Association analysis of SNPs polymorphisms in mstn gene of Paralichthys olivaceus with growth traits
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摘要:
为研究牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 肌肉生长抑制基因 (mstn) 多态性，开发其分子辅助育种新标记，采用重测序方法对120尾牙鲆 (3个双克隆杂交家系：60 尾；3个雌核发育家系：60 尾) 的mstn基因进行单核苷酸多态性 (Single nucleotide polymorphism, SNP) 位点筛选，并对不同基因型个体的生长性状进行多重比较及SNP标记验证。结果显示，共检测到7个SNPs位点，均为颠换型突变；外显子区3个 (Exonl 1: G2063A; Exonl 3: C3883T, C4009A)，为同义突变；内含子区3个 (Intron 1: A2444T; Intron 2: T3816C, A3832C)；3'端非编码区1个 (3'UTR: C4564A)。SNPs与生长性状关联分析结果表明，A3832C和C4564A标记位点与牙鲆体质量、体长、体高等生长性状显著相关 (P<0.05)，其中A3832C 位点AA基因型和C4564A位点AC基因型在生长上表现出优势，A3832C位点CC和C4564A位点AA、CC基因型在生长上表现出劣势，其他5个SNPs位点对牙鲆生长性状影响不显著 (P>0.05)。将A3832C和C4564A标记位点在牙鲆生长快速群体 (F: 60 尾) 和生长缓慢群体 (S: 60 尾) 中验证，验证结果与多重比对结果一致，表明2个SNPs位点具有较高的稳定性。综上所述，研究筛选出了牙鲆mstn基因中与生长性状显著相关的A3832C和C4564A两个标记位点，为牙鲆分子辅助育种提供了理论参考。
Abstract:In order to study the polymorphism of mstn gene in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) and develop new markers for its molecular assisted breeding, we srceened 120 individuals of Japanese flounder (Three double clone hybrid families: 60, three Gynogenesis families: 60) mstn genes for single nucleotide polymorphisms (SNP), and conducted multiple comparisons and SNPs markers validation on the growth traits with different genotypes. The results detected seven SNPs loci, all of which were transposition type mutation; three Exon regions (Exonl 1: G2063A; Exonl 3: C3883T, C4009A) were synonymous mutations; three Intron regions (Intron I: A2444T; Intron II: T3816C, A3832C); and one non Coding region at 3' end (3' UTR: C4564A). The correlation analysis between SNPs and growth traits show that A3832C and C4564A were significantly correlated with growth traits such as body mass, body length and body height (P<0.05). Among them, A3832C AA genotype and C4564A AC genotype showed advantages in growth; A3832C CC, C4564A AA and CC genotype showed disadvantages in growth, while the other SNPs loci had no significant impact on growth traits (P>0.05). A3832C and C4564A markers were validated in fast-growing population (F: 60) and slow-growing population (S: 60), and the validation results are consistent with the results of multiple alignments, indicating that the two SNPs loci have high stability. In summary, this study screened two marker loci (A3832C, C4564A) in the mstn gene of Japanese flounder, which are significantly related to growth traits, providing theoretical references for its molecular assisted breeding.
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Keywords:
- Paralichthys olivaceus /
- mstn gene /
- SNPs /
- Growth traits
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肌肉生长抑制素 (Myostatin, Mstn) 主要在动物骨骼肌和脂肪中分泌，属于转化因子-β (TGF-β) 超家族成员，能够抑制动物肌细胞的增殖和分化，负向调控肌肉的生长发育[1]。McPherron等[2]首次在小鼠中发现mstn基因，并且敲除该基因后，小鼠骨骼肌生长加快。Wang等[3]利用CRISPR/Cas9系统使猪的 mstn基因发生突变，发现其骨骼肌显著增生，产生“双肌”表型。mstn基因具有较高的保守性，因其在动物肌肉生长上的调控功能，以及在育种上的潜在价值，受到广泛关注。
鱼类是人类重要的蛋白源，其体质量、体长等生长性状是育种的主要选育性状。目前，mstn基因已经在多种鱼类中被发现，如鲤 (Cyprinus carpio)[4]、草鱼 (Ctenopharyngodon idella)[5]、泥鳅 (Misgurnus anguillicaudatus)[6]、虹鳟 (Oncorhynchus mykiss)[7]、大西洋鲑 (Salmo salar)[8]、罗非鱼 (Oreochromis mossambicus)[9]等。mstn基因在鱼脑和肌肉中高表达，在其他组织中有微量表达，表明mstn基因在鱼类中也具有调控肌肉生长的功能，并且可能具有调控肌肉生长以外的其他功能[10]。目前关于鱼类mstn基因功能的研究主要集中在肌肉生长方面，在模式动物斑马鱼 (Danio rerio) 和青鳉 (Oryzias latipes) 中，敲除mstn基因后，鱼体出现体质量增加、肌肉肥大、肌纤维增加等变化[11-12]。而且近期研究发现，通过抑制牙鲆 (Paralichthys olivaceus) mstn基因活性，鱼的躯体厚度和肌纤维数量增加，表明mstn基因抑制了牙鲆的肌肉生长[13]。上述研究表明，mstn基因在鱼类中具有较高的保守性，并且鉴于其抑制肌肉生长的特性，其在鱼类育种上具有较高的选择潜力。
牙鲆又名偏口、左口、牙片等，是我国重要的养殖海水鱼类，其生产以工厂化养殖和网箱养殖为主，分布于国内多个沿海地区，上市规格为0.8~1.0 kg (1.5龄)[14]，养殖周期较长且成本较高。因此，通过对牙鲆优良数量性状的选育，不断提高其生长速度，缩短养殖周期，降低养殖成本，有利于推动牙鲆养殖业的发展。
DNA分子标记已广泛应用于鱼类辅助育种中，其中单核苷酸多态性 (Single nucleotide polymorphism, SNP) 是普遍存在于人类和动物中的一种分子标记，因其具有数量多、覆盖率高、遗传稳定性强、易操作等特点，在遗传图谱构建和辅助育种等方面具有良好的应用前景[15-16]。SNP位点作为分子标记辅助育种已在多种鱼类中实现，高风英等[17]对罗非鱼NOD1基因SNP位点及抗无乳链球菌感染的关联分析中发现，NOD1基因3个SNPs分别与无乳链球菌易感性、抗性、抗性/敏感性状显著相关 (P<0.05)，可作为辅助育种的候选标记；陈义培等[18]对中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) mstn基因SNPs多态性与生长性状进行关联分析，发现一个位点 (S1) 对中华绒螯蟹体质量和壳长等生长性状有显著影响，可作为辅助育种的候选标记。王桂兴等[19]通过直接测序的方法，检测到牙鲆生长激素基因 (gh) 7个SNPs位点，其中2个SNPs位点与牙鲆的体质量、体长、体高等生长性状相关。分子辅助育种是将分子生物学和传统育种相结合，提高育种效率和准确率，对于牙鲆这种生长周期较长的鱼类，可有效降低其选育成本。因此有必要利用分子辅助育种，对牙鲆生长性状实现定向选育。
目前，牙鲆mstn基因序列已被克隆出来[20]，但关于牙鲆mstn基因SNP位点筛选及与生长性状关联分析的研究较少。因此，本研究首次将mstn基因作为牙鲆育种的候选基因，通过重测序方法，筛选牙鲆mstn基因中的SNP位点，利用SNaPshot法对SNP位点进行分型，将突变位点与生长性状进行关联分析，探究与牙鲆生长发育相关的SNP位点，并在牙鲆生长快速和生长缓慢两个家系中进行验证，以期为牙鲆分子标记辅助育种提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验牙鲆为中国水产科学研究院北戴河中心实验站培育的3个牙鲆双克隆杂交家系和3个雌核发育家系，分池饲养在规格相同的3 m3水槽内，每个水槽30 尾。自然海水养殖，保持相同的流水量，水中溶解氧质量浓度≥4 mg·L−1，3月龄时进行荧光标记后同池混养。每天按鱼体质量5%投喂东丸海水鱼商品饲料 (4-11号料)，投喂2次 (8:00, 15:00)，每天换水1次，清理水槽内残饵。将牙鲆培育至15月龄时，每个家系随机选取20 尾，共120 尾，测量体质量、体长和体高，并采集胸鳍鳍条，置于−20 ℃冰箱保存。
1.2 基因组DNA提取
基因组DNA采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒 (Tiangen, DP324-02) 提取。通过1% (w) 琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，由NanoDrop分光光度仪检测其纯度和浓度，最后于−20 ℃保存备用。
1.3 mstn基因SNP位点鉴定
从上述120尾牙鲆中挑选表型差异显著的20尾进行mstn基因重测序 (每个家系挑选数量≥2)，将测序后的序列进行比对分析，筛选鉴定SNP位点。
1.3.1 重测序引物设计
根据NCBI上已公布的牙鲆mstn基因序列 (GenBank登录号: DQ997779.1)，利用Primer 5.0软件设计引物 (表1)，以牙鲆DNA为模板，进行PCR扩增。
表 1 测序用引物序列Table 1. Primer sequences used for sequencing引物
Primer序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')扩增区域
Product position退火温度
Temperature/℃产物大小
Product size/bpmstn1 F: AGTCCTGTATGATTGAAACTG 1513—3317 55 1 800 R: TGAAACCTCTGGAGGCCTGAAG mstn2 F: GTGAATAGTGTGGGTGCATGC 3157—4263 56 1 102 R: ACGCTCTCCGTCCCAACTCAAG mstn3 F: CATGCACTTGCAGAAGTATCC 4064—5530 55 1 456 R: CAGCAAACAAGCTAGAAACTT 1.3.2 PCR扩增及测序反应
PCR反应体系为50 μL，其中模板DNA 1 μL，Mg2+ 2.5 μL，10×Buffer 5 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.6 μL，ddH2O补至50 μL。反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 3 min。PCR扩增产物经切胶纯化后送至上海生工进行测序。
1.4 SNP位点基因分型
利用SNaPshot方法和ABI3730XL遗传分析仪对剩余的100 尾牙鲆进行SNPs位点基因型分析，使用GeneMapper 4.1软件[21]进行基因型检测。根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型，根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位点。以牙鲆DNA为模板，进行PCR扩增和纯化 (同1.3.2)，进行延伸反应后上测序仪测序。其中延伸反应总体系为6 μL，PCR产物2 μL，Snapshot Mix 1 μL，延伸引物 0.3 μL (表2)，ddH2O 2.7 μL；反应程序：96 ℃ 1 min；96 ℃ 10 s，52 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，30个循环；取1 μL延伸产物，加入HI-DI 10 μL，95 ℃ 变性3 min，冰水浴后测序。
表 2 牙鲆mstn基因的SNPs引物及延伸引物信息Table 2. SNPs primer and extended primer information of mstn gene of P. olivaceus引物
Primer序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')多态性
Polymorphism延伸引物
Extended primer方向
Direction产物
Production大小
Size/bpSNP 1 F: TGTCTCACATTGTGCTCTATC
R: CTTCATTCGCAGTTTGCTCAG[G/A] TGCGACCAAGAGACGCACCATCA 正向 AG 23 SNP 2 F: CCACAGAGACAATCATGATGAT
R: TGTACTGATTCCTGTACAATC[A/T] TTTTTTTTTTATCTAGCGTCTCCCGTGCGCTC 反向 AT 32 SNP 3 F: CTGTGGTTAACCAACCGTCAG
R: CTTCTGCAAGTGCATGTACTC[T/C] GACTGCTGTCATCCCACTCT 正向 CT 20 A3832C F: CTGTGGTTAACCAACCGTCAG
R: CTTCTGCAAGTGCATGTACTC[A/C] TTTTATGAATGGTTGCTGAA
ATGACAAAAATGAAAT反向 GT 36 SNP 5 F: CTGTGGTTAACCAACCGTCAG
R: CTTCTGCAAGTGCATGTACTC[C/T] CTCTCCTGACTCGCTTTGGGCC 反向 AG 22 SNP 6 F: CTGTGGTTAACCAACCGTCAG
R: CTTCTGCAAGTGCATGTACTC[A/G] TTTTTTTTAATAGTTGGCCTTGTAGCGCTT 反向 CT 30 C4564A F: ATGCACACATGCTGGACGTTG
R: AGCTTAGCGAAACGTGTATTAG[C/A] CGTATAAATGGAGAGAACAC
GGTAACGATGGAGAAAAAAG反向 GT 40 1.5 统计与分析
利用SHEsis软件 (http://analysis.bio−x.cn/) 在线分析基因型频率和等位基因频率，使用Popgene 32软件检测SNPs之间的哈温平衡[22] (Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE)。利用SPSS 19.0软件分析SNPs位点各基因型与牙鲆生长形状的关联程度。计算公式为：
$$ \begin{array}{c} \;\\[-10pt] Y_{i j}=\mu+G_i+e_{i j} \end{array} $$ (1) 式中：Yij是某个性状第i个基因型第j个个体的观测值；μ是观测值的平均值；Gi是基因型i的有效值；eij是观测值的随机残差效应 (研究过程中，随机误差包括了周围环境的影响。所有统计分析的P均值<0.05)。根据120 尾牙鲆基因型及生长性状数据，利用Origin 2021软件绘制SNPs标记不同基因型的主要生长性状分布。
1.6 SNPs位点连锁不平衡分析及标记验证
利用Haploview 4.1软件[23]对筛选出的SNPs位点进行单倍型和连锁不平衡 (Linkage disequilibrium, LD) 分析。从上述6个家系选择生长快速和生长缓慢的牙鲆个体各60 尾，根据上述PCR程序，验证新开发SNP分子标记的稳定性，并对SNP标记的基因型在生长快速和缓慢家系中的频率进行G-test检验。
2. 结果
2.1 数量性状分布特征
对120 尾牙鲆进行体质量、全长、体长、体高、头长、尾柄长、尾柄高等数量性状进行测量，运用SPSS 19.0软件对其进行正态分布检验。结果显示，各性状符合正态分布 (偏正)，具有连续遗传变异的特点 (表3)。
表 3 牙鲆数量性状的正态分布检验Table 3. Test of normal distribution of quantitative traits of P. olivaceus性状
Trait平均值±标准差
$ \overline { x}\pm s$最大值
Max.最小值
Min.偏度
Skewness峰度
Kurtosis体质量 Body mass/g 422.02±212.94 950.30 117.40 0.396 −1.101 全长 Total length/mm 343.89±58.49 483.43 228.03 0.292 −0.801 体长 Body length/mm 300.03±55.37 436.88 194.53 0.312 −0.842 头长 Head length/mm 82.56±12.94 118.12 56.59 0.37 −0.692 体高 Body height/mm 107.14±3.98 179.80 15.58 −1.029 0.032 尾柄长Tail shank length/mm 40.99±2.21 103.12 15.23 1.558 1.042 尾柄高 Tail shank height/mm 27.87±0.49 39.29 16.25 0.213 −0.94 2.2 SNPs位点及其多态性
利用重测序方法，共筛选出7个多态性SNPs位点 (表4)，位点G2063A、C3883T和C4009A位于编码区的外显子区，其中G2063A位于第1外显区 (Exonl 1) 区域，第29个氨基酸，即谷氨酰胺 (Gln)，密码子CAG转化为CAA，未发生氨基酸变化，属于同义突变；C3883T和C4009A位于第3外显子 (Exonl 3) 区域，其中C3883T位点编码第252个氨基酸，即天冬氨酸 (Asp)，密码子GAC转化为GAT，未发生氨基酸变化，属于同义突变；C4009A编码第303个氨基酸，即脯氨酸 (Pro)，密码子CCC转化为CCA，未发生氨基酸变化，属于同义突变。位点 A2444T、T3816C、A3832C位于编码区中内含子区域，属于非编码序列，其中A2444T位于第1内含子 (Introl 1) 区域，T3816C、A3832C位于第2内含子 (Introl 2) 区域。位点C4564A位于3'端非编码区 (3'UTR)，C转化为A。
表 4 牙鲆mstn基因位点信息Table 4. Information on mstn gene loci in P. olivaceus序号
No.SNP 位点
SNP site位置
Mutation area/bp类别
Mutation type所在区域
Region1 G2063A 2 063 G转化为A Exonl 1 2 A2444T 2 444 A转化为T Introl 1 3 T3816C 3 816 T转化为C Introl 2 4 A3832C 3 832 A转化为C Introl 2 5 C3883T 3 883 C转化为T Exonl 3 6 C4009A 4 009 C转化为A Exonl 3 7 C4564A 4 564 C转化为A 3'UTR 2.3 SNPs位点等位基因及基因型频率
7个位点的多重比较结果显示，A3832C和C4564A位点与生长性状显著相关 (P<0.05)。在A3832C位点中，等位基因A占优势，频率为74%，而C仅占26%。在C4564A位点中，等位基因A的频率为35%，C的频率为65%；在基因型方面，A3832C位点的显性纯合基因型AA的频率为57.5%，而基因型CC的频率仅为9.2%。C4564A基因型中，AC基因型的频率最高 (65%)，其次为CC (32.5%)，而AA的频率最低 (2.5%) (表5)。
表 5 牙鲆mstn基因中SNP位点的等位基因和基因型频率Table 5. Allele and genotype frequencies of SNP loci in mstn gene of P. olivaceus位点
Site等位基因
Allele等位基因频率
Allele frequency基因型
Genotype个体数
Number基因型频率
Genotype frequency哈温平衡
Hardy-weinbergA3832C A
C0.74
0.26AA 69 0.58 χ2=16.09
P=0.000321AC 40 0.33 CC 11 0.09 C4564A A
C0.35
0.65AA 3 0.03 χ2=37.69
P=6.53×10−9AC 78 0.64 CC 39 0.33 2.4 SNPs位点单倍型和连锁不平衡分析
牙鲆mstn基因 SNPs连锁不平衡分析结果显示 (图1)，C4009A和C4564A为相互独立状态 (D'<0.8, R2<0.33)，其他位点组成Block1，构成单倍型H1、H2，分别为GATAC、GATCC，频率为0.723、0.256，其中G2063A、A2444T处于完全连锁状态 (D'>0.8, R2>0.33)，A3832C和C4564A位点处于非完全连锁状态 (D'>0.8, R2<0.33)。
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图 1 牙鲆mstn基因SPNs的连锁不平衡分析注：方块中数字表示SNPs之间的连锁程度 (R2)，D' 值越高方块颜色越深。Figure 1. Linkage disequilibrium analysis of SNPs in mstn gene of P. olivaceusNote: The number in the block represents the linkage degree (R2) between SNPs; the higher the D' value is, the darker the color of the block is.2.5 SNPs标记位点与生长性状相关性分析
对与牙鲆生长性状显著相关的标记位点 (A3832C、C4564A) 基因型进行多重比较，其结果显示，在A3832C位点中，AA基因型与CC基因型在体质量性状上差异显著 (P<0.05)，AA基因型较CC基因型表现出生长优势；在C4564A位点中，AC基因型与AA、CC基因型在体质量性状上差异显著 (P<0.05)，AC基因型表现出生长优势 (表6)。
表 6 牙鲆mstn基因的2个SNPs标记位点不同基因型个体生长性状的多重比较Table 6. Multiple comparisons of growth traits among individuals with different genotypes at two SNPs marker loci of mstn gene of P. olivaceus位点
Site基因型
Genotype样本数
n/尾体质量
Body mass/g体长
Body length/mm体高
Body height/mm头长
Head length/mm尾柄长
Tail shank
length/mm尾柄高
Tail shank
height/mmA3832C AA 69 467.25±211.16a 310.73±55.66a 114.75±41.34a 85.03±13.43a 39.95±20.41a 28.88±5.58a AC 40 393.70±216.69b 295.25±54.00a 100.20±47.31ab 81.70±11.69ab 44.46±28.80a 27.47±4.92a CC 11 225.77±66.07c 250.30±21.00b 84.75±33.95b 70.17±4.62b 34.99±28.90a 23.02±2.92b C4564A AA 3 223.80±97.85a 243.45±59.42a 78.88±53.58a 68.8±12.0a 41.71±27.21a 22.73±5.92a AC 78 498.68±210.44b 318.21±54.85b 115.10±45.45b 87.09±12.76b 43.78±24.30a 29.76±5.35b CC 39 279.57±136.42a 268.02±36.55a 93.41±35.15a 74.56±8.03a 35.38±24.25a 24.48±3.26a 注：不同小写字母表示不同基因型生长性状存在差异显著 (P<0.05)。 Note: Different lowercase letters represent significant differences in growth traits of different genotypes (P<0.05). 根据120 尾牙鲆基因型及生长性状数据，利用Origin 2021软件绘制不同基因型牙鲆生长性状分布图 (图2、图3)，结果显示与多重比较 (表7) 结果一致，A3832C标记位点中，AA基因型在生长性状表型数据中表现出优势，CC基因型表现出劣势；同样的，C4564A中，AC基因型表现出优势，AA、CC基因型表现出劣势。
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图 2 A3832C位点不同基因型对应生长性状分布注：性状参数中间的线为中位线。Figure 2. Distribution of growth traits corresponding to different genotypes at A3832C locusNote: The line in the middle of the trait parameter is the median line.![]()
图 3 C4564A位点不同基因型对应生长性状分布注：性状参数中间的线和点分别为中位线和平均值。Figure 3. Distribution of growth traits corresponding to different genotypes at C4564A locusNote: The lines and points in the middle of the trait parameters are the median and mean values, respectively.表 7 生长快速 (F: 60尾) 和生长缓慢 (S: 60尾) 牙鲆的生长性状表型数据Table 7. Phenotypic data of growth traits in P. olivaceus with fast growth (F: 60 individuals) and slow growth (S: 60 individuals)家系
Family体质量
Body mass/g体长
Body length/cm体高
Body height/cm头长
Head length/cm尾柄长
Tail shank length/cm尾柄高
Tail shank height/cmF 605.66±133.19a 34.53±3.66a 13.86±1.46a 9.62±0.95a 3.52±0.61a 3.21±0.38a S 235.54±74.10b 25.48±2.53b 7.57±3.98b 7.25±0.63b 2.29±0.39b 2.36±0.27b 注：不同小写字母表示不同群体牙鲆生长性状间差异显著。 Note: Different lowercase letters represent significant differences in growth traits among different populations of P. olivaceus. 2.6 SNPs标记验证和应用
利用开发的两个SNPs标记，在生长快速 (F: 60尾) 和生长缓慢 (S: 60尾) 个体中进行验证，结果显示：A3832C-AA基因型、C4564A-AC基因型与A3832C-CC基因型、C4564A-AA、C4564A-CC基因型在两个群体间存在极显著性差异 (P<0.001)，并且优势型的个体体质量性状均显著高于劣势基因型个体，具有较高的稳定性 (表7—表8)。
表 8 牙鲆mstn基因SNPs标记 (A3832C、C4564A) 验证Table 8. Verification of SNPs markers (A3832C, C4564A) for mstn gene of P. olivaceusSNP标记 基因型
GenotypeF S G-test P A3832C AA 43 17 40.557 P<0.001 AC 17 14 CC 0 29 C4564A AA 0 3 42.462 P<0.001 AC 56 22 CC 4 35 3. 讨论
3.1 牙鲆mstn基因SNPs位点分布
肌肉生长抑制激素与动物生长息息相关，是肌肉形成的负调节因子[24-25]。mstn基因在肌肉生长、发育中发挥重要作用，并且参与能量代谢，在脂肪形成中也起到重要调控作用[26-27]，如Yang等[28]敲除牛的mstn基因，促进了牛的骨骼肌生长，脂肪比例下降、瘦肉比例升高。近期研究表明mstn基因与哺乳动物生长性状相关联，Chalbi等[29]筛选出的突尼斯山羊 (Capra hircus) mstn基因SNPs位点，与山羊头部生长显著相关。并且，mstn基因也与鱼类生长性状息息相关，体长、体质量、体高等生长性状是鱼类重要的经济性状，这些性状多态位点标记开发和遗传解析一直是鱼类育种的重要研究途径[30]。目前，mstn基因SNPs特性已经在多种动物中发现，大量研究证实了其作为辅助标记育种的可行性[18,31-32]。本研究发现了7个SNPs标记位点，其中G2063A位于第1外显子区，A2444T位于第1内含子区，T3816C、A3832C位于第2内含子区，C3883T、C4009A位于第3外显子区，C4564A位于3'端非编码区，SNPs位点在内含子、外显子区均有分布，与黄颡鱼 (Tachysurus fulvidraco) mstn基因SNPs位点分布相似[33]，但本研究中SNPs位点在非编码区也有分布，表明牙鲆mstn基因具有较高的选择潜力。
3.2 SNPs位点与牙鲆生长性状的相关性
同一基因的不同SNPs标记位点在性状相关性分析中会表现出差异，如张世勇等[34]对斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus) 的研究中，共筛选出4个mstn基因SNPs标记位点，与生长性状关联分析发现，仅SNP位点g.4355C>G与生长性状显著相关；于爱清等[35]采用直接测序技术，从刀鲚 (Coilia ectenes) mstn基因中筛选出3个SNPs位点，SNP位点g.786C>T与体长、体高和体质量呈显著相关，其他2个位点与生长性状相关性不显著。本研究共检测到7个SNPs标记位点，A3832C、C4564A标记位点与生长性状显著相关 (P<0.05)，其他SNPs位点与生长性状的相关性不显著 (P>0.05)。A3832C和C4564A标记位点均有3个基因型，其中A3832C的3个基因型中，AA基因型在生长性状上表现出优势，并且AA、AC基因型数量上也比CC基因型多；C4564A基因型中，AC基因型在生长性状上表现出优势，并且AC基因数量最多，AA基因型数量最少且在生长性状上表现出劣势。基于上述基因型情况推测，在排除其他突变的情况下，A3832C位点CC基因型和C4564A位点AA基因型属于隐性突变，单个位点碱基的突变导致mstn基因表达量升高，抑制牙鲆生长发育。该现象也存在于牛[36]、猪[37]、海湾扇贝 (Argopecten irradians)[38]、红鳍东方鲀 (Takifugu rubripes)[39]等动物研究中。
本研究获得的2个SNPs标记位点，分别位于内含子区和3' 端非编码区，均不直接参与编码氨基酸。目前，在多种鱼类mstn基因的内含子区域均发现了SNPs位点[33-40]，基因调控主要归因于基因启动子区域的顺式元件，而内含子则在转录后被切除，不参与翻译和蛋白表达，但自从内含子被发现以来，内含子被证实为基因调控的重要参与者，可以通过对外显子的重组驱动进化[41-42]。Maniatis和Tasic[43]研究表明，内含子通过选择性剪切从单个基因中翻译多个蛋白质，并且内含子可以通过以介导增强的机制调控基因表达[44-46]。本研究中，C4564A位点位于非编码区，很多研究已证实，非编码区序列虽然不直接参与转录、翻译及蛋白表达，但可通过与特定的微型非编码RNA (miRNAs) 结合的方式，调节基因表达[47-48]。miRNAs是一种内源的小型非编码RNA，可直接与3' 端非编码区的信使RNA结合，调控基因表达[49]。因此，基于C4564A位点与牙鲆生长性状显著相关的现象，推测该位点可能是miRNAs特异性结合位点，调节msnt基因表达，从而影响牙鲆生长。
3.3 SPNs位点连锁不平衡分析及标记验证
同一染色体上等位基因存在非随机组合现象称为连锁不平衡 (LD)[50-51]。连锁不平衡程度常用D' 和R2表示，当D'>0.8且R2>0.34表示两个位点处于完全连锁状态，将作为一个整体进行遗传，当D'>0.8但R2<0.34表示两个位点处于非完全连锁状态[52]。在本研究中A3832C和C4564A两个位点处于非完全连锁不平衡状态 (D'>0.8, R2<0.34)，与刀鲚的两个SNPs位点的LD结果相似[53]。因此，综合A3832C和C4564A两个位点的基因分型结果，筛选出具有优异基因型的亲本，对牙鲆良种选育具有重要的参考价值。
将A3832C和C4564A在牙鲆2个基础群体 (F和S) 中验证，结果表明2个标记位点的不同基因型之间存在显著差异，在筛选过程中具有较高的准确性和稳定性。因此，在牙鲆的育种过程中，可以利用标记淘汰CC等生长上劣势的基因型，选择优势基因型进行配组。这两个位点可作为牙鲆分子育种的候选分子标记，为其分子辅助育种提供理论依据。
4. 结论
本研究利用重测序法和SNaPshot基因分型技术，在牙鲆上检测到7个SNPs位点，成功鉴定出2个与牙鲆生长性状显著相关的分子标记位点 (A3832C、C4564A)，并对这2个标记进行验证，证实其在牙鲆中具有较高的准确性和稳定性，该标记有望作为速生牙鲆繁育亲本的候选分子标记位点。
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图 1 牙鲆mstn基因SPNs的连锁不平衡分析
注：方块中数字表示SNPs之间的连锁程度 (R2)，D' 值越高方块颜色越深。
Figure 1. Linkage disequilibrium analysis of SNPs in mstn gene of P. olivaceus
Note: The number in the block represents the linkage degree (R2) between SNPs; the higher the D' value is, the darker the color of the block is.
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图 2 A3832C位点不同基因型对应生长性状分布
注：性状参数中间的线为中位线。
Figure 2. Distribution of growth traits corresponding to different genotypes at A3832C locus
Note: The line in the middle of the trait parameter is the median line.
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图 3 C4564A位点不同基因型对应生长性状分布
注：性状参数中间的线和点分别为中位线和平均值。
Figure 3. Distribution of growth traits corresponding to different genotypes at C4564A locus
Note: The lines and points in the middle of the trait parameters are the median and mean values, respectively.
表 1 测序用引物序列
Table 1 Primer sequences used for sequencing
引物
Primer序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')扩增区域
Product position退火温度
Temperature/℃产物大小
Product size/bpmstn1 F: AGTCCTGTATGATTGAAACTG 1513—3317 55 1 800 R: TGAAACCTCTGGAGGCCTGAAG mstn2 F: GTGAATAGTGTGGGTGCATGC 3157—4263 56 1 102 R: ACGCTCTCCGTCCCAACTCAAG mstn3 F: CATGCACTTGCAGAAGTATCC 4064—5530 55 1 456 R: CAGCAAACAAGCTAGAAACTT 
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表 2 牙鲆mstn基因的SNPs引物及延伸引物信息
Table 2 SNPs primer and extended primer information of mstn gene of P. olivaceus
引物
Primer序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')多态性
Polymorphism延伸引物
Extended primer方向
Direction产物
Production大小
Size/bpSNP 1 F: TGTCTCACATTGTGCTCTATC
R: CTTCATTCGCAGTTTGCTCAG[G/A] TGCGACCAAGAGACGCACCATCA 正向 AG 23 SNP 2 F: CCACAGAGACAATCATGATGAT
R: TGTACTGATTCCTGTACAATC[A/T] TTTTTTTTTTATCTAGCGTCTCCCGTGCGCTC 反向 AT 32 SNP 3 F: CTGTGGTTAACCAACCGTCAG
R: CTTCTGCAAGTGCATGTACTC[T/C] GACTGCTGTCATCCCACTCT 正向 CT 20 A3832C F: CTGTGGTTAACCAACCGTCAG
R: CTTCTGCAAGTGCATGTACTC[A/C] TTTTATGAATGGTTGCTGAA
ATGACAAAAATGAAAT反向 GT 36 SNP 5 F: CTGTGGTTAACCAACCGTCAG
R: CTTCTGCAAGTGCATGTACTC[C/T] CTCTCCTGACTCGCTTTGGGCC 反向 AG 22 SNP 6 F: CTGTGGTTAACCAACCGTCAG
R: CTTCTGCAAGTGCATGTACTC[A/G] TTTTTTTTAATAGTTGGCCTTGTAGCGCTT 反向 CT 30 C4564A F: ATGCACACATGCTGGACGTTG
R: AGCTTAGCGAAACGTGTATTAG[C/A] CGTATAAATGGAGAGAACAC
GGTAACGATGGAGAAAAAAG反向 GT 40
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表 3 牙鲆数量性状的正态分布检验
Table 3 Test of normal distribution of quantitative traits of P. olivaceus
性状
Trait平均值±标准差
$ \overline { x}\pm s$最大值
Max.最小值
Min.偏度
Skewness峰度
Kurtosis体质量 Body mass/g 422.02±212.94 950.30 117.40 0.396 −1.101 全长 Total length/mm 343.89±58.49 483.43 228.03 0.292 −0.801 体长 Body length/mm 300.03±55.37 436.88 194.53 0.312 −0.842 头长 Head length/mm 82.56±12.94 118.12 56.59 0.37 −0.692 体高 Body height/mm 107.14±3.98 179.80 15.58 −1.029 0.032 尾柄长Tail shank length/mm 40.99±2.21 103.12 15.23 1.558 1.042 尾柄高 Tail shank height/mm 27.87±0.49 39.29 16.25 0.213 −0.94
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表 4 牙鲆mstn基因位点信息
Table 4 Information on mstn gene loci in P. olivaceus
序号
No.SNP 位点
SNP site位置
Mutation area/bp类别
Mutation type所在区域
Region1 G2063A 2 063 G转化为A Exonl 1 2 A2444T 2 444 A转化为T Introl 1 3 T3816C 3 816 T转化为C Introl 2 4 A3832C 3 832 A转化为C Introl 2 5 C3883T 3 883 C转化为T Exonl 3 6 C4009A 4 009 C转化为A Exonl 3 7 C4564A 4 564 C转化为A 3'UTR
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表 5 牙鲆mstn基因中SNP位点的等位基因和基因型频率
Table 5 Allele and genotype frequencies of SNP loci in mstn gene of P. olivaceus
位点
Site等位基因
Allele等位基因频率
Allele frequency基因型
Genotype个体数
Number基因型频率
Genotype frequency哈温平衡
Hardy-weinbergA3832C A
C0.74
0.26AA 69 0.58 χ2=16.09
P=0.000321AC 40 0.33 CC 11 0.09 C4564A A
C0.35
0.65AA 3 0.03 χ2=37.69
P=6.53×10−9AC 78 0.64 CC 39 0.33
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表 6 牙鲆mstn基因的2个SNPs标记位点不同基因型个体生长性状的多重比较
Table 6 Multiple comparisons of growth traits among individuals with different genotypes at two SNPs marker loci of mstn gene of P. olivaceus
位点
Site基因型
Genotype样本数
n/尾体质量
Body mass/g体长
Body length/mm体高
Body height/mm头长
Head length/mm尾柄长
Tail shank
length/mm尾柄高
Tail shank
height/mmA3832C AA 69 467.25±211.16a 310.73±55.66a 114.75±41.34a 85.03±13.43a 39.95±20.41a 28.88±5.58a AC 40 393.70±216.69b 295.25±54.00a 100.20±47.31ab 81.70±11.69ab 44.46±28.80a 27.47±4.92a CC 11 225.77±66.07c 250.30±21.00b 84.75±33.95b 70.17±4.62b 34.99±28.90a 23.02±2.92b C4564A AA 3 223.80±97.85a 243.45±59.42a 78.88±53.58a 68.8±12.0a 41.71±27.21a 22.73±5.92a AC 78 498.68±210.44b 318.21±54.85b 115.10±45.45b 87.09±12.76b 43.78±24.30a 29.76±5.35b CC 39 279.57±136.42a 268.02±36.55a 93.41±35.15a 74.56±8.03a 35.38±24.25a 24.48±3.26a 注：不同小写字母表示不同基因型生长性状存在差异显著 (P<0.05)。 Note: Different lowercase letters represent significant differences in growth traits of different genotypes (P<0.05).
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表 7 生长快速 (F: 60尾) 和生长缓慢 (S: 60尾) 牙鲆的生长性状表型数据
Table 7 Phenotypic data of growth traits in P. olivaceus with fast growth (F: 60 individuals) and slow growth (S: 60 individuals)
家系
Family体质量
Body mass/g体长
Body length/cm体高
Body height/cm头长
Head length/cm尾柄长
Tail shank length/cm尾柄高
Tail shank height/cmF 605.66±133.19a 34.53±3.66a 13.86±1.46a 9.62±0.95a 3.52±0.61a 3.21±0.38a S 235.54±74.10b 25.48±2.53b 7.57±3.98b 7.25±0.63b 2.29±0.39b 2.36±0.27b 注：不同小写字母表示不同群体牙鲆生长性状间差异显著。 Note: Different lowercase letters represent significant differences in growth traits among different populations of P. olivaceus.
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表 8 牙鲆mstn基因SNPs标记 (A3832C、C4564A) 验证
Table 8 Verification of SNPs markers (A3832C, C4564A) for mstn gene of P. olivaceus
SNP标记 基因型
GenotypeF S G-test P A3832C AA 43 17 40.557 P<0.001 AC 17 14 CC 0 29 C4564A AA 0 3 42.462 P<0.001 AC 56 22 CC 4 35
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