Analysis of microbiammunl coity structure and potential pathogens in mucus, intestinal content of Acipenser dabryanus and culture water
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摘要:
长江鲟 (Acipenser dabryanus) 为中国特有鱼类，已被国际自然保护联盟 (IUCN) 列为极危级 (CR) 物种。通过Illumina高通量测序技术，探究了长江鲟幼鱼黏液、肠道内容物及其养殖水体的微生物菌群组成、多样性及动态变化，以期为长江鲟幼鱼健康养殖和病害分析提供参考依据。结果显示：养殖水体微生物多样性最高，黏液次之，肠道内容物最低。黏液和肠道内容物微生物菌群结构更为相似，且可与养殖水体微生物菌群区分开来。在门水平，黏液和肠道内容物均以放线菌门、变形菌门和厚壁菌门为主；养殖水体则以变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门为主。研究还发现7种可能的病原菌在养殖水体和黏液中富集，当鱼体处于应激状态或养殖环境恶化时，可能导致病害发生。BugBase表型预测分析发现，长江鲟幼鱼黏液、肠道内容物及其养殖水体中存在革兰氏阴性菌和阳性菌。其中肠道内容物的优势菌群为革兰氏阳性菌，占比超过60%；黏液和养殖水体的优势菌群均为革兰氏阴性菌，占比分别为60%和70%。在氧气需求方面，黏液和肠道内容物以好氧菌为主，养殖水体以好氧菌和兼性厌氧菌为主。
Abstract:Yangtze sturgeon (Acipenser dabryanus) is an endemic fish in China and has been listed as a critically endangered (CR) species by the International Union for Conservation of Nature (IUCN). In order to provide a reference basis for healthy breeding and disease analysis of juvenile Yangtze sturgeon, we analyzed the composition, diversity and dynamic changes of microbial flora between its surface mucus, intestinal content and culture water by using Illumina high-throughput sequencing technology. The results show the diversity of microorganisms in culture water was higher than that in mucus and intestinal content. The microbial community structure of mucus and intestinal content were more similar, and could be clearly distinguished from the microbial community of culture water. On phylum level, mucus and intestinal content were mainly composed of Actinobacteria, Proteobacteria and Firmicutes, while the culture water was mainly composed of Proteobacteria, Bacteroidetes and Firmicutes. Seven potential pathogenic genera were found, mainly in culture water and mucus which might lead to the occurrence of diseases under certain circumstances. BugBase phenotype prediction analysis reveals that both Gram negative and Gram positive bacteria were present in the mucus, intestinal content and culture water of juvenile Yangtze sturgeon. The dominant microbiota of intestinal content was Gram positive bacteria, accounting for over 60%. The dominant microbial communities in mucus and culture water were both Gram negative bacteria, accounting for 60% and 70%, respectively. In terms of oxygen demand, mucus and intestinal content were mainly composed of aerobic bacteria, while culture water was mainly composed of aerobic and facultative anaerobic bacteria.
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罗非鱼原产于非洲，现已被联合国粮农组织(FAO)列为人类六大主食品之一[1]，罗非鱼产业是当今世界渔业的重要组成部分。罗非鱼因具有生长快、产量高、食性杂、适应性与抗病力强，可在淡水与咸水中养殖等优点，而且其肉厚色白、质嫩刺少、富有弹性、细腻味美，含多种不饱和脂肪酸及丰富的蛋白质、维生素、微量元素等营养成分，成为深受生产者和消费者喜爱的鱼类品种之一。近年来，中国大力推广养殖罗非鱼，随着高密度精养模式的发展，在养殖中大量使用高脂、高糖饲料，采取饱食性投喂，导致罗非鱼脂肪肝病频繁发生。
鱼类脂肪肝病是长期以来困扰水产养殖者的难题之一。近年来国内外学者围绕脂肪肝病对鱼类生长的影响、脂肪肝组织学及脂肪肝病防治等开展了大量研究，研究对象包括舌齿鲈Moronidae Dicentrarchus、大西洋鳕Gadus morhua、草鱼Ctenopharyngodon idellus、团头鲂Megalobrama amblycephala、红姑鱼Sciaenops ocellatus、石斑鱼Epinephelus akaara等众多种类[2-7]，目前对于罗非鱼脂肪肝病仅见黄凯等[8]和庞思成[9]初步研究报道。文章通过配制不同脂肪含量的饲料，研究养殖中奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O.aureus)的生长指标与肝脏形态学、组织学等变化，旨在阐明脂肪水平对罗非鱼幼鱼脂肪肝病发生的影响，为罗非鱼高效健康养殖及养殖鱼类脂肪肝病的防治提供理论依据和技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 试验鱼和养殖方法
试验用奥尼罗非鱼幼鱼体长2.08±0.18 cm，体重0.26±0.02 g。随机取600尾试验鱼，分为5组，每组设3个平行，每个水泥池养殖40尾鱼，15个室外长方形水泥池(0.75 m×0.5 m×1.2 m)均循环流水过滤，试验期间自然光照。水温26.5±2.0℃，DO 7.03±0.23 mg · L-1，pH 6.9±0.1，NH3-N含量0.03±0.01 mg · L-1。
养殖试验为期70 d，在前30 d投饲每天为鱼体重5%左右，每天上午8时至下午8时每隔3 h投喂1次，共投喂5次；30 d后每天投饲量为鱼体重3%左右，每天投喂3次，分别为上午9时、中午1时和下午6时。并在投喂30 min后迅速吸取残饵并晒干称重。
1.2 饲料配制
试验饲料原料包括酪蛋白、明胶、纤维素、糊精、鱼油、豆油、复合维生素、复合矿盐、氯化胆碱和氯化钠等。为了排除饲料蛋白和能量等因素的影响，各组饲料添加等氮和等能量的酪蛋白和糊精，采用鱼油和豆油1 : 1混合后作为添加的脂肪源。试验共设5个脂肪梯度组，1~5组添加的脂肪量分别为0%、2%、4%、6%和8%，饲料蛋白源为酪蛋白，用糊精调节脂肪梯度，饲料日粮配方组成见表 1。将原料用小型颗粒机制粒，在60℃恒温箱中经5 h烘干，制成粒径2 mm的颗粒状饲料，密封冷藏备用。
表 1 奥尼罗非鱼幼鱼基础日粮的组成Table 1 Composition of the experimental diets for juvenile tilapia% 配方
formulation试验组treatments 1 2 3 4 5 鱼油与豆油fish oil and soybean oil 0 2.00 4.00 6.00 8.00 糊精dextrine 51.57 49.57 47.57 45.57 43.57 酪蛋白casein 35.00 35.00 35.00 35.00 35.00 明胶glutin 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 纤维素cellulose 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 复合维生素avitamins permix 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 复合矿盐bmineral permix 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 氯化胆碱choline chloride 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 氯化钠sodium chloride 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 粘合剂adhesive 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 抗氧化剂antioxidant 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 诱食剂phagostimulant 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 防腐剂antiseptic 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 注：a. 每千克复合维生素含VD 480 000 IU，VE 20.00 g，VK 0.20 g，VC 14.00 g，VB1 0.10 g，VB2 1.40 g，VB6 1.20 g，VB12 0.20 g，泛酸钙6.521 g，烟酸5.60 g，生物素0.20 g，肌醇88.00 g；b. 每千克复合矿盐含FeSO4 · 7H2O(19.74%Fe)152.00 g，CuSO4 · 5H20(25.22%Cu)2.40 g，ZnSO4 · 7H2O(19.25%Zn)31.20 g，MnSO4 · H2O(31.89%Mn)8.20 g，Na2SeO3 · 5H2O(28.54%)0.18 g，KI(75.73%)0.16 g，CaCO3 805.86 g
Note：a. Vitamins premix per kilogram including VD 480 000 IU, VE 20.00 g, VK 0.20 g, VC 14.00 g, VB1 0.10 g, VB2 1.40 g, VB6 1.20 g, VB12 0.20 g, pantothenic acid calcium 6.521 g, nicotinic acid 5.60 g, biotin 0.20 g, inositol 88.00 g；b. mineral premix per kilogram including FeSO4 · 7H2O (19.74%Fe) 152.00 g, CuSO4 · 5H20 (25.22%Cu) 2.40 g, ZnSO4 · 7H2O (19.25%Zn) 31.20 g, MnSO4 · H2O (31.89%Mn) 8.20 g, Na2SeO3 · 5H2O (28.54%) 0.18 g, KI (75.73%) 0.16 g, CaCO3 805.86 g1.3 样品采集与测定
养殖试验结束时，每池随机取罗非鱼10尾，首先用MS-222麻醉后逐尾测定体长体重，进行生长指标统计。随后逐尾解剖，观察记录内脏中各个器官组织(肝胰脏、胆囊等)变化特征，并拍照留存。最后剖离出肝脏，固定于10%福尔马林缓冲液中，按常规组织切片法进行脱水、石蜡包埋、切片和H-E(苏木精-伊红对染法)染色；切片厚度5~6 μm；切片在光学显微镜下观察记录微观形态结构特征，并拍照留存。
1.4 数据统计与分析
采用统计分析软件SPSS 13.0进行方差分析和Duncan氏多重比较，各组试验数据结果以平均数±标准差表示。试验的相关计算公式：
相对增重率(%) = (末重－初重) /初重×100；
肥满度=体重/全长3×100；
饲料系数=摄食饲料总量/ (末重－初重)。
2. 结果与分析
2.1 不同脂肪含量饲料对生长的影响
养殖期间奥尼罗非鱼幼鱼1~5组间的增重率均有显著性差异。1~3组试验鱼随着饲料脂肪水平升高，增重率先升高后降低，以3组为最高。肥满度变化规律与增重率相似，呈现先上升后下降的趋势，以3组最高，达(1.92±0.18)%；1、3、4和5组间肥满度均有显著性差异；而2组试验鱼则与1组、3组间有显著性差异，与4、5组间无显著性差异。饲料系数在1~5组间均有显著性差异，3组试验鱼饲料系数最低，为1.01±0.09，5组的最高，达1.36±0.23(表 2)。
表 2 饲料脂肪水平对奥尼罗非鱼幼鱼生长指标的影响Table 2 Effects of different diet lipid levels on growth of juvenile tilapia生长指标
growth index试验组treatments 1 2 3 4 5 增重率/% WGR 3 554±68a 4 369±111b 5 481±156c 4 269±203de 3 404±128e 肥满度/% CF 1.63±0.14a 1.78±0.21bc 1.92±0.18de 1.80±0.21b 1.74±0.24c 饲料系数FCR 1.12±0.13a 1.08±0.12b 1.01±0.09c 1.24±0.19de 1.36±0.23e 注：同行所标字母不同表示两者差异显著，而字母相同表示差异不显著
Note：The different letters on the parameters in one row stand for significant difference (P < 0..05), otherwise, the same ones stand for no significant difference.2.2 饲料脂肪水平对肝脏脂肪含量的影响
由表 3可知，随着脂肪添加量的增加，1~5组奥尼罗非鱼幼鱼肝脏重量、肝体比、肝脏脂肪含量和肌肉脂肪含量等4个指标均呈现逐渐升高的趋势，饲料脂肪水平对这4个指标都有明显影响，呈正相关关系。5组的肝脏脂肪含量为(43.44±3.87)%，分别比1、2、3和4组高34.53%、24.72%、19.11%和10.59%。随着脂肪添加量的增加，1~5组奥尼罗非鱼幼鱼的肝脏重量、肝体比和肝脏脂肪含量等指标在各个组间都具显著性差异。
表 3 饲料脂肪水平对奥尼罗非鱼幼鱼肝脏脂肪含量的影响Table 3 Effects of different diet lipid levels on liver fat content of juvenile tilapia指标
index试验组treatments 1 2 3 4 5 肝脏重/g liver weight 0.29±0.08e 0.38±0.11d 0.49±0.18c 0.58±0.12b 0.67±0.21a 肝体比/% HSI 2.85±0.15e 3.22±0.19d 3.84±0.36c 4.65±0.54b 5.56±0.71a 肝脏脂肪含量(湿重)/%
liver fat content32.29±2.24e 34.83±3.53d 36.47±2.39c 39.28±3.34b 43.44±3.87a 注：同行所标字母不同表示两者差异显著，字母相同表示差异不显著Note：The different superscript letters on the parameters in one row stand for significant difference (P < 0..05), otherwise, the same ones stand for no significant difference. 2.3 不同脂肪含量饲料对脂肪肝形成的影响
投喂不同脂肪含量的饲料，经70 d养殖试验后，各个试验组罗非鱼的肝脏和胆囊颜色及体积的异常变化见表 4。结果表明，低脂肪水平的1~3组与高脂肪水平的4~5组的肝脏和胆囊差别较大。1~3组肝脏和胆囊的颜色与体积正常，肠系膜无白色脂肪沉积(图 1－a)。而4~5组病鱼的肝胰脏肿大，呈油腻状，颜色发黄，柔软粉糊，用刀切易碎，有的出现白色坏死病灶，部分胆囊肿大且颜色变深，肠系膜均有过量的白色脂肪沉积，严重时脂肪几乎覆盖整个肠器官，呈现典型的脂肪肝病变特征(图 1－b)。第4组脂肪肝出现率为44.44%，第5组脂肪肝出现率为66.67%。
表 4 不同饲料脂肪水平对奥尼罗非鱼幼鱼脂肪肝形成的影响Table 4 Effects of different diet lipid levels on fatty liver disease in juvenile tilapia% 组别
group肝脏liver 胆囊gallbladder 出现脂肪肝
appearance of fatty liver disease颜色异常colour abnormity 体积异常volume abnormality 颜色异常colour abnormality 体积异常volume abnormality 1 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 4 55.56 55.56 55.56 55.56 44.44 5 33.33 33.33 33.33 33.33 66.67 ![]()
图 1 正常与患病的罗非鱼比较a. 正常的奥尼罗非鱼幼鱼剖腹观察(取自第1组)；b. 患病的奥尼罗非鱼幼鱼剖腹观察(取自第5组)Fig. 1 The difference between normal and sick tilapiaa. The viscus dissection symptom of normal tilapia(group 1);b. The viscus dissection symptom of sick tilapia(group 5)2.4 脂肪肝的病变特征
对不同试验组的奥尼罗非鱼幼鱼肝脏进行组织学切片，并在光学显微镜下(16×100~16×200)观察拍照，肝细胞拍照结果见图 2－1~5。1~3组试验鱼肝细胞排列整齐，肝细胞索明显，肝细胞平均直径为8.9 μm，未发现脂肪肝病变特征。4~5组罗非鱼肝细胞平均直径为17.9 μm，最大达23.2 μm，呈现明显的脂肪肝病变特征，患病组肝细胞的直径超过正常组肝细胞约1倍(表 5)。1~5组试验鱼的肝细胞直径随着饲料脂肪水平升高而增大，其中低脂肪水平的1~3组与高脂肪水平的4~5组有显著差异，而1组、2组、3组间无显著差异，4和5组间亦无显著差异。
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图 2 各组肝脏组织学切片N. 细胞核；CM. 细胞膜；FD. 脂肪滴；1. 1组试验鱼肝脏切片图(H-E染色，×40)；2. 2组试验鱼肝脏切片图(H-E染色，×40)；3. 3组试验鱼肝脏切片图(H-E染色，×40)；4. 4组试验鱼肝脏切片图(H-E染色，×40)；5. 5组试验鱼肝脏切片图(H-E染色，×40)Fig. 2 Histology of different groupN. nucleus; CM. cell membrane; FD. fat dripping; 1. The liver section of tilapia (group 1); 2. The liver section of tilapia (group 2);3. The liver section of tilapia (group 3); 4. The liver section of tilapia (group 4);5. The liver section of tilapia (group 5).表 5 罗非鱼肝脏组织细胞病理变化特征Table 5 Pathological changes in hepatopancreas cells of juvenile tilapia fed diets with different lipid levels试验组group 1 2 3 4 5 肝细胞脂肪变性(空泡化)liver cell is change － － － ++ +++ 肝细胞坏死liver cell is dead － － － + +++ 肝细胞直径/μm liver cell diameter 7.8±2.5a 8.7±1.3a 10.4±0.5a 16.5±4.4b 19.3±3.9b 肝脏颜色live colour 正常 正常 正常 淡黄色 土黄色 注：－.未见病变；+.轻度病变；+ +.中度病变；+ + +.重度病变；同行所标字母不同表示两者差异显著，字母相同表示差异不显著
Note：－.no pathological change；+.slight pathological change；+ +.medium pathological change；+ + +.high pathological change. The different letters on the parameters in one row stand for significant difference (P < 0..05), otherwise, the same ones stand for no significant difference.第5组患病试验鱼肝细胞核偏位，肝细胞胞浆内有大小不一的脂肪滴，且脂肪滴浸润细胞胞浆将细胞核挤压至一侧，甚至肝细胞核心出现萎缩，整个肝细胞浆充满脂肪滴使肝细胞肿胀、胞浆外逸，呈现细胞透明空泡化，变性的肝细胞随后坏死，有的细胞核破裂或溶解，有的细胞核消失，但其结构轮廓仍在。变性的肝细胞互相离散，肝小叶结构被破坏，显得柔软粉糊，用刀切易碎。坏死的组织被溶解吸收，肝脏表面出现大小不一的白色坏死病灶。
3. 讨论
3.1 饲料脂肪含量与生长的关系
脂肪作为鱼类能量的主要来源之一，当饲料脂肪不足时，蛋白质将被作为能源消耗；因此，在饲料中适当提高脂肪含量，有助于提高饲料蛋白质的利用效率，促进鱼类生长。然而饲料脂肪水平过高，对鱼的生长和品质有不利影响，比如鱼类易患脂肪肝、代谢性疾病和肉味差等[10]。奥尼罗非鱼幼鱼生长指标表明，4%脂肪含量时试验鱼的生长最好，而在6%~8%脂肪含量时，罗非鱼幼鱼生长指标显著下降，甚至出现明显的脂肪肝病症状，初步表明奥尼罗非鱼幼鱼饲料中脂肪的适宜添加量为4%。
不同鱼类对饲料脂肪需要量不同，团头鲂幼鱼饲料中脂肪适宜含量为2%~5%，在3.6%左右团头鲂增重率最大，饲料系数最低和蛋白质效率最高[5]；俄罗斯鲟Acipenser gueldenstaeti稚鱼在饲料脂肪添加量为5%时增重率及饲料系数达到最佳[11]；鳜鱼Siniperca chuatsi在饲料脂肪水平7%~12%时特定生长率和蛋白质效率最高[10]，因此，此试验中奥尼罗非鱼幼鱼饲料脂肪添加量与杂食性鱼类团头鲂、俄罗斯鲟等相近，而比肉食性鳜鱼低，这表明饲料脂肪添加量与鱼类的食性密切相关。饲料脂肪添加量除与品种相关外，亦与饲料中脂肪酸组成、饲料配方、鱼类生长阶段、饲养条件等有关[12]。鱼类对饲料中脂肪的利用能力与高不饱和脂肪酸的差异密切有关[4, 6]，而且氧化油脂会导致罗非鱼的增重率和饲料转化率显著下降，肝体比增加[13]。
3.2 脂肪肝对内脏器官的影响
此试验中添加脂肪量6%~8%的4和5组罗非鱼均出现了典型的脂肪肝病，而添加脂肪量0~4%的1~3组未出现上述症状，表明饲料中脂肪添加过量易使罗非鱼幼鱼产生脂肪肝，这与冯健和贾刚[6]研究红姑鱼肝胰脏脂肪含量与日粮脂肪水平成正比，脂肪肝病的病变程度与日粮脂肪水平成正相关的结果一致。
罗非鱼患脂肪肝病后病变特征主要表现在肝脏、胆囊及肠系膜等部位。肝胰脏是鱼类的重要器官，是发生鱼类脂肪肝病的主要部位，患脂肪肝的罗非鱼肝脏肿大，油腻状，柔软粉糊，颜色发黄，有的出现白色坏死病灶，这与草鱼、红姑鱼、虹鳟Salrno irideus等患脂肪肝的症状相似[4, 6, 14]。鱼类患脂肪肝病后胆囊亦会发生一定的形态变化[14-15]，正常情况下，罗非鱼胆囊处于中等充满状态，颜色为绿色，此试验发现部分患病罗非鱼胆囊偏大且颜色变深为墨绿色。引起胆囊变化的原因可能是脂肪肝病的发生使病鱼食欲下降，肝脏中分泌至胆囊的胆汁无法排出从而使胆囊膨胀变大，胆汁大量淤积后使胆囊颜色变深，导致伴有胆汁淤积现象。罗非鱼脂肪消化吸收的主要部位在肠道前部，肠道内的脂肪酶大多数来自肝胰脏，饲料中的脂肪在脂肪酶的作用下分解为甘油和脂肪酸而被吸收，罗非鱼是无胃鱼类，由于摄入过量脂肪及脂肪肝影响脂肪酶的合成，因此，摄入的脂肪经过肠道被消化吸收时而发生沉积引起患脂肪肝病鱼的肠系膜有明显的脂肪积累。
3.3 脂肪肝对肝脏组织细胞结构的影响
脂肪肝可引起奥尼罗非鱼幼鱼肝细胞结构改变，呈现肝胰脏病理组织变化。患病试验鱼肝细胞排列不规则，肝细胞索较紊乱，肝细胞明显增大，肝细胞胞浆内出现明显的大小不一的脂肪滴，严重时整个肝细胞浆充满脂肪滴使细胞变性呈空泡化，部分肝细胞中细胞核偏位或消失，有的局部肝细胞坏死或浸润，这与红姑鱼、虹鳟等患脂肪肝后的症状相似[6, 14]。
LIN等[16]认为草鱼营养性脂肪肝发生可分为3个阶段：肝脂肪积存阶段、肝脂肪浸润阶段和肝细胞核心出现萎缩阶段。此试验中第4组病鱼肝细胞排列不规则，肝细胞索较紊乱，这是由于肝细胞中脂肪油滴蓄积细胞质，造成部分肝细胞增大，是脂肪肝病的第2个阶段；第5组部分病鱼肝细胞核偏位，肝细胞胞浆内有大小不一的脂肪滴，且脂肪滴浸润细胞胞浆将细胞核挤压至一侧，甚至肝细胞核心出现萎缩，这已发展为脂肪肝病的第3阶段。这与建鲤Cyprinuis carpio var.Jian摄食氧化脂肪造成的症状有相同之处，如肝脏表面形成腊样色素，肝细胞破裂，胞浆外逸，肝细胞肿大，细胞空泡变性，发生坏死等[17]。
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图 2 黏液、肠道内容物及其养殖水体 OTUs 分布 Venn 图
Figure 2. Venn diagram analysis of mucus, intestinal content and culture water
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图 3 黏液、肠道内容物及其养殖水体中微生物的 Alpha 多样性指数间差异检验
注：*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001。
Figure 3. Alpha diversity difference of microorganism in mucus, intestinal content and culture water
Note: *. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001.
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图 4 黏液、肠道内容物及养殖水体中微生物的 Beta 多样性
注：a. PCoA图 (属水平)；b. 样本层级聚类树 (属水平)。
Figure 4. Beta diversity of bacteria in mucus, intestinal content and culture water
Note: a. PCoA on genus level; b. Hierarchical clustering tree on genus level.
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图 5 黏液 (a)、肠道内容物 (b) 及养殖水体中 (c) 微生物在门水平的菌群结构组成
Figure 5. Dominant species of bacteria in mucus (a), intestinal content (b) and culture water (c) on phylum level
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图 6 黏液 (a)、肠道内容物 (b) 及养殖水体中 (c) 微生物在属水平的菌群结构组成
Figure 6. Dominant species of bacteria in mucus (a), intestinal content (b) and culture water (c) on genus level
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图 7 属水平下黏液、肠道内容物及其养殖水体中微生物组成热图
Figure 7. Heatmap of microbial communities in mucus, intestinal content and culture water on genus level
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