量差异不明显 (P>0.05)，8:00的摄食量显著高于其余时间段，12:00的摄食量与其余时间段差异显著 (P<0.05)。秋分时华南鲤的摄食量也在8:00最低，2个摄食高峰分别出现在12:00和20:00，与春分不同的是，摄食量的最高峰出现在20:00。经Duncan's多重比较分析，12:00、16:00、24:00这3个时间段的摄食量差异不明显 (P>0.05)，20:00的摄食量显著高于其余时间点，8:00和4:00的摄食量显著低于其余时间点 (P<0.05)。从总体变化趋势来看，春分和秋分时节摄食节律变化趋势相似。经过6个月的生长，随着华南鲤体质量的增大摄食量增加，秋分时节的摄食量明显高于春分。
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图 1 华南鲤在春分和秋分的摄食节律注：相同字母表示差异不显著 (P>0.05)，相邻字母表示差异显著 (P<0.05)，相隔字母表示差异极显著 (P<0.01)。Figure 1. Feeding rhythm of C. carpio rubrofuscus during spring and autumn equinoxesNote: The same letters represent no significant differences (P>0.05); adjacent letters represent significant differences (P<0.05); separated letters represent significant differences (P<0.01).2.2 AgRP氨基酸序列和其蛋白结构
PCR扩增和测序结果表明，华南鲤agrp1基因的编码区（CDS）为387 bp，推测编码128个氨基酸 (图2-a)，分子质量为14.80 kD，理论等电点 (pI) 为6.15。有16个带负电荷的氨基酸残基 (Asp+Glu)和13个带正电荷的氨基酸残基 (Arg+Lys)。华南鲤agrp2基因的CDS为411 bp，预测编码136个氨基酸 (图2-b)，分子质量为15.33 kD，pI 为9.58。带负电荷的氨基酸残基 (Asp+Glu) 有7个，带正电荷的氨基酸残基 (Arg+Lys) 有20个。AgRP1和AgRP2蛋白二级结构预测结果表明，AgRP1肽链中α-螺旋占60.94%，β-折叠占0.78%，无规则卷曲占37.50%，延伸链占0.78%；AgRP2肽链中α-螺旋占47.06%，β-折叠占4.41%，无规则卷曲占47.06%，延伸链占1.47%，在AgRP蛋白三维结构同源建模图 (图3) 中可以更直观地看出AgRP2比AgRP1少了1段α-螺旋。
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图 2 华南鲤agrp1和agrp2核酸序列及其编码的氨基酸序列Figure 2. Nucleotide and predicted amino acid sequences of agrp1 and agrp2 in C. carpio rubrofuscus![]()
图 3 华南鲤AgRP1和AgRP2蛋白三维结构图Figure 3. Three-dimensional structure of AgRP1 and AgRP2 proteins in C. carpio rubrofuscus2.3 同源性比较与进化树
蛋白氨基酸序列多重比较结果显示，6种鱼类的AgRP1、AgRP2与智人、小鼠、鸡 (Gallus gallus) 的AgRP同源性很低，只有16个氨基酸位点是完全相同的，其中包含10个半胱氨酸的保守位点 (图4)。同源性比较分析表明，华南鲤AgRP1氨基酸序列与其他5种已知硬骨鱼的AgRP1同源性介于84.09%~95.31%，AgRP2氨基酸序列与其他5种已知硬骨鱼的AgRP2同源性介于81.62%~94.85%，均有较高的同源性。但华南鲤Agrp1和AgRP2的同源性仅为48.15%，而华南鲤AgRP1与智人、小鼠、鸡的AgRP同源性分别为36.51%、42.19%、 42.72%；AgRP2与智人、小鼠、鸡的AgRP同源性分别为50.00%、42.72%、50.00%。通过MEGA 7.0软件构建华南鲤与其他11个物种AgRP的系统进化树 (图5) ，结果显示，硬骨鱼类AgRP1先聚为一支，再与哺乳类 (智人和小鼠)、鸟类 (鸡) AgRP聚为一支，最后才与硬骨鱼类AgRP2聚为一支。
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图 4 不同物种AgRP氨基酸序列的多重比较Figure 4. Multiple alignment of AgRP amino acid sequences of different species![]()
图 5 不同物种AgRP氨基酸序列构建的系统进化树Figure 5. Phylogenetic tree base on alignment of amino acid sequences of AgRP2.4 agrp1和agrp2基因的组织分布
采用qRT-PCR技术检测了在8:00时agrp1和agrp2基因在华南鲤脑、下丘脑、垂体、心、肝、脾、胃、肾、肠、肌肉和鳃 9个组织中的相对表达情况。结果显示，agrp1基因在华南鲤下丘脑中的表达量最高，垂体和肝脏中的表达量次之，肾脏、心、脾、肠中的表达量依次减少，在鳃中的表达量最低 (图6-a)；agrp2基因在华南鲤下丘脑的表达量最高，肌肉和鳃中表达量次之，垂体、肝脏、心、肠、肾中的表达量依次减少，脾中的表达量最低 (图6-b)。由此可以明显看出agrp1和agrp2基因在组织分布上有各自的特点。
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图 6 agrp1和agrp2基因在不同组织中的相对表达量注：相同字母表示差异不显著 (P>0.05)，相邻字母表示差异显著 (P<0.05)，相隔字母表示差异极显著 (P<0.01)。Figure 6. Relative expression of agrp1 gene and agrp2 gene in different tissuesNote: The same letters represent no significant differences (P>0.05); adjacent letters represent significant differences (P<0.05); separated letters represent significant differences (P<0.01).2.5 agrp1和agrp2在脑、肠中表达水平的昼夜节律
agrp1和agrp2基因在神经系统的脑及消化系统的前、中、后肠中6个时间段的表达量检测结果显示 (图7)，agrp1基因在脑中8:00的表达量最高且显著高于其他时间点，12:00其相对表达量降至8:00的约1/60，12:00—20:00表达量呈现上升趋势，20:00的表达量约为8:00的1/8，24:00的表达量是整个昼夜节律的最低点，约为8:00的1/120，4:00的表达量升高，约为8:00的1/23；agrp1基因在前肠和中肠中的表达量都呈现先升高后下降的趋势，其表达量在8:00之后逐渐升高，16:00和20:00处于高水平且显著高于其他时间点，20:00以后开始下降；agrp1基因在后肠中的表达量8:00最低，8:00之后表达量开始升高，24:00的表达量达到最高，之后降低，4:00的表达量约为24:00的1/6。agrp2基因在脑中的表达量从8:00到20:00逐渐降低，20:00的表达量最低，之后开始升高，4:00的表达量最高，约为20:00的10倍；agrp2基因在前肠中的表达量在12:00最低且显著低于其他时间点，在16:00、20:00和24:00表达量较高，约为8:00的2倍，24:00之后表达量降低，4:00的表达量约为8:00的1/2；agrp2基因在中肠和后肠中的表达量变化基本一致，在24:00的表达量在整个时间段中均处于最高水平。双变量Pearson检验结果显示：华南鲤摄食量与agrp1基因在脑中的表达量呈负相关 (r=−0.751, P<0.05)；摄食量与agrp2基因在脑中的表达量无明显相关性 (r=−0.216, P>0.05)。
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图 7 agrp1和agrp2基因在脑、肠中表达量的昼夜变化注：相同字母表示差异不显著 (P>0.05)，相邻字母表示差异显著 (P<0.05)，相隔字母表示差异极显著 (P<0.01)。Figure 7. Diurnal changes in expression of agrp1 and agrp2 genes in brain and intestinesNote: The same letters represent no significant differences (P>0.05); adjacent letters represent significant differences (P<0.05); separated letters represent significant differences (P<0.01).3. 讨论
3.1 华南鲤昼夜摄食节律特征
鱼类的摄食节律是一种内源性节律[20]，短期内不因生态因子的改变而改变，但是会受到外界环境 (如光照、水温、溶解氧和饲料等) 变化的影响，使鱼体能够适应新环境[21]。本研究结果显示 (图1)，春分和秋分时节华南鲤摄食量有相似的昼夜节律，春分时华南鲤的摄食量在8:00最低，12:00和24:00出现2个摄食高峰；秋分时华南鲤的摄食量也在8:00最低，但2个摄食高峰分别出现在12:00和20:00。刘家寿[22]对池塘养殖环境下野鲤和杂交鲤摄食节律的研究结果表明，鲤的摄食活动在12:00—20:00较强，峰值出现在16:00，而4:00的摄食量最低，认为池塘中溶解氧水平和天然饵料丰度的变化会影响鲤的摄食节律。本研究的摄食实验在室内光线充足的循环水养殖系统中进行，溶解氧水平稳定；分段连续投喂保持饲料供应稳定，所以得到的摄食节律与刘家寿[22]在池塘环境中测定的结果不同。另外，不同季节也能造成鱼类昼夜摄食节律改变，舌齿鲈[23]和大西洋鲑(Salmo salar)[24]在温暖的夏季白天摄食活动较强，冬季夜间摄食活动较强。而华南鲤春分和秋分摄食节律类似，可能是由于广州地区春分与秋分温差较小，且实验中养殖水体的温度恒定在28 ℃左右。
人工养殖过程中，经常根据鱼类摄食节律来调整投喂时间、投喂量以此有效提高饲料利用率。本研究中摄食节律结果显示，12:00和20:00是华南鲤的摄食高峰期，投喂饵料的时间宜在12:00和20:00各投喂1次。
3.2 华南鲤agrp基因序列及AgRP蛋白结构
四足动物agrp基因为单拷贝，全基因组加倍事件使鱼类agrp基因出现两个拷贝，分别命名为agrp1和agrp2[25-26]，华南鲤中也扩增到了agrp1和agrp2两个同源基因。蛋白三维结构预测结果显示 (图4)，AgRP1有2个α螺旋而AgRP2只有1个α螺旋。如图5所示，华南鲤AgRP和其他8个物种的11个AgRP氨基酸序列C端都存在10个保守的半胱氨酸残基。半胱氨酸残基可形成对蛋白质三级结构的稳定性具有重要作用[27]的二硫键，推测这段序列高度保守可能为AgRP蛋白的同源结构域。对于富含半胱氨酸残基的保守区域以外的序列，AgRP1和AgRP2氨基酸序列之间存在较大差异。华南鲤AgRP1蛋白包含7个丝氨酸磷酸化位点和2个苏氨酸磷酸化位点，而AgRP2包含3个丝氨酸磷酸化位点和5个苏氨酸磷酸化位点，特定丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸化是调节大多数蛋白质活性的重要翻译后修饰，苏氨酸与丝氨酸磷酸化位点则是蛋白质行使功能的关键组件[28]。基于蛋白三维结构建模、进化树分析结果和磷酸化位点预测，推测华南鲤agrp1和agrp2的基因序列和其蛋白结构已发生分化。
3.3 华南鲤agrp1和agrp2基因具有不同的组织表达谱
本研究显示 (图7)，agrp1和agrp2基因在华南鲤下丘脑中的表达量最高，这与红鳍东方鲀 (Takifugu rubripes) [29]、金钱鱼 (Scatophagus argus) [30]和金鱼[16]的结果相似。因此，与其他硬骨鱼类相似，华南鲤的下丘脑也是调节食欲和代谢平衡的关键组织。在舌齿鲈中，agrp1基因主要在脑、卵巢和后肾中表达，agrp2基因主要在脑中表达[31]。Shainer等[32]研究表明，斑马鱼下丘脑agrp1神经元调节摄食，松果体agrp2有独特的分泌能力，并可作为神经内分泌因子参与应激调节，能够减少皮质醇的分泌。Jeong等[33]发现agrp2基因在斑马鱼中参与伪装机制的调节。本研究中华南鲤的agrp1和agrp2基因在鳃和肌肉中的表达量具有明显的差异，由于华南鲤的agrp1和agrp2的基因序列和其蛋白结构已发生分化，推测华南鲤agrp基因在进化过程中也产生了功能分化。
3.4 华南鲤agrp1和agrp2基因表达与昼夜摄食节律的相关性
食欲调节是一个复杂的过程，由肠脑轴通过下丘脑食欲中枢和胃肠道食欲激素来调节动物的食欲[34]。因此，本研究选择神经系统的脑和消化系统的前、中、后肠作为探究摄食节律的组织。结果表明，华南鲤的agrp基因在脑和肠中的表达量具有昼夜节律，对食欲可能存在短期的瞬时调节作用。已有研究显示，短期禁食后齐口裂腹鱼 (Schizothorax prenanti) 与正常喂养组相比，下丘脑agrp基因表达水平显著升高[35]，金钱鱼在饥饿7 d后下丘脑的agrp1基因表达水平显著下调[30]。本研究中agrp1基因在脑中的表达量在8:00最高，推测8:00华南鲤的神经中枢脑感知到饥饿，促食因子agrp1基因表达量最高，激发觅食行为使华南鲤的摄食量增加；反之，12:00华南鲤达到摄食量的最高峰时和夜间华南鲤摄食量出现第2次峰值后，agrp1基因在脑中的表达水平较低，推测此时华南鲤达到饱食状态，对食物的需求量下降，agrp1基因的表达水平下调以减弱觅食行为。可见饥饿状态下，agrp1基因在不同物种中对摄食调节存在差异性，但其对摄食调控的具体机制仍待进一步研究。另外，对agrp1基因与肠道中食欲信号相关的研究发现，小鼠肠道分泌的胆汁酸能够调节agrp基因的启动子区域，以控制葡萄糖稳态[36]。硬骨鱼胃肠道的信号 (如饱腹感) 亦能影响agrp基因的表达水平，例如，大西洋鲑的胃干质量与下丘脑agrp1 mRNA表达水平呈显著负相关性[37]。本研究结果显示，agrp1基因在华南鲤前、中、后肠中的表达量分别在16:00、20:00、24:00最高，推测其表达量变化可能与食物在肠道内的运动过程相关并维持葡萄糖稳态。综上，华南鲤agrp1基因在脑和肠中呈现不同的表达模式，推测其在不同组织中可能具有不同的潜在功能。在舌齿鲈[31]、金钱鱼[30]和大西洋鲑[38]中均发现，饥饿后agrp2基因的表达量无显著变化。本研究中agrp2基因在脑、肠中的表达量也存在昼夜节律性，但其表达水平与摄食节律无相关的变化趋势，这可能是由于华南鲤的agrp1和agrp2基因在进化过程中出现了功能分化。一项对舌齿鲈摄食调节的研究发现，禁食未诱导脑中agrp1基因表达的变化，但增加了agrp2基因的表达[39]，说明在其他硬骨鱼中agrp1和agrp2基因也出现了功能分化的情况。
由于agrp1和agrp2基因表达具有昼夜变化规律，在设计实验方法时应重视其昼夜节律性特点，取样时间点的设置对研究的准确性尤为重要。已有研究表明，agrp1基因在大西洋鲑中对食欲的调节存在争议：禁食6 d后其脑中agrp1基因的表达量下降[38]，但另一项对大西洋鲑禁食3 d的研究发现，其下丘脑agrp1基因的表达水平显著上调[37]。上述研究结果的差异可能由取样时间点不同所致。
4. 结论
华南鲤的摄食量和agrp基因的表达水平均具有昼夜节律。agrp1基因在脑和肠中的表达水平变化与昼夜摄食节律相关，推测该基因可能参与了华南鲤摄食昼夜节律调控的分子机制。而agrp2基因表达水平的昼夜节律变化与摄食的相关性不明显。本研究结果为形成食欲调控因子表达模式的假说提供了可靠的研究数据。此外，后续对agrp这样有昼夜表达水平节律的基因进行研究时，需要关注实验组和对照组取样的时间点，使实验结果更为准确可信。掌握华南鲤昼夜摄食节律将有助于制定水产养殖中的最佳摄食时间表，即在食物能够被更有效地摄入时进行投喂，从而减少饲料浪费，提高生产效率。
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图 1 华南鲤在春分和秋分的摄食节律
注：相同字母表示差异不显著 (P>0.05)，相邻字母表示差异显著 (P<0.05)，相隔字母表示差异极显著 (P<0.01)。
Figure 1. Feeding rhythm of C. carpio rubrofuscus during spring and autumn equinoxes
Note: The same letters represent no significant differences (P>0.05); adjacent letters represent significant differences (P<0.05); separated letters represent significant differences (P<0.01).
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图 2 华南鲤agrp1和agrp2核酸序列及其编码的氨基酸序列
Figure 2. Nucleotide and predicted amino acid sequences of agrp1 and agrp2 in C. carpio rubrofuscus
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图 3 华南鲤AgRP1和AgRP2蛋白三维结构图
Figure 3. Three-dimensional structure of AgRP1 and AgRP2 proteins in C. carpio rubrofuscus
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图 4 不同物种AgRP氨基酸序列的多重比较
Figure 4. Multiple alignment of AgRP amino acid sequences of different species
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图 5 不同物种AgRP氨基酸序列构建的系统进化树
Figure 5. Phylogenetic tree base on alignment of amino acid sequences of AgRP
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图 6 agrp1和agrp2基因在不同组织中的相对表达量
注：相同字母表示差异不显著 (P>0.05)，相邻字母表示差异显著 (P<0.05)，相隔字母表示差异极显著 (P<0.01)。
Figure 6. Relative expression of agrp1 gene and agrp2 gene in different tissues
Note: The same letters represent no significant differences (P>0.05); adjacent letters represent significant differences (P<0.05); separated letters represent significant differences (P<0.01).
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图 7 agrp1和agrp2基因在脑、肠中表达量的昼夜变化
注：相同字母表示差异不显著 (P>0.05)，相邻字母表示差异显著 (P<0.05)，相隔字母表示差异极显著 (P<0.01)。
Figure 7. Diurnal changes in expression of agrp1 and agrp2 genes in brain and intestines
Note: The same letters represent no significant differences (P>0.05); adjacent letters represent significant differences (P<0.05); separated letters represent significant differences (P<0.01).
表 1 华南鲤agrp基因PCR所用引物
Table 1 Primers used for agrp gene PCR amplifing in C. carpio rubrofuscus
引物
Primer序列 (5'—3')
Sequence (5'–3')用途
Usage长度
Length/bpagrp1-F GTGGCTGAAGTTTATCTTGTTTT 扩增CDS 610 agrp1-R TGCATTCTTTATGCTTTGTGC agrp2-F AATGACGACGGCAGTGATGAA 扩增CDS 506 agrp2-R TCTTTTTGGACGATAAACAACATTT β-actinF GCCGTGACCTGACTGACTACCT qRT-PCR 273 β-actinR CGCAAGATTCCATACCCAAGA agrp1-qF AATAAACTCAGCAGAAGAAAAGC qRT-PCR 201 agrp1-qR TAACAGAAAGCCTTGAAGAAACG agrp2-qF AATGACGACGGCAGTGATGAA qRT-PCR 202 agrp2-qR CAGATAGCGAGTCCTGGCAAA 
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