Preliminary exploration of Balaenoptera edeni edeni population distribution in surrounding waters of Weizhou Island based on environmental DNA
-
摘要:
鲸类作为海洋生态系统中的顶级捕食者，是维持海洋生态平衡和生态稳定的关键物种。广西涠洲岛布氏鲸 (Balaenoptera edeni edeni) 是中国近海唯一稳定出现的须鲸种群，但其栖息地分布现状尚不明确。由于布氏鲸活动能力强、分布范围广，目视监测难以进行稳定跟踪调查。基于此，结合环境DNA (Environmental DNA, eDNA) 技术，监测了不同时期 (2022年4月和2023年1月) 涠洲岛布氏鲸栖息地的分布现状。研究发现，4月在布氏鲸的热点分布海域 (涠洲岛—斜阳岛之间) 目视和eDNA均发现布氏鲸存在 (n=3)，同时在涠洲岛西南海域也发现布氏鲸存在 (n=2)，其中有1个站位仅eDNA检测到；1月在布氏鲸的热点分布海域目视和eDNA均发现布氏鲸存在 (n=1)，涠洲岛东部海域仅eDNA检测到布氏鲸存在 (n=1)。结果表明，eDNA技术相比目视具有更高的灵敏度，可用于验证布氏鲸的分布，同时发现涠洲岛东部和西南部海域是布氏鲸的潜在热点分布海域。该研究验证了eDNA技术在涠洲岛布氏鲸分布监测上的可行性，进一步明确了涠洲岛布氏鲸栖息地的分布现状，为其种群的高效监测和科学保护提供了基线信息。
Abstract:Cetaceans, as apex predators in marine ecosystems, play a key role in maintaining ecological balance and stability. The Eden's whale (Balaenoptera edeni edeni) in Weizhou Island is the only baleen whales population that consistently appears in the waters near China. However, their specific distribution around Weizhou Island remains unclear. Due to their extensive range and active behavior, conducting stable tracking surveys via visual means is challenging. Thus, through environmental DNA (eDNA) technology, we assessed the distribution status of Eden's whales habitats around Weizhou Island during different periods (April 2022 and January 2023). The study reveals that in April, Eden's whales were visually observed and detected via eDNA in the hotspot distribution area (Between Weizhou Island and Xieyang Island) (n=3). They were also found in the southwest waters of Weizhou Island (n=2), with one site solely identified via eDNA. In January, Eden's whales were visually observed through eDNA in the hotspot distribution area (n=1) and detected through eDNA in the eastern waters off Weizhou Island (n=1). The findings indicate that compared with visual observation, eDNA technology exhibited higher sensitivity and could be utilized to verify the distribution of Eden's whales. Furthermore, potential hotspot distribution areas for Eden's whales were identified in the eastern and southwestern waters off Weizhou Island. In conclusion, this research validates the feasibility of utilizing eDNA technology for monitoring the distribution of Eden's whales around Weizhou Island. Besides, it provides further clarification regarding the distribution status of Eden's whales habitats around Weizhou Island, which supplies essential baseline information for the effective monitoring and scientific conservation of this population.
-
低氧环境影响鱼类的生存、生长、繁殖和代谢等生命活动[1-3]。为适应低氧环境，鱼类在长期进化中形成了一系列的低氧适应机制，由低氧诱导因子 (Hypoxia inducible factor, HIF) 介导的低氧信号传导途径在环境缺氧应答机制中起主导作用[4]。血红素加氧酶1 (Heme oxygenase 1, HO1) 是血红素降解过程中的起始酶和限速酶，可将血红素降解形成胆绿素、一氧化碳 (CO) 和游离铁，这三种代谢产物均是机体重要的生物效应分子，可以保护细胞免受氧化应激损伤[5]；ho1是HIF信号通路的靶基因之一，具有重要生物学功能。目前，ho1序列及其表达特征已在多种鱼类中报道，如斑马鱼 (Danio rerio)[6]、舌齿鲈 (Dicentrarchus labrax)[7]、卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus)[8]、团头鲂 (Megalobrama amblycephala)[9]、南亚野鲮 (Labeo rohita)[10]等。研究表明，鱼类ho1在低氧刺激下能够为细胞提供保护作用。如鲫 (Carassius auratus) ho1对于抗低氧诱导的细胞凋亡具有重要作用，可保护细胞应对低氧刺激[11]；ho1可调节金鱼 (C. auratus) 对低氧的呼吸反应[12]；斑马鱼ho1可通过抗细胞凋亡发挥低氧保护作用[13]。
梭鲈 (Sander lucioperca) 隶属鲈形目、鲈科、梭鲈属，具有生长速度快、抗病能力强、肉质细嫩、营养价值高[14]等特点，在欧洲具有较高的市场认可度[15]。20世纪 90 年代我国梭鲈人工繁育取得成功，目前在东北、西北、华北、华东、华南等地区均有养殖，已成为我国重要的淡水名优养殖鱼类。梭鲈为凶猛性鱼类，性情急躁，应激反应强烈，对低氧极为敏感。研究显示，梭鲈养殖的最佳溶解氧 (DO) 质量浓度为7~9 mg·L−1[16]，因此在集约化养殖和苗种运输过程中容易发生低氧应激、死亡等现象。目前，关于梭鲈对低氧的耐受性及其适应机制研究报道较少，Baekelandt 等[17]研究发现，养殖水域的DO质量浓度为4~6 mg·L−1时，梭鲈的采食量和生长速度均降低；Nadine等[3]报道，在DO质量浓度为3.2 mg·L−1的缺氧环境中，梭鲈头肾中淋巴细胞数量下降，头肾和肝脏中的免疫和应激基因 (包括 fth1、hif1a 和nr3c1) 表达量下调。可见低氧显著影响到梭鲈的生长、免疫调节等重要生命活动，但有关梭鲈低氧应激分子机制的研究尚不多见，血红素加氧酶1在低氧胁迫下的响应机制尚不清楚。本研究通过对梭鲈低氧相关基因ho1的克隆及序列特征分析，探讨了梭鲈ho1在各组织中的表达模式，并检测了低氧、复氧下皮肤、鳃、心、肾、肝、脑中ho1的表达规律，以期为梭鲈养殖、运输等技术研发提供数据支持，同时也为梭鲈耐低氧机制研究、耐低氧育种提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
实验用梭鲈来自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所呼兰试验场。选取体格健壮、体表无伤、规格基本一致的1龄梭鲈220尾，体质量 (73±6) g，体长 (200±10) mm，于实验室循环水系统水族箱中暂养7 d，正常投喂配合饲料。暂养期间，保持DO质量浓度大于8 mg·L−1，水温 (18±0.2) ℃。实验前禁食24 h。
1.2 低氧胁迫与恢复试验
取30尾实验鱼，放入密闭水族箱中，用于测试“浮头点”。低氧胁迫前，采用YSI多功能水质分析仪测得DO质量浓度为9.9 mg·L−1，水温18 ℃。停止增氧，观察鱼的活动情况，当实验鱼开始因低氧而浮在水面吞食空气时，则达到“浮头点”，此时水中DO质量浓度为3.5 mg·L−1。因此，本实验将低氧胁迫DO质量浓度设定为3.5 mg·L−1。
取90尾实验鱼平均放至于3个循环水族箱中作为常氧对照组 (DO质量浓度10 mg·L−1)，90尾实验鱼平均放至于3个密闭水族箱中作为低氧胁迫组 (DO质量浓度3.5 mg·L−1)。停止增氧，向水中持续充氮气 (N2)，使水体DO质量浓度降至3.5 mg·L−1，之后调节氮气 (N2) 与氧气 (O2)充入量使水体DO质量浓度保持在 (3.5±0.3) mg·L−1，维持9 h。每间隔15 min用水质分析仪监测水体温度、pH、DO、氨氮 (
${\rm{NH}}_4^+ $ -N)等。低氧实验结束后，将胁迫组梭鲈转至3个循环可控水族箱中 (DO质量浓度10 mg·L−1)，进行常氧恢复实验，并维持12 h。此次实验均使用直径30 cm、长100 cm的水族箱，且放置1个气石；除水族箱中DO条件存在差异，其他水质条件均一致。1.3 样品采集和保存
用 MS-222对实验鱼进行麻醉，分别在常氧对照组，低氧胁迫第3、第6、第9小时，常氧恢复第0.5、第1、第2、第3、第6、第9、第12小时，在每个水族箱随机选取3尾鱼，采取皮肤、肌肉、心、肝、肾、肠、脑、鳃组织样本，并迅速投入液氮中冷冻备用。
1.4 总RNA提取及cDNA第一链的制备
将皮肤、肌肉、心、肝、肾、肠、脑、鳃组织样品从液氮罐取出，剪取1~2 mg置于事先加入500 μL Trizol的离心管中，使用手持匀浆仪 (QIAGEN) 匀浆至无颗粒状态，参考Trizol法提取样品总RNA。利用紫外分光光度计 (NanoDrop 8000) 及1.2% (质量分数) 琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度及完整性 (图1)。
使用 PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 试剂盒 (TaKaRa) 去除基因组DNA、反转录合成cDNA第一链，于−80 ℃保存备用。
1.5 梭鲈ho1基因全长cDNA的获得
根据NCBI数据库中河鲈 (Perca fluviatilis)、舌齿鲈及其他鲈科鱼类ho1基因的cDNA序列，选择保守区域与梭鲈转录组数据库进行序列比对，获得梭鲈ho1基因的部分cDNA序列。利用Primer 3 Plus软件设计PCR特异性引物 (表1)，以梭鲈鳃组织cDNA为模板，对其开放阅读框 (Open reading frame, ORF) 进行PCR扩增，用 1.2% (质量分数) 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 (图2)，参考胶回收试剂盒 (康为世纪) 纯化目的片段，再连接至PMD-18T载体 (TaKaRa)、转入E. coli DH5α感受态细胞 (TaKaRa)，使用LB培养基 (含氨苄) 筛选阳性克隆，并测序验证。
表 1 引物序列Table 1. Primers used in this study基因
Gene目的
Purpose引物
Primer引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')退火温度
Annealing temperature/℃ho1 ORF扩增 ho1-F1 GGAGCCAGAGAAGAAGACTCAG 59.8 ho1-R1 TGCAGCTCGTTTTCAGTGAC 60.2 ho1 RACE扩增 5'GSP ACACCGGGGAAGGCGAAGAATGAC 72.0 5'nGSP CACTGGGGTGGTTGGAGTTCCTGTC 70.9 3'GSP GAGGGCAGGTCCTGGGTCGAATC 71.2 3'nGSP ATGGGGCTAAAGGGCAGCGAAGGTC 73.2 ho1 RT-PCR ho1-F1 CTGTGCTCGCTGTATGAGGT 59.1 ho1-R1 CCAGTCCTGGCCATAGAAGT 59.2 gapdh RT-PCR gapdh1-F ATGTTCGTCATGGGCGTCAA 60.0 gapdh1-R CAGGCCCTCAATGATGACGA 60.0 ![]()
图 2 梭鲈ho1基因PCR扩增产物电泳图Figure 2. Electrophoresis of PCR products of ho1 in S. lucioperca根据已获得梭鲈ho1基因ORF序列设计RACE (Rapid amplification of cDNA ends) 引物，参考SMARTer® RACE 5'/3'试剂盒 (TaKaRa) 说明书构建 RACE文库。使用SeqAmpTM DNA Polymerase (TaKaRa) 试剂盒并结合巢氏PCR法进行 RACE 扩增 (图2)。扩增产物的回收纯化及克隆同以上ORF序列的获得。引物合成及菌落测序均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
测序结果经BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 比对，DNAMAN 软件拼接、分析，最终获得梭鲈ho1基因全长cDNA序列。
1.6 梭鲈ho1基因序列的生物信息学分析
使用NCBI上ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 工具查找各基因开放阅读框，进一步推导出氨基酸序列。使用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) 和NCBI在线工具查找基因的蛋白功能结构域。通过EXPASY (https://web.expasy.org/protparam/) 在线分析软件分析功能域、分子式、理论等电点、信号肽、蛋白疏水性、跨膜结构、蛋白质二级结构等。采用DNAMAN软件进行氨基酸序列多重对比；使用MEGA 7.0软件的邻接法 (Neighbor-Joining method, NJ) 构建系统发育进化树, 其中Bootsrap (1 000次) 得出各分支置信度。
1.7 梭鲈ho1在各组织表达规律分析
为确定梭鲈ho1的组织表达特异性模式，根据已获得ho1基因的编码序列设计RT-PCR (Real-time quantitative PCR) 引物 (表1)，以梭鲈gapdh为内参基因，以上获得各组织的cDNA为模板，使用TB Green® Premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus) 试剂盒 (TaKaRa)，ABI 7500 荧光定量 PCR 仪，检测梭鲈ho1基因在常氧对照、低氧胁迫及复氧中各个组织的表达情况，每个样本至少设置3个平行。采用2−∆∆Ct法[18]计算目的基因的相对表达量，SPSS 17.0 软件中的单因素方差分析 (One-way ANOVA) 方法对数据进行处理和检验分析，P<0.05表示差异显著。
组织样本总RNA的提取、cDNA第一链的制备，方法参考1.4.1。
2. 结果
2.1 梭鲈ho1基因全长cDNA序列分析
根据基因保守序列的同源扩增法、RACE技术，经克隆拼接，得到梭鲈ho1基因全长cDNA序列。
梭鲈ho1 cDNA序列全长1 256 bp，包括840 bp的开放阅读框、162 bp的5'非编码区 (5'-UTR) 和254 bp的3'-UTR，编码279个氨基酸，在3'-UTR区PolyA上游43 bp处有一个“AATAAA”加尾信号。梭鲈HO1蛋白分子式为C1412H2253N377O424S12，相对分子质量31.68 kD，理论等电点(pI) 6.04，其中异亮氨酸(Leu)含量最高，占比12.5%。蛋白总平均亲水性为 −0.288，不稳定系数为40.59，说明该蛋白为亲水性不稳定蛋白。经TMHMM和Signal.4预测，HO1蛋白无信号肽位点，N末端第256—第278位氨基酸处有一个跨膜结构域(图3)，前255个氨基酸位于细胞膜内，第279位氨基酸在细胞膜外，说明HO1在细胞中具有跨膜转运的功能。除此之外，SMART在线工具推测出梭鲈HO1还拥有一个Pfam功能结构域(图3)，位于第17—第221位氨基酸，是HO1蛋白发挥其催化功能的区域，也是血红素加氧酶家族共有的保守功能域。
![]()
图 3 梭鲈ho1基因cDNA全长序列及推导的氨基酸序列Figure 3. Nucleotide and predicted protein sequences of ho1 of S. lucioperca2.2 氨基酸序列比对及系统发育进化树的构建
使用Blast在线分析工具对梭鲈ho1编码的蛋白进行同源性搜索，发现不同物种HO1氨基酸序列有较高相似度(图4)，梭鲈HO1与翘嘴鳜 (Siniperca chuatsi)、舌齿鲈、大口黑鲈 (Micropterus salmoides)、大菱鲆 (Scophthalmus maximus)、军曹鱼 (Rachycentron canadum) 同源性分别为91.84%、88.69%、88.11%、87.28%、84.77%。在NJ系统发育进化树中(图5)，梭鲈先与鲈形目鱼类聚在一起，再与鸟纲、两栖纲、爬行纲聚为一支，而哺乳动物则单独聚为另一支。
![]()
图 4 梭鲈与其他物种HO1氨基酸同源性比对Figure 4. Multiple alignment of HO1 amino acid sequences between S. lucioperca and other species![]()
图 5 基于不同物种HO1氨基酸序列构建的系统发育进化树 (NJ法)Figure 5. Phylogenetic tree based on HO1 amino acid sequences of different species (Neighbor-Joining method)2.3 梭鲈ho1基因在不同组织的表达模式
利用实时荧光定量PCR技术检测梭鲈ho1基因在组织中 (皮肤、肌肉、心、肝、肾、肠、脑、鳃)的表达情况，结果显示 (图6)，常氧条件下ho1广泛分布于各个组织，但出现明显的组织差异性。ho1在脑中的表达量最高，且相较其他组织呈现极显著性差异 (P<0.01)；其次是肝、肾、鳃、肠，而在皮肤和肌肉中的表达量较少。
![]()
图 6 梭鲈ho1在各组织的相对表达量注：图中数值为“平均值±标准差”(N=3)，不同字母表示组间差异极显著(P<0.01)，后图同此。Figure 6. Relative expression of ho1 in different tissues of S. luciopercaNote: The values are "$ { {\overline X } \pm {\minifont \rm{SD}}}$" (N=3). Different letters indicate extremely significant differences among the tissues (P<0.01). The same below.2.4 低氧胁迫和复氧对梭鲈ho1表达的影响
在低氧胁迫过程中，ho1在梭鲈皮肤、鳃中的变化更迅速，其表达量极显著升高 (图7-a、7-b)，分别在第3、第6小时迅速升至最高点，而后开始下降；复氧第0.5小时，皮肤ho1持续下降，鳃ho1则显著升高，之后均呈现升高-降低的表达趋势，但鳃组织的相对表达量变化较不稳定；至复氧第9小时，ho1在梭鲈皮肤、鳃中表达量基本可恢复至正常水平。在低氧胁迫前3 h，梭鲈心、肾、肝中ho1无显著性变化 (图7-c、7-d、7-e)，3 h后表达量才开始升高，在低氧第6、第9小时均显著高于正常水平；复氧后均呈现出降低-升高-降低的变化趋势，且极显著高于对照组 (P<0.01)；心、肾中ho1在复氧第6、第9小时后与对照组无显著性差异 (P>0.05)，而肝ho1表达量直至复氧第12小时也未恢复至正常状态，仍与对照组有极显著差异。梭鲈脑中ho1在低氧期间的相对表达量呈降低-升高-降低趋势 (图7-f)，胁迫第3、第9小时的表达量均低于对照组，且差异显著 (P<0.05)；复氧的前3 h，梭鲈脑中ho1先上调再下调；3 h后ho1在脑中表达量逐渐升高，6 h后与对照组无显著性差异 (P>0.05)。
![]()
图 7 急性低氧胁迫与常氧恢复下梭鲈ho1在组织中表达变化Figure 7. Expression of ho1 in S. lucioperca under acute hypoxia stress and normoxia recovery3. 讨论
3.1 梭鲈ho1序列特征生物信息学分析
目前对血红素加氧酶1的作用及其分子机制的研究已取得一定进展，但主要集中于肿瘤、癌症等人类疾病，近年来水产动物中的HO1研究也日益受到关注。本研究在梭鲈中克隆得到ho1的cDNA序列，并进行生物信息学分析。梭鲈ho1全长1 256 bp，包括840 bp的ORF、162 bp的5'-UTR和254 bp的3'-UTR，共编码279个氨基酸，为亲水性不稳定蛋白。梭鲈HO1蛋白有一个Pfam功能结构域，是血红素加氧酶家族共有的保守功能域[19]，也是HO1发挥其催化功能的区域；同时HO1蛋白的N末端有一个跨膜结构域，具有跨膜转运功能。有报道称，人HO1的C端被裂解后，可转移到细胞核内，参与由氧化应激介导的表达调控[20]，梭鲈HO1可能有着与之相似的功能。氨基酸序列比对发现，梭鲈与河鲈、鲤 (Cyprinus carpio)、智人 (Homo sapiens) 等不同物种的 HO1序列有较高相似度；系统发育进化树也表明梭鲈HO1与翘嘴鳜、舌齿鲈和大口黑鲈的氨基酸序列相似性分别为91.84%、88.69%和88.11%，与鲈科鱼类亲缘关系最近，与哺乳动物亲缘关系最远。蛋白结构及同源性分析皆显示梭鲈ho1在进化上具有一定的保守性，推测ho1基因在不同物种间可能发挥着相似的生物学功能。
3.2 梭鲈ho1在不同组织的表达分析
基于ho1属于低氧应激基因，参与哺乳动物多种生理病理调节过程，近年来有关鱼类ho1与环境低氧适应的研究也相继被报道。利用RT-PCR检测ho1在梭鲈脑中的相对表达量最高，在皮肤、肌肉中最少，这与斑马鱼ho1的有关报道一致[6]。有研究报道，哺乳动物脑组织中血红素加氧酶1蛋白水平较高[21]，这也提示ho1可能还具有维持神经元稳态和保护神经元免受应激损伤的作用；但是舌齿鲈脑中ho1表达活性则较低，说明脑组织中血红素加氧酶1的基因表达模式具有较大的物种差异性[7]。ho1在梭鲈肝脏中也具有高表达特性，而在大多数不直接参与红细胞或血红蛋白代谢的皮肤、肌肉中表达水平较低，这与哺乳动物的研究结果一致[22]，可能是因为肝脏是血浆中血红蛋白、血红素摄取和降解部位[23]。Lu等[24]还发现，草鱼 (Ctenopharyngodon idella) ho1主要在免疫器官中表达，并在抗菌免疫和炎症调节中发挥作用。
3.3 低氧胁迫和复氧对梭鲈ho1基因表达影响
在探究梭鲈血红素加氧酶1对低氧的生理响应中发现，ho1的表达变化与组织类型有关。低氧胁迫前期，梭鲈呼吸频率增加，而ho1在与呼吸有关的组织——皮肤、鳃中也最先作出响应，其相对表达量快速升高，分解血红素速率加快；但梭鲈心、肝、肾中ho1在低氧胁迫3 h后才显著上调。有研究报道，低温低氧条件下，金鱼呼吸频率、鳃化学感应神经上皮细胞中ho1表达量显著提高[25]；Li等[26]发现，热应激时梭鲈肌肉、鳃中热休克蛋白70 (Heat shock protein 70, Hsc70) 水平的变化比其他组织更快；也有研究表明，低氧胁迫下鲢 (Hypophthalmichthys molitrix)、青海湖裸鲤 (Gymnocypris przewalskii) 心、肝、肾的超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶 (Catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (Glutathione peroxidase, GSH-Px)活性快速升高[27-28]。因此，在低氧应激前3 h，ho1主要在梭鲈皮肤、鳃中发挥作用，可以通过调节气体交换、能量代谢、物质循环等过程，来保护机体免受氧化应激损伤；此时心、肝、肾组织或许主要通过提高抗氧化酶活性来抵御低氧应激。持续低氧3 h后，梭鲈ho1在皮肤、鳃中逐渐下调，而在心、肝、肾中则开始显著上调；可能是持续低氧导致梭鲈鳃组织受损，ho1也无法正常行使其抗应激保护功能；多项研究显示，低氧胁迫可使舌齿鲈[29]、卵形鲳鲹[30]鳃组织发生病变，并影响其生理功能。因而低氧刺激3 h后，ho1主要在梭鲈心、肝、肾中发挥转录调控作用，可能参与调节其磷酸化途径、提高细胞自噬能力来保护组织免受损伤[31-33]。梭鲈脑则与其他组织不同，在低氧胁迫第3、第9小时，ho1的表达受到短暂抑制，这与Guan等[9]报道的低氧可使团头鲂脑ho1的表达量降低的研究结果类似；说明在低氧胁迫下，ho1在梭鲈脑中具有独特的调节机理，但是否与脑细胞的凋亡机制有关还需深入研究。
在常氧恢复阶段，梭鲈皮肤、心、肝、肾ho1的相对表达量均在复氧0.5 h内迅速下降，之后均再次升高，说明这些组织通过持续高表达ho1来补偿或缓冲由常氧恢复而造成的应激，使生物体尽快恢复至稳定状态以发挥正常的生理功能[34]。复氧第12小时，肝ho1的表达水平仍高于对照组，说明长时间低氧对梭鲈肝组织产生的氧化应激影响较大，但是否引起肝损伤，还有待深入探讨；其他组织在复氧第12小时后ho1相对表达量基本可恢复至正常，与胁迫前无显著性差异，这与低氧对鱼类组织学、抗氧化酶活性的研究结果相一致[35-37]。梭鲈鳃ho1在复氧过程中表现出复杂的变化，在恢复伊始，ho1表达量迅速升高又降低，可能是水体DO突然增多，直接提高了鳃瓣上皮细胞氧气的摄入量，需要更多的血红素降解产物参与氧气的运输，形成了一定的应激性变化；但1 h后，梭鲈显然未完全恢复，再次上调ho1的表达以避免因常氧应激造成的组织损伤，使鳃组织尽快恢复以维持机体各项生理机能的正常运转。
综上所述，梭鲈ho1具有较高的保守性，与其他硬骨鱼类高度同源。ho1在梭鲈多个组织中广泛表达，但响应低氧应激时具有组织及时间差异性。低氧刺激前3 h，梭鲈ho1主要在皮肤、鳃中发挥作用，其变化更灵敏；低氧胁迫3 h后，ho1主要在梭鲈心、肝、肾中发挥转录调控作用，且低氧刺激对梭鲈肝组织ho1的表达产生了较大影响。
-
![]()
图 1 涠洲岛周围海域eDNA采样站点图
Figure 1. Map of eDNA sampling sites in sea area around Weizhou Island
![]()
图 2 布氏鲸线粒体COI基因部分序列及5对引物设计位点
Figure 2. Partial sequence of Eden's whale mitochondrial COI gene and design sites of five primers
![]()
图 3 布氏鲸目击站点eDNA扩增结果
注：A 1、A2表示目击站点；1、2表示重复样本；P1—P5表示引物。
Figure 3. Eden's whale eDNA amplification of sighting sites
Note: A1, A2 represent sighting sites; 1, 2 represent replicate samples; P1−P5 represent primers.
![]()
图 4 预设采样站点布氏鲸eDNA扩增结果
注：a、b、c、d、e分别为引物P1、P2、P3、P4、P5扩增胶图；1、2、3表示重复样品；B12—B26表示预设采样站点。
Figure 4. Eden's whale eDNA amplification of preset sampling sites
Note: a, b, c, d, e represent primers of P1, P2, P3, P4 and P5 amplification gels; 1, 2, 3 represent replicate samples; B12−B26 represent pre-defined sampling sites.
表 1 布氏鲸线粒体COI目的片段扩增引物信息
Table 1 Primers information for target fragment of Eden's whale mitochondrial COI
引物
Primer引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'−3')扩增长度
Amplification length/bp延伸时间
Extension time/s退火温度
Annealing temperature/℃P1 F: CTGACTATTCTCAACCAACCACAAA
R: GGGGGACTAGTCAGTTTCCGAAT222 16 58 P2 F: CTGACTATTCTCAACCAACCACAAA
R: GATTATCACAAAGGCGTGGGCTG184 14 58 P3 F: GACCTTACCATCTTCTCCCTACATCT
R: ACAGGTAACGATAGTAGGAGTAGCA173 13 58 P4 F: TTTGGTGCATGAGCAGGAATAGTAG
R: GGGGGACTAGTCAGTTTCCGAAT190 14 58 P5 F: GTATCCTCAATCCTCGGAGCCATC
R: TTTAGGTTTCGGTCAGTAAGTAGCA185 14 58 
下载: 导出CSV
表 2 不同引物在北部湾鲸类中的特异性检验
Table 2 Specificity testing of different primers for cetacean species in Beibu Gulf
搁浅鲸类
Stranded cetacean引物P1
Primer P1引物P2
Primer P2引物P3
Primer P3引物P4
Primer P4引物P5
Primer P5布氏鲸 Balaenoptera edeni edeni √ √ √ √ √ 小鳁鲸 B. acutorostrata √ — × — — 长吻真海豚 Delphinus capensis × × × × × 短吻真海豚 D. delphis × × × × × 里氏海豚 Grampus griseus × × × × × 伪虎鲸 Pseudorca crassidens × × × × × 中华白海豚 Sousa chinensis × × × × × 热带斑海豚 Stenella attenuata × × × × × 长吻飞旋海豚 S. longirostris × × × × × 糙齿海豚 Steno bredanensis × × × × × 印太宽吻海豚 Tursiops aduncus × × × × × 宽吻海豚 T. truncatus × × × × × 印太江豚 Neophocaena phocaenoides × × × × × 注：“×”表示在选定数据库中未匹配到目标序列；“√”表示在选定数据库中匹配到目标序列；“—”表示检测出的所有目标序列均有碱基差异。 Note: "×" represents the absence of the target sequence in the selected database; "√" represents the presence of the target sequence in the selected database; "—" represents that all detected target sequence exhibit variations in nucleotide bases.
下载: 导出CSV
表 3 布氏鲸COI基因片段测序比对结果
Table 3 Sequencing and alignment results of Eden's whale COI gene fragment
站点
Sampling site重复
Repetition引物 Primer P1 P2 P3 P4 P5 A1 1 * — — * — A1 2 布氏鲸 布氏鲸 布氏鲸 布氏鲸 布氏鲸 A2 1 布氏鲸 布氏鲸 布氏鲸 布氏鲸 布氏鲸 A2 2 布氏鲸 布氏鲸 布氏鲸 布氏鲸 布氏鲸 B12 1, 2, 3 池鹭 (2) — — — — B16 1, 2, 3 — — — — — B17 1, 2, 3 家鸡 (3) — — — — B19 1, 2, 3 — — — 沙丁鱼属 (1, 3) — B20 1, 2, 3 — — — — — B21 1,2,3 — — — — — B26 1, 2, 3 池鹭 (1, 3) — — — — 注：“—”表示未扩增出布氏鲸；“*”表示扩增出目标条带但测序失败。 Note: "—" represents that B. edeni edeni have not been amplified; "*" represents successful amplification of the target band, but sequencing was unsuccessful.
下载: 导出CSV
-
[1] HOYT E. Whale watching 2001: wordwide tourism number, expenditures, and expanding socioeconomic benefits[M]. Yarmouth Port, MA, USA: International Fund for Animal Welfare (IFAW), 2001: 13-14.
[2] POLOCZANSKA E S, BROWN C J, SYDEMAN W J, et al. Global imprint of climate change on marine life[J]. Nat Clim Chang, 2013, 3(10): 919-925. doi: 10.1038/nclimate1958
[3] PECL G T, ARAUJO M B, BELL J D, et al. Biodiversity redistribution under climate change: Impacts on ecosystems and human well-being[J]. Science, 2017, 355: 6332.
[4] WEELDEN C V, TOWERS J R, BOSKER T. Impacts of climate change on cetacean distribution, habitat and migration[J]. Clim Chang Ecol, 2021, 1: 100009.
[5] LI M, WANG X X, HUNG S K, et al. Indo-Pacific humpback dolphins (Sousa chinensis) in the Moyang River Estuary: the western part of the world's largest population of humpback dolphins[J]. Aquat Conserv: Mar Freshw Ecosyst, 2019, 29(5): 798-808. doi: 10.1002/aqc.3055
[6] ZURIEL Y E, AVSHALOM N L, RIJN I V, et al. Multi-year passive acoustic monitoring of coastal dolphins along the Israeli Mediterranean shallow shelf reveals the impact of marine fish farms and trawling patterns on their habitat utilization[J]. Mar Environ Res, 2023, 188: 106014. doi: 10.1016/j.marenvres.2023.106014
[7] BOHMANN K, EVANS A, GILBERT M T, et al. Environmental DNA for wildlife biology and biodiversity monitoring[J]. Trends Ecol Evol, 2014, 29(6): 358-367. doi: 10.1016/j.tree.2014.04.003
[8] BENG K C, CORLETT R T. Applications of environmental DNA (eDNA) in ecology and conservation: opportunities, challenges and prospects[J]. Biodivers Conserv, 2020, 29(7): 2089-2121. doi: 10.1007/s10531-020-01980-0
[9] KUMAR G, EBLE J E, GAITHER M R. A practical guide to sample preservation and pre-PCR processing of aquatic environmental DNA[J]. Mol Ecol Resour, 2020, 20: 29-39. doi: 10.1111/1755-0998.13107
[10] BESSEY C, JARMAN S N, SIMPSON T, et al. Passive eDNA collection enhances aquatic biodiversity analysis[J]. Commun Biol, 2021, 4: 236-248. doi: 10.1038/s42003-021-01760-8
[11] TANG Y K, WU Y S, LIU K, et al. Investigating the distribution of the Yangtze finless porpoise in the Yangtze River using environmental DNA[J]. PLoS One, 2019, 14(8): e0221120. doi: 10.1371/journal.pone.0221120
[12] VALSECCHI E, BYLEMANS J, GOODMAN S J, et al. Novel universal primers for metabarcoding environmental DNA surveys of marine mammals and other marine vertebrates[J]. Environ DNA, 2020, 2(4): 460-476. doi: 10.1002/edn3.72
[13] ZOU K S, CHEN J W, RUAN H T, et al. eDNA metabarcoding as a promising conservation tool for monitoring fish diversity in a coastal wetland of the Pearl River Estuary compared to bottom trawling[J]. Sci Total Environ, 2020, 702: 134704. doi: 10.1016/j.scitotenv.2019.134704
[14] CHEN M, HUANG S L, WU H P, et al. Occurrence of Bryde's whales, Balaenoptera edeni, in the northern Beibu Gulf, China[J]. Mar Mammal Sci, 2019, 35(4): 1643-1652. doi: 10.1111/mms.12607
[15] CHEN B Y, ZHU L, JEFFERSON T A, et al. Coastal Bryde's whales' (Balaenoptera edeni) foraging area near Weizhou Island in the Beibu Gulf[J]. Aquat Mamm, 2019, 45(3): 274-279. doi: 10.1578/AM.45.3.2019.274
[16] ZHANG Y Y, CHEN M, CHEN M, et al. Community-based population monitoring for large baleen whales: the case study of Bryde's whale in Beibu Gulf of China[J]. Integr Zool, 2021, 16(4): 626-635. doi: 10.1111/1749-4877.12525
[17] 吴采雯. 广西布氏鲸的种群动态及捕食策略研究[D]. 南京: 南京师范大学, 2021: 1-6. [18] 何如, 黄梅丽, 罗红磊, 等. 近五十年来广西海岛的气候变化与气象灾害特征分析[J]. 气象研究与应用, 2015, 36(2): 31-35, 39. doi: 10.3969/j.issn.1673-8411.2015.02.006 [19] 黎广钊, 梁文, 农华琼, 等. 涠洲岛珊瑚礁生态环境条件初步研究[J]. 广西科学, 2004(4): 379-384. [20] YE J, COULOURIS G, ZARETSKAYA I, et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction[J]. BMC Bioinform, 2012, 13: 134. doi: 10.1186/1471-2105-13-134
[21] LIU M M, LIN M L, LI S H. Species diversity and spatiotemporal patterns based on cetacean stranding records in China, 1950–2018[J]. Sci Total Environ, 2022, 822: 153651. doi: 10.1016/j.scitotenv.2022.153651
[22] 李红婷, 张帅, 邹柯姝, 等. 珠江河口水体环境DNA提取方法的建立及优化[J]. 南方水产科学, 2022, 18(3): 30-37. doi: 10.12131/20210304 [23] VISSER F, MERTEN V J, BAYER T, et al. Deep-sea predator niche segregation revealed by combined cetacean biologging and eDNA analysis of cephalopod prey[J]. Sci Adv, 2021, 7: eabf5908. doi: 10.1126/sciadv.abf5908
[24] 王学昉, 孟维钊, 王丛丛, 等. 环境DNA技术在长江口水生生物监测中的应用潜力[J]. 应用海洋学学报, 2021, 40(3): 547-554. [25] PARSONS K M, EVERETT M, DAHLHEIM M, et al. Water, water everywhere: environmental DNA can unlock population structure in elusive marine species[J]. R Soc Open Sci, 2018, 5(8): 180537. doi: 10.1098/rsos.180537
[26] SZÉKELY D, CORFIXEN N L, MØRCH L L, et al. Environmental DNA captures the genetic diversity of bowhead whales (Balaena mysticetus) in West Greenland[J]. Environ DNA, 2021, 3(1): 248-260. doi: 10.1002/edn3.176
[27] BAKER C S, STEEL D, NIEUKIRK S, et al. Environmental DNA (eDNA) from the wake of the whales: droplet digital PCR for detection and species identification[J]. Front Mar Sci, 2018, 5: 133. doi: 10.3389/fmars.2018.00133
[28] JERDE C L, MAHON A R, CHADDERTON W L, et al. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA[J]. Conserv Lett, 2011, 4(2): 150-157. doi: 10.1111/j.1755-263X.2010.00158.x
[29] AKRE T S, PARKER L D, RUTHER E, et al. Concurrent visual encounter sampling validates eDNA selectivity and sensitivity for the endangered wood turtle (Glyptemys insculpta)[J]. PLoS One, 2019, 14(4): e0215586. doi: 10.1371/journal.pone.0215586
[30] 吴昀晟, 唐永凯, 李建林, 等. 环境DNA在长江江豚监测中的应用[J]. 中国水产科学, 2019, 26(1): 124-132. [31] FOOTE A D, THOMSEN P F, SVEEGAARD S, et al. Investigating the potential use of environmental DNA (eDNA) for genetic monitoring of marine mammals[J]. PLoS One, 2012, 7(8): e41781. doi: 10.1371/journal.pone.0041781
[32] WELTZ K, LYLE J M, OVENDEN J, et al. Application of environmental DNA to detect an endangered marine skate species in the wild[J]. PLoS One, 2017, 12(6): e0178124. doi: 10.1371/journal.pone.0178124
[33] GOLDBERG C S, STRICKLER K M, PILLIOD D S. Moving environmental DNA methods from concept to practice for monitoring aquatic macroorganisms[J]. Biol Conserv, 2015, 183: 1-3. doi: 10.1016/j.biocon.2014.11.040
[34] JIANG P W, ZHANG S, XU S N, et al. Comparison of environmental DNA metabarcoding and bottom trawling for detecting seasonal fish communities and habitat preference in a highly disturbed estuary[J]. Ecol Indic, 2023, 146: 109754. doi: 10.1016/j.ecolind.2022.109754
[35] THOMSEN P F, KIELGAST J, IVERSEN L L, et al. Monitoring endangered freshwater biodiversity using environmental DNA[J]. Mol Ecol, 2012, 21: 2565-2573. doi: 10.1111/j.1365-294X.2011.05418.x
[36] ZHANG S, CAO Y T, CHEN B Y, et al. Assessing the potential use of environmental DNA for multifaceted genetic monitoring of cetaceans: example of a wandering whale in a highly disturbed bay area[J]. Ecol Indic, 2023, 148: 110125. doi: 10.1016/j.ecolind.2023.110125
[37] DEINER K, BIK H M, MACHLER E, et al. Environmental DNA metabarcoding: transforming how we survey animal and plant communities[J]. Mol Ecol, 2017, 26(21): 5872-5895. doi: 10.1111/mec.14350
[38] GOLDBERG C S, TURNER C R, DEINER K, et al. Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species[J]. Methods Ecol Evol, 2016, 7(11): 1299-1307. doi: 10.1111/2041-210X.12595
[39] ALLENTOFT M E, COLLINS M, HARKER D, et al. The half-life of DNA in bone: measuring decay kinetics in 158 dated fossils[J]. Proc Biol Sci, 2012, 279(1748): 4724-4733.
[40] MAUVISSEAU Q, HARPER L R, SANDER M, et al. The multiple states of environmental DNA and what is known about their persistence in aquatic environments[J]. Environ Sci Technol, 2022, 56(9): 5322-5333. doi: 10.1021/acs.est.1c07638
[41] MATHESON C D, GURNEY C, ESAU N, et al. Assessing PCR inhibition from humic substances[J]. Open Enzym Inhib J, 2010, 3: 38-45.
[42] SHAW J L A, CLARKE L J, WEDDERBURN S D, et al. Comparison of environmental DNA metabarcoding and conventional fish survey methods in a river system[J]. Biol Conserv, 2016, 197: 131-138. doi: 10.1016/j.biocon.2016.03.010
[43] REES H C, MADDISON B C, MIDDLEDITCH D J, et al. Review: the detection of aquatic animal species using environmental DNA−a review of eDNA as a survey tool in ecology[J]. J App Ecol, 2014, 51(5): 1450-1459. doi: 10.1111/1365-2664.12306
[44] 刘玉香, 宋晓琛, 江香梅. 润楠ISSR-PCR优化反应体系建立及引物筛选[J]. 林业科技开发, 2013, 27(5): 24-28. [45] 彭雷, 赵艳, 马银花. 基于巢式PCR的重叠延伸PCR优化[J]. 安徽农业科学, 2016, 44(20): 126-127. [46] SIGSGAARD E E, CARL H, MØLLER P R, et al. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples[J]. Biol Conserv, 2015, 183: 46-52. doi: 10.1016/j.biocon.2014.11.023
[47] 李莎, 刘雪清, 姜伟, 等. 环境DNA技术在宜昌江段四大家鱼自然繁殖中的应用[J]. 应用生态学报, 2021, 32(6): 2241-2248. [48] ZHANG Y Y, SUN X D, NONG Z W, et al. The first baleen whale marine protected area proposed for Bryde's whales in the Beibu Gulf, China[J]. Mar Mammal Sci, 2023: 1-17.
[49] BUSTIN S A, BENES V, GARSON J A, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments[J]. Clin Chem, 2009, 55(4): 611-622. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797
[50] WHALE A S, HUGGETT J F, COWEN S, et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation[J]. Nucleic Acids Res, 2012, 40(11): e82. doi: 10.1093/nar/gks203
-
期刊类型引用(2)
1. 史磊，罗伟杰，黄瑜，雷美华，喻大鹏，简纪常，黄浦江. 斜带石斑鱼源致病溶藻弧菌的分离鉴定及病理性分析. 广东农业科学. 2024(07): 91-104 . 
百度学术
2. 曹海鹏，顾颖，孙苗苗，王会聪，叶仁智，安健. 中华绒螯蟹养殖用抑水绵枯草芽孢杆菌A4的安全性分析. 淡水渔业. 2023(05): 104-112 . 百度学术
其他类型引用(5)
计量
- 文章访问数: 154
- HTML全文浏览量: 29
- PDF下载量: 47
- 被引次数: 7
粤公网安备 44010502001741号
