Study on tributyrin enhancing anti periodic high temperature stress ability of gill tissue in Litopenaeus vannamei
-
摘要:
在水产养殖中，周期性高温 (Periodic high temperature, PHT) 对虾类的生物学功能会产生显著影响。鳃作为虾类的呼吸和代谢器官，在维持体内渗透平衡方面具有关键作用，但其功能易受高温等环境变化的干扰。为了探究有效的对虾PHT应对策略，研究了三丁酸甘油酯 (Tributyrin, TB) 对PHT [(34±1) ℃, 7 d] 胁迫下凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 鳃组织形态和生理功能的影响。结果表明，PHT胁迫导致了显著的鳃组织损伤，诱导了氧化应激反应，进而造成内质网应激、细胞凋亡以及渗透调节功能障碍。不同饲喂策略下 (胁迫前饲喂三丁酸甘油酯7 d；每天饲喂三丁酸甘油酯；胁迫后饲喂三丁酸甘油酯7 d)，鳃组织损伤程度均显著减轻，同时氧化应激水平降低。此外，三丁酸甘油酯还正向调节了PHT诱导的氧化应激、内质网应激、细胞凋亡以及渗透调节基因的相对表达水平。尤其是每天饲喂三丁酸甘油酯能够有效保持鳃组织形态完整和生理功能稳定。
Abstract:Periodic high temperature (PHT) has a significant effect on biological function of shrimps in aquaculture. Gill, as the respiratory and metabolic organ of shrimp, plays a key role in maintaining the osmotic balance in fish body. However, its function is easily disturbed by environmental changes such as high temperature. In order to investigate effective strategies against PHT in shrimp, we investigated the effects of tributyrin (TB) on the morphology and physiological function of gill tissue of Litopenaeus vannamei under PHT [(34±1) ℃, 7 d] stress. The results show that PHT stress caused significant gill tissue damage and induced oxidative stress, which in turn caused endoplasmic reticulum stress, apoptosis and osmotic regulation dysfunction. With different feeding strategies (Feeding tributyrin for 7 d before stress, feeding tributyrin every day including 7 stressed days, and feeding tributyrin for 7 d after stress), the degree of gill tissue damage decreased significantly, so did the level of oxidative stress. In addition, tributyrin positively regulated the relative expression levels of oxidative stress, endoplasmic reticulum stress, apoptosis and osmoregulation genes which were induced by PHT. In particular, daily feeding tributyrin was effective in maintaining the morphological integrity of gill tissues and stable physiological functions.
-
Keywords:
- Litopenaeus vannamei /
- Tributyrin /
- Periodic high temperature /
- Gill /
- Histologic changes /
- Physiological function
-
小黄鱼 (Larimichthys polyactis)为我国最常见的海水鱼类之一，年产量达20万吨[1]。其肉质细嫩，富含蛋白质、多种维生素以及有益于心血管健康的不饱和脂肪酸，还含有丰富的钙 (Ca)、磷 (P)、锌 (Zn)等矿物质[2]，对骨骼和身体发育有益，因此深受消费者喜爱。然而，小黄鱼含有大量的内源酶[3]和嗜冷微生物，这类微生物繁殖能力超强，会加快鱼肉腐烂，但在冷藏环境下其繁殖速度下降。因此，为了延长小黄鱼产品的保质期，需要利用冷冻储存维持其新鲜度。然而，当前我国的冷藏运输系统仍面临着一些挑战，如智能化水平不高、流程不完整以及追踪存储信息的能力有限等，这些问题使得监控冷藏运输过程中鱼肉的新鲜度变得至关重要。高品质的鱼肉不仅能促进鱼类市场的发展，还能对人类健康产生积极影响。
传统鱼肉品质的评价指标包括K值、颜色、组胺、pH、新鲜度[4-5]等，这些指标所采用的检测方法均存在效率低、准确率不高、破坏样本等问题。随着科技发展，高效、快速、准确的新鲜度检测方法备受关注，例如电子鼻技术[6]、感官仿真技术[7-8]、计算机视觉检测技术等。其中计算机视觉检测技术具有无损、无害、快速等特点[9]，能够对生产线上的鱼肉产品质量进行快速、精准、无损的检测，因而得到广泛应用。
小黄鱼在储存期间，其挥发性盐基氮(TVB-N)的含量随着鱼肉腐败发生变化，最终反映在颜色、纹理、光泽、形态等特征上，以上几个特征可以通过图像得到体现[10]。图像识别技术可以通过对大量标记的肉类图像进行训练和模型学习，将不同的外观特征与新鲜度指标进行关联。通过提取图像特征[11]和运用深度学习算法，实现对新鲜度进行预测和分类。焦俊等[12]提出一种基于改进残差网络的黑毛猪肉的新鲜度识别方法，采用迁移学习和数据扩充的方式，模型总体识别准确率达到94.5%。Amin等[13]以AlexNet模型为基础，使用迁移学习法实现了水果新鲜度的自动分类，在3个公开数据集上准确率均达到98%以上。Liu[14]以虾为研究对象，提出一种基于AlexNet的Deep-ShrimpNet卷积神经网络的模型，实现了对虾新鲜度的评估。Banwari等[15]利用鱼眼颜色变化和新鲜度之间的相关性，通过计算机视觉技术实现了鱼类新鲜度检测96.67%的准确率。李振波等[16]提出了一种改进VGG-19神经网络，对4 ℃冷藏条件下冰鲜银鲳 (Pampus argenteus)新鲜度评估的准确率达到99.79%。Taheri等[17]利用卷积神经网络提取鲤 (Cyprinus carpio) 图像的特征信息，实现了对鲤新鲜度的智能分类。上述研究均证明了将深度学习应用于水产和食品行业新鲜度检测的可能性。
计算机视觉技术是食品工业领域重点应用的技术之一[18]。以深度学习理论为基础的计算机视觉技术具有强大的特征提取能力和分析计算能力。本研究针对水产品新鲜度检测存在的问题，以DenseNet-121作为主干网络，并在其基础上改进和优化。首先，测定小黄鱼的理化指标——TVB-N，并根据行业标准判断所拍摄图像的新鲜度等级，构建小黄鱼新鲜度数据集。其次，对网络结构进行改进，在网络中的每个Denseblock模块中融入SENet注意力机制模块，加强网络在分类任务中对重要特征的提取能力，以提高网络的分类准确率。用3个3×3的卷积核代替网络第一层7×7的卷积核，通过堆叠多个小卷积核增加了网络的非线性能力和特征表达能力，进一步提高识别准确率。为了解决网络梯度更新过程中出现梯度消失的问题，用PReLU激活函数替换原网络中的ReLU激活函数，提高了模型的鲁棒性。最后，将以上3种改进方法结合，构成了小黄鱼新鲜度识别模型 (FishNet)，通过实验验证了FishNet网络模型的有效性，达到了高效、准确识别的目标。
1. 材料与方法
神经网络需要大量数据支持才能进行有效的识别和分类工作。为解决小黄鱼图像数据和新鲜度标签信息较少的问题，本研究通过测定小黄鱼的TVB-N来确定其新鲜度，并据此对小黄鱼图像进行新鲜度等级判定。在数据集构建过程中，严格控制采集环境的温、湿度条件，并依据SC/T 3101—2010《鲜大黄鱼、冻大黄鱼、鲜小黄鱼、冻小黄鱼》划分小黄鱼的新鲜度等级。
1.1 样本制备
样本购于舟山国际水产城，将100尾体质量约80 g的小黄鱼在0.5 h内运送到食品安全研究实验室，运输期间严格控制运输环境条件。到达实验室后，将鱼体宰杀，去除内脏，清洗血迹，每10尾鱼放入1个样品袋中，共10个样品袋，之后储存于4 ℃的恒温环境下。实验期间，每天从所有样品中随机抽取3个样品测定TVB-N，其余的鱼用于图像采集，每晚18:00测量，连测7 d。
1.2 TVB-N测定
鱼肉的腐烂与其体内的内源性酶和腐败细菌密切相关，两者含量越高则鱼肉的TVB-N越大，相对应的鱼肉腐烂就越严重。TVB-N是检测鱼类新鲜度的理化指标[19-20]，其测定方法如下：
首先，从样品袋中随机抽取3尾小黄鱼，去除鱼骨、鱼刺，取可食部分剁碎后加入蒸馏水并搅拌、振荡后静置让其缓慢沉淀。之后，按照全自动凯氏定氮仪操作说明书运行仪器，依据GB 5009.228—2016自动凯氏定氮仪法测定小黄鱼的TVB-N，共测3个样品，取平均值。最后，完成测定后及时清洗仪器并记录每天所测结果。TVB-N的计算公式为：
$$ \mathrm{T}\mathrm{V}\mathrm{B}{\text{-}}\mathrm{N}{\text{=}}\frac{14\left({V}_{1}{\text{−}}{V}_{2}\right)C}{m}\times 100 $$ (1) 式中：C为盐酸质量浓度 (mg·L−1)；m为样品质量 (g)；V1为试液消耗盐酸标准溶液的体积 (mL)；V2为试剂空白消耗盐酸标准滴定溶液体积 (mL)。
1.3 小黄鱼新鲜度等级划分
根据SC/T 3101—2010 的规定：TVB-N≤13 mg·100 g−1阶段内的小黄鱼肉质新鲜可食用；13 mg·100 g−1 <TVB-N≤30 mg·100 g−1为合格品，表明该阶段小黄鱼肉质较为新鲜可食用；TVB-N>30 mg·100 g−1为不合格品，小黄鱼肉质已经腐烂不可食用。表1列出了4 ℃条件下每天随机抽取的小黄鱼TVB-N随时间的变化情况，第3天小黄鱼的TVB-N为15.26 mg·100 g−1 >13 mg·100 g−1，表明在微生物作用下，第3天的小黄鱼样品新鲜度等级由新鲜转合格，第6天TVB-N为47.36 mg·100 g−1 >30 mg·100 g−1，其肉质已腐败。
表 1 4 ℃储存条件下小黄鱼TVB-N变化Table 1. Change of TVB-N value of L. polyactis at 4 ℃ storage mg·100 g−1时间
t/d样品1
Sample 1样品2
Sample 2样品3
Sample 3平均值
Mean1 9.70 10.10 10.40 10.06 2 12.10 12.10 12.90 12.36 3 15.30 14.90 15.60 15.26 4 21.80 21.40 22.10 21.76 5 29.70 29.50 29.20 29.46 6 47.60 46.70 47.80 47.36 7 68.90 72.40 74.20 71.83 1.4 图像预处理
1.4.1 原始数据集制作
为了能够拍摄到清晰的小黄鱼图像，将2盏LED酷毙灯固定在样本上方，以获得均匀的采光效果。同时为确保采集图像的标准化，成像设备与样本之间的采集距离统一固定在25 cm，以俯视角度拍摄。每天于固定时间从冷藏箱中取出样品，用专用纸巾擦去表面水分。小黄鱼图像数据采集共7 d，将每天拍摄的图片按照新鲜度等级评判标准划分为一级品、合格品、不合格品3类，共采集图片932 张，图片尺寸为3 024×4 032像素，由于高分辨率的图片送入卷积神经网络会占据较大内存并增加训练时长，因此使用图像处理工具对图片统一缩放，图片的格式为JPG。
1.4.2 数据集增强
为模拟不同识别场景，增强模型学习鲁棒性特征的能力，提高模型识别准确率和降低过拟合的风险，本实验采用高斯噪声、翻转、对比度增强、亮度增强、旋转等5 种数据扩增方法。增强前、后各等级的图像数量如表2所示。
表 2 增强前后小黄鱼新鲜度图像数量Table 2. Freshness images of small yellow croaker before and after enhancement数据集
Dataset一级品
First-grade
products合格品
Qualified
products不合格品
Unaccepted
products总数量
Total
number增强前
Before enhancement300 325 307 932 增强后
After enhancement1 500 1 625 1 535 4 660 1.4.3 数据集划分
分别对3个等级的图像进行数据集增强后，将不同等级的小黄鱼图片打乱，按照4∶1划分训练集和测试集。其中，训练集用于模型的选择和训练，通过反向传播算法不断优化模型；而测试集用于评估模型分类准确率和所耗时间。各等级图像数据划分如表3所示。
表 3 小黄鱼数据集划分表Table 3. Partition table for L. polyactis dataset新鲜度等级
Freshness grade训练集
Train set测试集
Test set总数量
Total number一级品 First-grade 1 200 300 1 500 合格品 Qualified 1 300 325 1 625 不合格品 Unaccepted 1 228 307 1 535 总计 Total 3 728 932 4 660 2. 小黄鱼新鲜度识别模型
2.1 DenseNet模型结构
DenseNet由Huang等[21]于2017年提出，该网络通过前馈的方式将每个层和其他后续层进行连接，形成一个密集连接的卷积神经网络，其结构如图1所示。
DenseNet网络采用非线性组合函数(Hi)来融合特征，通过批标准化操作 (BN)、ReLU激活函数、卷积 (Conv) 得到X0, X1, X2,…Xi−1等第i层前的所有特征映射，并将其作为第i层的输入Xi，表示为：
$$ X_i{\text{=}}H_i\left(\left[X_0, X_1, \cdots X_{i{\text{−}}1}\right]\right)$$ (2) 为了方便下采样操作，网络被划分为多个紧密连接的密集块，每个密集块内部有多个连续的卷积层，这些层之间通过密集连接来传递特征。同时，在密集块之间引入过渡层 (Trainsition layer)，过渡层由卷积层和池化层组成，用于调整特征映射的大小，以实现下采样操作。DenseNet是一种革命性的网络架构，它通过特征复用和旁路连接的设计减少了网络的参数量，使得网络更易于训练，避免了梯度消失的问题[22-24]。此外，特征复用使得网络具有正则化效果，可有效防止模型训练过程出现过拟合现象。因此，本研究以DenseNet121模型为基础，对小黄鱼新鲜度图像进行分类。
2.2 SENet模块
SE模块是一种通道注意力机制，旨在通过自适应性地调整每个通道的权重来提高模型的性能[25]。SE模块由Fsq和Fex两部分组成，Fsq部分是一个全局平均池化层 (Globalpooling)，该部分将输入通道数为C、高度为H、宽度为W的特征图进行压缩，并捕捉每个通道的全局信息。Fex由ReLU激活函数、Sigmoid激活函数和2个全连接层 (FC) 组成，用于对每个通道进行自适应通道调整，以捕捉到每个通道的重要特征，具体实现步骤包括降维操作、引入非线性因素、解压缩操作和激活操作。通过将每个通道的权重乘以相应通道的特征图，得到新加权的特征图，进而生成最终输出。SENet注意力机制使得模型增强了对有用特征的感知和利用，提高了模型的性能和泛化能力。其结构如图2所示。
3. 改进的DenseNet网络模型结构
3.1 SE-DenseNet小黄鱼新鲜度识别模型
通过采用密集连接的策略，DenseNet实现了特征重用、减少网络参数量以及缓解梯度消失等优势。然而，DenseNet忽略了各个Denseblock之间不同通道的相关性。因此，本研究引入SENet，在DenseNet网络中引入SE Block通道注意力机制，以便更准确地选择和增强当前任务中最有用的特征，从而提高模型的表达能力，并进一步提升分类和识别性能。
本研究对原始DenseNet进行改进，通过将SE Block嵌入到每个Denseblock中，使其对每个网络层的输入和输出进行挤压和激励，目的是生成通道特征权重，以增强有益的特征。在未改进的DenseNet中，Denseblock包含i层，其中第i层的输入是前面所有层输出的并集。而在改进后的SE-DenseNet中，在原来的非线性激活函数之前和之后加入了SENet。通过SENet对每个非线性函数处理的特征图进行特征重标定，从而提升了对当前任务中有益特征的效果。本研究将经过SENet优化和分解卷积以及采用PReLU激活函数的网络模型命名为FishNet。网络模型结构如图3所示。首先，输入的图像数据经过3个3×3的卷积层和最大池化作用，本研究将7×7的卷积改成3个3×3的卷积，相应的阐述见3.2。之后通过SE-Denseblock稠密块对特征图进行特征重标定，该模块的作用是在稠密连接的基础上引入注意力机制，适应性地调整每个通道的权重，以更好地提取有用的特征。其次，将第一个SE-Denseblock稠密块作用后的图像数据通过过渡层传给下一个稠密块，过渡层的作用是减少特征图的通道数，从而控制整个网络的参数量。网络依序继续重复这一过程。最后，经过最后一个稠密块作用的数据传输给池化层和线性函数(Linear function)，由线性函数执行分类预测并输出预测结果。
3.2 分解卷积
在DenseNet网络中，输入的图像数据首先经过7×7的卷积和最大池化层进行下采样操作。7×7的卷积主要用于提取图像中有用的特征，为网络构建起一个初始的特征表示，但其无法提升网络性能。本研究以提升分类识别的准确率和计算速度为目标，对网络结构进行优化，用3个3×3的卷积核代替7×7的卷积核，主要目的是增加网络的非线性能力和特征表达能力，这种方法称为分解卷积。分解卷积有以下好处：首先，可以增加每个卷积核的感受野，使得网络可以捕捉到不同尺度的特征；其次，可以减少网络的计算量，通过将一个大的卷积核拆分成多个小的卷积核，可以减少所需的乘法运算次数，从而降低计算复杂度；最后，分解卷积通过将多个小的卷积核堆叠在一起，可以引入更多的非线性变换，使网络可以更好地适应复杂的数据分布并取得更好的性能，提升识别准确率。虽然分解卷积需要引入额外的卷积核参数，使得网络总体的参数量增加，但可以通过其他策略来控制，例如正则化、模型剪枝等。因此，本研究在保证提高准确率的基础上，使用L2正则化方法，通过在损失函数中引入一个附加的惩罚项，惩罚模型权重的大小，鼓励模型能够学习到简洁、泛化能力更强的权重。L2正则化既防止了网络过拟合的风险，又控制了网络的参数量。综合考虑影响模型性能的因素，本研究使用分解卷积的方法来提升网络性能。
3.3 激活函数的改进
原始DenseNet网络使用ReLU激活函数，当输入值x为负时，ReLU无法发挥其作用，可能导致神经元死亡和梯度消失等问题[26]。PReLU[27]激活函数是ReLU激活函数的一种扩展形式。其表达式为：
$$ {\rm{PReLU}}\left(x\right){\text{=}}\left\{\begin{array}{c}x, x > 0\\ {a}_{i}x, x\leqslant 0\end{array}\right. $$ (3) PReLU的参数 $ {a}_{i} $ 可以根据梯度下降算法进行训练，使网络能够自适应地学习合适的斜率，对负输入值的响应也更加平滑，可以缓解“神经元死亡”问题，提高模型的鲁棒性和学习能力。因此，本研究用PReLU激活函数替换ReLU激活函数作为改进后网络模型中间层的激活函数，初始值 $ {a}_{i} $ 设置为0.25，PReLU激活函数在提升分类准确率上也优于ReLU激活函数。
4. 结果与分析
4.1 实验环境及评价指标
小黄鱼新鲜度识别实验均在同一平台下进行。实验环境为：12 vCPU Intel(R) Xeon(R) Platinum 8255C CPU，24 G RAM，RTX3090显卡，内存43 GB，使用PyTorch深度学习框架，CUDA 11.3版本，Python 3.8版本。本研究使用准确率、损失函数、训练时间作为模型性能的评价指标。
准确率是指分类模型正确分类的样本数占总样本数的比例，深度学习中，准确率是评估模型性能的重要指标之一，有助于评估模型的分类能力。准确率 (RAcc) 的计算公式为：
$$ R_{\mathrm{A}\mathrm{c}\mathrm{c}}{\text{=}}\frac{M}{N}\times 100\text{%} $$ (4) 式中：M为正确分类的样本数；N为全部样本个数。
损失是指模型预测结果与实际结果之间的差异，损失值也就是损失函数的收敛值，本研究选取交叉熵损失函数作为所有实验的Loss函数。计算公式为：
$$ L{\text{=}}{\text{−}}{\sum }_{c{\text{=}}1}^{M}{y}_{c}\mathrm{log}\left({p}_{c}\right) $$ (5) 式中：L为损失函数；yc表示真实标签的第c个元素； pc表示模型预测y属于第c个类别的概率；M表示正确分类样本数。训练时间，反映了模型训练的效率和速度，时间越短，意味着模型可以更快进行迭代和优化，从而达到最优解。但时间越短也可能导致模型欠拟合。
4.2 实验结果
4.2.1 不同激活函数对网络性能的影响
本研究统一选择Adma[28]优化算法，初始学习率大小设置为0.01，批大小设置为64，网络迭代次数为200个epoch，选择交叉熵损失函数[29]来计算网络的损失。选择常见的激活函数Mish、LeakyReLU、PReLU、SELU与DenseNet121网络中的ReLU激活函数进行对比实验，结果见表4。在以上4种激活函数的作用下，网络的分类准确率均达到75%以上，其中PReLU激活函数的准确率最高 (90.78%)，相较于原网络中的ReLU激活函数，提升了2.78%。因此，本研究选择PReLU激活函数代替原网络中的ReLU激活函数。
表 4 不同激活函数实验结果Table 4. Experimental results of different activation functions序号
No.激活函数
Activation准确率
Accuracy/%时间
t/s1 ReLU 88.00 30 2 Mish 81.78 29 3 LeakyReLU 86.71 28 4 PReLU 90.78 29 5 SELU 75.24 28 4.2.2 不同改进方案实验结果对比
DenseNet121模型是在大型数据集ImageNet下预训练的模型，有1 000个类别输出，与本研究所用的数据集差异较大。因此，在改进模型卷积层第一层的基础上，自定义全连接层，利用迁移学习和自建数据集来训练小黄鱼新鲜度检测模型。本研究中，统一选择Adam优化算法，初始学习率大小设置为0.01，批大小设置为64，迭代次数200个epoch，选择交叉熵损失函数进行测试。
为了验证本模型的改进方法对小黄鱼新鲜度识别准确率提升的有效性，采用单因素实验法，控制单因素变量的情况下，改进网络结构，增加SE模块等。实验结果如表5所示，图4和图5分别为各方案的准确率曲线和损失曲线。
表 5 不同改进方案结果Table 5. Results of different improvement plans方案
Plan改进策略
Improvement strategy准确率
Accuracy/%损失值
Loss时间
t/s1 DenseNet 88.00 0.30 30 2 DenseNet-3×3 90.25 0.27 28 3 SE- DenseNet 90.89 0.26 29 4 FishNet 91.53 0.24 28 方案1，代表改进前的原始DenseNet121网络模型，整体识别准确率为88%，损失值为0.30。方案2，用3个3×3的卷积核代替原网络中7×7的卷积核，准确率比原模型提高2.25%，损失值减少0.03，训练时间减少2 s，损失值下降速度也比原网络快，这均得益于改进后在卷积核之间引入更多的非线性变换，从而减少了网络的计算量。方案3，加入SE通道注意力机制后，模型更加关注对当前任务有用的特征，模型的识别准确率提高了2.89%，训练时间为29 s，充分体现了引入SE模块后给网络带来识别准确率提升的优势。方案4同时使用这两个模块，从损失曲线图中可以看出，在最初几个epoch中，同时使用这2个模块的训练准确率以及模型收敛速度都高于原网络，网络在经过140个epoch后已基本收敛。总体而言，在200个epoch训练过程中，改进后准确率达到了91.53%，比原模型提升3.53%，损失值为0.24。改进后的模型 (FishNet) 准确率高于原网络，损失值的下降速度也更快实现了对小黄鱼新鲜度的准确识别。
4.2.3 改进模型与其他分类模型实验结果对比
为验证本研究使用的分类网络模型的优势，选择目前主流的深度卷积神经网络进行性能对比，使用小黄鱼新鲜度数据集对ResNet18、GoogleNet[30]、ResNet101[31]、MobileNetV3[32]等网络进行训练，设置同样的超参数，结果如表6所示。在同一实验条件下，相对于其他4种模型，改进DenseNet121模型 (FishNet) 具有更高的准确率，ResNet18网络分类准确率最低。在4种主流模型中，ResNet101和MobileNetV3的分类准确率均达到83%以上，但与FishNet相差8.14%和6.64%，并且FishNet的损失值更低。虽然在训练时间上，相对于其他4种模型，FishNet网络并没有获得大的优化，但准确率远高于其他网络，可完全满足实际需求。综上，FishNet具有优越的性能，是识别小黄鱼新鲜度的最佳模型。
表 6 各模型实验对比结果Table 6. Comparison results of various model experiments序号
No.模型
Model准确率
Accuracy/%损失值
Loss时间
t/s1 ResNet18 78.67 0.50 28 2 GoogleNet 79.74 0.55 27 3 ResNet101 83.39 0.42 29 4 MobileNetV3 84.89 0.38 27 5 FishNet 91.53 0.24 28 4.2.4 模型识别结果例图分析
为了展示模型实际分类效果，可视化准确率最高epoch的部分识别结果如图6所示。图6中a、b、c分别是FishNet模型的正确识别结果，可视化结果图所属等级与相应划分等级完全吻合。而d、e是模型识别错误的图，d本应是合格品，模型识别为一级品，e本应是合格品，模型识别为不合格品，与对应划分等级不符。经分析，由于相邻的两个新鲜度等级，前一天拍摄的图片属于一级品，而后一天拍摄的图片属于合格品，前后两天的TVB-N值差异不大，导致部分小黄鱼图像上新鲜度特征区分度不明显，从而使得FishNet无法准确地提取不同等级的特征，出现识别错误。但对于大多数图像，模型能够准确地进行分类且识别准确率达到91.53%，验证了所构建模型的有效性。
5. 小结
针对鱼类新鲜度检测方法存在检测准确率和效率较低等问题，本研究提出一种基于改进DenseNet网络模型的小黄鱼新鲜度自动识别方法。以DenseNet-121网络为基础网络，改进DenseNet-121网络结构，引入高效通道注意力机制，构建了小黄鱼新鲜度识别模型，实验结果验证了所构建的FishNet模型应用于小黄鱼新鲜度检测评估的可行性。得出以下结论：
1)通过实验对比DenseNet、SE-DenseNet、DenseNet-3×3、FishNet等4种模型，可以看出每种改进方案的准确率均较原始DenseNet的准确率有所提升，将SENet模块、分解卷积、PReLU激活函数三者结合的FishNet模型的识别准确率比DenseNet提高3.53%，说明通过引入SENet模块，网络更加准确地选择和强化当前任务中最有用的特征，从而进一步提高了网络分类和识别性能。用3个3×3卷积核代替网络第一个7×7卷积核，增加了网络的非线性能力和特征表达能力。为了进一步解决卷积神经网络梯度消失的问题，使用PReLU激活函数代替原始的ReLU激活函数，同时还提高了模型的鲁棒性和识别准确率。
2)通过与ResNet18、GoogleNet、ResNet101、MobileNetV3等经典深度神经网络进行对比，FishNet模型识别准确率均优于这些网络，验证了本研究使用的分类网络模型的优势。
3)本研究构建的FishNet模型，实现了对小黄鱼新鲜度高效、准确地自动分类识别。在实际应用方面，该模型仍有改进的空间。首先，从数据集层面扩大样本来源，收集不同光照、不同拍摄角度与距离的小黄鱼图像，并根据小黄鱼的新鲜度特征优化模型算法，将模型移植到其他鱼类或肉类的新鲜度识别上，以提高模型的普适性。其次，对模型进行实时性能优化，通过对模型压缩、使用模型轻量化技术，使模型在资源受限的设备上也能快速执行，在实际应用场景中能够快速、高效地完成新鲜度判断。最后，将本研究构建的模型部署到移动终端，实现人们日常生活和生产线上对肉类产品新鲜度的快捷智能识别。
-
![]()
图 1 本研究实验设计示意图
注：N. 阴性对照组；P. PHT胁迫阳性对照组；D1. 三丁酸甘油酯胁迫前投喂组；D2. 三丁酸甘油酯每天投喂组；D3. 三丁酸甘油酯胁迫后投喂组。
Figure 1. Sketch map of experimental design of this study
Note: N. Negative control group; P. PHT stress positive control group; D1. Feeding tributyrin before PHT stress group; D2. Feeding tributyrin every day group; D3. Feeding tributyrin after PHT stress group.
![]()
图 2 三丁酸甘油酯对周期性高温胁迫下凡纳滨对虾鳃组织学形态的影响 (200×)
注：a. 阴性对照组 (N)；b. PHT胁迫阳性对照组 (P)；c. 胁迫前投喂组 (D1)；d. 每天投喂组(D2)；e. 胁迫后投喂组 (D3)。
Figure 2. Effects of dietary tributyrin on histological morphology of L. vannamei under periodic high-temperatures stress (200×)
Note: a. Negative control group (N); b. PHT stress positive control group (P); c. Feeding before PHT stress group (D1); d. Feeding every day group (D2); e. Feeding after PHT stress group (D3).
![]()
图 3 三丁酸甘油酯对周期性高温胁迫下凡纳滨对虾鳃组织氧化应激指标的影响
注：数据上标不同字母表示组间差异显著 (P<0.05)。
Figure 3. Effects of dietary tributyrin on antioxidant capacity of L. vannamei under periodic high-temperature stress
Note: Different letters on each bar represent significant differences (P<0.05).
![]()
图 4 三丁酸甘油酯对周期性高温胁迫下凡纳滨对虾鳃组织氧化应激、内质网应激、细胞凋亡和渗透调节基因表达水平的影响
注：数据上标不同字母表示组间差异显著 (P<0.05)。
Figure 4. Effects of dietary tributyrin on oxidative stress, endoplasmic reticulum stress, apoptosis and osmoregulation gene expression levels in gill tissues of L. vannamei under periodic high-temperature stress
Note: Different letters on each bar represent significant differences (P<0.05).
表 1 实验饲料配方
Table 1 Experimental feed formulation
成分 (干物质)
Ingredient (Dry mass)三丁酸甘油酯添加水平
Addition amount of tributyrin/
(g∙kg−1)0 2.0 鱼粉 White fish meal 250 250 豆粕 Soybean meal 180 180 花生麸 Peanut bran 164 164 面粉 Wheat flour 230 222 啤酒酵母 Beer yeast 50 50 磷虾粉 Krill meal 50 50 大豆卵磷脂 Soybean lecithin 10 10 鱼油 Fish oil 10 10 豆油 Soybean oil 10 10 氯化胆碱 Choline chloride (50%) 5 5 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 10 10 维 C-磷酸酯 VC-phosphate ester 1 1 维生素预混料 Vitamin premix① 10 10 矿物质预混料 Mineral premix② 10 10 海藻酸钠 Sodium alginate 10 10 三丁酸甘油酯 Tributyrin 0 2 总计 Total 1 000 1 000 营养成分 Nutritional composition③ 粗蛋白 Crude protein 398.7 399.1 粗脂肪 Lipid 72.6 72.9 灰分 Ash 120.3 120.7 水分 Moisture 105.2 105.7 注：三丁酸甘油酯添加量参照 Su等[19]和 Wang等[20]的研究。 ① 维生素预混料 (g∙kg−1)：醋酸维甲酸酯 2.5；胆钙化醇 6.25；all-rac-生育酚乙酸酯 75；甲萘醌 2.5；硫胺素 0.25；核黄素 1；D-泛酸钙 5；吡哆醇 HCl 0.75；氰钴胺 2.5；烟酸 2.5；叶酸 0.25；生物素 2.5；肌醇 379；纤维素 500。② 矿物质预混料 (g∙kg−1)：氯化钾90；碘化钾 0.04；氯化钠 40；五水合硫酸铜3；七水硫酸锌4；七水硫酸钴0.02；七水硫酸亚铁20；一水硫酸锰3；七水硫酸镁124；二水合磷酸氢钙500；碳酸钙 215。③ 测量值 (g∙kg−1)。 Note: The addition amount of tributyrin is based on the research of Su, et al[19] and Wang, et al[20]. ① Vitamin premix (g∙kg−1): Retinoate acetate 2.5; Cholecalciferol 6.25; All rac tocopherol acetate 75; Methyl naphthoquinone 2.5; Thiamine 0.25; Riboflavin 1; D-calcium pantothenate 5; Pyridoxine HCl 0.75; Cyanocobalamine 2.5; Niacin 2.5; Folic acid 0.25; Biotin 2.5; Inositol 379; Cellulose 500. ② Minerals (g∙kg−1) premix: KCl 90; KI 0.04; NaCl 40; CuSO4-5H2O 3; ZnSO4-7H2O 4; CoSO4-7H2O 0.02; FeSO4-7H2O 20; MnSO4-H2O 3; MgSO4-7H2O 124; CaHPO4-2H2O 500; CaCO3 215. ③ Measured value (g∙kg−1). 
下载: 导出CSV
表 2 本研究所用引物序列
Table 2 Primer sequences used in this study
基因名称
Gene name正向引物(5'—3')
Forward primer (5'–3')反向引物(5'—3')
Reverse primer (5'–3')β-actin AGCTCATTGTAGAAGGTGTGATGCC TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG ROMO1 GCACCGTGGAGTAGGAGAACAAC TTGCCATGCCGACTGAGAAACC CAT TGATCGCTACAACAGTGCTGATGAG ATGTTCTCCACCAAACGCTGACG SOD GACACGACCATTAGCCTGTACGAC GTTGCCAGTAGCGAGTGAACCTTC GPX CGGCGAGATGGTGTCGTTCAAG GAGTTGGTTCATCTGGTGGAAGTCC TRX TCATCAATCAGCCGCATACCATCG CACCTTCTAAGTCCTTGGGAGATAACG ATF6 AGCAACACATCACGGACATCATCAG GTGGGAAACTGGGCTTTGTTAGGG IRE1 CCAGCACGACATCCAGTTCTTCC CCTCCGCAGCAAACACCTTCTC EIF2α ATCACCCATCTCCTCACCACAGAC AGCCTTCCATCTACCCTCCACTG CYTC TCGACGTGTACCTGACCAACCC TTCGCCTGGCTTCCTCTTCCTC CASP3 ATTATAGAGTGCCTGCGTTGCTACC TGCGATATCATGCCTAGATGCTTGG P53 CGCCGCCAAGGAAGTGAAGG TGGGAGGCGATGGTGGTGTC TIP4 GTCTCTCTGAACCCTTGCCAAACTC GTTGCCTATGATTACCTGCGTCCTC AQP GCAGCCATCTTGAAGGGAGTGAC ACGAGGACGAAGGTGATGAGGAG NKAα TGAAATCGTGTTTGCCCGTACCTC ACCATCACCAGTTACAGCCACAATG NKAβ GAACCCAGCCGACGAAGAATACG CAGCAACAATAGGTGGCAGGTAGC
下载: 导出CSV
-
[1] LU Q P, BO F, LING X J, et al. The effect of temperature on selected immune parameters of the white shrimp, Litopenaeus vannamei[J]. J World Aquac Soc, 2007, 38(2): 326-332. doi: 10.1111/j.1749-7345.2007.00105.x
[2] 曲旻, 谭建, 栾生, 等. 凡纳滨对虾幼虾耐高温性状的遗传力评估[J]. 水产科学, 2023, 42(5): 805-812. [3] 张宗锋. 以湛江、茂名海南为例探究我国凡纳滨对虾、罗非鱼养殖现状及面临的问题[D]. 上海: 上海海洋大学, 2012: 30. [4] 朱孟凯, 姚翠鸾. 温度胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺氧代谢及能量代谢的影响[J]. 水产学报, 2015, 39(5): 669-678. [5] 熊大林, 段亚飞, 陈成勋, 等. 高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾渗透调节的影响[J]. 水产科学, 2021, 40(4): 475-482. [6] MAGALLON B, SERVIN V, PORTILLO C, et al. Litopenaeus vannamei (Boone) post-larval survival related to age, temperature, pH and ammonium concentration[J]. Aquac Res, 2006, 37(5): 492-499. doi: 10.1111/j.1365-2109.2006.01455.x
[7] 熊大林, 段亚飞, 徐敬明, 等. 凡纳滨对虾鳃组织对高温和氨氮胁迫的生理响应[J]. 南方农业学报, 2020, 51(9): 2296-2303. doi: 10.3969/j.issn.2095-1191.2020.09.031 [8] 徐煜, 徐武杰, 文国樑, 等. 颤藻浓度和水温对凡纳滨对虾响应颤藻粗提液毒性的影响[J]. 南方水产科学, 2017, 13(1): 26-32. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.01.004 [9] DUAN Y F, XIONG D L, WANG Y, et al. Toxic effects of ammonia and thermal stress on the intestinal microbiota and transcriptomic and metabolomic responses of Litopenaeus vannamei[J]. Sci Total Environ, 2021, 754: 141867. doi: 10.1016/j.scitotenv.2020.141867
[10] GONZÁLEZ R, DÍAZ F, LICEA A, et al. Thermal preference, tolerance and oxygen consumption of adult white shrimp Litopenaeus vannamei (Boone) exposed to different acclimation temperatures[J]. J Therm Biol, 2010, 35(5): 218-224. doi: 10.1016/j.jtherbio.2010.05.004
[11] JIA X Y, ZHONG D S, ZHANG D, et al. Energy metabolic enzyme responses of Litopenaeus vannamei to thermal stress: a comparative study in freshwater and seawater conditions[J]. Aquac Int, 2018, 26(4): 1067-1081. doi: 10.1007/s10499-018-0268-9
[12] ANDRÉS C, PÉREZ D, ANDRÉS J, et al. Superoxide anion chemistry-its role at the core of the innate immunity[J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(3): 1841. doi: 10.3390/ijms24031841
[13] 郑欣, 徐树德, 艾庆辉, 等. 三丁酸甘油酯对动物生长和肠道屏障功能的影响及其作用机制[J]. 动物营养学报, 2018, 30(5): 1668-1675. doi: 10.3969/j.issn.1006-267x.2018.05.009 [14] 崔君. 三丁酸甘油酯缓解奶牛热应激效果的研究[D]. 长春: 吉林大学, 2020: 63-68. [15] RAIRAT T, PHANSAWAT P, KEETANON A, et al. Effects of tributyrin on the growth performance, survival, tolerance to hypoxic stress, and nutrient digestibility of Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei, fed different levels of soybean meal[J]. J World Aquac Soc, 2023, 54(6): 1468-1481. doi: 10.1111/jwas.13016
[16] LEE C, SHIN J, FEYAERTS J, et al. Effects of dietary supplementation of monobutyrin and tributyrin on growth, feed efficiency, innate immunity, digestibility and disease resistance of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) against Vibrio harveyi[J]. Aquac Nutr, 2021, 27(3): 771-781. doi: 10.1111/anu.13222
[17] HU Y C, CHU K F, YANG W K, et al. Na+, K+-ATPase β1 subunit associates with α1 subunit modulating a "higher-NKA-in-hyposmotic media" response in gills of euryhaline milkfish, Chanos chanos[J]. J Comp Physiol B, 2017, 187(7): 995-1007. doi: 10.1007/s00360-017-1066-9
[18] ABDEL L, ABDEL T, DAWOOD M, et al. Benefits of dietary butyric acid, sodium butyrate, and their protected forms in aquafeeds: a review[J]. Rev Fish Sci Aquac, 2020, 28(4): 421-448. doi: 10.1080/23308249.2020.1758899
[19] SU J, HE L, ZHANG N N, et al. Evaluation of tributyrin lipid emulsion with affinity to low-density lipoprotein: pharmacokinetics in adult male Wistar rats and cellular activity on Caco-2 and HepG2 cell lines[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2006, 316(1): 62-70. doi: 10.1124/jpet.105.090464
[20] WANG J P, ZHANG H Y, BAI S P, et al. Dietary tributyrin improves reproductive performance, antioxidant capacity, and ovary function of broiler breeders[J]. Poult Sci, 2021, 100(11): 101429. doi: 10.1016/j.psj.2021.101429
[21] DUAN Y F, LU Z J, ZENG S M, et al. Effects of dietary arachidonic acid on growth, immunity and intestinal microbiota of Litopenaeus vannamei under microcystin-LR stress[J]. Aquaculture, 2022, 549: 737780. doi: 10.1016/j.aquaculture.2021.737780
[22] 吴加莹, 戴明姝, 刘志刚, 等. 温度对织锦巴非蛤稚贝生存和生长的影响[J]. 南方水产科学, 2023, 19(2): 62-69. doi: 10.12131/20220155 [23] 于姗姗, 王青林, 董云伟. 亲本高温驯化和囊胚期热应激对刺参幼体生长、发育影响的初步研究[J]. 南方水产科学, 2015, 11(4): 46-52. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2015.04.007 [24] 贾艳丽, 王江勇, 刘广锋, 等. 高温胁迫对皱纹盘鲍幼鲍生长和成活的影响[J]. 南方水产科学, 2015, 11(2): 96-100. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2015.02.014 [25] ISLAM S, ZAHANGIR M, ASHAF-UD-DOULAH M, et al. Extreme warm acclimation temperature alters oxygen consumption, micronucleus formation in erythrocytes, and gill morphology of rohu (Labeo rohita) fingerlings[J]. Fish Physiol Biochem, 2020, 46(6): 2323-2330. doi: 10.1007/s10695-020-00886-6
[26] 孟德龙, 申奔龙, 白万强, 等. 缢蛏热休克转录因子1 (HSF1) 基因克隆、组织表达及功能[J]. 南方水产科学, 2020, 16(5): 115-122. doi: 10.12131/20190164 [27] JIANG S, ZHOU F, YANG Q B, et al. Impact of temperature stress on oxygen and energy metabolism in the hepatopancreas of the black tiger shrimp, Penaeus monodon (Crustacea: Decapoda: Penaeidae)[J]. Pak J Zool, 2018, 51: 92146545.
[28] KADIISKA M, GLADEN B, BAIRD D, et al. Biomarkers of oxidative stress study II: are oxidation products of lipids, proteins, and DNA markers of CCl4 poisoning?[J]. Free Radic, 2005, 38(6): 698-710. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2004.09.017
[29] DUAN Y F, ZHANG Y, DONG H B, et al. Effect of the dietary probiotic Clostridium butyricum on growth, intestine antioxidant capacity and resistance to high temperature stress in kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus[J]. J Therm Biol, 2017, 66: 93-100. doi: 10.1016/j.jtherbio.2017.04.004
[30] JUNGHARE M, SUBUDHI S, LAL B. Improvement of hydrogen production under decreased partial pressure by newly isolated alkaline tolerant anaerobe, Clostridium butyricum TM-9A: optimization of process parameters[J]. Int J Hydrogy, 2012, 37(4): 3160-3168. doi: 10.1016/j.ijhydene.2011.11.043
[31] PAO H P, LIAO W I, TANG S E, et al. Suppression of endoplasmic reticulum stress by 4-PBA protects against hyperoxia-induced acute lung injury via up-regulating Claudin-4 expression[J]. Front Immunol, 2021, 12: 674316. doi: 10.3389/fimmu.2021.674316
[32] CHUNG Y, KIM J, YOO Y. A novel protein, Romo1, induces ROS production in the mitochondria[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 347(3): 649-655. doi: 10.1016/j.bbrc.2006.06.140
[33] BRAZÃO C, KRACIZY R, DUTRA F, et al. Combined and isolated effects of ammonia and nitrite on Amazon River prawn Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) juveniles[J]. Aquaculture, 2021, 533: 736204. doi: 10.1016/j.aquaculture.2020.736204
[34] 蒋魁, 胡晓娟, 徐创文, 等. 裂褶菌多糖对凡纳滨对虾生长、免疫和肠道菌群的影响[J]. 南方水产科学, 2023, 19(5): 95-103. doi: 10.12131/20230041 [35] ZHENG J, CAO J, MAO Y, et al. Effects of thermal stress on oxidative stress and antioxidant response, heat shock proteins expression profiles and histological changes in Marsupenaeus japonicus[J]. Ecol Indic, 2019, 101: 780-791. doi: 10.1016/j.ecolind.2018.11.044
[36] 赵楠, 肖雪, 曹兰秀. 内质网应激在细胞自噬调控中的作用及其分子机制[J]. 生理科学进展, 2023, 54(5): 426-432. [37] 史进选, 傅明骏, 赵超, 等. 斑节对虾GRP94基因的克隆及其在不同应激条件下的表达与分析[J]. 南方水产科学, 2016, 12(5): 61-70. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.05.008 [38] XU J, RUAN L, SHI H. eIF2α of Litopenaeus vannamei involved in shrimp immune response to WSSV infection[J]. Fish Shellfish Immunol, 2014, 40(2): 609-615. doi: 10.1016/j.fsi.2014.08.016
[39] LEE A. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress[J]. Methods, 2005, 35(4): 373-381. doi: 10.1016/j.ymeth.2004.10.010
[40] ZHAO X Q, LI L L, LI C J, et al. Heat stress-induced endoplasmic reticulum stress promotes liver apoptosis in largemouth bass (Micropterus salmoides)[J]. Aquaculture, 2022, 546: 737401. doi: 10.1016/j.aquaculture.2021.737401
[41] NUEZ-ORTIN W, CARTER C, NICHOLS P, et al. Liver proteome response of pre-harvest Atlantic salmon following exposure to elevated temperature[J]. BMC Genom, 2018, 19(1): 133. doi: 10.1186/s12864-018-4517-0
[42] 高杰, 郭华阳, 刘明鉴, 等. 无乳链球菌感染对卵形鲳鲹脾脏的损伤及细胞凋亡相关基因表达的影响[J]. 南方水产科学, 2022, 18(6): 44-51. doi: 10.12131/20220099 [43] JIANG S Q, ZHANG Z W, YU F M, et al. Ameliorative effect of low molecular weight peptides from the head of red shrimp (Solenocera crassicornis) against cyclophosphamide-induced hepatotoxicity in mice[J]. J Funct, 2020, 72: 104085. doi: 10.1016/j.jff.2020.104085
[44] WANG J, REN R M, YAO C. Oxidative stress responses of Mytilus galloprovincialis to acute cold and heat during air exposure[J]. Ocean Coast Manag, 2018, 84: 285-292.
[45] JIA Y D, CHEN X T, WANG Z Y, et al. Physiological response of juvenile turbot (Scophthalmus maximus L.) during hyperthermal stress[J]. Aquaculture, 2020, 529: 735645. doi: 10.1016/j.aquaculture.2020.735645
[46] HOU Y Q, WANG L, DAN Y, et al. Dietary supplementation with tributyrin alleviates intestinal injury in piglets challenged with intrarectal administration of acetic acid[J]. Br J Nutr, 2014, 111(10): 1748-1758. doi: 10.1017/S0007114514000038
[47] CLARKE K, FEINMAN R, HARRISON L. Tributyrin, an oral butyrate analogue, induces apoptosis through the activation of caspase-3[J]. Cancer Lett, 2001, 171(1): 57-65. doi: 10.1016/S0304-3835(01)00574-2
[48] CHARMANTIER G. Ontogeny of osmoregulation in crustaceans: a review[J]. Invertebr Reprod Dev, 1998, 33(2/3): 177-190. doi: 10.1080/07924259.1998.9652630
[49] 苏家齐, 祝华萍, 朱长波, 等. 盐度和钠离子/钾离子对凡纳滨对虾幼虾存活与组织结构的影响[J]. 南方水产科学, 2021, 17(5): 45-53. [50] HUANG Y H, LIU Z Q, LI Y M, et al. Cloning and characterisation of Na+/K+-ATPase and carbonic anhydrase from oriental river prawn Macrobrachium nipponense[J]. Int J Biol Macromol, 2019, 129: 809-817. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2019.02.098
[51] FINN R, CERDÀ J. Evolution and functional diversity of aquaporins[J]. Biol Bull, 2015, 229(1): 6-23. doi: 10.1086/BBLv229n1p6
计量
- 文章访问数: 116
- HTML全文浏览量: 23
- PDF下载量: 28
粤公网安备 44010502001741号
