Isolation, identification and antimicrobial susceptibility test of Edwardsiella tarda in Bahaba taipingensis
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摘要:
2023 年入夏以来，东莞市黄唇鱼 (Bahaba taipingensis) 自然保护区救护基地出现黄唇鱼发病和死亡病例，症状主要为食欲下降，体表发红、充血，眼球突出，角膜白浊溃烂，吻部溃烂；解剖后发现腹腔有大量腹水，肝肿大呈褐色。为确定其病因，针对性制定防治措施，采集死亡病鱼的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、鳃丝等组织样品。从病死鱼体内分离到一株优势菌株，命名为DG230920，通过对菌株的形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列综合分析，鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda)。病理组织学检测结果显示，心脏、肝脏、脾脏、肾脏和鳃均有明显的炎症反应，肠出血、黏膜上皮细胞脱落，脾淋巴细胞稀疏、内皮细胞变性坏死，肾小管变性坏死，鳃见鳃丝脱落、出血。对分离菌株进行药敏分析，结果为对环丙沙星、左氧氟沙星高度敏感，最低抑菌质量浓度仅≤0.25 mg·mL−1；其次是厄他培南，最低抑菌质量浓度≤0.5 mg·mL−1。结果表明，黄唇鱼发病原因可能是迟缓爱德华氏菌感染，分离菌株遗传序列稳定，对临床使用的抗菌药物均为敏感。研究提示，应加强黄唇鱼迟缓爱德华氏菌感染的防治，选用敏感药物科学治疗。
Abstract:Since the summer of 2023, there have been cases of outbreak and death in the Bahaba taipingensis Natural Conservation Area in Dongguan City. The symptoms mainly include loss of appetite, reddening and congestion of body surface, protruding eyeballs, opaque and ulcerated corneas, as well as ulceration in snout. Dissection revealed a large amount of ascites in abdominal cavity and enlarged liver with brown color. To determine the cause of the disease, and make prevention and control measures, we collected tissue samples such as heart, liver, spleen, kidney, intestine and gills from the dead fish. A dominant strain was isolated from and named as DG230920. Through a comprehensive analysis of its morphological characteristics, physiological and biochemical properties, in addition to the 16S rRNA gene sequence analysis, the bacteria were identified as Edwardsiella tarda. Pathological histological examination results show obvious inflammatory reactions in heart, liver, spleen, kidney and gills. Hemorrhage and desquamation of epithelial cells were observed in intestine; sparse lymphocytes and necrosis of endothelial cells were found in the spleen; tubular degeneration and necrosis were observed in the kidney. Gills showed shedding and hemorrhage of gill filaments. Drug sensitivity analysis of the isolated strain revealed high sensitivity to ciprofloxacin and levofloxacin, with a minimum inhibitory concentration of only ≤0.25 mg·mL−1. The next most effective drug was imipenem, with a minimum inhibitory concentration of ≤0.5 mg·mL−1. The results indicate that the cause of B. taipingensis disease might be an infection with E. tarda, and the isolated strain exhibited stable genetic sequences and sensitivity to clinically used antibiotics. The study suggests that prevention and control measures should be strengthened against E. tarda infection in B. taipingensis, and sensitive drugs should be used for treatment.
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美拉德反应 (Maillard reaction, MR)，又称“非酶棕色化反应”，主要是指羰基化合物与氨基化合物之间的复杂反应[1]。该反应不仅给食品带来特殊的色泽与风味，还产生大量抗氧化活性物质，能有效延长食品的货架期[2-3]。目前已有关于氨基酸或多肽与不同种类还原糖的美拉德反应产物的抗氧化活性和特定香料的生产研究，但美拉德反应机制尚未明确[4]。方菲等[5]研究了鲷鱼鳞多肽-木糖的美拉德反应产物的结构与抗氧化活性，表明肽链结构发生变化，形成了新的化合物，反应产物抗氧化活性显著增加，且具有多酚氧化酶抑制活性。
裂壶藻 (Schizochytrium limacinum)，又称裂殖壶菌，属单细胞海洋真菌微藻[6]。裂壶藻富含油脂，占干质量的40%以上，目前已实现工业化生产DHA藻油[7]，且异养发酵培养时绿色环保无污染。然而，裂壶藻经提取不饱和脂肪酸后会产生蛋白质含量高达干质量40%以上的藻渣，目前该藻渣大多被当作动物饲料或肥料使用，造成该蛋白资源高值化利用程度低。本实验以提取油脂后的裂壶藻渣为原料，采用复合蛋白酶对其进行水解，得到裂壶藻酶解物 (S. limacinum hydrolysate, SLH)，加入还原糖对SLH进行美拉德反应修饰，通过单因素实验探究美拉德反应条件对SLH抗氧化活性的影响，再借助超滤、葡聚糖凝胶层析色谱等技术对SLH进行逐级分离纯化，测定不同分子量的美拉德反应产物 (Maillard reaction products, MRPs) 的抗氧化能力，并分析其氨基酸组成，为进一步实现裂壶藻藻渣的高值化和资源再利用提供理论依据和思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
裂壶藻渣购自广东润科生物工程有限公司。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH, 美国Sigma公司)。复合蛋白酶、核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、盐酸、无水乙醇、铁氰化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、三氯化铁 (广州齐云生物技术有限公司)。
1.2 仪器与设备
BS224S型电子精密天平 (德国Sartorius公司)；N & DN系列 (LCD) 超声波细胞粉碎机 (宁波新芝生物科技股份有限公司)；THZ-82水浴恒温振荡器 (精达仪器制造有限公司)；UV2550型紫外可见分光光度计 (日本岛津)；SynergyH1型酶标仪 (美国伯腾仪器有限公司)；超纯水系统 (德国Milipore公司)；凝胶层析柱Sephadex G-25 (Φ=1.6 cm×78 cm, 瑞典Pharmacia)；Alpha1-4 型冷冻干燥机 (德国Christ)；Labscale TFF system小型切向流超滤系统 (德国Milipore公司)；AvantiJ26XP型高速离心机 (美国Beckman Coulter)；3K30型高速冷冻离心机 (德国Sigma公司)；AKTA purifier UPC100型蛋白质纯化系统 (美国GE Healthcare)。
1.3 方法
1.3.1 酶解产物的制备
按照高颖等[8]的方法制备SLH。称取一定质量的藻渣于烧杯中，按料水质量比1∶12加入蒸馏水，混匀，超声处理25 min (功率调至70%) 后，将pH调至7.5，按酶总量质量分数0.5%加入复合蛋白酶，于50 ℃水浴锅恒温酶解3 h。酶解完成后，将酶解液置于沸水浴中灭酶10 min，冷却后以10 000 r·min−1离心15 min，冷冻干燥上清液后所得粉末即为SLH。
1.3.2 单因素实验
采用单因素实验分别研究糖种类、糖肽质量比、反应pH、反应温度和反应时间对反应产物的影响，以MRPs褐变程度和抗氧化活性为指标，确定美拉德反应条件；选取核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和果糖作为参与美拉德反应的糖类，反应条件为糖肽质量比1∶1、pH 7.0、反应温度80 ℃、反应时间1 h，探讨单糖的种类对美拉德反应程度及其产物抗氧化活性的影响；以核糖作为美拉德反应修饰物，反应条件为pH 7.0、反应温度80 ℃、反应时间1 h，研究糖肽质量比 (1∶1、2∶1、1∶2) 对美拉德反应程度及其产物抗氧化活性的影响；以核糖作为美拉德反应修饰物，反应条件为糖肽质量比1∶1、反应温度80 ℃、反应时间1 h，研究不同反应pH (4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0) 对美拉德反应程度及其产物抗氧化活性的影响；以核糖作为美拉德反应修饰物，糖肽质量比为1∶1、pH为9.0、反应时间1 h来考察反应温度 (30、40、50、60、70、80、90、100 ℃) 对美拉德反应程度及其产物抗氧化活性的影响；以核糖作为美拉德反应修饰物，糖肽质量比1∶1、pH 9.0、反应温度100 ℃，考察反应时间 (1、2、4、6、8 h) 对美拉德反应程度和抗氧化能力的影响。
1.3.3 MRPs褐变程度的测定
美拉德反应的中间产物随反应的进行不断增加，使溶液颜色逐渐变深。将样品稀释至25~250倍，测定产物在294和420 nm处的吸光值来表示美拉德反应的程度[4]。
1.3.4 DPPH自由基清除能力
参照Zhang等[9]的测定方法加以修改。预实验以确定样品需要稀释的倍数。取0.5 mL样液于10 mL离心管中，再加入0.5 mL 2×10−4 mol·L−1的DPPH乙醇溶液，混匀后室温避光20 min，以10 000 r·min−1离心10 min，用酶标仪测定517 nm处的吸光度。DPPH自由基清除能力的计算公式为：
$$ {\rm{DPPH}}{\text{清除率}}=\left( {1-\frac{{A}_{i}-{A}_{j}}{{A}_{0}}} \right)\times 100{\text{%}} $$ (1) 式中Ai为样液与DPPH溶液混合后的吸光值；Aj为样液与乙醇混合后的吸光值；A0为不含样液的DPPH溶液的吸光值。
1.3.5 还原力
参照李瑞杰等[10]的测定方法并略作修改。取1 mL待测样液于10 mL离心管中，分别加入1 mL 0.2 mol·L−1的磷酸盐缓冲液 (pH 6.6)，1 mL质量分数1%的铁氰化钾溶液，振荡混匀后于50 ℃水浴保温20 min。取出，加入1 mL质量分数10%三氯乙酸，振荡混匀后以10 000 r·mim−1离心10 min。取1 mL上清液，加入1 mL去离子水和0.2 mL质量分数0.1%的氯化铁溶液，振荡混匀后于50 ℃保温10 min，溶液体系变为蓝色，用酶标仪于700 nm处测定吸光度。以去离子水代替样品作空白对照。
1.3.6 超滤分离
将SLH依次通过截留分子量为50、10、5 kD的超滤膜，收集过完膜的组分，得到分子量为50 kD以下、10 kD以下及5 kD以下的多肽，经冷冻干燥后于−20 ℃备用。分别比较<5 kD (SLH-1)、<10 kD (SLH-2)、<50 kD (SLH-3) 组在美拉德反应前后的DPPH自由基清除能力及还原力。其中测量DPPH清除能力所用样品质量浓度为5 mg·mL−1，还原力所用样品质量浓度为2 mg·mL−1。
1.3.7 Sephadex G-25纯化
选取SLH-1组通过Sephadex G-25凝胶柱 (Φ=1.6 cm×78 cm) 纯化，将收集到的各峰冷冻干燥，得到不同分子量的多肽，将各个峰组分进行美拉德反应，对其产物DPPH自由基清除率和还原力大小进行测定。其中测量DPPH清除能力所用样品质量浓度为5 mg·mL−1，还原力所用样品质量浓度为2 mg·mL−1。
1.3.8 氨基酸组成分析
参考国标GB 5009.124—2016进行。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 糖种类
在美拉德反应初期，氨羰缩合会产生酮、醛等无色小分子物质，这些小分子在294 nm处会有吸收，吸光值越大，中间产物越多；而美拉德反应最终产物——类黑精在420 nm检测有吸收值，吸光值越大，褐变程度越高[11]。褐变程度用来评价美拉德反应的程度。SLH与核糖的美拉德反应中间产物和终产物的含量最多，与葡萄糖、果糖反应得到的产物含量较少 (图1-a)。SLH与核糖的美拉德反应产物的抗氧化活性高于其他糖类，其还原力 (5 mg·mL−1) 和DPPH自由基清除率 (12.5 mg·mL−1) 分别为1.39和86.73% (图2-a)。还原糖的开链程度对美拉德反应进程和速率起着重要作用[12]。上述结果表明，核糖可能更易于裂解参与美拉德反应，生成更多的类黑精，增加褐变程度，从而产物抗氧化能力较高。这与其他研究结果[13-15]一致。因此，选用核糖作为与SLH进行美拉德反应的糖类。
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图 1 裂壶藻酶解物与不同糖、糖肽质量比、反应pH、反应温度和反应时间对美拉德反应产物吸光值的影响Figure 1. Effect of SLH and different sugars, mass ratio of sugar to peptide, reaction pH, reaction temperature and reaction time on absorbance of Maillard reaction products![]()
图 2 裂壶藻酶解物与不同糖、糖肽质量比、反应pH、反应温度和反应时间对美拉德反应产物其还原力与1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率的影响Figure 2. Effect of SLH and different sugars, mass ratio of sugar to peptide, reaction pH, reaction temperature and reaction time on reducing power activity and DPPH free radical scavenging rate of Maillard reaction products2.1.2 糖肽质量比
随着糖肽质量比的增加，SLH发生美拉德反应的程度和抗氧化活性均先增加后下降。糖肽质量比为1∶1时，在294和420 nm处吸光值达到最高值 (图1-b)，表明美拉德反应最强烈，此时产物的还原力为1.35，DPPH自由基清除率为86.59% (图2-b)。反应底物的用量不同会影响美拉德反应进程，适当的糖肽用量比例可以减少副反应的发生。核糖分子与SLH之间的有效碰撞随核糖浓度的升高而增加，促进美拉德反应进行。然而，随着比例继续升高，核糖分子与多肽分子会受到空间阻碍，影响了美拉德反应进程，导致各项指标降低[16]。周冬香等[17]控制L-赖氨酸与还原糖质量比分别为1∶1、2∶1和1∶2，测得质量比为1∶1的美拉德反应产物的DPPH自由基清除效果相对最好。因此，美拉德反应时，核糖与SLH的质量比为1∶1较为适宜。
2.1.3 反应pH
美拉德产物的吸光值随着pH递增而逐渐上升，当pH>9时变化趋于平缓 (图1-c)。美拉德产物的抗氧化活性随着pH的增加而增强，反应pH为10.0时还原力和DPPH自由基清除率较高 (图2-c)，说明pH为10.0时有利于美拉德反应的发生。这可能是由于氨基在酸性条件下以-NH3 +的存在阻碍了羰氨缩合，影响美拉德反应；而在碱性条件下，氨基态氮被游离出来参与反应，pH越高，越有利于美拉德反应[18]。这与康乐和宋焕禄[19]及胡礼等[20]的研究结果一致。由于pH 9.0同pH 10.0的各项指标无显著差异 (P<0.05)，因此选择反应 pH为9.0较为适宜。
2.1.4 反应温度
反应温度对美拉德反应产物的抗氧化性影响较大，随着温度的升高，美拉德反应产物的吸光值增大，反应越来越强烈，100 ℃时产物在294和420 nm的吸光值分别为0.866、0.995 (图1-d)。随着温度的升高，美拉德反应产物的抗氧化活性增强，温度到达100 ℃时，还原力达1.17，DPPH清除率为88.02% (图2-d)，表明高温有利于SLH进行美拉德反应且促进其抗氧化活性。这可能是温度的升高带来了焦糖化和美拉德反应速率的增加，使得褐变程度加深，同时也导致了肽的降解和交联发生[21]。杨璐等[22]在羊骨胶原肽与还原糖的美拉德反应体系中也发现在一定温度范围内，提升温度可使反应产物的抗氧化能力提高。因此在常压条件下，选取反应温度100 ℃较为合适。
2.1.5 反应时间
随着反应时间的延长，美拉德反应产物在294和420 nm的吸光值逐渐增加，当反应时间达6 h后吸光值变化缓慢 (图1-e)。产物的抗氧化活性随反应时间的增加而逐渐增强，反应6 h时其还原力和DPPH清除率分别为1.24 (5 mg·mL−1) 和88.62% (12.5 mg·mL−1)，继续延长反应时间其抗氧化活性变化不显著 (图2-e)。这可能是由于SLH与核糖反应产生了大量具有还原性的酮类物质，因此随着时间的延长，其反应程度、还原力及清除DPPH自由基的能力迅速提升。当达到一定时间之后反应完全，继续增加反应时间，其反应程度、还原力及清除DPPH自由基的能力不再有太大的变化[23-24]。故选择反应时间为6 h较为合适。
综上，美拉德反应的最佳条件确定为：SLH与核糖质量比为1∶1，反应pH为9.0，反应温度为100 ℃，反应时间为6 h，在此条件下的美拉德反应产物具有较好的抗氧化活性。
2.2 超滤分离
分别比较其超滤组SLH-1 (<5 kD)、SLH-2 (<10 kD)、SLH-3 (<50 kD) 在美拉德反应前后的抗氧化活性。不同分子量的各组分及其MRPs之间的抗氧化活性存在显著性差异 (P<0.05，图3-a)，其中SLH-1组及其MRPs的抗氧化活性均高于其他组。SLH-1组的美拉德反应前的还原力为0.561，DPPH自由基清除率为71.01%，其经过美拉德反应后的还原力为0.591，DPPH自由基清除率为74.81%。分析可知，裂壶藻不同分子量多肽均具有一定的抗氧化能力，小分子量的肽能更易在生物体内运转，可更有效地通过细胞膜，清除自由基，抗氧化能力更高[25]，此结论与王传幸和李国英[26]及徐浩等[27]的结果一致；美拉德反应能够提高多肽抗氧化活性，尤指低分子量多肽易于和还原糖结合[28]，与韩佳润等[29]对虾夷扇贝 (Patinopecten yessoensis) 生殖腺酶解物与核糖反应生成的MRPs的抗氧化实验的结论相似。为了获得更好的分离效果，本实验对SLH-1组继续分离纯化。
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图 3 不同超滤组分和Sephadex G-25凝胶柱层析组分的美拉德反应产物还原力和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率Figure 3. Comparison of reducing power activity and DPPH free radical scavenging rate of Maillard reaction products prepared by different ultrafiltration fractions and Sephadex G-25 gel column separated fraction2.3 Sephadex G-25分离
SLH-1组经葡聚糖凝胶分离出4个分离峰，分别记为SLH-1-I、SLH-1-II、SLH-1-III、SLH-1-IV (图4)。根据凝胶层析法原理可知组分SLH-1-I的分子量较大，SLH-1-IV的较小[30]。SLH-1-I组的抗氧化活性远高于其他3组，其对DPPH自由基的清除率为78.95%，还原力为0.715 (图3-b)。SLH-1-IV的抗氧化活性较差，其对 DPPH自由基的清除率为3.84%，还原力为0.198。经美拉德反应后，4个分离组的美拉德反应产物的抗氧化活性在一定程度上得到提升，其中SLH-1-I组的MRPs抗氧化活性最好，其对DPPH自由基的清除率达79.41%，还原力为0.741。肽的抗氧化活性与其分子量分布和氨基酸组成有关[31-32]，一般认为小分子肽的抗氧化活性要高于大分子多肽或蛋白质，但Yu等[31]发现分子量较大的大豆多肽 (1~3 kD) 抗氧化活性较高，与本结果一致。同时美拉德反应的修饰提高了抗氧化性，可能是在加热过程中生成呋喃、还原酮、吡嗪等中间产物参与反应增强了其活性。
2.4 氨基酸组成分析
裂壶藻蛋白肽经美拉德反应修饰时主要是氨基酸参与反应，这可能会导致氨基酸组成发生较大变化，通过比较美拉德反应前后的氨基酸组成可以反映出各种氨基酸参与美拉德反应的程度[33-34]。美拉德反应会导致裂壶藻蛋白肽中的酪氨酸 (Tyr)、赖氨酸 (Lys)、组氨酸 (His)、精氨酸 (Arg)、色氨酸 (Trp) 等氨基酸含量显著降低 (P<0.05，表1)，其中Arg和Lys含量降幅最大，分别减少了71.88%和70.56%，表明Arg和Lys是参与美拉德反应的主要氨基酸，这极有可能是因为在反应过程中，与核糖或其降解产物之间的相互作用 (交联) 大量消耗了体系中的氨基酸[21]。从美拉德反应前后的必需氨基酸含量来看，其含量由反应前的34.97%变为反应后的33.09%，变化不显著 (P>0.05)，表明美拉德反应并未明显降低裂壶藻蛋白肽的营养价值。
表 1 美拉德反应前后的氨基酸含量比较Table 1. Comparison of amino acid content before and after Maillard reaction氨基酸种类
Amino acid type含量 Content/% 美拉德反应前
Before Maillard reaction美拉德反应后
After Maillard reaction天冬氨酸 Asp 10.46±0.61 11.74±0.54 苏氨酸* Thr 5.12±0.30 5.77±0.38 丝氨酸 Ser 4.70±0.21 4.78±0.33 谷氨酸 Glu 20.18±2.13 24.07±2.69 脯氨酸 Pro 4.32±0.20 6.17±0.39 甘氨酸 Gly 6.22 ±0.31 6.76±0.27 丙氨酸 Ala 8.64±0.42 8.75±0.33 缬氨酸* Val 5.82±0.36 6.76±0.41 蛋氨酸* Met 2.33±0.24 2.19±0.17 异亮氨酸* Ile 4.24±0.23 4.78±0.37 亮氨酸* Leu 7.08±0.44 6.96±0.30 酪氨酸 Try 3.30±0.28 1.83±0.10 苯丙氨酸* Phe 4.21±0.32 4.78±0.29 赖氨酸* Lys 4.45±0.25 1.31±0.08 组氨酸 His 1.82±0.09 1.29±0.06 精氨酸 Arg 5.37±0.36 1.51±0.11 色氨酸* Trp 1.72±0.16 0.54±0.04 必需氨基酸
Essential amino acids34.97±2.31 33.09±2.05 注：*. 必需氨基酸Note: *. Essential amino acids 3. 结论
本研究采用单因素实验分别考察了还原糖种类、糖肽质量比、pH、反应温度和反应时间对SLH发生美拉德反应的影响。研究表明当参与反应的糖为核糖、糖肽质量比为1∶1、pH为9、反应温度为100 ℃、反应时间为6 h时，MRPs生成量较多，其还原力和DPPH清除率分别为1.24 (5 mg·mL−1) 和88.62% (12.5 mg·mL−1)。此外，采用超滤与葡聚糖凝胶柱对SLH-1超滤组进行分离纯化后发现SLH-1-I组的抗氧化活性最好，且该组的MRPs抗氧化活性也最高，其还原力 (2 mg·mL−1) 为0.741、DPPH自由基清除率 (5 mg·mL−1) 为79.41%。由于在美拉德反应过程中会产生呋喃、噻唑和噻吩等杂环类挥发性物质，SLH-1-I组的电子转移能力 (DPPH自由基清除活性) 和还原铁氰化钾的能力 (还原力) 均得到了提升。对比美拉德反应前后的氨基酸含量发现，美拉德反应导致了裂壶藻蛋白肽中的Tyr、Lys、His、Arg、Trp等氨基酸的含量降低，但对其必需氨基酸总含量的影响不大，未明显降低其营养价值。本研究结果可为裂壶藻渣蛋白资源的高值化利用以及抗氧化产品的开发提供一定参考。
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图 1 部分病死黄唇鱼的外部特征和解剖后内脏状态
注： a. 吻溃疡，眼球突出，角膜白浊溃烂；b. 肝肿大，肝脏表面有出血点，变脆呈褐色，腹腔有大量腹水；c. 肠黏膜出血、充血；d. 肠腔内有炎性渗出物；e. 口腔溃疡。
Figure 1. Symptoms of some infected B. taipingensis
Note: a. Ulcers on the snout, protruding eyeballs, corneal opacification and ulceration; b. Enlarged liver, hemorrhagic spots on the liver surface, brittle texture with brown color, and a large amount of ascites in the abdominal cavity; c. Hemorrhage and congestion of the intestinal mucosa; d. Inflammatory exudate present in the intestinal avity; e. Oral ulcer.
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图 2 病死黄唇鱼心脏、肝脏、肠、脾、肾、鳃丝组织病理切片 (HE, 200×)
注：a. 心肌呈现淋巴细胞浸润性心肌炎；b. 肝细胞团间见淋巴细胞浸润性肝炎；c. 肠见出血、黏膜上皮细胞脱落和炎性细胞浸润；d. 淋巴细胞稀疏，内皮细胞变性坏死；e. 肾小管变性坏死，炎性细胞浸润；f. 鳃见鳃丝的脱落、出血、炎性细胞浸润。
Figure 2. Pathological sections of heart, liver, intestine, spleen, kidney and gill filaments of dead B. taipingensis (HE, 200×)
Note: a. Lymphocyte infiltration between myocardial cells; b. Lymphocyte infiltration between liver cell clusters; c. Hemorrhage, mucosal epithelial cell shedding and inflammatory cell infiltration in the intestine; d. Sparse lymphocytes, endothelial cell degeneration and necrosis; e. Renal tubular degeneration and necrosis, inflammatory cell infiltration; f. Shedding of gill filaments, hemorrhage, and inflammatory cell infiltration in the gills.
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图 3 菌株DG230920的菌落形态、显微形态
注：a. TSA 培养基上的菌落形态；b. 血琼脂平板培养48 h后的菌落形态；c. 革兰氏染色的镜检图片 (1 000×)。
Figure 3. Morphology and microphotograph of DG230920 on TSA plate
Note: a. Colony morphology of DG230920 on TSA plate; b. Colony morphology on blood nutrient agar after 48 h; c. Gram's stain microphotograph of DG230920 (1 000×).
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图 5 分离菌株DG230920基于16S rRNA序列的系统进化树
Figure 5. Phylogenetic tree based on 16S ribosomal RNA sequences
表 1 16S rRNA引物、反应体系及反应程序
Table 1 Primers of 16S rRNA, reaction and protocol
引物
Primer引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')反应体系 Reaction mixture 反应程序
Protocol片段大小
Size/bp组分
Component用量
Volume/µL上游引物
Upstream primerAGAGTTTGATCCTGGCTCAG PCR Master Mix 12.5 94 ℃预变性2 min；94 ℃变性45 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35 次循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保温 约1 500 上游引物 1.0 下游引物
Downstream primerGGTTACCTTGTTACGACTT 下游引物 1.0 模板 2.0 ddH2O 8.5 
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表 2 DG230920菌株的生理生化鉴定结果
Table 2 Physiological and biochemical identification results of DG230920
生化项目
Biochemical
item结果
Result生化项目
Biochemical
item结果
Result生化项目
Biochemical
item结果
Result生化项目
Biochemical
item结果
Result生化项目
Biochemical
item结果
Result丙氨酸-苯丙氨酸-
脯氨酸芳胺酶(APPA)− 侧金盏花醇
(ADO)− L-吡咯烷酮芳胺酶
(PyrA)− L-阿拉伯醇
(IARL)− D-纤维二糖
(dCEL)− β-半乳糖苷酶
(BGAL)− Β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(BNAG) + 谷氨酰芳胺酶 pNA
(AGLTp)− D-葡萄糖
(dGLU)+ Γ-谷氨酰转移酶(GGT) − 发酵/葡萄糖
(OFF)+ β-葡糖苷酶
(BGLU)− D-麦芽糖
(vdMAL)+ D-甘露醇
(dMAN)− D-甘露糖
(dMNE)+ β-木糖苷酶
(BXYL)− Β-丙氨酸芳胺酶 pNA(BAlap) − L-脯氨酸芳胺酶
(ProA)− 脂肪酶
(LIP)− 古老糖
(PLE)− 酪氨酸芳胺酶
(TyrA)− 尿素酶
(URE)− D-山梨醇
(dSOR)− 蔗糖
(SAC)− D-塔格糖
(dTAG)− D-海藻糖
(dTRE)− 柠檬酸盐(钠)
(CIA)+ 丙二酸盐
(MNT)− 5-酮基-D-葡萄糖酸盐(5KG) − M-乳酸盐碱化(N-ILATk) − α-葡糖苷酶
(AGLU)− 琥珀酸盐碱化
(SUCT)+ Β-N-乙酰氨基半乳糖苷酶 (NAGA) − Α-半乳糖苷酶
(AGAL)− 磷酸酶
(PHOS)+ 甘氨酸芳胺酶
(GlyA)− 鸟氨酸脱羧酶
(ODC)+ 赖氨酸脱羧 (LDC) + L-组氨酸同
(IHISa)− 香豆酸
(CMT)+ Β-葡萄糖醛酸酶
(BGUR)− O/129 耐药
(O129R)− 谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶(GGAA) − L-苹果酸盐同化
(IMLTa)− ELLMAN
(ELLM)+ L-乳酸盐同化
(ILATa)− 注：+. 阳性；−. 阴性。 Note: +. Positive; −. Negtive.
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表 3 菌株DG230920的药敏试验结果
Table 3 Drug sensitivity test results of DG230920
抗菌剂
Antibiotic最低抑菌浓度
MIC/(mg·mL−1)结果①
Result抗菌剂
Antibiotic最低抑菌浓度
MIC/(mg·mL−1)结果①
Result氨苄西林 Ampicillin ≤2 S 厄他培南 Ertapenemc ≤0.5 S 氨苄西林/舒巴坦 Ampicillin/Sulbactam ≤2 S 亚胺培南 Imipenemc ≤1 S 哌拉西林/他唑巴坦
Piperacillin/Tazobactamm≤4 S 阿米卡星 Amikcin ≤2 S 头孢唑林 Cefazolin ≤4 S 庆大霉素 Gentamicin ≤1 S 头孢替坦 Cefotetan ≤4 S 妥布霉素 Tobramycin ≤1 S 头孢他啶 Ceftazidime ≤1 S 环丙沙星 Ciprofloxacin ≤0.25 S 头孢曲松 Ceftriaoxone ≤1 S 左氧氟沙星 Levofloxacin ≤0.25 S 头孢吡肟 Cetepime ≤1 S 呋喃妥因 Nitrofurantoin ≤16 S 氨曲南 Aztreonam ≤1 S 复方新诺明
Trimethoprim/Sulfamethoxazole≤20 S 注：① 药物的敏感度 (S代表对药物敏感)。 Note: ① Drug sensitivity (S represents sensitivity).
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