Cloning of adsl gene in Larimichthys crocea and analysis of its correlation between expression level and inosine content
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摘要:
大黄鱼 (Larimichthys crocea) 风味品质劣化严重制约其产业的健康发展。为探究大黄鱼腺苷琥珀酸裂解酶 (Adenylosuccinate lyase, ADSL) 在风味关键物质肌苷酸 (Inosine monophosphate, IMP) 合成中的作用，克隆了大黄鱼adsl基因的开放阅读框 (ORF) 序列，分析了其基因结构和进化特征；在明确其组织分布特性的基础上，比较了不同养殖规格大黄鱼肌肉组织中的IMP含量和adsl基因的表达差异。结果显示：大黄鱼adsl基因ORF全长1 446 bp，编码481个氨基酸。对应的蛋白质相对分子质量为54.6 kD，等电点为6.19，包含N末端的裂解酶1和C末端的ADSL_C两个结构域。大黄鱼与棘头梅童鱼 (Collichthys lucidus) 的亲缘关系最近，相似性达98.54%。大黄鱼adsl基因由12个外显子和11个内含子组成，其mRNA在肌肉组织中表达量最大，且显著高于其他组织 (P<0.05)。随着体质量的增加，养殖大黄鱼肌肉组织中的IMP含量显著增加 (P<0.01)；adsl基因mRNA的相对表达量也呈类似规律。相关性分析显示，大黄鱼肌肉组织中adsl基因的相对表达量与对应的IMP含量呈显著正相关 (r=0.962, P<0.0001)。研究结果为进一步探明adsl基因在大黄鱼IMP合成及风味形成中的作用机制提供了参考资料。
Abstract:Declining flesh quality in farmed large yellow croaker (Larimichthys crocea) seriously restricts the healthy development of its industry. To investigate the role of adenylsuccinate lyase (ADSL) in the synthesis of the key flavor substance inosine monophosphate (IMP) in L. crocea, we cloned the open reading frame (ORF) sequence of its adsl gene and analyzed the gene structure and evolutionary characteristics. After clarifying its tissue distribution characteristics, we compared the differences in IMP content and adsl gene expression in muscle tissues of cultured L. crocea with different sizes. The results show that the ORF cDNA of adsl was 1 446 bp and encoded a polypeptide of 481 amino acids (aa). The corresponding protein had a relative molecular weight of 54.6 kD and an isoelectric point of 6.19, including Pfam Lyase_1 (Ala24−Leu309) and ADSL_C (Leu374−Leu458) structural domains. Phylogenetic analysis of the deduced AA sequence reveals that the genetic relationship between L. crocea and Collechthys lucidus was the closest, with a similarity of 98.54%. The genomic DNA sequence of adsl gene was subdivided into 12 exons and 11 introns. Its mRNA had the highest expression level in muscle tissue and was significantly higher than other tissues (P<0.05). With the increase of body mass, the IMP content in L. crocea muscle increased significantly (P<0.01). The relative expression level of adsl gene mRNA also followed a similar pattern. Correlation analysis shows that the relative expression level of adsl gene in L. crocea muscle was significantly positively correlated with the corresponding IMP content (r=0.962). The results provide references for further sudy on the mechanism of action of adsl gene in IMP synthesis and flavor formation in L. crocea.
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大黄鱼 (Larimichthys crocea) 是中国重要的海水养殖经济鱼类，2022年养殖产量达257 683 t，连续多年位居海水养殖鱼类之首[1]。随着产量激增、养殖环境恶化和集约化程度的不断提高，养殖大黄鱼出现了风味下降、肉质松软等品质劣化特征，严重影响了其市场接受度[2-4]。Ma等[5]研究表明，养殖大黄鱼的形体、颜色、肌肉质地和风味均与野生大黄鱼存在较大差异。因此，如何在维持养殖产量的同时提升肌肉品质是大黄鱼养殖产业需要关注的重要课题。
肌肉品质是一个复杂的概念，一般以风味、口感、营养价值和安全性作为评价指标[6]。鲜味是肌肉风味的重要决定因素，其来源主要有呈味氨基酸和核苷酸类物质，前者主要包括谷氨酸和氨基酸酰胺等，后者包括肌苷酸 (Inosine monophosphate, IMP) 和鸟苷酸 (Guanosine monophosphate, GMP)[7]。IMP的鲜味强度达谷氨酸的近40倍，且能与谷氨酸协同作用，提升谷氨酸鲜味30倍[8]。相比IMP，GMP在肌肉中的含量很低，对鲜味贡献有限。因此，IMP被认为是水产动物重要的鲜味物质，也是评估其肌肉品质的重要指标之一[9-10]。品种、性别、气候条件、养殖环境、饲喂方法、养殖动物年龄与体质量以及屠宰后的储存条件等均能影响肉制品中IMP的含量[11-12]。
IMP又称次黄嘌呤核苷酸，其在生物活体中有两条合成途径：第一种是“从头合成”，是机体IMP的主要合成途径；另一种为“补救合成”，其主要在骨髓、脑等组织中进行[7]。“从头合成”共有十几种酶参与，其中腺苷酸琥珀酸裂解酶 (Adenylosuccinate lyase, ADSL) 是催化合成嘌呤核苷酸起始与循环的双功能酶，既能催化从头合成的第8步反应，又能转化腺苷酸琥珀酸单磷酸生成腺苷酸单磷酸，在IMP合成过程中发挥关键的调控作用[13-14]。目前，关于adsl基因的特性及其与养殖动物IMP含量的相关性研究主要集中在家禽和家畜上。徐善金等[15]发现，在鸭的不同品种、相同品种的不同性别和同一性别的不同部位间，adsl基因的表达量和对应的IMP含量呈显著正相关关系；陈晨等[16]通过比较不同猪种间IMP含量和adsl基因表达的相关性发现，二者呈极显著正相关关系。在水生动物中，斑马鱼 (Danio rerio)[17]和草鱼 (Ctenopharyngodon idella)[18]的adsl基因已被克隆，但相关研究主要集中于基因的分子特性，对于其表达量与IMP含量的对应关系研究尚未见报道。本研究克隆了大黄鱼adsl基因序列，并分析了其基因结构与进化特征。利用实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR, qPCR) 检测了其在各组织中的表达情况。同时，对不同规格养殖大黄鱼肌肉组织中的IMP含量和adsl基因的表达进行了检测。研究结果可为后续深入探明adsl基因在大黄鱼肌苷酸合成及风味形成中的作用机制奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 实验用鱼与采样
不同养殖规格的健康大黄鱼采集于福建省宁德市三都澳海域的同一养殖鱼排，以确保其养殖环境和饲喂条件一致。分别选取平均体质量为 (243.08±7.32) g (组1)、(281.80±6.70) g (组2) 和 (460.44±19.86) g (组3) 的大黄鱼用于IMP含量测定和基因表达分析，每组取5尾鱼，使用MS-222将大黄鱼麻醉后在冰盘上解剖，组1取肌肉、心脏、肝脏、鳃、脑、前肠、中肠、后肠、胃、皮肤、肾脏、脾脏和头肾组织 (用于基因的组织分布特性分析)，组2和组3仅取肌肉组织。其中，将全部3组中取样的肌肉组织分成2份，一份用于总RNA提取，另一份用于IMP含量的测定，将取样的所有组织迅速置于液氮冷冻后转移至−80 ℃冰箱保存。
1.2 大黄鱼adsl基因cDNA的克隆
按照操作说明书，使用Eastep® Super总RNA提取试剂盒 (Promega，美国) 提取大黄鱼肌肉组织总RNA。2% (w) 琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA的质量后，使用Nano Drop One (Thermo，美国) 测定其浓度。按照Eastep® RT Master反转录试剂盒 (Promega，美国) 操作说明书配制反应体系，获得cDNA模板，−20 ℃保存备用。
根据GenBank中预测的大黄鱼adsl基因序列 (XM_019265987.2)，使用Primer 5设计上下游引物对Lcadsl-F/R (表1) 扩增其开放阅读框 (Opening reading frame, ORF) 序列。以肌肉组织cDNA为模板，设置退火温度为55 ℃，PCR扩增目的基因。2% (w) 琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增结果验证后，使用产物回收试剂盒对扩增片段进行回收并连接至pMD 19T载体 (TaKaRa，日本)，重组载体转化DH5α感受态细胞后，经氨苄青霉素和菌落PCR筛选阳性克隆，送福州博尚 (尚辰) 生物技术有限公司测序验证。
表 1 大黄鱼adsl基因的扩增和qPCR引物Table 1. Primers used for gene cloning and qPCR of adsl in L. crocea引物名称
Primer name引物序列 (5'—3')
Sequence (5'−3')GenBank登录号
Accession No.用途
ApplicationLcadsl-F TGACCGGCTTTCGCGAACATG XM_019265987.2 adsl基因扩增 Lcadsl-R GTTCGTCAAAGCTCAAGCTCAA qLcadsl-F CATGCTGCGTGATGGATTCG OQ126879.1 qPCR qLcadsl-F GCTTTCCAACCGTGGTCAAC qLcβactin-F GACCTCACAGACTACCTCATG GU584189.1 qPCR qLcβactin-R TGTTGTAGGTGGTCTCGTGGA 1.3 大黄鱼adsl基因的序列特性分析
使用NCBI在线工具ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 分析大黄鱼adsl基因的ORF序列，并推导其氨基酸序列。使用Expasy在线工具 (https://web.expasy.org/compute_pi/) 分析其蛋白质的分子量和等电点，SMART软件 (http://smart.embl-heidelberg.de/) 预测其蛋白质的结构域。使用NCBI在线比对工具BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 对大黄鱼ADSL进行同源性比对，并选取不同种属的ADSL序列用于多序列比对，以MEGA 7.0 软件采用邻位相连法构建其系统进化树。使用NCBI在线工具Splign (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi) 分析大黄鱼adsl的基因结构。
1.4 大黄鱼adsl基因mRNA的组织分布
为探究大黄鱼adsl基因mRNA在各组织中的表达特性，按照1.2中方法提取组1中5尾大黄鱼的各组织总RNA，并反转录为cDNA模板。使用NCBI程序Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 设计用于adsl基因扩增的qPCR引物 (表1)。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (2×) (诺唯赞，中国) 说明书配制反应体系，于荧光定量PCR仪QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific，美国) 中进行扩增，实验以β-actin为内参[19] (表1)，每个样品设置3个平行。qPCR扩增程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。扩增程序结束后绘制熔解曲线以评估引物的特异性。根据qPCR各反应孔测得的目的基因adsl和内参基因β-actin的Ct值，以2−∆∆Ct法计算adsl基因mRNA在各组织中的相对表达量[20]。
1.5 不同规格养殖大黄鱼肌肉肌苷酸含量的测定
参考Jiang等[21]和刘旭等[22]的研究，采用高效液相色谱 (High performance liquid chromatography, HPLC) 法测定大黄鱼肌肉组织的IMP含量。使用流动相 [V (磷酸盐缓冲液)∶V (甲醇)=1 000∶40)] 将IMP标准品 (上海源叶生物科技有限公司) 进行梯度稀释，获得质量浓度分别为1.00、5.00、10.00、50.00、100.00和200.00 mg·L−1的IMP稀释液，经0.22 μm微孔滤膜过滤并超声处理30 min后，取10 μL上样于高效液相色谱仪 (Agilent，美国) 中，使用Agilent C18 (4.6 mm×250 mm×5 μm) 色谱柱和DAD检测器，设置流动相流速为1.0 mL·min−1，检测波长为254 nm。根据色谱图中不同浓度IMP样品对应的峰面积，拟合标准曲线，用于后续大黄鱼肌肉组织的IMP含量测定。
取不同规格养殖大黄鱼肌肉组织，准确称量并剪碎后，加入10% (φ) 的高氯酸5 mL，随后于超声波破碎仪 (Sonics，美国) 中处理30 min，破碎液经离心后收集上清液；向破碎液沉淀中继续加入5% (φ) 的高氯酸5 mL，并按上步方法获得上清液后，合并两次实验所得上清液，用氢氧化钾 (KOH)调节溶液pH为6.5，并以超纯水定容至20 mL，过0.22 μm微孔滤膜后上机检测。检测参数与标准曲线建立步骤中一致，根据各样品获得的峰面积，以标准曲线方程计算得到样品中IMP的质量分数，其计算公式为：
$$ W{\text{=}}\left[\left(C{\text{−}}C_0\right) \times V \times N\right] / m $$ 式中：W为肌肉中IMP的质量分数 (mg·kg−1)；C为样品测定液中IMP的质量浓度 (mg·L−1)；C0为空白对照中IMP的质量浓度 (mg·L−1)，即0；V为定容体积，即20 mL；N为稀释倍数，即1；m为各组中称量的肌肉质量 (g)。
1.6 不同规格养殖大黄鱼肌肉组织adsl表达分析
按照1.2的方法分别提取组1、组2和组3中大黄鱼肌肉组织总RNA，并反转录为cDNA模板。qPCR检测adsl基因mRNA在3组大黄鱼肌肉组织中的表达，具体方法同1.4。利用2−∆∆Ct法计算3组不同规格大黄鱼肌肉组织中adsl基因的相对表达量。
1.7 数据统计与分析
实验数据以“平均值±标准误 (
$\overline { x}\pm s_{\overline { x}} $ )”表示，采用SPSS Statistics 27软件对健康大黄鱼中adsl基因mRNA的组织分布、3组不同规格大黄鱼中adsl基因mRNA的表达差异及IMP含量差异进行单因素方差 (One-way ANOVA) 及Duncan's多重比较分析，显著性水平α为0.05。采用皮尔逊 (Pearson) 相关法对3组大黄鱼中adsl基因表达量和对应的IMP含量进行相关性分析，以P<0.05代表二者总体线性相关，以Pearson相关系数r>0代表二者正相关。用GraphPad Prism 8软件绘图。2. 结果
2.1 大黄鱼adsl基因的克隆与序列分析
以大黄鱼肌肉组织cDNA为模板，PCR扩增adsl基因的ORF片段，序列全长1 446 bp，编码481个氨基酸 (图1)。序列已提交至NCBI数据库，登录号为OQ126879.1。ADSL蛋白相对分子质量为54.6 kD，等电点为6.19；包含2个主要结构域，分别为N端的裂解酶1 (Pfam Lyase_1) 结构域 (Ala24—Leu309) 和C末端ADSL_C结构域 (Leu374—Leu458) (图2)，此外，在裂解酶1结构域内还包含一段典型的延胡索酸家族结构域 (Ser286—Glu299) (图1)。
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图 1 大黄鱼adsl基因的核苷酸及氨基酸序列注：红色下划线为Pfam Lyase_1结构域；蓝色下划线为ADSL_C结构域；阴影部分为延胡索酸家族结构域。Figure 1. Nucleotide and amino acid sequence of adsl gene in L. croceaNote: The Pfam Lyase_1 domain is shown with red underlines. The ADSL_C domain is shown with blue underlines. The fumarase region is shaded in grey.![]()
图 2 大黄鱼ADSL保守结构域预测Figure 2. Prediction of ADSL conserved structure domain in L. crocea2.2 大黄鱼adsl基因的进化与结构
将大黄鱼ADSL的氨基酸序列与其他物种进行同源性比对，结果显示：其与棘头梅童鱼 (Collichthys lucidus, TKS91682)、金头鲷 (Sparus aurata, XP_030263577.1)、黑点青鳉 (Oryzias melastigma, KAF6719572.1)、草鱼 (ACB72735.1) 和斑马鱼(NP_956193.2) 等硬骨鱼类的相似性较高，分别达到98.54%、95.63%、93.14%、92.53%和91.08%；与热带爪蟾 (Xenopus tropicalis, NP_001005457.1) 和原鸡 (Gallus gallus, NP_990860.2) 的相似度分别为76.74%和78.97%；与小鼠 (Mus musculus, NP_033764.2)、猪 (Sus scrofa, ADA82235.1)、牛 (Bos taurus, NP_001095847.1) 和人 (Homo sapiens, AAC21560.1) 等哺乳动物的相似度相对较低，分别为76.24%、77.07%、75.10%和75.83%。
系统进化树显示，大黄鱼与棘头梅童鱼聚为一小支 (置信度为98%)，之后与其他海水硬骨鱼类聚为一支，再与鲤 (Cyprinus carpio) 等淡水鱼类聚为一大支 (图3)，与同源性比对结果一致。基因结构分析显示：大黄鱼adsl基因的结构与黄鳍棘鲷 (Acanthopagrus latus) 和欧洲舌齿鲈 (Dicentrarchus labrax) 等海水鱼类一致，均由12个外显子和11个内含子组成，而草鱼等淡水鱼类和其他高等生物的adsl基因则由13个外显子和12个内含子组成 (图4)，表明在进化过程中adsl基因的结构发生了改变。
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图 3 不同物种ADSL的系统进化树Figure 3. Phylogenetic analysis of different species based on ADSL amino acid sequences![]()
图 4 不同物种adsl基因的结构Figure 4. Structure analysis of adsl genomic DNA sequence in different species2.3 大黄鱼adsl基因的组织分布
应用qPCR检测adsl基因mRNA在健康大黄鱼各组织中的分布，通过对模板进行梯度稀释并构建标准曲线计算adsl和β-actin基因的扩增效率，其数值介于0.95~1.05；扩增产物的单峰熔解曲线也显示了基因的特异性扩增。大黄鱼adsl基因mRNA在肌肉组织中有最大表达量，显著高于其他组织 (P<0.05)，心脏组织中的表达量次之，其余组织中的表达量均较低 (图5)。
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图 5 adsl基因mRNA在大黄鱼不同组织中的分布注：不同字母代表有显著性差异 (P<0.05)。Figure 5. qPCR analysis of tissues distribution of adsl transcripts in healthy L. croceaNote: Different letters represent significant differences between different tissues (P<0.05).2.4 不同规格养殖大黄鱼肌肉IMP含量比较
应用HPLC法检测不同规格养殖大黄鱼肌肉组织的IMP含量。通过对IMP标准品进行梯度稀释，获得峰面积关于IMP的线性方程：y=0.271 5x−0.073 4，R2 (决定系数) 为0.999 8，拟合回归效果良好，可用于后续实验分析 (图6-a)。使用构建的标准曲线测定不同规格养殖大黄鱼肌肉组织中IMP的质量分数 (图6-b)，组1大黄鱼肌肉组织中IMP质量分数为 (2 663.93±54.52) mg·kg−1；组2为 (2 996.43±24.10) mg·kg−1，显著高于组1 (P< 0.001)；组3达 (3 313.00±54.89) mg·kg−1，显著高于组1和组2 (P<0.01)。
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图 6 HPLC法检测不同规格大黄鱼肌肉组织中的肌苷酸含量注：a. 标准曲线的建立；b. 不同规格大黄鱼肌肉组织IMP含量；**. P<0.01；***. P<0.001。Figure 6. IMP content in muscles of L. crocea with different sizesNote: a. Construction of a standard curve to determine the IMP content; b. IMP content in muscles of L. crocea with different sizes; **. P<0.01; ***. P<0.001.2.5 大黄鱼adsl基因在不同规格养殖大黄鱼肌肉组织中的表达分析
qPCR检测不同养殖规格大黄鱼肌肉组织中adsl基因的相对表达量，结果显示：与组1的小规格大黄鱼相比，adsl基因mRNA在组2大黄鱼肌肉中的表达量显著上调 (P<0.01)，达到组1中的3.11倍；组3中adsl基因表达量显著高于组1和组2 (P<0.01)，达到组1的4.95倍 (图7-a)。
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图 7 不同规格养殖大黄鱼肌肉组织中adsl基因的mRNA表达量 (a) 及其与肌苷酸含量的相关性分析 (b)注：***. P<0.001。Figure 7. Relative expression of adsl mRNA in muscles of L. crocea with different sizes (a) and its correlation analysis with IMP content (b)Note: ***. P<0.001.由图7-b可知，不同规格大黄鱼肌肉组织中adsl基因表达的变化与IMP含量变化趋势一致。对二者进行Pearson相关性分析，P<0.000 1，表明二者显著线性相关；相关系数r为0.962，表明二者呈强正相关性。
3. 讨论
ADSL在嘌呤核苷酸合成和嘌呤核苷酸循环中均发挥重要作用[23]，解析ADSL的分子特征与表达特性将为研究IMP合成机制打下基础。本研究克隆的大黄鱼adsl基因ORF序列为1 446 bp，编码481个氨基酸，与草鱼的adsl基因分子大小相近[24]。ADSL蛋白包含N末端的裂解酶1和C末端的ADSL_C两个保守结构域，这与其他物种如鹅[14]、驴[23]等的ADSL结构一致。研究表明，II型延胡索酸酶、天冬氨酸酶、精氨基琥珀酸裂解酶和ADSL超家族均包含一段组成为“SSxxPxKxNxxxxE”的14个氨基酸的保守结构域[18,25]，大黄鱼的典型延胡索酸结构域为“SSAMPYKRNPMRAE”。同源比对结果显示，大黄鱼ADSL与其他硬骨鱼类的相似性达90%以上，与两栖类、鸟类和哺乳类的相似性较低，仍达75%以上。Yuan等[18]使用抗人源ADSL蛋白的抗体能特异性识别草鱼的ADSL。上述结果均表明，ADSL具有高度的保守性。在基因结构方面，小鼠和智人等高等生物的adsl基因由13个外显子和12个内含子组成，淡水鱼类如草鱼和斑马鱼的adsl基因结构也与之相同，而大黄鱼等海水鱼类的adsl基因则由12个外显子和11个内含子组成，表明adsl基因在进化过程中结构发生了改变。
ADSL是嘌呤核苷酸代谢的关键酶，在真核生物能量代谢中发挥重要作用，因此，其在肌肉和脑组织中具有很强的活性[26]。草鱼的adsl基因在肌肉组织中有最大表达量，其次为心脏和脑组织，表明这些组织中嘌呤核苷酸合成最为活跃[18]。大黄鱼adsl基因mRNA在各组织中呈组成型表达，其在肌肉中表达量最高，心脏组织次之，而在其他组织中的表达量均较低，这与草鱼adsl基因的表达趋势基本一致。不同的是，草鱼adsl基因在各组织中的相对表达量差异较小，肌肉组织中adsl基因的表达量约为心脏的2.5倍，约为其他组织的3~7倍；而大黄鱼肌肉组织中adsl基因的表达量则为心脏组织的15.8倍，约为脑等其他组织的近百倍。这些差异可能与鱼种、鱼体规格和养殖环境等因素相关，具体原因还有待进一步研究。
ADSL在肌肉风味物质IMP的合成过程中发挥至关重要的作用。许多研究表明，养殖动物肌肉组织adsl基因的表达量与肌肉IMP含量呈正相关关系[15-16,27]。本研究应用HPLC法测定了相同养殖条件下不同规格大黄鱼肌肉组织中的IMP含量，发现大规格鱼体肌肉组织中的IMP含量显著高于小规格鱼 (P<0.01)，而对应的adsl基因表达量也呈类似趋势，相关性分析显示二者存在显著正相关关系。这些结果均表明，与畜禽等高等生物类似，大黄鱼肌肉组织中adsl基因的表达量与IMP含量也存在正相关关系。本研究仅对3种不同规格的养殖大黄鱼进行了采样检测，后续拟通过检测同批次大黄鱼不同生长阶段的adsl基因表达量和对应的IMP含量，进一步揭示二者的关联性。此外，除鱼体规格外，养殖环境和饲料组成也能显著影响IMP的合成和代谢相关基因的表达，并进一步影响肌肉中的IMP含量[11,28]。因此，本研究采样的3组不同规格大黄鱼均源于同一养殖网箱，以确保结果的准确性。
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图 1 大黄鱼adsl基因的核苷酸及氨基酸序列
注：红色下划线为Pfam Lyase_1结构域；蓝色下划线为ADSL_C结构域；阴影部分为延胡索酸家族结构域。
Figure 1. Nucleotide and amino acid sequence of adsl gene in L. crocea
Note: The Pfam Lyase_1 domain is shown with red underlines. The ADSL_C domain is shown with blue underlines. The fumarase region is shaded in grey.
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图 2 大黄鱼ADSL保守结构域预测
Figure 2. Prediction of ADSL conserved structure domain in L. crocea
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图 3 不同物种ADSL的系统进化树
Figure 3. Phylogenetic analysis of different species based on ADSL amino acid sequences
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图 4 不同物种adsl基因的结构
Figure 4. Structure analysis of adsl genomic DNA sequence in different species
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图 5 adsl基因mRNA在大黄鱼不同组织中的分布
注：不同字母代表有显著性差异 (P<0.05)。
Figure 5. qPCR analysis of tissues distribution of adsl transcripts in healthy L. crocea
Note: Different letters represent significant differences between different tissues (P<0.05).
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图 6 HPLC法检测不同规格大黄鱼肌肉组织中的肌苷酸含量
注：a. 标准曲线的建立；b. 不同规格大黄鱼肌肉组织IMP含量；**. P<0.01；***. P<0.001。
Figure 6. IMP content in muscles of L. crocea with different sizes
Note: a. Construction of a standard curve to determine the IMP content; b. IMP content in muscles of L. crocea with different sizes; **. P<0.01; ***. P<0.001.
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图 7 不同规格养殖大黄鱼肌肉组织中adsl基因的mRNA表达量 (a) 及其与肌苷酸含量的相关性分析 (b)
注：***. P<0.001。
Figure 7. Relative expression of adsl mRNA in muscles of L. crocea with different sizes (a) and its correlation analysis with IMP content (b)
Note: ***. P<0.001.
表 1 大黄鱼adsl基因的扩增和qPCR引物
Table 1 Primers used for gene cloning and qPCR of adsl in L. crocea
引物名称
Primer name引物序列 (5'—3')
Sequence (5'−3')GenBank登录号
Accession No.用途
ApplicationLcadsl-F TGACCGGCTTTCGCGAACATG XM_019265987.2 adsl基因扩增 Lcadsl-R GTTCGTCAAAGCTCAAGCTCAA qLcadsl-F CATGCTGCGTGATGGATTCG OQ126879.1 qPCR qLcadsl-F GCTTTCCAACCGTGGTCAAC qLcβactin-F GACCTCACAGACTACCTCATG GU584189.1 qPCR qLcβactin-R TGTTGTAGGTGGTCTCGTGGA 
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