地西泮在模拟养殖环境中的含量变化及累积特征

黄丽, 高磊, 吴松, 郝其睿, 李晨辉, 汤施展, 白淑艳, 陈中祥, 杜宁宁, 覃东立, 王鹏

黄丽, 高磊, 吴松, 郝其睿, 李晨辉, 汤施展, 白淑艳, 陈中祥, 杜宁宁, 覃东立, 王鹏. 地西泮在模拟养殖环境中的含量变化及累积特征[J]. 南方水产科学, 2024, 20(2): 38-47. DOI: 10.12131/20230128
引用本文: 黄丽, 高磊, 吴松, 郝其睿, 李晨辉, 汤施展, 白淑艳, 陈中祥, 杜宁宁, 覃东立, 王鹏. 地西泮在模拟养殖环境中的含量变化及累积特征[J]. 南方水产科学, 2024, 20(2): 38-47. DOI: 10.12131/20230128
HUANG Li, GAO Lei, WU Song, HAO Qirui, LI Chenhui, TANG Shizhan, BAI Shuyan, CHEN Zhongxiang, DU Ningning, QIN Dongli, WANG Peng. Variation and accumulation characteristics of diazepam in simulated culture environment[J]. South China Fisheries Science, 2024, 20(2): 38-47. DOI: 10.12131/20230128
Citation: HUANG Li, GAO Lei, WU Song, HAO Qirui, LI Chenhui, TANG Shizhan, BAI Shuyan, CHEN Zhongxiang, DU Ningning, QIN Dongli, WANG Peng. Variation and accumulation characteristics of diazepam in simulated culture environment[J]. South China Fisheries Science, 2024, 20(2): 38-47. DOI: 10.12131/20230128

地西泮在模拟养殖环境中的含量变化及累积特征

基金项目: 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助 (HSY202112Q);国家重点研发计划项目 (2020YFD0900301);中央财政经费政府购买服务项目 (ZF2022512400, ZF2023660007);中国水产科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助 (2023TD60)
详细信息
    作者简介:

    黄 丽 (1990—),女,助理研究员,硕士,研究方向为渔业环境及水产品质量安全。E-mail: huangli@hrfri.ac.cn

    通讯作者:

    覃东立 (1974—),男,研究员,研究方向为渔业环境及水产品质量安全。E-mail: qdl978@163.com

    王 鹏 (1966—),男,研究员,研究方向为渔业环境及水产品质量安全。E-mail: wangpeng@hrfri.ac.cn

  • 中图分类号: X 131.2;X 52

Variation and accumulation characteristics of diazepam in simulated culture environment

  • 摘要:

    为探究地西泮 (Diazepam, DZP) 在模拟养殖环境中的降解特点及累积特征,设置2个浓度胁迫组 (A、C组),并在2个浓度下添加蜈蚣草 (Pteris vittata) 作对照组 (B、D组),共4个试验组;分析水体、底泥和蜈蚣草中DZP浓度随时间的变化特点,探讨蜈蚣草和底泥对水体中DZP的累积特征。结果表明,给药后4组水体中DZP的初始质量浓度分别为A:(0.118±0.002) μg·L−1、B:(0.117±0.004) μg·L−1、C:(1.141±0.078) μg·L−1和D:(1.142±0.039) μg·L−1,给药后第768小时水体中DZP质量浓度下降了29.71%~40.17%;DZP降解半衰期介于65.29~139.11 d。4组底泥中DZP质量分数随时间变化逐渐上升,给药768 h后4组底泥中DZP质量分数分别达到初始质量分数的17.99倍(1.384 μg·kg−1)、14.81倍(0.918 μg·kg−1)、4.77倍 (7.848 μg·kg−1)和5.30倍 (7.763 μg·kg−1),富集系数介于9.79~18.80;B、D组蜈蚣草中DZP浓度峰值出现在给药后第216小时。蜈蚣草和底泥对水体中的DZP具有一定的吸附和富集作用,可明显缩短高浓度DZP在水中降解的半衰期,在低浓度DZP水体中添加蜈蚣草可抑制底泥对DZP的富集。

    Abstract:

    In order to explore the degradation and accumulation characteristics of diazepam (DZP) in simulated culture environment, we set up four experimental groups including two different concentration stress groups (Group A and Group C) and two control groups (Group B and Group D) with addition of Pteris vittata to analyze the changes of DZP content in water, sediment and P. vittata with time, and to investigate the accumulation characteristics of DZP in water by P. vittata and sediment. The results show that the initial DZP mass concentrations in Group A, Group B, Group C and Group D were (0.118±0.002) μg·L−1, (0.117±0.004) μg·L−1, (1.141±0.078) μg·L−1 and (1.142±0.039) μg·L−1, respectively. The DZP concentration had decreased by 29.71%–40.17% after 768 h, and the degradation half-life period of DZP ranged from 65.29 d to 139.11 d. The DZP concentration in the sediment in the four groups increased gradually with time, reaching 17.99 times (1.384 μg·kg−1, dry mass), 14.81 times (0.918 μg·kg−1, dry mass), 4.77 times (7.848 μg·kg−1, dry mass) and 5.30 times (7.763 μg·kg−1, dry mass) of the initial concentration after 768 h of administration, respectively. The enrichment coefficients were 9.79–18.80. The peak concentration of DZP in Group B and Group D appeared after 216 h after administration. The adsorption and enrichment of DZP in water by P. vittata and the sediment can obviously shorten the degradation half-life period of high concentration DZP in water, and addition of P. vittata to low concentration DZP can inhibit the enrichment of DZP in sediment.

  • 鲢 (Hypophthalmichthys molitrix) 是中国主要的养殖型淡水鱼类,其肉质鲜美、营养丰富,是鱼糜加工的主要原料之一。冷冻贮藏是鱼糜制品保存的主要方法,肌原纤维蛋白 (Myofibrillar protein, MP) 是鱼肉中重要的蛋白质,然而,由于长时间的冷冻贮藏,鱼糜制品中冰晶的生长会引起肌原纤维蛋白变性[1],从而影响其品质。因此,探索新型的冷冻方式来减弱肌原纤维蛋白变性程度,保持良好的鱼糜品质显得尤为重要。磁场对食品材料具有高穿透性,且与食品无接触[2],是一种新型的非热物理加工技术。磁场会使食品中水分子之间的键联更紧密,形成的网络更稳定,从而达到冰点冻结,并在冻结过程中形成大小均匀的冰晶,以保护产品的品质属性[3]

    褐藻寡糖 (Alginate oligosaccharide, AO) 是经褐藻胶降解产生,由β-D甘露糖醛酸 (ManA) 和C-5差向异构体α-L古洛糖醛 (GulA) 通过1-4糖苷键连接而成[4]。有研究报道,褐藻寡糖可以阻碍冰晶的生成,并且有良好的抗菌、抗氧化能力[5],可作为天然绿色的抗冻剂。褐藻寡糖可以降低贮藏期间猕猴桃 (Actinidia chinensis) 灰霉病的发生率和病斑直径,并能使其保持更高的硬度和更低的可溶性固形物含量[6];在凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 的冷冻中,褐藻寡糖可以延缓蛋白质变性,显著提高虾的保水能力,并保持良好的品质[7];也有研究发现,褐藻寡糖可以降低冷冻鱿鱼鱼糜肌肉组织的硬度,提升色泽和弹性[8]。但目前仍缺乏褐藻寡糖对磁场冷冻过程中产品保鲜的相关报道。

    低磁场 (Low magnetic field, LMF) 冷冻作为新型技术,已逐渐应用于食品冷冻保鲜领域。在鲤 (Cyprinus carpio) 冷冻中,低磁场缩短了相变阶段的时间,延长了冻结阶段的时间[9];在牛肉保鲜上,低磁场可使牛肉的保质期延长6 d以上,同时可以防止结晶[10];在樱桃 (Cerasus pseudocerasus) 冷冻中,低磁场可一定程度上减少其滴水损失[11]。使用低磁场冷冻技术和抗冻剂均能减弱冷冻贮藏过程中食品蛋白质的变化,并使其保持良好的品质。目前有关天然、绿色来源抗冻剂的协同增效作用研究报道仍较少。因此,本研究选择褐藻寡糖协同低磁场技术的冷冻方式,通过测定无处理冷冻、褐藻寡糖修饰冷冻、褐藻寡糖协同低磁场冷冻和常规冷冻下鲢肌原纤维蛋白的浊度、表面疏水性、巯基含量等指标,探讨了褐藻寡糖结合低磁场冷冻技术对鲢肌原纤维蛋白结构及功能的影响,以期为抗冻剂与低磁场技术在水产品冷冻和保鲜中的应用提供理论依据,并为获得良好的保鲜品质提供新思路。

    鲜活鲢体质量约1.5 kg,购买于辽宁省大连市熟食品交易中心。褐藻寡糖由中国科学院过程工程研究所苏州产业基地中科荣耀 (苏州) 生物科技有限公司提供,相对分子质量为400~1 500 D,聚合度为3~7。

    试剂:氯化钠 (NaCl) (辽宁泉瑞试剂有限公司);氢氧化钠 (NaOH)  (天津市东丽区天大化学试剂厂);乙醇 (天津市北联精细化学品开发有限公司);溴化钾 (KBr) (光谱纯) 天津市大茂化学试剂厂;三羟甲基氨基甲烷(Tris)(青岛捷世康生物科技有限公司);其余试剂均为国产分析纯。

    仪器与设备:MFl-F1磁场冷冻冷藏箱 [英都斯特 (无锡) 感应科技有限公司];TD5A-WS立式高速冷冻离心机 (湖南赫西仪器装备有限公司);SynergyH1/H1M酶标仪 (美国伯腾仪器有限公司);F-2700荧光分光光度计 (日本Hitachi公司);Q20差示扫描量热仪 (美国TA仪器公司);NEXUS670红外光谱仪 (美国PerkinElmer公司);Scientz-30D真空冷冻干燥机 (宁波新芝生物科技股份有限公司)。

    根据Park等[12]的方法,略作修改。取鲢背部白肉,加入4倍体积10 mmol·L−1  Tris-HCl (pH 7.2) 缓冲液 (4 ℃),高速均质15 s,在5 000 r·min−1下离心15 min,然后在沉淀中加入4倍体积10 mmol·L−1 Tris-HCl缓冲液 (0.6 mol·L−1NaCl, pH 7.2, 4 ℃) 混匀后再均质10 s,接着在4 500 r·min−1下再次离心20 min,保留上清液。以牛血清蛋白作为标准品制作标准曲线。将溶液与双缩脲试剂按体积比1∶4混匀,静置30 min后于540 nm测量吸光度,计算蛋白质的质量浓度。

    将提取的肌原纤维蛋白与0.6% (w) 褐藻寡糖混合置于MFl-F1磁场冷冻冷藏箱采用 2和0 mT低磁场结合−20 ℃冷冻,以海尔BCD-336WDPC冷藏箱−30 ℃的常规冷冻组作为阳性对照组,以无添加褐藻寡糖的0 mT磁场−20 ℃冷冻为空白组 (B),冷冻周期为28 d。在测定各项指标之前,样品在4 ℃下解冻过夜。

    根据Liu等[13]的方法,略作修改。调整肌原纤维蛋白溶液质量浓度为1 mg·mL−1,混匀后静置20 min于340 nm处测定吸光度 (A340 nm) 以表示其浊度。每个样品重复3次。

    根据Joo等[14]的方法,略作修改。将肌原纤维蛋白溶液调整至5 mg·mL−1,取0.5 mL蛋白质溶液,加入2 mL双缩脲试剂于4 ℃静置30 min后在540 nm下检测其吸光度;另取1 mL溶液,在5 500 r·min−1下离心15 min,取上清液0.5 mL,其余操作步骤与离心前相同,得到离心前后溶液的吸光度。计算出对应的浓度。具体按如下公式计算:

    $$ {S}_{{\rm{o}}}=\frac{{{C}}_{{0}}}{{{C}}_{{1}}}{ \times 100{\text{%}}} $$ (1)

    式中:So为溶解度;C0为离心后上清液肌原纤维蛋白质量浓度;C1为离心前肌原纤维蛋白质量浓度。

    根据 Riebroya等[15]的方法,略作修改。准备质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg·mL−1的肌原纤维蛋白溶液各2 mL,然后分别加入10 µL 8-苯胺基-1-萘磺酸钠(8-Aniline-1-naphthalenesulfonic acid sodium, ANS) (10 mmol·L−1 ANS, 20 mmol·L−1 Tris, pH 7.5)充分混匀,于4 ℃静置避光冷藏10 min。使用酶标仪进行检测。参数设置:激发波长375 nm,发射波长485 nm,增益50。以荧光强度为纵坐标,肌原纤维蛋白各浓度为横坐标作图,以曲线斜率表示蛋白质表面疏水性系数So-ANS。

    根据Liu等[16]的方法,略作修改。调整肌原纤维蛋白溶液质量浓度至5 mg·mL−1,取0.5 mL溶液,加入4.5 mL [Tris-HCl 0.2 mol·L−1,pH 6.8,8 mol尿素,2% (w) SDS,10 mmol·L−1 EDTA] 缓冲液,取4 mL混合液,加入0.25 mL DTNB溶液,40 ℃水浴25 min,在412 nm下测吸光度。活性巯基的测定是将4.5 mL缓冲液 (Tris-HCl 0.2 mol·L−1, pH 6.8, 10 mmol·L−1 EDTA) 加入0.25 mL DTNB 溶液,混合后在4  ℃下反应1 h于412 nm下测吸光度。按如下公式计算巯基质量摩尔浓度。每个样品重复3次。

    $$ {b}_{\mathrm{S}\mathrm{H}}=\frac{{{10}}^{6}{\times}{A}{\times}{D}}{{13\;600 \times }{C}} $$ (2)

    式中:bSH为巯基质量摩尔浓度 (mmol·kg−1);A为除去空白试剂后样品于412 nm处吸光度;D为稀释倍数;C为蛋白质质量浓度 (mg·mL−1)。

    根据Dergez等[17]的方法,略作修改。取鲢肌原纤维蛋白溶液12.0~18.0 mg,均匀地铺在液体铝制坩埚中,压盖密封,进行扫描。以空坩埚为空白,升温速率10 ℃·min−1,温度扫描范围40~80 ℃。每个样品重复3次。

    根据Xiong等[18]的方法,略作修改。将3.0 mL 肌原纤维蛋白冷冻干燥,取冻干后的样品中。在约18 MPa 的压力下加压2 min,释放压力后取出样品进行扫描得到傅里叶变换红外光谱。

    内源性荧光强度通过荧光分光光度计进行测定。根据 Chelh等[19]的方法,略作修改。调整肌原纤维蛋白溶液质量浓度为1 mg·mL−1,设置激发波长为280 nm,扫描范围300~450 nm。每个样品重复3次。

    采用Excel 2021软件处理数据和绘图。使用SPSS 26.0软件对数据进行单因素方差分析,通过Duncan's法进行多重比较,当P<0.05 时为差异显著。结果以“平均值±标准差 ($\overline { X}\pm { \rm {SD}} $)”表示。

    浊度是评价蛋白质聚集状态的指标。在探究鱼糜凝胶特性及凝胶形成机理中,浊度增加有利于形成蛋白聚集体,增加凝胶强度[20]。经28 d不同冷冻方式的肌原纤维蛋白的浊度如图1所示。与空白组相比,褐藻寡糖组经褐藻寡糖修饰冷冻后,肌原纤维蛋白的浊度稍有上升,但并不显著 (P>0.05)。与褐藻寡糖组相比,褐藻寡糖+低磁场组的浊度降低,但不显著 (P>0.05)。说明此方法可抑制肌原纤维蛋白聚集,但其效果并不显著。−30 ℃下冷冻的常规冷冻组,其浊度显著高于−20 ℃下冷冻的褐藻寡糖组 (P<0.05)。从整体上看,−20 ℃下3种冷冻方式之间浊度无显著性差异。

    图  1  不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的浊度、溶解度和表面疏水性
    注:相同颜色方柱上不同字母表示组间存在显著差异(P<0.05);图2同此。
    Figure  1.  Turbidity, solubility and surface hydrophobicity of myofibrillar protein with different freezing methods
    Note: Different letters on the same color bars indicate significant differences among the groups (P<0.05). The same case in Fig. 2.

    蛋白质溶解度与多个理化性质相关,如起泡、乳化和凝胶等。溶解度的增加,可以增强肌原纤维蛋白凝胶强度[21]。不同冷冻方式对肌原纤维蛋白溶解度的影响见图1,4个组的肌原纤维蛋白溶解度分别为89.85%、91.78%、91.23%和94.11%。空白组的溶解度最低,与褐藻寡糖组相比,溶解度下降了1.38%,差异显著 (P<0.05)。褐藻寡糖+低磁场组的溶解度略高于褐藻寡糖组,但无显著性差异 (P>0.05)。在不同低温下冷冻,−30 ℃下的常规冷冻组与−20 ℃的褐藻寡糖组相比,溶解度高出了2.88%,差异显著 (P<0.05)。总体上,−20 ℃条件下,经0.6% (w) 的褐藻寡糖修饰冷冻后,会提高肌原纤维蛋白的溶解度;在此条件下,增加低磁场后,二者协同也明显提高了肌原纤维蛋白的溶解度。而在−30 ℃条件下,鲢肌原纤维蛋白的溶解度更高,更能保持其理化性质。

    表面疏水性可以反映蛋白质的变性程度,也是凝胶网络形成的主要结合力,表面疏水性的降低,不利于肌原纤维蛋白凝胶的形成[22]。不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的表面疏水性见图1。褐藻寡糖组的表面疏水性显著低于空白组 (P<0.05)。褐藻寡糖+低磁场组的表面疏水性比褐藻寡糖组低127.34,差异显著 (P<0.05)。与褐藻寡糖组相比,常规冷冻组的表面疏水性显著降低 (P<0.05),说明在褐藻寡糖的修饰冷冻下,可降低肌原纤维蛋白疏水基团的暴露,抑制蛋白变性,降低温度会增加抑制作用。褐藻寡糖+低磁场组的肌原纤维蛋白表面疏水性相对最低,表明双重作用下,可更好地抑制肌原纤维蛋白变性。

    巯基对于维护肌原纤维蛋白空间结构的稳定性有重大意义,其中活性巯基易被氧化生成二硫键,而二硫键的形成是导致肌原纤维蛋白发生变化的主要原因。有研究显示,总巯基含量降低会导致肌原纤维蛋白凝胶的持水力下降[23]。不同冷冻方式下鲢肌原纤维蛋白巯基和二硫键的质量摩尔浓度如图2所示。褐藻寡糖组总巯基的浓度显著低于空白组 (P<0.05),但活性巯基和二硫键的浓度变化较小。褐藻寡糖+低磁场双重作用下,肌原纤维蛋白的总巯基和活性巯基的浓度显著高于褐藻寡糖组 (P<0.05)。另外,与褐藻寡糖组相比,常规冷冻组的总巯基和活性巯基的浓度上升,二硫键浓度显著下降 (P<0.05)。总体上,常规冷冻组在防止肌原纤维蛋白的变性上有更好的成效,而褐藻寡糖协同低磁场冷冻对维持鲢肌原纤维蛋白的巯基含量效果显著,有利于保护肌原纤维蛋白空间结构的稳定性。

    图  2  不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的巯基质量摩尔浓度
    Figure  2.  Sulfhydryl molality of myofibrillar protein with different freezing methods

    热稳定性也可以用于评价蛋白质的变性程度。有研究报道,热稳定性的升高,可以增加肌原纤维蛋白凝胶的持水量[24]。不同冷冻方式处理对肌原纤维蛋白热稳定性温度 (ΔT) 和变性焓值 (ΔH) 的影响见表1。褐藻寡糖组与空白组之间无显著性差异 (P>0.05)。而褐藻寡糖+低磁场组的肌原纤维蛋白ΔT比褐藻寡糖组高出14 ℃左右 (P<0.05)。常规冷冻组的ΔT与褐藻寡糖组无显著性差异 (P>0.05)。说明在褐藻寡糖修饰冷冻下,对肌原纤维蛋白的热稳定性温度无显著性影响,但加入低磁场后,肌原纤维蛋白的热稳定性温度出现明显提升,说明二者协同能显著提高肌原纤维蛋白的热稳定性温度,减少肌原纤维蛋白变性。此外,空白组的ΔH比褐藻寡糖组有小幅度升高,但无显著性变化 (P>0.05),表明褐藻寡糖修饰冷冻对变性焓值影响不大。不同冷冻条件下褐藻寡糖组、褐藻寡糖+低磁场组和常规冷冻组之间的ΔH无显著变化 (P>0.05),表明在这3种冷冻条件下,鲢肌原纤维蛋白变性时需要的焓值基本相似。

    表  1  不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的热变性温度与焓值
    Table  1.  Thermal denaturation temperature and enthalpy of  myofibrillar protein with different freezing methods
    组别
    Group
    ΔT/ΔH/(J·kg−1)
    空白组 Blank group 55.24±0.97b 6.5±2.8a
    褐藻寡糖 AO 52.42±3.64bc 3.7±2.7ab
    褐藻寡糖+低磁场 AO+LFM 69.24±2.46a 2.3±1.2b
    常规冷冻 CF 49.84±2.29c 1.6±0. 2b
    注:不同字母表示不同处理间差异显著 (P<0.05);后表同此。 Note: Different letters indicate significant differences (P<0.05). The same case in the following table.
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    傅里叶变换红外光谱能够利用分子中有振动模式的化学键来研究分子的结构,在测定蛋白质二级结构中发挥重要作用。在鱼糜凝胶特性的研究中,α-螺旋含量降低和β-折叠含量增加均有利于蛋白质变性和凝胶形成[25]图3显示肌原纤维蛋白在红外图谱上有多个吸收波段,蛋白质二级结构包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲,蛋白质二级结构的特征峰 (酰胺I带) 分别位于1 650~1 658 cm−1、1 665~1 680 cm−1和1 660~1 665 cm−1附近[26]表2为不同冷冻方式下蛋白质二级结构含量。有研究报道,蛋白质的结构特征与β-折叠、β-转角和无规卷曲的比例呈正相关,但与α-螺旋部分呈负相关[27]。褐藻寡糖组对比空白组,α-螺旋含量略有增加 (P>0.05);褐藻寡糖+低磁场组相比于褐藻寡糖组,α-螺旋含量显著下降 (P<0.05),β-转角含量略有上升 (P>0.05)。与褐藻寡糖组相比,常规冷冻组的α-螺旋含量降低 (P>0.05)。总的来说,采用褐藻寡糖修饰冷冻能减少鲢肌原纤维蛋白α-螺旋的损失,有助于抑制水溶性蛋白质和疏水残留物的暴露。

    图  3  不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的红外光谱图
    Figure  3.  Fourier transform infrared spectra of myofibrillar protein with different freezing methods
    表  2  不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的二级结构变化
    Table  2.  Change in secondary structure of myofibrillar protein with different freezing methods %
    组别
    Group
    α-螺旋
    α-helix
    β-折叠
    β-sheet
    β-转角
    β-turn
    无规卷曲
    Random coil
    空白组 Blank group 21.78±0.03ab 23.54±0.08a 35.14±0.05a 19.54±0.00a
    褐藻寡糖 AO 31.65±0.06a 28.12±0.14a 30.88±0.08a 9.35±0.16a
    褐藻寡糖+低磁场 AO+LFM 13.90±0.12b 29.63±0.05a 34.04±0.03a 22.43±0.07a
    常规冷冻 CF 23.85±0.02ab 31.37±0.08a 33.05±0.01a 11.73±0.10a
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    蛋白质中色氨酸等芳香族氨基酸残基是天然发色团,可以产生荧光。色氨酸残基的暴露情况可以反映蛋白质的三级结构变化。因此通常用其内源性荧光光谱检测蛋白质的展开和微环境极性的变化。从图4-a可以看出,肌原纤维蛋白的荧光峰约在297 nm波长处。由图4-b可知,褐藻寡糖组的最大荧光强度值高于空白组,但无统计学意义 (P>0.05)。褐藻寡糖+低磁场组的最大荧光强度值低于褐藻寡糖组,也无统计学意义 (P>0.05)。常规冷冻组的最大荧光强度值显著高于其他组 (P<0.05)。总体来说,褐藻寡糖协同低磁场冷冻处理对减少蛋白质中色氨酸残基的暴露和蛋白质展开变性具有良好的效果。

    图  4  不同冷冻方式下肌原纤维蛋白内源性荧光光谱 (a) 和最大荧光强度 (b)
    注:方柱上不同字母表示组间存在显著性差异 (P<0.05)。
    Figure  4.  Endogenous fluorescence spectra (a) and maximum fluorescence intensity (b) of myofibrillar protein with different freezing methods
    Note: Different letters on the bars indicate significant differences among the groups (P<0.05).

    冷冻是常用食品保存方法之一,冷冻过程中形成的冰晶大小、形态及冷冻加工参数和原料条件等均会对产品的最终品质产生一定影响[28],如蛋白质变性、汁液流失等,而蛋白质变性程度是维持食品品质的重要参数。目前保护蛋白质免受外力损伤并延缓其变性的方法主要有2种:添加抗冻剂 (糖类化合物和抗冻蛋白等) 和采用冷冻技术。笔者团队前期的研究发现,低磁场冷冻技术对鲢肌原纤维蛋白具有良好的保护作用[29];也有研究表明褐藻寡糖可以防止肌原纤维蛋白的结构免受冰晶破坏,维持良好的蛋白质结构稳定性[30]

    冷冻温度是影响冻结和冰晶形成的重要因素之一,而冷冻贮存期间的温度波动往往会加速产品中的冰再结晶,导致较大的冰晶形成,加大了产品的机械损伤[31]。在−20和−30 ℃低温冷冻的情况下,产生的冰晶大小、形态不同,常规冷冻组 (−30 ℃) 下产生的冰晶破坏蛋白质结构的能力更强[32],加速了蛋白质的聚集变性;此外,冰晶间的挤压和分子间相互作用,使肌原纤维蛋白构象发生变化[33],导致其二硫键发生弱化和断裂[34];在肌原纤维蛋白三级结构方面,降低温度后,冰晶导致肌原纤维蛋白结构的解折叠,在冷冻贮藏过程中减少了网状蛋白质的聚集,增加了色氨酸的暴露[35]。本研究中传统常规冷冻 (−30 ℃) 下,加速了蛋白质的聚集,使得肌原纤维蛋白的二级结构变得松散、不稳定,这与浊度和二级结构的含量变化结果一致。

    糖类抗冻剂可以促进自由水向结合水转化,有效抑制冰晶生成,也可以取代蛋白质分子表面的结合水与之结合,从而抑致蛋白质变性。研究发现,褐藻寡糖可以通过氢键、疏水相互作用或静电相互作用嵌入冰层,抑制冰晶的生长[36],防止肌原纤维蛋白的结构受到冰晶的破坏;褐藻寡糖也可通过作用力与冰晶结合,从空间上影响蛋白质的分布[30]

    本研究中添加褐藻寡糖后,其肌原纤维蛋白的溶解度显著升高 (P<0.05),褐藻寡糖组活性巯基和二硫键的含量无显著变化。薛勇等[37]用10% (w) 的海藻糖溶液处理鳙 (Aristichthys nobilis) 肌原纤维蛋白后,活性巯基和二硫键的含量均明显降低,推测其与褐藻寡糖的浓度相关,但具体原因还需验证。褐藻寡糖与肌原纤维蛋白间的静电作用[38]可导致其α-螺旋含量升高;Zhong等[39]用0.2~1.6 mg·mL−1苹果多酚对羔羊 (Agnus) 肌原纤维蛋白处理后,所得结果与本研究相似。在肌原纤维蛋白三级结构方面,褐藻寡糖与肌原纤维蛋白聚合反应后,蛋白质天然排列改变,会暴露出色氨酸残基[40],提升其荧光强度。本研究使用0.6% (w)的褐藻寡糖维持了肌原纤维蛋白二级结构的稳定,在溶解度、表面疏水性等方面有较好表现,使用褐藻寡糖作为抗冻剂,在成本上具有优势。

    磁场可能通过干扰氢键减小冰晶成核的临界半径和临界功,提高均相成核率[41],从而抑制冰晶的生长;也可能使得水分子重新排列,在冷冻过程中形成细小、均匀、光滑的冰晶,保护细胞免受破坏[2]。研究表明,低磁场冷冻产生的自由基可诱导蛋白质构象变化,影响蛋白质结构和功能特性[42]。本研究中,在褐藻寡糖的存在下,使用低磁场冷冻技术使得肌原纤维蛋白表面疏水性显著降低,总巯基含量和热变性温度显著升高,这与低磁场通过折叠、再交联和聚集来修饰蛋白质结构[43]和肌原纤维蛋白的总巯基和游离氨基以及β-转角和β-折叠结构的总含量增加相关[44],有效维持了肌原纤维蛋白的三级结构构象。然而0.6% (w) 的褐藻寡糖协同低磁场冷冻处理导致肌原纤维蛋白二级结构变的不稳定、松散,其作用机制还需进一步探讨。

    本研究结果表明,与空白组相比,褐藻寡糖组、褐藻寡糖+低磁场组和常规冷冻组均维持了肌原纤维蛋白良好的溶解性并抑制了疏水基团的暴露;0.6% (w)褐藻寡糖组的α-螺旋与β-折叠的总含量为59.77%,说明其对肌原纤维蛋白的二级结构有一定的保护作用;褐藻寡糖+低磁场组的最大荧光强度降低了3.6%,显著抑制了肌原纤维蛋白中色氨酸残基的暴露,总巯基的浓度最大 (1.5 mmol·kg−1),维持了肌原纤维蛋白良好的三级结构构象;常规冷冻组的热变性温度显著降低 (P<0.05),最大荧光强度为235.33,显著升高 (P<0.05),表明常规冷冻处理可使肌原纤维蛋白三级结构构象改变。总的来说,0.6% (w) 褐藻寡糖协同低磁场冷冻对肌原纤维蛋白三级结构的保护具有积极作用,在维持二级结构稳定性方面有优势,也说明在褐藻寡糖的存在下,低磁场冷冻比常规冷冻更适合肌原纤维蛋白冷冻,可以降低能源损耗。探索低磁场冷冻工艺中,针对不同的原料,褐藻寡糖的最适添加量以及合适的磁场强度将成为下一步的研究方向,褐藻寡糖协同低磁场冷冻对肌原纤维蛋白中抑制冰晶生长的机理,还需进一步深入探索;同时冷冻方案对冷冻鱼糜、冷冻鱼肉的研究,将进一步验证褐藻寡糖协同低磁场冷冻方案的优势,有助于解决制约冷冻加工业发展的能耗大、产品品质下降的瓶颈问题。

  • 图  1   水体中地西泮质量浓度变化特点

    注:不同字母表示差异显著,后图同此。

    Figure  1.   Variation characteristics of diazepam mass concentration in water

    Note: Different letters represent significant differences. The same case in the following figures.

    图  2   底泥中地西泮质量分数变化特点

    Figure  2.   Variation characteristics of diazepam mass fraction in sediment

    图  3   蜈蚣草中地西泮质量分数变化特点

    Figure  3.   Variation characteristics of diazepam mass fraction in P. vittata

    表  1   流动相梯度洗脱程序

    Table  1   Mobile phase gradient elution procedure

    时间 t/minA/%B/%
    095.005.00
    1.0095.005.00
    2.505.0095.00
    3.905.0095.00
    3.9195.005.00
    5.0095.005.00
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    表  2   地西泮及内标物的质谱参数

    Table  2   Mass spectrum parameters of diazepam and internal standard

    化合物
    Compound
    定性离子对
    Qualitative
    ion pair/
    (m·z−1)
    定量离子对
    Quantitative
    ion pair/
    (m·z−1)
    碰撞能量
    Collision
    energy/
    (eV)
    地西泮
    Diazepam
    285.2>193.1 285.2>193.1 35
    285.2>154.1 37
    地西泮-D5
    Diazepam-D5
    290.2>154.1 290.2>154.1 37
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    表  3   不同基质中地西泮加标回收率和相对标准偏差

    Table  3   Adding standard recovery and relative standard deviation of diazepam in different substrates

    基质
    Substrate
    加标水平
    Spiked level
    实测结果
    Measurement result
    回收率
    Recovery rate/%
    相对标准偏差
    RSDs/%
    水体 Water 0.100 μg·L−1 0.092 μg·L−1 92.0 3.831
    0.600 μg·L−1 0.527 μg·L−1 87.8 3.542
    1.000 μg·L−1 0.954 μg·L−1 95.4 1.555
    底泥 Sediment 0.500 μg·kg−1 0.484 μg·kg−1 96.8 1.614
    2.000 μg·kg−1 1.909 μg·kg−1 95.5 1.059
    4.000 μg·kg−1 4.335 μg·kg−1 108.4 2.967
    蜈蚣草 P. vittata 0.100 μg·kg−1 0.092 μg·kg−1 92.0 3.262
    0.500 μg·kg−1 0.431 μg·kg−1 86.2 4.028
    0.900 μg·kg−1 0.894 μg·kg−1 99.3 1.468
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    表  4   水体中地西泮降解动力学拟和参数

    Table  4   Fitting parameters of degradation kinetics of diazepam in water

    理论浓度
    Theoretical concentration/
    (μg·L−1)
    模拟养殖环境
    Simulated culture
    environment
    方程式
    Equation
    R2C0/
    (μg·L−1)
    kT1/2/d反应级数
    Order of reaction
    0.1 μg·L−1 底泥
    Sediment
    y=0.001 0x+0.014 7 0.918 8 0.118 零级
    y=−0.011 3x−0.127 8 0.926 3 一级
    y=0.129 0x+1.085 8 0.932 0 0.129 0 65.69 二级
    底泥-蜈蚣草
    Sediment-P. vittata
    y=0.009 0x+0.020 9 0.950 4 0.117 零级
    y=−0.010 8x−0.191 5 0.959 3 一级
    y=0.130 9x+1.729 9 0.965 5 0.130 9 65.29 二级
    1.0 μg·L−1 底泥
    Sediment
    y=0.004 7x+0.213 7 0.835 3 1.141 零级
    y=−0.0054x−0.2069 0.842 9 一级
    y=0.006 3x+0.200 8 0.850 3 0.006 3 139.11 二级
    底泥-蜈蚣草
    Sediment-P. vittata
    y=0.006 9x+0.231 9 0.922 5 1.142 零级
    y=−0.008 5x−0.224 2 0.933 7 一级
    y=0.010 5x+0.216 2 0.942 2 0.010 5 83.40 二级
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    表  5   底泥对不同浓度地西泮的富集系数

    Table  5   Bioconcentration factors of diazepan at different concentrations in sediment

    组别
    Group
    给药时间 Time of administration/h
    024487296216264360600768
    A组 Group A 0.65 4.46 4.73 4.93 5.38 5.87 6.92 13.26 14.54 18.80
    B组 Group B 0.53 2.95 4.85 4.99 5.15 5.34 5.95 8.66 9.28 13.19
    C组 Group C 1.44 5.93 6.02 6.17 6.32 6.46 7.25 7.56 9.56 9.79
    D组 Group D 1.28 5.95 6.22 6.30 6.48 6.81 7.28 7.99 8.12 11.05
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    表  6   蜈蚣草对不同浓度地西泮的富集系数

    Table  6   Bioconcentration factors of diazepan at different concentrations in P. vittata

    组别
    Group
    给药时间 Time of administration/h
    024487296216264360600768
    B组 Group B 0.79 3.07 3.23 3.41 3.57 3.78 2.67 2.86 1.67 1.54
    D组 Group D 0.21 0.55 0.60 0.63 0.70 0.81 0.83 0.87 0.63 0.63
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图(3)  /  表(6)
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-06-30
  • 修回日期:  2023-10-08
  • 录用日期:  2023-11-02
  • 网络出版日期:  2023-11-15
  • 刊出日期:  2024-04-04

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