Assessment of fishery resources in southern sea area of Yintan Marine Ranching, Guangxi Province
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摘要:
为掌握广西北海银滩海洋牧场海域的鱼类资源状况，分别于2022年3月、2023年1月采用分裂波束式科学探鱼仪 (Simrad EK80) 对该海域进行了2次声学调查。利用回波积分法并结合拖网采样 (网目尺寸：4.0 cm×2.5 cm) 对调查海域内生物的尾数密度、生物量密度及空间分布进行了评估分析。结果表明，无论是在人工鱼礁区还是对照区，渔获组成均主要以小型个体为主 (2022和2023年的个体平均体质量分别为8.64和29.8 g)。2022年3月人工鱼礁区和对照区声学评估种类平均尾数密度分别为66 003和41 903 尾·km−2，平均生物量密度分别为726.66和469.90 kg·km−2；2023年1月人工鱼礁区和对照区声学评估种类平均尾数密度分别为17 194和11 110 尾·km−2，平均生物量密度分别为665.94和406.85 kg·km−2。人工鱼礁区表现出明显的集鱼效果。调查海域渔业资源主要分布于5.0 m以深水层，且礁区渔业资源较对照区垂直分布范围更广。2次调查的人工鱼礁区平均单体目标强度 (Target strength, TS) 均大于对照区，且人工鱼礁区检测出的单体目标较对照区多，分布比对照区更集中，表明人工鱼礁影响了鱼类的资源分布。
Abstract:In order to understand the status of fish resources in the Beihai Yintan Marine Ranching sea area of Guangxi Province, we conducted two acoustic surveys with a split-beam scientific echosounder (Simrad EK80) in March 2022 and January 2023. We evaluated the fish density, fish biomass density and spatial distribution in the survey sea area by using echo integration method combined with trawl sampling (Mesh size: 4.0 cm×2.5 cm). The results show that both in the artificial reef area and control area, the catches were mainly composed of small individuals (Average masses of individuals in 2022 and 2023 were 8.64 and 29.8 g, respectively). In March 2022, the average fish densities of acoustic evaluation species in the artificial reef area and control area were 66 003 and 41 903 inds·km−2, respectively. The average fish biomass densities in the artificial reef area and control area were 726.66 and 469.90 kg·km−2, respectively. In January 2023, the average fish densities of acoustic evaluation species in the artificial reef area and control area were 17 194 and 11 110 inds·km−2, respectively. The average fish biomass densities in the artificial reef area and control area were 665.94 and 406.85 kg·km−2, respectively. The artificial reef area showed a significant fish catching effect. The fishery resources were distributed mainly in water layers below 5 m, and those in reef areas had a wider vertical distribution range than those of the control area. The average target strength (TS) of the two survey voyages in the artificial fish reef area were greater than that in the control area, and more single targets were detected in the artificial fish reef area with a more concentrated distribution than in the control area. The results reveal the impact of artificial reefs on the redistribution of fish resources.
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海水养殖过程中产生的残饵和粪便中含有大量的氮 (N)、磷 (P)元素，过多的营养盐输入会导致水体富营养化和生态破坏等问题[1-6]，饲料中仅约1/3的营养物质被养殖动物利用，2/3的营养物质随着生长而排出。一般来说，饲料中57%的氮和76%的磷会以各种形式进入环境[1,7]。总磷 (Total phosphorus, TP) 指未过滤水样中的所有磷形态，TP是一个重要的海水环境变量，包括无机磷酸盐与有机磷酸盐[8]；海水养殖尾水中TP的测定，是评价海水养殖水质和养殖尾水处理效果的重要参数[9]，同时，测定水体中的TP，对研究水体磷循环、生态系统的管理和恢复有重要意义[10]。
按照GB/T 12763.4—2007《海洋调查规范 第4部分：海洋化学要素调查》中的TP测定法 (过硫酸钾氧化法) (以下简称常规方法)，TP检测前必须进行预处理，首先需将水样消解，将所有类型的磷转化为易于检测的正磷酸盐[8,11-12]。常规方法是在水样中加入中性过硫酸钾(K2S2O8) 通过高压蒸汽灭菌器将所有含磷化合物消解为正磷酸盐，正磷酸盐与钼酸铵[(NH4)2MoO4] 形成磷钼黄，再被还原为磷钼蓝[13]，于882 nm 波长处进行吸光度测定，常规方法操作不仅过程繁琐，样品使用高温灭菌器消解的升、降温时间也长，总过程长达3~4 h，同时因分光光度计样品检测通量低，通常一次只能测量1~3个样品，且检测后需要不断清洗和润洗比色皿，以便检测下一个样品，这导致在检测较多样品时耗时过长且产生废液较多[14]，另外磷钼蓝在比色皿上的吸附较强[15]，不易清洗干净，对结果造成较大误差。
为弥补常规方法的不足，很多学者对消解过程或检测方法进行了单一方面的优化。在消解阶段，主要是加热装置和消解剂的优化。例如，Huang和Zhang[16]以烘箱代替高压蒸汽灭菌器消解样品，优点是消解温度仅需90 ℃，且消解样品通量大，但消化时间长达16 h，效率低。有报道使用微波结合王水[17]或者微波结合硝酸[17]消解样品，由于微波消解对压力要求不高，是一种有前景的消解方法[18]。也有使用特殊处理的氧化铅电极[19]或利用臭氧、紫外光协同超声波雾化[20]产生羟基自由基(·OH)，以降解含磷化合物。TP消解转化为磷酸盐后的含量测定方法的优化，主要有电化学法[21-23]、色谱法[24-26]和化学发光法[27]，但常规的分光光度法因技术成熟和显色稳定，仍是最经典和应用最广泛的方法[28]。随着实验技术的进步，需要定期评估常规的TP分析方法，以提高检测效率、准确性，降低检测成本，减少实验废水的排放[29]，样品通量大的酶标仪在其他领域的定量分析中逐渐普及起来。温云杰[30]分别运用孔雀绿显色法和磷钼蓝显色法测定土壤速效磷和水体磷酸盐含量时，在酶标仪上对比96与48孔微孔板检测效果，均取得很好的效果。张怡等[31]直接在96孔板内进行显色，显色后用多功能酶标仪进行测定，所用的河水样品量和显色的试剂体积均很小，取得了满意的效果；有研究人员利用48孔平底酶标板测定奶制品中的TP含量，消解后的样品和显色剂总加样量仅需400 µL，且快速、可靠[32]。近年来，TP的联合检测技术得到进一步的发展，朱红霞等[33]利用微波消解-离子色谱法测定地表水中的痕量TP，方法检测限达到0.002 mg·L−1 (约0.064 µmol·L−1)，能够很好地解决I类地表水TP监测过程中“检出即超标”问题，但离子色谱仪价格昂贵，普及困难，且操作也相对复杂。
集消解和测定于一体的TP在线分析仪器受到重视，例如微流控光学技术能够在室温和常压下10 s内完成对TP的消解，且能检测的TP质量浓度低至0.005 mg·L−1 (约0.16 µmol·L−1)，是一种十分有前景的检测方法[34]。但因其装置构造复杂、仪器不稳定[20]，且自动在线消化和分析过程中，几乎不可能避免颗粒沉降，造成TP的低估，其准确度受到质疑[35]。本研究探索了使用控温加热板代替高压灭菌器对水样进行消解，结合多功能酶标仪检测代替紫外分光光度计，测定了海水养殖尾水的TP质量浓度，通过测定比较不同规格的酶标板与加样量等组合，分析控温加热板加热消解后用酶标仪测定方法(以下简称优化法) 和常规方法之间的相对误差 (Relative error, RE)，以及评估优化法测定水样的准确度和精密度，并通过检测空白样品的吸光度计算出优化法的检出限 (Limit of detection, LOD)和测定下限或测定限 (Limit of quantification, LOQ)，以期探索出一种绿色、准确、便捷和高通量的海水养殖尾水中TP的测定方法。
1. 材料与方法
1.1 水样和试剂
尾水水样：采自不同海水养殖区排放的海水养殖尾水，养殖品种为花鲈 (Lateolabrax maculatus)，盐度为18‰~25‰。
主要试剂：优级纯（GR）磷酸二氢钾 (KH2PO4)；过硫酸钾 (K2S2O8)；抗坏血酸；钼酸铵；酒石酸锑钾 (C8H4K2O12Sb2)；硫酸 (H2SO4)；六偏磷酸钠 [(NaPO3)6]，磷酸二氢钾标准溶液系列质量浓度Cs为0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 µmol·L−1，以上试剂按GB/T 12763.4—2007中的要求配制。除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯 (AR) 试剂和纯净水。
1.2 设备和仪器
主要设备和仪器：紫外可见分光光度计 (瓦里安varian cary100)、Synergy HTX多功能酶标仪 (美国BioTek仪器有限公司)、ECH-II型微机控温加热板 (上海新仪微波化学科技有限公司)、SN510C全自动立式高压蒸汽灭菌器 (日本Yamato大和科学株式会社)、带螺旋盖的聚四氟乙烯瓶 (规格为25和50 mL)、平底酶标板(24、48和96孔，均为南通苏品实验器材有限公司)、96孔石英板 (连云港谱析光电科技有限公司) 和常用玻璃器皿等。
1.3 方法
1.3.1 常规方法
取25 mL水样于消煮瓶，加入2.5 mL过硫酸钾溶液，放入高压蒸汽灭菌锅，压力升至1.1 kPa (120 ℃)，保持30 min，待压力降至0后，取出。自然冷却至室温，加入0.5 mL抗坏血酸溶液摇匀，再加入2 mL硫酸-钼酸铵-酒石酸氧锑钾溶液 (体积比5∶2∶1) 和0.5 mL抗坏血酸溶液混匀，显色10 min后于882 nm测定吸光度。
1.3.2 消解方法的优化
取5个采样点的尾水水样，使用与水样相同盐度的氯化钠溶液将水样稀释至20倍，以保证在检测线性范围内，稀释后的水样按照以下操作：取同一水样各精确量取25 mL到3个规格为50 mL带螺旋盖的聚四氟乙烯瓶中，加入2.5 mL的过硫酸钾溶液，旋紧瓶盖后，按常规方法消解后显色。另各取5 mL水样到15个带螺旋盖的聚四氟乙烯瓶中，加入500 µL过硫酸钾溶液，放入控温加热板的加热孔中，设置仪器加热温度为120 ℃，加热时间为20、40、60、80和100 min，到设定时间取出相应的样品，自然冷却至室温后，加入100 µL抗坏血酸溶液摇匀后，再加入400 µL硫酸-钼酸铵-酒石酸氧锑钾溶液和100 µL的抗坏血酸溶液混匀，显色10 min后于882 nm测定吸光度，以常规方法测定吸光度的平均值为100%，计算控温加热板消解法的消解百分比，以确定最佳消解时间。
1.3.3 检测方法的优化
在882 nm的波长下扫描空酶标板的吸光值作为空白值Ab后，使用24孔普通酶标板、48孔普通酶标板、96孔普通酶标板和96孔石英板(以下分别简称24孔板、48孔板、96孔板和96孔石英板)，按照96孔板和96孔石英板加样200 µL，48孔板加样200和500 µL，以及24孔板加样500 µL和1 mL的方式，加入磷酸二氢钾标准系列溶液进行测定，将测得的系列标样吸光度值AS，减去相应空白吸光度值Ab，再扣除纯水的校正吸光度A水 (纯水在酶标板测到的吸光值减去酶标板的空白值) 得到An，以An为纵坐标，标准溶液系列的浓度Cs为横坐标，绘制标准工作曲线，综合考虑灵敏度、相关系数后确定最佳孔数的酶标板和加样量。
1.3.4 优化法的评估
对同一尾水样品用优化法和常规方法进行测定，优化法检测时，每个水样做6个平行样，常规方法直接测定3次取其平均值作为该瓶水样的真实值，测定两方法的RE以及优化法6个平行样的相对平均偏差 (Relative average deviation, RAD) 和相对标准偏差 (Relative standard deviation, RSD)。选取3个样品，使用甘油磷酸二钠[(
$ {{\mathrm{C}}_{3}{\mathrm{H}}_{7}\mathrm{N}\mathrm{a}}_{2}{\mathrm{O}}_{6}\mathrm{P} \cdot 5{\mathrm{H}}_{2} $ O),β-GLP]和六偏磷酸钠[$ \rm{(NaP}{\rm{O}}_{\text{3}}{)}_{6} $ , SHMP]为标准加入物，评估优化法的加标回收率。优化法的准确度是以RE和加标回收率来衡量，精密度用RAD和RSD来判断。另外配制20个空白样品，按优化法的程序进行处理测定，每个空白样品测定3次取其平均值，根据20个空白样品吸光度的标准差，利用公式 (2) 和公式 (3) 分别计算出优化法的LOD和LOQ。加标回收率采用浓度计算公式：
$$ R=\left(C_{1}-C_{2}\right)/C_{3}\times100 {\text{%}} $$ (1) 式中：R为加标回收率 (%)；C1为加标后测定的浓度 (µmol·L−1)；C2为样品浓度 (µmol·L−1)；C3为按体积转化后加标物的浓度 (µmol·L−1)；
检出限LOD和测定限LOQ的计算公式[36]：
$$ \mathrm{LOD}=K_{\mathrm{d}} S_{\mathrm{b}}/a $$ (2) $$ \mathrm{LOQ}=K_{\mathrm{q}} S_{\mathrm{b}}/a $$ (3) 式中：LOD为方法的检出限；LOQ为方法的测定限；Sb为空白20次测量的标准偏差(吸光度)；a为方法的灵敏度 (即标准曲线的斜率)；Kd和Kq均为信噪比，Kd=3，Kq=10。
1.4 数据处理
测定结果以Excel 2019、IBM SPSS Statistics 26.0和Origin Pro 2021软件进行处理，所有数值以“平均数±标准差 (
$\overline { X}\pm { \rm {SD}} $ )”表示，对优化法测定结果进行单样本t-检验 (以测到的常规方法的平均值为总体均值)，差异显著水平设为0.05。2. 结果
2.1 消化方法的对比
控温加热板消解实验中，在温度120 ℃条件下，消解时间分别为20、40、60、80和100 min时，消解百分比结果见图1。结果显示，在控温加热板加热时间为60 min时消解百分比即可达到100%，且平行样品在消解60、80和100 min测到的吸光度值，与常规方法测到的吸光度平均值 (从样品1至样品5分别为0.061 7、0.080 3、0.030 5、0.039 0、0.035 7) 无显著性差异(P>0.05)，故在检测样品时选择60 min作为平板加热消解样品的最佳时间，以节省时间，提高样品检测效率。
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图 1 消解百分比与消解时间关系注：不同字母之间表示同一样品在不同消解时间的消解百分比差异显著 (P<0.05)。Figure 1. Relationship between digestion percentage and digestion timeNote: Different letters indicate that the digestion percentage of the same sample at different digestion time is significantly different (P<0.05).2.2 酶标板和加样量的确定
TP标准溶液在使用不同孔数的酶标板和常规方法测定的方程见表1，绘制的标准曲线见图2。其中常规方法和48孔板加样1 mL的标准曲线斜率最大、灵敏度最高，R2=0.999 9，且两者的标准曲线较一致，因此，48孔板结合加样1 mL是与常规方法拟合度最高的检测方式。其他结果按检测的灵敏度由高到低分别是96孔板加样200 µL、24孔板加样1 mL、96孔石英板加样200 µL、48孔板加样500 µL、24孔板加样500 µL和48孔板加样200 µL，相关性由高到低的顺序和灵敏度一致。由于96孔板检测通量大，是48孔的2倍，相关性更佳，有必要对96孔板加量200 mL的方式进行进一步探索，故同时选用96孔板加样200 µL和48孔板加样1 mL两种检测方式对样品TP进行验证与评估。
表 1 不同酶标板与加样量和常规方法测定的回归方程Table 1. Regression equations of different types of microwell plates, amount of sample and conventional method测定方式Determination method 回归方程Regression equation 相关性R2 常规方法 Conventional method A=0.019 1c+0.001 2 0.999 9 48孔板1 mL 48-well plate 1 mL A=0.019 1c+0.002 1 0.999 9 96孔板 200 µL 96-well plate 200 µL A=0.010 8c+0.002 3 0.999 9 96孔石英板 200 µL 96-well quartz plate 200 µL A=0.009 7c+0.007 5 0.999 3 24孔板1 mL 24-well plate 1 mL A=0.010 0c+0.001 4 0.999 7 48孔板500 µL 48-well plate 500 µL A=0.009 4c+0.001 2 0.999 0 24孔板500 µL 24-well plate 500 µL A=0.004 7c+0.000 6 0.999 1 48孔板200 µL 48-well plate 200 µL A=0.003 5c+0.000 4 0.995 5 ![]()
图 2 酶标仪测定法和常规方法测定的TP标准曲线Figure 2. TP standard curve determined by microplate reader and conventional method2.3 优化法验证
对同一尾水水样分别使用常规方法与控温加热板加热消解后，使用 96孔板加样200 µL (以下简称96孔优化法) 以及48孔板加样1 mL (48孔优化法) 进行测定浓度后比较分析。96孔优化法与常规方法测定结果的RE、优化法测定6个平行样的RAD和RSD结果见表2，除了样品7和样品11，两方法测定的结果存在显著性差异 (P<0.05)，其他样品组均不存在显著性差异 (P>0.05)。两方法RE介于−14.03%~0.21%，96孔优化法测定6个平行样的RAD介于2.32%~12.65%，RSD介于2.63%~14.23%，样品加标回收率结果见表3，以β-GLP为标准加入物时，样品加标回收率为94.7%~99.0%，以SHMP为标准加入物时，样品加标回收率为88.9%~97.3%，20个空白样品吸光度的标准偏差为Sb=0.000 59，由标准曲线斜率a=0.010 8，根据公式 (2) 和 (3) 分别计算出LOD和LOQ为0.17和0.55 µmol·L−1。48孔优化法与常规方法测定结果的RE、48孔优化法测定6个平行样的RAD和RSD结果见表4，所有样品组两方法测定结果均无显著性差异(P>0.05)，两方法RE介于−2.97%~1.59%，优化法测定6个平行样的RAD介于0.30%~3.30%，RSD介于0.42%~4.06%，样品加标回收率结果见表5，以β-GLP为标准加入物时，样品加标回收率为98.2%~99.6%，以SHMP为标准加入物时，样品加标回收率为93.4%~97.1%，20个空白样品吸光度的标准偏差为Sb =0.000 48，由标准曲线斜率a=0.019 1，根据公式 (2) 和 (3) 分别计算出LOD和LOQ为0.08和0.25 µmol·L−1。
表 2 96孔板加样200 µL与常规方法测定水样TP的结果比较Table 2. Comparison of results of measuring TP of samples by 96-well plate with 200 µL of sample and conventional method样品号Sample No. 优化法Optimized method/(µmol·L−1) 常规方法Conventional method/(µmol·L−1) 相对误差RE/% 相对平均偏差RAD/% 相对标准偏差RSD/% 1 1.50±0.091 1.60±0.106 −6.25 5.33 6.04 2 3.00±0.137 3.10±0.079 −3.28 3.41 4.57 3 4.26±0.157 4.28±0.078 −0.39 3.15 3.69 4 1.48±0.128 1.43±0.102 3.73 7.04 8.61 5 4.74±0.118 4.73±0.067 0.21 2.32 2.49 6 2.44±0.115 2.49±0.097 −1.94 3.75 4.73 7 0.87±0.115 1.01±0.116 −14.03 10.56 13.19 8 3.17±0.117 3.32±0.082 −4.57 3.42 3.70 9 0.96±0.137 1.05±0.098 −8.41 12.65 14.23 10 1.87±0.116 1.96±0.086 −4.59 4.28 4.84 11 0.90±0.096 1.04±0.093 −13.46 10.00 11.55 12 3.05±0.139 3.11±0.074 −2.09 2.63 3.15 13 5.30±0.125 5.33±0.065 −0.59 2.35 2.63 14 3.88±0.156 3.82±0.073 1.53 2.95 3.24 15 2.18±0.093 2.28±0.080 −4.53 3.52 4.57 16 2.03±0.147 2.09±0.090 −3.11 3.95 4.74 17 5.85±0.204 5.64±0.056 3.72 3.42 3.49 18 1.19±0.100 1.26±0.118 −5.42 6.9 8.37 注：以常规方法的测定均值为真值，相对偏差 (%) 是优化法与常规方法的偏差，测定浓度是尾水稀释20倍后的浓度；表4同此。 Note: The measured mean value of the conventional method is considered to be the true value, and the relative deviation (%) is the deviation between the optimized method and the conventional method, and the measured concentration is the concentration after tail water dilution of 20 times. The same case in Table 4. 表 3 96孔板优化法的样品加标回收率Table 3. Sample spiked recovery by 96-well plate optimized method样品浓度Sample concentration/(µmol·L−1) 加入浓度 (β-GLP)Added concentration (β-GLP)/(µmol·L−1) 加标后浓度Found concentration/(µmol·L−1) 平均回收率Average recovery/% 加入浓度 (SHMP)Added concentration (SHMP)/(µmol·L−1) 加标后浓度Found concentration/(µmol·L−1) 平均回收率Average recovery/% 3.05 1.50 4.53±0.04 98.4 1.50 4.51±0.04 97.1 3.00 6.01±0.04 98.7 3.00 5.97±0.04 97.3 2.42 1.50 3.91±0.06 98.0 1.50 3.84±0.03 93.6 3.00 5.41±0.03 99.0 3.00 5.34±0.04 96.6 2.21 1.50 3.64±0.05 97.3 1.50 3.58±0.04 93.1 3.00 5.14±0.04 98.6 3.00 5.08±0.04 96.8 1.19 1.50 2.61±0.07 94.7 1.50 2.52±0.07 88.9 3.00 4.10±0.04 97.1 3.00 4.02±0.07 94.2 表 4 48孔板加样1 mL与常规方法测定水样TP的结果比较Table 4. Comparison of results of measuring TP of samples by 48-well plate with 1 mL of sample and conventional method样品号Sample No. 优化法Optimized method/(µmol·L−1) 常规方法Conventional method/(µmol·L−1) 相对误差RE/% 相对平均偏差RAD/% 相对标准偏差RSD/% 1 1.55±0.029 1.60±0.106 −2.50 1.9 1.10 2 3.12±0.024 3.10±0.079 0.65 0.8 0.77 3 4.31±0.025 4.28±0.078 0.70 0.5 0.58 4 1.39±0.043 1.43±0.102 −2.80 2.1 3.09 5 4.75±0.021 4.73±0.067 0.42 0.3 0.44 6 2.45±0.032 2.49±0.097 −1.61 1.0 1.31 7 0.98±0.037 1.01±0.116 −2.97 3.3 3.78 8 3.36±0.024 3.32±0.082 1.20 0.7 0.71 9 1.04±0.031 1.05±0.098 −0.95 2.3 2.98 10 1.95±0.027 1.96±0.086 −1.52 1.6 1.38 11 1.01±0.041 1.04±0.093 −2.88 2.9 4.06 12 3.12±0.029 3.11±0.074 0.32 0.8 0.93 13 5.37±0.034 5.33±0.065 0.75 0.6 0.63 14 3.79±0.033 3.82±0.073 −0.79 0.8 0.87 15 2.24±0.030 2.28±0.080 −1.75 1.2 1.34 16 2.11±0.035 2.09±0.090 −1.40 1.5 1.66 17 5.68±0.024 5.64±0.056 0.71 0.4 0.42 18 1.28±0.033 1.26±0.118 1.59 2.1 2.58 表 5 48孔板优化法的样品加标回收率Table 5. Sample spiked recovery by 48-well plate optimized method样品浓度Sample concentration/(µmol·L−1) 加入浓度 (β-GLP)Added concentration (β-GLP)/(µmol·L−1) 加标后浓度Found concentration/(µmol·L−1) 平均回收率Average recovery/% 加入浓度 (SHMP)Added concentration (SHMP)/(µmol·L−1) 加标后浓度Found concentration/(µmol·L−1) 平均回收率Average recovery/% 3.05 1.50 4.59±0.04 98.2 1.50 4.56±0.04 95.8 3.00 6.11±0.02 99.6 3.00 5.98±0.03 95.2 2.42 1.50 3.93±0.04 98.7 1.50 3.91±0.03 97.1 3.00 5.42±0.03 99.4 3.00 5.35±0.03 96.8 2.21 1.50 3.73±0.04 99.1 1.50 3.66±0.02 94.7 3.00 5.22±0.02 99.3 3.00 5.12±0.03 95.9 1.19 1.50 2.76±0.06 98.4 1.50 2.69±0.04 94.2 3.00 4.23±0.04 98.4 3.00 4.08±0.04 93.4 3. 讨论
TP在水样中所有含磷化合物主要包括正磷酸盐、磷单酯(C-O-P键)、磷双酯(C-P键)、磷酸盐(C-P键)、聚磷酸盐单酯(C-O-P-O-P-O-P键)、聚磷酸盐(P-O-P-O-P键)和焦磷酸盐(P-O-P键)[37]，简单来说水样中可能含有主要为磷酸根离子 (
$\rm{P}{\rm{O}}_{\text{4}}^{\text{3−}}$ ) 的无机物和含有P-O-P、C-O-P和C-P键的有机物。常规消解方法是使用蒸汽灭菌器或家用压力锅在中性过硫酸钾的条件下水解或氧化，将所有含磷化合物转化为$\rm{P}{\rm{O}}_{\text{4}}^{\text{3−}}$ 的无机物。对于国标消解方法的优化，有不少学者使用电热恒温干燥箱对比色管内的磷标准使用溶液进行消解，消解条件设定为120 ℃、30 min，认为此消解方法可以代替常规的消解方法[38-40]。实际上磷标准使用溶液中的磷酸盐是正磷酸盐，可直接进行显色测定，不存在消解问题，丁丹丹等[41]的实验也表明TP标准溶液消解与否对工作曲线影响很小，可以不用消解。本实验采用尾水水样进行消解对比，因其含有有机磷和无机磷化合物，相比而言具有合理性。Huang和Zhang等[16]利用烘箱在90 ℃下放置16 h消解各种含磷化合物，说明消解温度会显著影响消解时间。夏莉[42]提出使用消解器和专门配套的消解管对样品进行消解，仅优化了TP的消解过程，未对检测部分进行新的探索，同时使用的检测波长为710 nm，异于本实验的检测波长882 nm，其得出在消解温度为120 ℃，时间为20 min时，可得到最佳的消解效果的结论，该实验消解方法与本文消解方法接近，但本文得到的最佳消解时间为60 min，这可能与水样中P的种类相关[10]。本文探索使用控温加热板加热和密封的聚四氟乙烯瓶，使用过硫酸钾消解剂进行消解实验，水样经过30 min消解后消解率是常规方法的80%以上，消解率与样品中磷的种类相关，有研究认为有机磷化合物在第5分钟时达到最大消化百分比，并且随着消化时间从5 min延长到7 h，消化百分比没有显著增加[10]。实验中使用带螺旋盖的聚四氟乙烯瓶是控温加热板加热消解成功的关键，它的密封性能够提供高温高压的消解环境同时防止样品因高温喷溅出来而产生不必要的误差。常规方法检测TP消解后磷酸盐的原理是根据朗伯-比尔定律利用紫外-可见分光光度法进行定量分析，溶液中的待测物质吸光度(A)与吸收系数(K)、溶液中某种物质的浓度(c)和待测液体光程(b)的乘积值成正比[43]，即：A=Kcb，酶标仪测定原理与常规方法一样，同样是利用882 nm的波长对样品中转化的磷钼蓝进行吸光度检测后，通过相应的标准曲线换算出相应的浓度。根据商家提供的酶标板的相关参数，96、48和24孔板的底面积分别约为0.32、0.88和1.90 cm2。按照样品加样量，得到48孔板加样1 mL的光程最大，约为1.136 cm，与它检测的灵敏度最高相吻合。48孔板加样200 µL的光程约为0.273 cm，加样500 µL的光程约0.568 cm；24孔板加样500 µL的光程约为0.263 cm，1 mL的光程约为0.526 cm，没有探索24孔板200 µL的原因加样量太少，不能完全浸没底表面。96孔石英板检测效果不如96孔板，原因可能在于石英材料含有正电荷位，例如，
$ {\rm{Al}}{\text{-}}{\rm{O}}{\rm{H}}_{2}^{\text{+}} $ 和$ {\rm{Si}}{\text{-}}{\rm{OH}}_{2}^{\text{+}} $ 等会造成磷的吸附[44]，重复使用导致难以彻底清洗干净而对测定结果造成误差[15]。如果仅根据光程的推算，24孔板加样量增加后，灵敏度会增加，也可应用于小批量样品的检测。温云杰[30]对比48孔板总加样1 mL和96孔板总加样200 µL测量水体中的磷酸盐浓度，发现48孔板加样1 mL的效果较好。48孔板加样1 mL光程约为1.136 cm，远比96孔板加样200 µL的光程 (约0.625 cm) 大，但相对于96孔板，使用48孔板会减少样品检测通量。使用96孔优化法和常规方法对18个样品进行测定，两种方法对样品7和样品11测定结果存在显著性差异 (P<0.05)，这可能与样品7和样品11中TP浓度较低有关，样品7中TP浓度为(0.87±0.115) µmol·L−1，样品8中TP浓度为(0.90±0.096) µmol·L−1。准确度和精确度是评价仪器分析方法的重要指标，一般认为100%±5%才适合。RE的绝对值反映优化法和常规方法对测定结果的差异程度，绝对值越大，优化法偏离常规方法测定结果越大，准确度越低，实验结果显示RE大体上与样品中P浓度成负相关的关系，当样品中TP浓度低时，RE就相对大，本次实验中样品1、7、9、11、18共5组不符合准确度的要求。从样品加标回收率来看，样品18加标SHMP的回收率为88.9%，不符合常规方法的标准要求。另外从RAD和RSD两者分析，样品1、4、7、9、18共5组结果的RAD大于5%，样品1、4、7、9、11、18共6组结果的RSD大于5%，也不符合精确度要求。这些实验组共同的特点是TP浓度较低，因而无论从准确度和精确度的角度看，96孔优化法并不太适合用于测定TP浓度低的样品。高丹丹和郭瑞涛[45]的实验也发现TP浓度较低时，一般RSD较大，浓度水平较高的情况下RSD也小，建议根据不同浓度设定不同的RSD标准。LOD是指分析过程能够可靠检测到的分析成分的最低浓度或含量，而LOQ则是分析过程可以合理可靠地进行定量分析的最小浓度或质量，在实际使用中，为了准确测定的最低浓度或含量，往往采用信噪比K=10的LOQ为检测方法的测定下限[36]，在本次实验中，采用96孔优化法时LOD和LOQ分别为0.17 和0.55 µmol·L−1，难以准确测定寡营养水体中的TP，许金等[28]认为磷钼蓝分光光度法原理检测限过高而难以测定低浓度或寡营养水体中的磷酸盐，实验中96孔优化法比常规方法灵敏度低，因而也说明了96孔优化法不适合低TP浓度的样品。但当样品中TP浓度高于1.87 µmol·L−1时，显示出较好的准确度和精确度，海水养殖尾水TP浓度一般较高，所以样品在稀释到合适的倍数后，96孔优化法依然可以用于测定养殖尾水。48孔优化法与常规方法相比，RE、RAD和RSD均小于5%，LOD和LOQ小，同时样品加标回收率也能满足要求，是最佳的优化法，如果不能确定样品TP浓度的范围，建议先采用48孔优化法摸索测定，再根据需要对样品进行稀释，调整浓度后进行TP测定。本研究仅用常规方法样品和显色剂总体积的1/5，大大减少了化学试剂的使用以及实验废水的产生，并且一次可测48或96个样品，提高了检测效率，符合分析方法发展的快速、便捷、经济和环保的要求[46]。
4. 结论
综上所述，可使用控温加热板加热60 min消解水样后，采用48孔普通酶标板加样1 mL的检测方式，用于TP为0.25~6.40 µmol·L−1的入海养殖尾水检测，因96孔普通酶标板检测通量大，入海养殖尾水TP浓度一般较高，样品TP浓度介于0.55~6.40 µmol·L−1时，也可以使用96孔普通酶标板进行检测。优化法分析样品的效率要高于常规方法，可用于海水养殖尾水TP的测定。
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图 1 北海银滩海洋牧场海域调查断面图
Figure 1. Cross section map of Beihai Yintan Marine Ranching surveyed sea area
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图 3 调查区域渔业尾数密度及生物量密度的时空分布
Figure 3. Spatio-temporal distribution of regional fishery quantity and biomass density
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图 4 不同断面声学评估种类资源密度
Figure 4. Resource density of fish species assessed by acoustics at different cross-sections
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图 5 不同水层声学评估种类资源密度
Figure 5. Resource density of fish species acoustically assessed in different water layers
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图 6 调查海域目标强度频度分布图
Figure 6. Frequency distribution of target strength in survey sea area
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图 7 调查海域单体目标强度的垂直水深分布
Figure 7. Vertical water depth distribution of single target strength in survey sea area
表 1 科学探鱼仪 (Simrad EK80) 的主要技术参数设置
Table 1 Main technical parameters setting of scientific echosounder (Simrad EK80)
技术参数
Technical parameter参数设置
Parameter
setting工作频率范围 Operating frequency range/kHz 85~170 换能器频率 Transducer frequency/kHz 120 功率 Transmitting power/W 150 脉冲宽度 Pulse length/ms 0.256 脉冲间隔 Ping interval/s.ping 0.2 探测深度量程 Investigation depth range/m 30 
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表 2 调查船只及网具采样设置
Table 2 Investigate vessel and net sampling settings
参数
Parameter2022年3月
March 20222023年1月
January 2023采样类型 Sample type 拖网 拖网 船只功率 Vessel power/kW 135 135 拖网速度
Speed of trawling/(km·h–1)3 3 拖网时间 Trawl time/min 30 30 网具上纲长 Headline/m 9 6 网目 Mesh size 4.0 cm×2.5 cm 4.0 cm×2.5 cm
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表 3 声学评估种类的b20值
Table 3 b20 value for acoustically assessed species
种类 Species b20/dB 种类 Species b20/dB 种类 Species b20/dB 火枪乌贼
Loligo beka−80.0 赤鼻棱鳀
Thryssa kammalensis−72.5 长蛇鲻
Saurida elongata−80.0 杜氏枪乌贼
Uroteuthis duvauceli−80.0 竹荚鱼
Trachurus japonicus−72.5 海鳗
Muraenesox cinereus−76.0 剑尖枪乌贼
Uroteuthis edulis−80.0 截尾白姑鱼
Pennahia anea−68.0 日本花鲈
Lateolabrax japonicus−72.5 少鳞鱚
Sillago japonica−72.5 鹿斑仰口鲾
Leiognathus ruconius−72.5 日本绯鲤
Upeneus japonicus−72.5 短蛸
Octopusocellatus−80.0 短吻鲾
Leiognathus brevirostris−72.5 带鱼
Trichiurus lepturus−66.1 斑鰶
Onosirus punctatus−72.5 侧条天竺鲷
Apogon lateralis−68.0 月尾兔头鲀
Lagocephalus lunaris−76.0 印度鳓
Ilisha melastoma−72.5 二长棘鲷
Paerargyrops edita−68.0 双棘三刺鲀
Triacanthus biaculeatus−76.0 印度小公鱼
Stolephorus indicus−72.5 黑鲷
Sparus macrocephlus−71.5 丝背细鳞鲀
Stephanolepis cirrhifer−72.5 蓝圆鲹
Decapterus maruadsi−72.5 黄鳍鲷
Acanthopagrus latus−68.0 中华单角鲀
Monacanthus chinensis−72.5
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表 4 各种类资源密度
Table 4 Density of various resources
调查时间
Investigation
time种类
Class尾数密度
Fish density/
(尾·km−2)生物量密度
Fish biomass density/
(kg·km−2)2022-03 鱼类 55 226 520.48 头足类 1 388 34.89 蟹类 8 681 154.99 虾类 28 091 93.28 虾姑类 685 8.90 2023-01 鱼类 16 430 573.88 头足类 2 263 122.07 蟹类 2 301 60.87 虾类 5 413 32.48 虾姑类 424 10.67
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表 5 各次调查渔获数量百分比前5位的种类组成及生物学信息
Table 5 Top 5 of percentages of species composition and biological information of catches in each survey
调查时间
Investigation time种类
Species数量百分比
Quantity percentage/%平均体长
Mean body length/mm平均体质量
Mean body mass/g2022-03 二长棘鲷 Parargyrops edita 61.62 65 16.9 鹿斑仰口鲾 Leiognathus ruconius 8.56 57 4.1 短吻鲾 Leiognathus brevirostris 4.77 90 11.7 侧带天竺鲷 Apogon lateralis 3.53 58 2.8 竹荚鱼 Trachurus japonicus 3.26 78 14.5 2023-01 鹿斑仰口鲾 Leiognathus ruconius 19.24 49 11.7 二长棘鲷 Parargyrops edita 12.05 105 50.0 月尾兔头鲀 Lagocephalus lunaris 10.00 112 56.1 斑鰶 Konosirus punctatus 5.61 138 52.5 火枪乌贼 Loligo beka 5.30 61 12.6
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