Preparation of anti-largemouth bass ranavirus egg yolk antibody and establishment of indirect ELISA method
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摘要:
大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 蛙虹彩病毒 (Largemouth bass ranavirus, LMBV) 是我国大口黑鲈养殖中的常发病原，主要引起大口黑鲈病毒性溃疡病，制约其养殖业的健康发展。为探究卵黄抗体在防控LMBV中的潜在作用，利用LMBV灭活疫苗免疫蛋鸡，制备了抗LMBV卵黄抗体；通过筛选捕获物浓度、包被条件和封闭条件，建立了抗LMBV卵黄抗体的间接酶联免疫吸附测定 (ELISA)检测方法；使用构建的方法，评估了LMBV灭活疫苗免疫蛋鸡后卵黄抗体的效价消减规律。结果表明，1‰ (φ) β-丙内酯4 ℃作用72 h可完全灭活LMBV。间接ELISA反应中，每孔包被105 TCID50灭活病毒，37 ℃孵育2 h后，使用5% (φ) 牛血清白蛋白37 ℃封闭2 h，可有效降低阴性对照组卵黄抗体的背景值；此外，所建立的检测方法与杂交醴弹状病毒卵黄抗体、未免疫的蛋黄提取物和空白细胞不存在交叉反应，特异性较高。LMBV灭活疫苗免疫蛋鸡约48 d可产生特异性卵黄抗体，免疫后58 d效价升高至峰值(1∶12 800)，峰值水平可持续至免疫后128 d。所构建的LMBV卵黄抗体检测方法，可实时监测LMBV灭活疫苗免疫蛋鸡后的特异性卵黄抗体效价水平的变化规律，确定LMBV卵黄抗体的高效免疫程序及高免蛋收集持续期，为LMBV卵黄抗体产品的开发、应用及LMBV的防治提供了新思路。
Abstract:Largemouth bass ranavirus (LMBV) is a major pathogenic agent in largemouth bass culture in China, which mainly causes viral canker disease and restricts the healthy development of largemouth bass culture. In order to explore the potential role of egg yolk antibody in the prevention and control of LMBV, we immunized the LMBV inactivated vaccine to laying hens and prepared the egg yolk immunoglobulin against LMBV (Anti-LMBV IgY). Besides, we established an indirect enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA) method for detecting the titer of anti-LMBV IgY by screening trapping concentration, encapsulation condition and sealing condition. Then we evaluated the titer of anti-LMBV IgY at different time points post LMBV inactivated vaccine immunization by using the established method. The results show that 1‰ β-propanolactone could inactivate LMBV at 4 ℃ for 72 h completely. For indirect ELISA, being coated with 105 TCID50 inactivated virus, incubated at 37 ℃ for 2 h, and blocked with 5% bovine serum albumin at 37 ℃ for 2 h could reduce the background values of negative control effectively. In addition, no cross reaction had been detected between inactivate LMBV with other egg yolk extract or anti-LMBV IgY with cells, indicating that the indirect ELISA method had high specificity. Finally, we detected specific anti-LMBV IgY titer at 48 d post LMBV inactivated vaccine immunization; the titer increased to a peak of 1:12800 after 58 d post immunization, and last up to 128 d. To sum up, the indirect ELISA method in this study can real-time monitor the titer level of anti-LMBV IgY, determine the efficient immunization program and the duration of high-immunity egg collection, facilitate the development and application of LMBV egg yolk antibody products, and provide a potential solution for the prevention and treatment of LMBV.
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鲢 (Hypophthalmichthys molitrix) 是中国主要的养殖型淡水鱼类，其肉质鲜美、营养丰富，是鱼糜加工的主要原料之一。冷冻贮藏是鱼糜制品保存的主要方法，肌原纤维蛋白 (Myofibrillar protein, MP) 是鱼肉中重要的蛋白质，然而，由于长时间的冷冻贮藏，鱼糜制品中冰晶的生长会引起肌原纤维蛋白变性[1]，从而影响其品质。因此，探索新型的冷冻方式来减弱肌原纤维蛋白变性程度，保持良好的鱼糜品质显得尤为重要。磁场对食品材料具有高穿透性，且与食品无接触[2]，是一种新型的非热物理加工技术。磁场会使食品中水分子之间的键联更紧密，形成的网络更稳定，从而达到冰点冻结，并在冻结过程中形成大小均匀的冰晶，以保护产品的品质属性[3]。
褐藻寡糖 (Alginate oligosaccharide, AO) 是经褐藻胶降解产生，由β-D甘露糖醛酸 (ManA) 和C-5差向异构体α-L古洛糖醛 (GulA) 通过1-4糖苷键连接而成[4]。有研究报道，褐藻寡糖可以阻碍冰晶的生成，并且有良好的抗菌、抗氧化能力[5]，可作为天然绿色的抗冻剂。褐藻寡糖可以降低贮藏期间猕猴桃 (Actinidia chinensis) 灰霉病的发生率和病斑直径，并能使其保持更高的硬度和更低的可溶性固形物含量[6]；在凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 的冷冻中，褐藻寡糖可以延缓蛋白质变性，显著提高虾的保水能力，并保持良好的品质[7]；也有研究发现，褐藻寡糖可以降低冷冻鱿鱼鱼糜肌肉组织的硬度，提升色泽和弹性[8]。但目前仍缺乏褐藻寡糖对磁场冷冻过程中产品保鲜的相关报道。
低磁场 (Low magnetic field, LMF) 冷冻作为新型技术，已逐渐应用于食品冷冻保鲜领域。在鲤 (Cyprinus carpio) 冷冻中，低磁场缩短了相变阶段的时间，延长了冻结阶段的时间[9]；在牛肉保鲜上，低磁场可使牛肉的保质期延长6 d以上，同时可以防止结晶[10]；在樱桃 (Cerasus pseudocerasus) 冷冻中，低磁场可一定程度上减少其滴水损失[11]。使用低磁场冷冻技术和抗冻剂均能减弱冷冻贮藏过程中食品蛋白质的变化，并使其保持良好的品质。目前有关天然、绿色来源抗冻剂的协同增效作用研究报道仍较少。因此，本研究选择褐藻寡糖协同低磁场技术的冷冻方式，通过测定无处理冷冻、褐藻寡糖修饰冷冻、褐藻寡糖协同低磁场冷冻和常规冷冻下鲢肌原纤维蛋白的浊度、表面疏水性、巯基含量等指标，探讨了褐藻寡糖结合低磁场冷冻技术对鲢肌原纤维蛋白结构及功能的影响，以期为抗冻剂与低磁场技术在水产品冷冻和保鲜中的应用提供理论依据，并为获得良好的保鲜品质提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 材料
鲜活鲢体质量约1.5 kg，购买于辽宁省大连市熟食品交易中心。褐藻寡糖由中国科学院过程工程研究所苏州产业基地中科荣耀 (苏州) 生物科技有限公司提供，相对分子质量为400~1 500 D，聚合度为3~7。
试剂：氯化钠 (NaCl) (辽宁泉瑞试剂有限公司)；氢氧化钠 (NaOH) (天津市东丽区天大化学试剂厂)；乙醇 (天津市北联精细化学品开发有限公司)；溴化钾 (KBr) (光谱纯) 天津市大茂化学试剂厂；三羟甲基氨基甲烷(Tris)(青岛捷世康生物科技有限公司)；其余试剂均为国产分析纯。
仪器与设备：MFl-F1磁场冷冻冷藏箱 [英都斯特 (无锡) 感应科技有限公司]；TD5A-WS立式高速冷冻离心机 (湖南赫西仪器装备有限公司)；SynergyH1/H1M酶标仪 (美国伯腾仪器有限公司)；F-2700荧光分光光度计 (日本Hitachi公司)；Q20差示扫描量热仪 (美国TA仪器公司)；NEXUS670红外光谱仪 (美国PerkinElmer公司)；Scientz-30D真空冷冻干燥机 (宁波新芝生物科技股份有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 鲢肌原纤维蛋白的提取
根据Park等[12]的方法，略作修改。取鲢背部白肉，加入4倍体积10 mmol·L−1 Tris-HCl (pH 7.2) 缓冲液 (4 ℃)，高速均质15 s，在5 000 r·min−1下离心15 min，然后在沉淀中加入4倍体积10 mmol·L−1 Tris-HCl缓冲液 (0.6 mol·L−1NaCl, pH 7.2, 4 ℃) 混匀后再均质10 s，接着在4 500 r·min−1下再次离心20 min，保留上清液。以牛血清蛋白作为标准品制作标准曲线。将溶液与双缩脲试剂按体积比1∶4混匀，静置30 min后于540 nm测量吸光度，计算蛋白质的质量浓度。
1.2.2 冷冻条件及样品处理
将提取的肌原纤维蛋白与0.6% (w) 褐藻寡糖混合置于MFl-F1磁场冷冻冷藏箱采用 2和0 mT低磁场结合−20 ℃冷冻，以海尔BCD-336WDPC冷藏箱−30 ℃的常规冷冻组作为阳性对照组，以无添加褐藻寡糖的0 mT磁场−20 ℃冷冻为空白组 (B)，冷冻周期为28 d。在测定各项指标之前，样品在4 ℃下解冻过夜。
1.2.3 浊度的测定
根据Liu等[13]的方法，略作修改。调整肌原纤维蛋白溶液质量浓度为1 mg·mL−1，混匀后静置20 min于340 nm处测定吸光度 (A340 nm) 以表示其浊度。每个样品重复3次。
1.2.4 溶解度的测定
根据Joo等[14]的方法，略作修改。将肌原纤维蛋白溶液调整至5 mg·mL−1，取0.5 mL蛋白质溶液，加入2 mL双缩脲试剂于4 ℃静置30 min后在540 nm下检测其吸光度；另取1 mL溶液，在5 500 r·min−1下离心15 min，取上清液0.5 mL，其余操作步骤与离心前相同，得到离心前后溶液的吸光度。计算出对应的浓度。具体按如下公式计算：
$$ {S}_{{\rm{o}}}=\frac{{{C}}_{{0}}}{{{C}}_{{1}}}{ \times 100{\text{%}}} $$ (1) 式中：So为溶解度；C0为离心后上清液肌原纤维蛋白质量浓度；C1为离心前肌原纤维蛋白质量浓度。
1.2.5 表面疏水性的测定
根据 Riebroya等[15]的方法，略作修改。准备质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg·mL−1的肌原纤维蛋白溶液各2 mL，然后分别加入10 µL 8-苯胺基-1-萘磺酸钠（8-Aniline-1-naphthalenesulfonic acid sodium, ANS） (10 mmol·L−1 ANS, 20 mmol·L−1 Tris, pH 7.5)充分混匀，于4 ℃静置避光冷藏10 min。使用酶标仪进行检测。参数设置：激发波长375 nm，发射波长485 nm，增益50。以荧光强度为纵坐标，肌原纤维蛋白各浓度为横坐标作图，以曲线斜率表示蛋白质表面疏水性系数So-ANS。
1.2.6 巯基的测定
根据Liu等[16]的方法，略作修改。调整肌原纤维蛋白溶液质量浓度至5 mg·mL−1，取0.5 mL溶液，加入4.5 mL [Tris-HCl 0.2 mol·L−1，pH 6.8，8 mol尿素，2% (w) SDS，10 mmol·L−1 EDTA] 缓冲液，取4 mL混合液，加入0.25 mL DTNB溶液，40 ℃水浴25 min，在412 nm下测吸光度。活性巯基的测定是将4.5 mL缓冲液 (Tris-HCl 0.2 mol·L−1, pH 6.8, 10 mmol·L−1 EDTA) 加入0.25 mL DTNB 溶液，混合后在4 ℃下反应1 h于412 nm下测吸光度。按如下公式计算巯基质量摩尔浓度。每个样品重复3次。
$$ {b}_{\mathrm{S}\mathrm{H}}=\frac{{{10}}^{6}{\times}{A}{\times}{D}}{{13\;600 \times }{C}} $$ (2) 式中：bSH为巯基质量摩尔浓度 (mmol·kg−1)；A为除去空白试剂后样品于412 nm处吸光度；D为稀释倍数；C为蛋白质质量浓度 (mg·mL−1)。
1.2.7 热稳定性的测定
根据Dergez等[17]的方法，略作修改。取鲢肌原纤维蛋白溶液12.0~18.0 mg，均匀地铺在液体铝制坩埚中，压盖密封，进行扫描。以空坩埚为空白，升温速率10 ℃·min−1，温度扫描范围40~80 ℃。每个样品重复3次。
1.2.8 傅里叶变换红外光谱的测定
根据Xiong等[18]的方法，略作修改。将3.0 mL 肌原纤维蛋白冷冻干燥，取冻干后的样品中。在约18 MPa 的压力下加压2 min，释放压力后取出样品进行扫描得到傅里叶变换红外光谱。
1.2.9 内源性荧光光谱的测定
内源性荧光强度通过荧光分光光度计进行测定。根据 Chelh等[19]的方法，略作修改。调整肌原纤维蛋白溶液质量浓度为1 mg·mL−1，设置激发波长为280 nm，扫描范围300～450 nm。每个样品重复3次。
1.3 数据处理
采用Excel 2021软件处理数据和绘图。使用SPSS 26.0软件对数据进行单因素方差分析，通过Duncan's法进行多重比较，当P<0.05 时为差异显著。结果以“平均值±标准差 (
$\overline { X}\pm { \rm {SD}} $ )”表示。2. 结果
2.1 浊度
浊度是评价蛋白质聚集状态的指标。在探究鱼糜凝胶特性及凝胶形成机理中，浊度增加有利于形成蛋白聚集体，增加凝胶强度[20]。经28 d不同冷冻方式的肌原纤维蛋白的浊度如图1所示。与空白组相比，褐藻寡糖组经褐藻寡糖修饰冷冻后，肌原纤维蛋白的浊度稍有上升，但并不显著 (P>0.05)。与褐藻寡糖组相比，褐藻寡糖+低磁场组的浊度降低，但不显著 (P>0.05)。说明此方法可抑制肌原纤维蛋白聚集，但其效果并不显著。−30 ℃下冷冻的常规冷冻组，其浊度显著高于−20 ℃下冷冻的褐藻寡糖组 (P<0.05)。从整体上看，−20 ℃下3种冷冻方式之间浊度无显著性差异。
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图 1 不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的浊度、溶解度和表面疏水性注：相同颜色方柱上不同字母表示组间存在显著差异(P<0.05)；图2同此。Figure 1. Turbidity, solubility and surface hydrophobicity of myofibrillar protein with different freezing methodsNote: Different letters on the same color bars indicate significant differences among the groups (P<0.05). The same case in Fig. 2.2.2 溶解度
蛋白质溶解度与多个理化性质相关，如起泡、乳化和凝胶等。溶解度的增加，可以增强肌原纤维蛋白凝胶强度[21]。不同冷冻方式对肌原纤维蛋白溶解度的影响见图1，4个组的肌原纤维蛋白溶解度分别为89.85%、91.78%、91.23%和94.11%。空白组的溶解度最低，与褐藻寡糖组相比，溶解度下降了1.38%，差异显著 (P<0.05)。褐藻寡糖+低磁场组的溶解度略高于褐藻寡糖组，但无显著性差异 (P>0.05)。在不同低温下冷冻，−30 ℃下的常规冷冻组与−20 ℃的褐藻寡糖组相比，溶解度高出了2.88%，差异显著 (P<0.05)。总体上，−20 ℃条件下，经0.6% (w) 的褐藻寡糖修饰冷冻后，会提高肌原纤维蛋白的溶解度；在此条件下，增加低磁场后，二者协同也明显提高了肌原纤维蛋白的溶解度。而在−30 ℃条件下，鲢肌原纤维蛋白的溶解度更高，更能保持其理化性质。
2.3 表面疏水性
表面疏水性可以反映蛋白质的变性程度，也是凝胶网络形成的主要结合力，表面疏水性的降低，不利于肌原纤维蛋白凝胶的形成[22]。不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的表面疏水性见图1。褐藻寡糖组的表面疏水性显著低于空白组 (P<0.05)。褐藻寡糖+低磁场组的表面疏水性比褐藻寡糖组低127.34，差异显著 (P<0.05)。与褐藻寡糖组相比，常规冷冻组的表面疏水性显著降低 (P<0.05)，说明在褐藻寡糖的修饰冷冻下，可降低肌原纤维蛋白疏水基团的暴露，抑制蛋白变性，降低温度会增加抑制作用。褐藻寡糖+低磁场组的肌原纤维蛋白表面疏水性相对最低，表明双重作用下，可更好地抑制肌原纤维蛋白变性。
2.4 巯基
巯基对于维护肌原纤维蛋白空间结构的稳定性有重大意义，其中活性巯基易被氧化生成二硫键，而二硫键的形成是导致肌原纤维蛋白发生变化的主要原因。有研究显示，总巯基含量降低会导致肌原纤维蛋白凝胶的持水力下降[23]。不同冷冻方式下鲢肌原纤维蛋白巯基和二硫键的质量摩尔浓度如图2所示。褐藻寡糖组总巯基的浓度显著低于空白组 (P<0.05)，但活性巯基和二硫键的浓度变化较小。褐藻寡糖+低磁场双重作用下，肌原纤维蛋白的总巯基和活性巯基的浓度显著高于褐藻寡糖组 (P<0.05)。另外，与褐藻寡糖组相比，常规冷冻组的总巯基和活性巯基的浓度上升，二硫键浓度显著下降 (P<0.05)。总体上，常规冷冻组在防止肌原纤维蛋白的变性上有更好的成效，而褐藻寡糖协同低磁场冷冻对维持鲢肌原纤维蛋白的巯基含量效果显著，有利于保护肌原纤维蛋白空间结构的稳定性。
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图 2 不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的巯基质量摩尔浓度Figure 2. Sulfhydryl molality of myofibrillar protein with different freezing methods2.5 热稳定性
热稳定性也可以用于评价蛋白质的变性程度。有研究报道，热稳定性的升高，可以增加肌原纤维蛋白凝胶的持水量[24]。不同冷冻方式处理对肌原纤维蛋白热稳定性温度 (ΔT) 和变性焓值 (ΔH) 的影响见表1。褐藻寡糖组与空白组之间无显著性差异 (P>0.05)。而褐藻寡糖+低磁场组的肌原纤维蛋白ΔT比褐藻寡糖组高出14 ℃左右 (P<0.05)。常规冷冻组的ΔT与褐藻寡糖组无显著性差异 (P>0.05)。说明在褐藻寡糖修饰冷冻下，对肌原纤维蛋白的热稳定性温度无显著性影响，但加入低磁场后，肌原纤维蛋白的热稳定性温度出现明显提升，说明二者协同能显著提高肌原纤维蛋白的热稳定性温度，减少肌原纤维蛋白变性。此外，空白组的ΔH比褐藻寡糖组有小幅度升高，但无显著性变化 (P>0.05)，表明褐藻寡糖修饰冷冻对变性焓值影响不大。不同冷冻条件下褐藻寡糖组、褐藻寡糖+低磁场组和常规冷冻组之间的ΔH无显著变化 (P>0.05)，表明在这3种冷冻条件下，鲢肌原纤维蛋白变性时需要的焓值基本相似。
表 1 不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的热变性温度与焓值Table 1. Thermal denaturation temperature and enthalpy of myofibrillar protein with different freezing methods组别
GroupΔT/℃ ΔH/(J·kg−1) 空白组 Blank group 55.24±0.97b 6.5±2.8a 褐藻寡糖 AO 52.42±3.64bc 3.7±2.7ab 褐藻寡糖+低磁场 AO+LFM 69.24±2.46a 2.3±1.2b 常规冷冻 CF 49.84±2.29c 1.6±0. 2b 注：不同字母表示不同处理间差异显著 (P<0.05)；后表同此。 Note: Different letters indicate significant differences (P<0.05). The same case in the following table. 2.6 傅里叶变换红外光谱
傅里叶变换红外光谱能够利用分子中有振动模式的化学键来研究分子的结构，在测定蛋白质二级结构中发挥重要作用。在鱼糜凝胶特性的研究中，α-螺旋含量降低和β-折叠含量增加均有利于蛋白质变性和凝胶形成[25]。图3显示肌原纤维蛋白在红外图谱上有多个吸收波段，蛋白质二级结构包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲，蛋白质二级结构的特征峰 (酰胺I带) 分别位于1 650~1 658 cm−1、1 665~1 680 cm−1和1 660~1 665 cm−1附近[26]。表2为不同冷冻方式下蛋白质二级结构含量。有研究报道，蛋白质的结构特征与β-折叠、β-转角和无规卷曲的比例呈正相关，但与α-螺旋部分呈负相关[27]。褐藻寡糖组对比空白组，α-螺旋含量略有增加 (P>0.05)；褐藻寡糖+低磁场组相比于褐藻寡糖组，α-螺旋含量显著下降 (P<0.05)，β-转角含量略有上升 (P>0.05)。与褐藻寡糖组相比，常规冷冻组的α-螺旋含量降低 (P>0.05)。总的来说，采用褐藻寡糖修饰冷冻能减少鲢肌原纤维蛋白α-螺旋的损失，有助于抑制水溶性蛋白质和疏水残留物的暴露。
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图 3 不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的红外光谱图Figure 3. Fourier transform infrared spectra of myofibrillar protein with different freezing methods表 2 不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的二级结构变化Table 2. Change in secondary structure of myofibrillar protein with different freezing methods% 组别
Groupα-螺旋
α-helixβ-折叠
β-sheetβ-转角
β-turn无规卷曲
Random coil空白组 Blank group 21.78±0.03ab 23.54±0.08a 35.14±0.05a 19.54±0.00a 褐藻寡糖 AO 31.65±0.06a 28.12±0.14a 30.88±0.08a 9.35±0.16a 褐藻寡糖+低磁场 AO+LFM 13.90±0.12b 29.63±0.05a 34.04±0.03a 22.43±0.07a 常规冷冻 CF 23.85±0.02ab 31.37±0.08a 33.05±0.01a 11.73±0.10a 2.7 内源性荧光光谱
蛋白质中色氨酸等芳香族氨基酸残基是天然发色团，可以产生荧光。色氨酸残基的暴露情况可以反映蛋白质的三级结构变化。因此通常用其内源性荧光光谱检测蛋白质的展开和微环境极性的变化。从图4-a可以看出，肌原纤维蛋白的荧光峰约在297 nm波长处。由图4-b可知，褐藻寡糖组的最大荧光强度值高于空白组，但无统计学意义 (P>0.05)。褐藻寡糖+低磁场组的最大荧光强度值低于褐藻寡糖组，也无统计学意义 (P>0.05)。常规冷冻组的最大荧光强度值显著高于其他组 (P<0.05)。总体来说，褐藻寡糖协同低磁场冷冻处理对减少蛋白质中色氨酸残基的暴露和蛋白质展开变性具有良好的效果。
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图 4 不同冷冻方式下肌原纤维蛋白内源性荧光光谱 (a) 和最大荧光强度 (b)注：方柱上不同字母表示组间存在显著性差异 (P<0.05)。Figure 4. Endogenous fluorescence spectra (a) and maximum fluorescence intensity (b) of myofibrillar protein with different freezing methodsNote: Different letters on the bars indicate significant differences among the groups (P<0.05).3. 讨论
冷冻是常用食品保存方法之一，冷冻过程中形成的冰晶大小、形态及冷冻加工参数和原料条件等均会对产品的最终品质产生一定影响[28]，如蛋白质变性、汁液流失等，而蛋白质变性程度是维持食品品质的重要参数。目前保护蛋白质免受外力损伤并延缓其变性的方法主要有2种：添加抗冻剂 (糖类化合物和抗冻蛋白等) 和采用冷冻技术。笔者团队前期的研究发现，低磁场冷冻技术对鲢肌原纤维蛋白具有良好的保护作用[29]；也有研究表明褐藻寡糖可以防止肌原纤维蛋白的结构免受冰晶破坏，维持良好的蛋白质结构稳定性[30]。
3.1 冷冻温度对肌原纤维蛋白结构和性质的影响
冷冻温度是影响冻结和冰晶形成的重要因素之一，而冷冻贮存期间的温度波动往往会加速产品中的冰再结晶，导致较大的冰晶形成，加大了产品的机械损伤[31]。在−20和−30 ℃低温冷冻的情况下，产生的冰晶大小、形态不同，常规冷冻组 (−30 ℃) 下产生的冰晶破坏蛋白质结构的能力更强[32]，加速了蛋白质的聚集变性；此外，冰晶间的挤压和分子间相互作用，使肌原纤维蛋白构象发生变化[33]，导致其二硫键发生弱化和断裂[34]；在肌原纤维蛋白三级结构方面，降低温度后，冰晶导致肌原纤维蛋白结构的解折叠，在冷冻贮藏过程中减少了网状蛋白质的聚集，增加了色氨酸的暴露[35]。本研究中传统常规冷冻 (−30 ℃) 下，加速了蛋白质的聚集，使得肌原纤维蛋白的二级结构变得松散、不稳定，这与浊度和二级结构的含量变化结果一致。
3.2 褐藻寡糖对肌原纤维蛋白结构和性质的影响
糖类抗冻剂可以促进自由水向结合水转化，有效抑制冰晶生成，也可以取代蛋白质分子表面的结合水与之结合，从而抑致蛋白质变性。研究发现，褐藻寡糖可以通过氢键、疏水相互作用或静电相互作用嵌入冰层，抑制冰晶的生长[36]，防止肌原纤维蛋白的结构受到冰晶的破坏；褐藻寡糖也可通过作用力与冰晶结合，从空间上影响蛋白质的分布[30]。
本研究中添加褐藻寡糖后，其肌原纤维蛋白的溶解度显著升高 (P<0.05)，褐藻寡糖组活性巯基和二硫键的含量无显著变化。薛勇等[37]用10% (w) 的海藻糖溶液处理鳙 (Aristichthys nobilis) 肌原纤维蛋白后，活性巯基和二硫键的含量均明显降低，推测其与褐藻寡糖的浓度相关，但具体原因还需验证。褐藻寡糖与肌原纤维蛋白间的静电作用[38]可导致其α-螺旋含量升高；Zhong等[39]用0.2~1.6 mg·mL−1苹果多酚对羔羊 (Agnus) 肌原纤维蛋白处理后，所得结果与本研究相似。在肌原纤维蛋白三级结构方面，褐藻寡糖与肌原纤维蛋白聚合反应后，蛋白质天然排列改变，会暴露出色氨酸残基[40]，提升其荧光强度。本研究使用0.6% (w)的褐藻寡糖维持了肌原纤维蛋白二级结构的稳定，在溶解度、表面疏水性等方面有较好表现，使用褐藻寡糖作为抗冻剂，在成本上具有优势。
3.3 低磁场对肌原纤维蛋白结构和性质的影响
磁场可能通过干扰氢键减小冰晶成核的临界半径和临界功，提高均相成核率[41]，从而抑制冰晶的生长；也可能使得水分子重新排列，在冷冻过程中形成细小、均匀、光滑的冰晶，保护细胞免受破坏[2]。研究表明，低磁场冷冻产生的自由基可诱导蛋白质构象变化，影响蛋白质结构和功能特性[42]。本研究中，在褐藻寡糖的存在下，使用低磁场冷冻技术使得肌原纤维蛋白表面疏水性显著降低，总巯基含量和热变性温度显著升高，这与低磁场通过折叠、再交联和聚集来修饰蛋白质结构[43]和肌原纤维蛋白的总巯基和游离氨基以及β-转角和β-折叠结构的总含量增加相关[44]，有效维持了肌原纤维蛋白的三级结构构象。然而0.6% (w) 的褐藻寡糖协同低磁场冷冻处理导致肌原纤维蛋白二级结构变的不稳定、松散，其作用机制还需进一步探讨。
4. 结论
本研究结果表明，与空白组相比，褐藻寡糖组、褐藻寡糖+低磁场组和常规冷冻组均维持了肌原纤维蛋白良好的溶解性并抑制了疏水基团的暴露；0.6% (w)褐藻寡糖组的α-螺旋与β-折叠的总含量为59.77%，说明其对肌原纤维蛋白的二级结构有一定的保护作用；褐藻寡糖+低磁场组的最大荧光强度降低了3.6%，显著抑制了肌原纤维蛋白中色氨酸残基的暴露，总巯基的浓度最大 (1.5 mmol·kg−1)，维持了肌原纤维蛋白良好的三级结构构象；常规冷冻组的热变性温度显著降低 (P<0.05)，最大荧光强度为235.33，显著升高 (P<0.05)，表明常规冷冻处理可使肌原纤维蛋白三级结构构象改变。总的来说，0.6% (w) 褐藻寡糖协同低磁场冷冻对肌原纤维蛋白三级结构的保护具有积极作用，在维持二级结构稳定性方面有优势，也说明在褐藻寡糖的存在下，低磁场冷冻比常规冷冻更适合肌原纤维蛋白冷冻，可以降低能源损耗。探索低磁场冷冻工艺中，针对不同的原料，褐藻寡糖的最适添加量以及合适的磁场强度将成为下一步的研究方向，褐藻寡糖协同低磁场冷冻对肌原纤维蛋白中抑制冰晶生长的机理，还需进一步深入探索；同时冷冻方案对冷冻鱼糜、冷冻鱼肉的研究，将进一步验证褐藻寡糖协同低磁场冷冻方案的优势，有助于解决制约冷冻加工业发展的能耗大、产品品质下降的瓶颈问题。
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表 1 正交试验设计表
Table 1 Orthogonal design
水平
Level因素 Factor A：抗原包被浓度
Antigen coating concentrationB：抗原包被条件
Antigen coating conditionsC：封闭条件
Blocked conditionD：显色条件
Coloured condition1 1∶25 4 ℃ 18 h 37 ℃ 1 h 37 ℃ 10 min 2 1∶50 23 ℃ 2 h 37 ℃ 2 h 37 ℃ 20 min 3 1∶100 37 ℃ 1 h 4 ℃ 18 h 4 ℃ 10 min 4 1∶200 37 ℃ 2 h 23 ℃ 2 h 4 ℃ 20 min 
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表 2 抗LMBV-FS1卵黄抗体阴性对照和阳性对照样品的筛选
Table 2 Screening of negative and positive control samples for anti-LMBV-FS1 IgY
免疫程序
Immune procedure参数
Parameter抗原稀释度 Antigen dilution 1∶50 1∶100 1∶200 3免前
Before third immunization阳性 Positive 0.141 0.127 0.122 阴性 Negative 0.105 0.074 0.095 P/N 1.34 1.72 1.28 3免后10 d
10 d post third immunization阳性 Positive 0.232 0.372 0.363 阴性 Negative 0.217 0.158 0.199 P/N 1.07 2.35 1.82 3免后20 d
20 d post third immunization阳性 Positive 0.403 0.593 0.653 阴性 Negative 0.374 0.214 0.332 P/N 1.08 2.77 1.97 3免后30 d
30 d post third immunization阳性 Positive 0.714 1.056 1.040 阴性 Negative 0.656 0.327 0.574 P/N 1.09 3.23 1.81
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表 3 抗原最佳包被浓度确定
Table 3 Determination of optimal antigen coating concentration
抗原-抗体稀释倍数
Antigen-IgY dilution1∶25 1∶50 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800 1∶1 600 1∶3 200 1∶6 400 1∶12 800 1∶25 阳性 Positive 2.373 2.167 1.737 1.306 0.850 0.523 0.353 0.214 0.133 0.089 阴性 Negative 1.967 1.529 1.021 0.659 0.394 0.235 0.130 0.093 0.073 0.065 P/N 1.21 1.42 1.70 1.98 2.16 2.23 2.72 2.30 1.82 1.37 1∶50 阳性 Positive 2.385 1.571 1.119 0.757 0.446 0.279 0.169 0.112 0.090 0.075 阴性 Negative 1.635 0.996 0.660 0.470 0.238 0.154 0.094 0.073 0.064 0.054 P/N 1.46 1.58 1.70 1.61 1.87 1.81 1.80 1.53 1.41 1.39 1∶100 阳性 Positive 2.017 1.476 1.002 0.637 0.380 0.246 0.139 0.097 0.070 0.059 阴性 Negative 1.032 0.644 0.311 0.243 0.163 0.108 0.084 0.064 0.058 0.054 P/N 1.95 2.29 3.22 2.62 2.33 2.28 1.65 1.52 1.21 1.09 1∶200 阳性 Positive 1.495 0.980 0.637 0.378 0.240 0.150 0.095 0.073 0.067 0.058 阴性 Negative 0.629 0.374 0.228 0.137 0.096 0.070 0.064 0.060 0.054 0.054 P/N 2.38 2.62 2.79 2.76 2.50 2.14 1.48 1.22 1.24 1.07 1∶400 阳性 Positive 1.235 0.715 0.469 0.310 0.192 0.133 0.091 0.071 0.058 0.053 阴性 Negative 0.630 0.387 0.247 0.148 0.099 0.069 0.057 0.052 0.053 0.052 P/N 1.96 1.85 1.90 2.09 1.94 1.93 1.60 1.37 1.09 1.02
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表 4 P/N值确定抗原最佳包被条件
Table 4 Optimal antigen coating conditions determined by P/N value
抗原包被条件-抗体稀释倍数
Antigen coating
condition-Antibody dilution4 ℃孵育18 h
Incubated for
18 h at 4 ℃37 ℃孵育1 h
Incubated for
1 h at 37 ℃37 ℃孵育2 h
Incubated for
2 h at 37 ℃23 ℃孵育1 h
Incubated for
1 h at 23 ℃23 ℃孵育2 h
Incubated for
2 h at 23 ℃1∶100 阳性 Positive 0.963 1.177 1.153 1.089 1.056 阴性 Negative 0.650 0.573 0.410 0.593 0.583 P/N 1.48 2.05 2.81 1.84 1.81 1∶200 阳性 Positive 0.492 0.642 0.552 0.631 0.593 阴性 Negative 0.314 0.302 0.234 0.363 0.322 P/N 1.57 2.13 2.36 1.74 1.84 1∶400 阳性 Positive 0.267 0.341 0.301 0.332 0.372 阴性 Negative 0.186 0.173 0.152 0.215 0.192 P/N 1.44 1.97 1.98 1.54 1.94 1∶800 阳性 Positive 0.158 0.200 0.170 0.187 0.199 阴性 Negative 0.126 0.116 0.104 0.122 0.118 P/N 1.25 1.72 1.63 1.53 1.69 1∶1 600 阳性 Positive 0.111 0.130 0.117 0.124 0.127 阴性 Negative 0.103 0.087 0.090 0.087 0.079 P/N 1.08 1.49 1.30 1.43 1.61
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表 5 P/N值确定最佳封闭条件
Table 5 Optimal antigen coating conditions determined by P/N value
封闭条件-抗体稀释倍数
Blocking
condition-Antibody dilution4 ℃孵育18 h
Incubated for
18 h at 4 ℃37 ℃孵育1 h
Incubated for
1 h at 37 ℃37 ℃孵育2 h
Incubated for
2 h at 37 ℃23 ℃孵育1 h
Incubated for
1 h at 23 ℃23 ℃孵育2 h
Incubated for
2 h at 23 ℃1∶100 阳性 Positive 1.314 1.009 1.014 0.935 0.852 阴性 Negative 0.796 0.554 0.426 0.571 0.415 P/N 1.65 1.82 2.38 1.64 2.05 1∶200 阳性 Positive 0.942 0.602 0.673 0.483 0.454 阴性 Negative 0.656 0.379 0.318 0.462 0.269 P/N 1.44 1.59 2.12 1.05 1.69 1∶400 阳性 Positive 0.790 0.472 0.382 0.265 0.250 阴性 Negative 0.488 0.323 0.222 0.318 0.173 P/N 1.62 1.46 1.72 0.83 1.45 1∶800 阳性 Positive 0.620 0.293 0.173 0.155 0.140 阴性 Negative 0.374 0.204 0.175 0.255 0.113 P/N 1.66 1.44 0.99 0.61 1.24 1∶1 600 阳性 Positive 0.455 0.149 0.116 0.102 0.095 阴性 Negative 0.246 0.172 0.113 0.188 0.085 P/N 1.85 0.87 1.03 0.54 1.12
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表 6 正交试验分析
Table 6 Results of orthogonal tests
组合序列
Combinatorial sequenceA：抗原包被浓度
Antigen coating
concentrationB：抗原包被条件
Antigen coating
conditionC：封闭条件
Blocked conditionD：显色条件
Color development
conditionP/N 1 1 1 1 1 1.69 2 1 2 2 2 1.56 3 1 3 3 3 1.71 4 1 4 4 4 1.67 5 2 1 2 3 1.74 6 2 2 1 4 1.62 7 2 3 4 1 1.61 8 2 4 3 2 1.63 9 3 1 3 4 4.39 10 3 2 4 3 4.03 11 3 3 1 2 2.89 12 3 4 2 1 4.40 13 4 1 4 2 2.88 14 4 2 3 1 3.39 15 4 3 2 1 3.71 16 4 4 1 3 3.65 K1 1.657 2.675 2.462 2.772 K2 1.650 2.650 2.853 2.240 K3 3.928 2.480 2.780 2.783 K4 3.408 2.837 2.548 2.848 R 2.278 0.357 0.391 0.608 主次因素
Primary and secondary factorsA>D>C>B 较优组合
Optimal combinationKA3 KB4 KC2 KD1
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表 7 间接ELISA的特异性验证
Table 7 Specificity validation of indirect ELISA
抗体或包被物
Antibody or coatingOD450均值
Mean OD450结果
Result阳性对照组 Positive control 1.414 + 阴性对照组 Negative control 0.099 − 杂交鳢弹状病毒卵黄抗体
Anti-hybrid snakehead rhabdvirus IgY0.128 − 未免疫蛋黄提取物
Pre-immunized egg yolk extract0.063 − MBC细胞包被组 MBC coating control 0.085 − 空白对照 Blank control 0.077 −
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