Parentage assignment of Monopterus albus using multiplex PCR of microsatallites
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摘要:
为助力黄鳝 (Monopterus albus) 良种选育中的亲子鉴定和系谱管理问题，利用黄鳝全基因组预测并筛选获得的16个多态性较高的微卫星标记，建立了2组微卫星多重PCR体系，并成功用于11个家系的亲子鉴定。通过Cervus 3.0软件对132尾黄鳝进行遗传多样性分析，结果显示，16个微卫星标记的平均等位基因数 (Na) 为5.562，平均观测杂合度 (Ho) 和平均期望杂合度 (He) 分别为0.627和0.619，平均多态信息含量 (PIC) 为0.564。亲子鉴定结果表明，双亲基因型未知时单亲本的累积排除概率 (CE-1P) 为0.999 999 99，单亲基因型已知时另一亲本的累积排除概率 (CE-2P) 为0.999 999 91，双亲基因型未知时双亲的累积排除概率 (CE-PP) 为0.999 964 76。黄鳝11个家系的模拟鉴定率为99.96%，实际鉴定率为95%。模拟分析不同亲本数的结果显示，实验的16个微卫星标记在双亲性别已知的200对亲本和双亲性别未知的150对亲本的情况下，均可达到95%以上的鉴定率。利用NTSYS软件对11个家系的110尾子代个体进行聚类分析，结果显示除2尾子代外其余108尾子代均可正确聚类，准确率为98.18%。实验构建的2组微卫星多重PCR亲子鉴定技术为黄鳝良种选育及种质资源管理提供了重要技术支持。
Abstract:In order to solve the problems in paternity test and genealogical management for improved variety breeding of Monopterus albus, we obtained 16 microsatellite markers with high polymorphism through whole genome searching of and following confirmation, and established two multiplex PCR sets by using 16 high polymorphic microsatellite markers and successfully applied to the parentage assignment for 11 full-sib M. albus families. The average allele number(Na) of 16 microsatellite was 5.562; the average of abserved heterozygosite(Ho) was 0.627; the average of expected heterozygosite(He) was 0.619; the average of polymorphic information content (PIC) was 0.564. Parentage analysis reveals that the combined exclusion probability of first parent given only the genotype of the offspring (CE-1P) was 0.999 999 99, the combined exclusion probability of a second candidate parent given the genotype of the offspring and one known parent (CE-2P) was 0.999 999 91, and combined exclusion probability of a parent pair given only the genotype of the offspring (CE-PP) was 0.999 964 76. The simulated identification rate of the 11 M. albus families was 99.96%, and the actual identification rate was 95%. Furthermore, the simulation analysis shows that the identification rate could reach over 95% in the case of 200 candidate parental individuals with known sexes and 150 candidate parental individuals with unknown sexes. The cluster analysis shows that 108 offspring could be clustered correctly except two, and the accuracy rate was 98.18%. The paternity method of M. albus established in this study provides important technical support for the future breeding program and management of germplasm resources of M. albus.
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Keywords:
- Monopterus albus /
- Microsatellite /
- Parentage assignment /
- Multiplex PCR
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广东内伶仃福田国家级红树林自然保护区是我国唯一地处城市腹地的国家级自然保护区，与拉姆萨尔国际重要湿地香港米埔自然保护区本为一体，共同组成了深圳湾红树林湿地生态系统，是研究人类活动对红树林生态系统影响的绝佳区域[1-2]。浮游植物作为初级生产者，为红树林丰富的生物多样性提供了饵料基础，同时由于其结构简单、繁殖周期短、生长速度快，且对环境变化的响应速度快，成为红树林水生态健康状况的重要指示类群[3-4]。对红树林浮游植物群落的调查是评估该区域水生态环境质量的重要途径。
目前虽已有一些对福田红树林保护区浮游植物群落特征的研究，但最新的研究距今已有8年。已有学者分别于1992—1993年、2004年、2001—2003年、2005—2006年和2015—2016年对福田红树林区基围鱼塘和观鸟屋、凤塘河口和沙咀码头等点位的浮游植物群落开展了调查研究，鉴定到51~135种浮游植物[5-11]。刘玉等[5]调查发现，1992—1993年间福田红树林保护区近海水质为劣IV类，以颤藻 (Oscillatoria spp.)、小环藻 (Cyclotella spp.) 和菱形藻 (Nitzschia spp.) 为主。2001—2006年间福田红树林近岸海水依旧为劣IV类，藻类总密度超106 个·L−1，达富营养化水平，以威氏海链藻 (Thalassiosira weissflogii)、诺氏海链藻 (T. nordenskiöldii)、微小小环藻 (C. caspia) 和尖尾蓝隐藻 (Chroomonas acuta) 等赤潮藻和耐污藻为优势种[6-7,9]。2015—2016年间福田红树林水域氮 (N)、磷 (P) 含量仍严重超标，但较往年有显著下降，浮游植物年平均密度仍超过106 个·L−1，优势种为微小小环藻、孟氏小环藻 (C. meneghiniana) 和威氏海链藻等[11]。综合来看，福田红树林水域水质有所改善，然而浮游植物仍以耐污种和赤潮种为主，水体仍为富营养化状态。
自2016年起，深圳市举全市之力开展了治水攻坚战，以流域为单元全面开展水污染治理和城市管网雨污分流，排入深圳湾的污染物 (如深圳河和茅洲河的污染物) 得到了有效控制，水质持续改善[12-13]。近年来，受新冠疫情的影响，深圳福田红树林保护区水环境和人类干扰程度产生了新的变化，保护区内浮游植物群落结构特征及变化趋势尚待进一步查明。因此，本研究对深圳市福田国家红树林保护区开展了浮游植物的调查监测，分析浮游植物群落结构及其影响因素，评估水生态系统富营养化状态。并通过与历史数据比较，对浮游植物群落结构开展年际动态变化分析，旨在明晰红树林生态系统中浮游植物群落和水生态系统健康的演变趋势，为福田红树林内的生物多样性保护提供理论支撑和科学依据。
1. 材料与方法
1.1 样品采集与分析
于2023年9月在深圳市福田国家红树林保护区内采集样品，共设13个样点 (图1)，分布在观鸟屋 (H1)、凤塘河口 (H2)、沙咀码头 (H3) 及1—10号咸水鱼塘 (X1—X10)。另外，考虑到潮汐对红树林区浮游植物群落结构的影响以及深圳湾不规则的半日潮特征[7]，按照高于2 m的涨潮期和低于1 m的退潮期，分别采集观鸟屋、凤塘河口、沙咀码头高潮位 (H1G、H2G、H3G) 和低潮位样品 (H1D、H2D、H3D)。
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图 1 福田红树林湿地调查采样站位分布注：H1. 观鸟屋；H2. 凤塘河口；H3. 沙咀码头；X1—X10. 1—10号咸水鱼塘。Fig. 1 Sampling stations of Futian mangrove wetlandNote: H1. Bird-watching pavilion; H2. Fengtang Estuary; H3. Shazui Wharf; X1–X10. Brackish water fish ponds No.1−10.1.1.1 水样采集及测定
使用YSI多参数水质分析仪 (YSI Professional Plus，美国) 现场测定水温 (WT)、溶解氧 (DO)、pH、盐度、电导率 (EC) 和氧化还原电位 (ORP)。使用5 L采水器采集水样，冷冻保存运回实验室。使用紫外分光光度计 (岛津UV-1800，日本) 和滴定法测定氨氮 (${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}}{\text{-}}{\mathrm{N}} $)、硝氮 (${\mathrm{NO}}_3^{\text{−}} {\text{-}}{\mathrm{N}} $)、亚硝氮 (${\mathrm{NO}}_2^{\text{−}} {\text{-}}{\mathrm{N}} $)、活性磷酸盐 (${\mathrm{PO}}_4^{3{\text{−}}} {\text{-}}{\mathrm{P}} $)、石油类 (OIL)、高锰酸盐指数 (CODMn) 和无机氮 (DIN) 等水质参数，测定方法参考 GB 17378—2007《海洋监测规范》。
1.1.2 浮游植物定量样品和定性样品的采集
使用5 L有机玻璃采水器，在涨潮及退潮时分别于观鸟屋、凤塘河口、沙咀码头距水体表层0.5 m处采集水样2 L；咸水塘1—10号分别取1 L距表层0.5 m水样作为定量样品。分别使用25号和13号浮游生物网在各调查样点拖网10次，采集浮游植物定性样品，浓缩装于50 mL样品瓶中。定量样品现场用1% (φ) 鲁哥试剂和4% (φ) 甲醛固定，定性样品用4% (φ) 甲醛固定。定量样品带回实验室后，静置48 h，使用虹吸法浓缩沉淀并定容至30~50 mL。样品充分振荡混匀后，吸取0.1 mL滴到浮游植物计数框上，随后用显微镜 (Olympus CX21，日本) 在400倍下进行鉴定与计数，浮游植物鉴定参考相关方法鉴定到种或属。浮游植物生物量通过体积法计算取几何近似值[14]。
1.2 数据统计与分析
运用Margalef物种丰富度指数 (d)、Shannon-Wiener物种多样性指数 (H')、Pielou均匀度指数 (J') 及Berger-Parker优势度 (D) 等参数分析浮游植物群落结构特征：
$$ d{\mathrm{=}}(S{\text{−}}1)/{\mathrm{log}}_{2}N $$ (1) $$ {H}{\text{'}}{\mathrm{=}}{\text{−}}\sum ({{n}}_{{i}}/N){\mathrm{log}}_{2}({{n}}_{{i}}/N) $$ (2) $$ J{\text{'}}{\mathrm{=}}H{\text{'}}/{\mathrm{log}}_{2}S $$ (3) $$ D {\mathrm{=}}{N}_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}/N $$ (4) 式中：S为浮游植物的物种数；N为所有物种的个体数；ni为第i种的个体总数；Nmax为个体数最多物种的个体数。
根据生物多样性指数H'的评价分级标准：0~1为重度干扰，1~2为中度干扰，2~3为轻度干扰，>3为未受干扰。
利用保护区管理局提供的2016—2020年浮游植物监测报告中未公开发表的数据，与本期监测数据相对比，分析近年来红树林保护区浮游植物群落结构的演变特征。
利用Microsoft Excel 2021、SPSS statistics 17.0和Origin 2018软件对浮游植物各类群密度数据进行处理和制图；利用主坐标分析 (Principal co-ordinates analysis, PCoA) 对浮游植物群落组成进行相似性分析；利用置换多因素方差分析 (Adonis test) 对不同类群浮游植物群落结构进行差异显著性检验；基于本次调查监测数据与环境因子数据，利用Pearson和热图分析福田红树林浮游植物群落与环境因子间的关系；利用R语言rfPermute、randomforest、vegan、ggplot2包分析环境因子对浮游植物群落密度、生物量和Shanon-Wiener多样性指数影响的重要性和显著性。
2. 结果
2.1 红树林湿地水环境特征
各采样点的水质调查结果见图2，福田红树林湿地DO质量浓度介于2.02~6.68 mg·L−1，平均为 (4.49±1.26) mg·L−1；氧化还原电位介于9.40~122.10 mV，平均为 (62.93±41.24) mV；电导率介于0.63~6.95 mS·cm−1，平均为 (4.03±2.14) mS·cm−1；pH介于6.79~8.24，平均为7.81±0.39；盐度介于2.80‰~27.80‰，平均为 (15.55±7.95)‰；CODMn介于1.29~4.80 mg·L−1，平均为 (3.24±1.12) mg·L−1；${\mathrm{NO}}_3^{\text{−}} {\text{-}}{\mathrm{N}} $介于0.056~0.790 mg·L−1，平均为 (0.24±0.18) mg·L−1；${\mathrm{NO}}_2^{\text{−}} {\text{-}}{\mathrm{N}} $介于0.005 0~0.190 0 mg·L−1，平均为 (0.020±0.045) mg·L−1；NH4 +-N介于0.007 0~0.096 0 mg·L−1，平均为 (0.027±0.022) mg·L−1；PO4 3−-P介于0.002 6~0.042 0 mg·L−1，平均为 (0.018±0.013) mg·L−1；DIN介于0.071~0.840 mg·L−1，平均为 (0.29±0.20) mg·L−1；石油类介于0.003 9~0.031 0 mg·L−1，平均为 (0.016 0±0.007 6) mg·L−1。综合单因子和富营养化评价，福田红树林水质属于III类水，处于中度富营养化状态。经t检验分析发现，红树林林区和咸水鱼塘水体pH、氧化还原电位、NH4 +-N和石油类浓度存在显著性差异：林区NH4 +-N和石油类显著高于咸水塘 (p<0.05)，咸水塘pH和氧化还原电位显著高于林区 (p<0.05)。
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图 2 福田红树林湿地水质注：不同字母表示差异显著 (p<0.05)。Fig. 2 Water quality in Futian mangrove wetlandNote: Different letters represent significant differences (p<0.05).2.2 福田红树林浮游植物的群落结构
2.2.1 种类组成及数量
福田红树林调查区域16个样点共检出浮游植物6门122种。其中硅藻门、绿藻门、蓝藻门、裸藻门、隐藻门和甲藻门分别检出49、41、16、9、4和3种，分别占总种类数的40.16%、33.61%、13.11%、7.38%、3.28%和2.46%。调查区域各样点间浮游植物物种数存在较大差异 (图3)，其中8号和10号塘的物种数最多 (34种)，7号塘最少 (10种)。
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图 3 福田红树林湿地浮游植物物种数注：H1G和H1D. 观鸟亭高和低潮位；H2G和H2D. 凤塘河口高和低潮位；H2G和H3D. 沙咀码头高和低潮位；X1—X10. 1—10号咸水鱼塘。Fig. 3 Species number of phytoplankton in Futian mangrove wetlandNote: H1G and H1D. The high and low tide levels at the bird-watching pavilion; H2G and H2D. The high and low tide levels at the Fengtang Estuary; H2G and H3D. The high and low tide levels at the Shazui Wharf; X1−X10. Brackish water fish ponds No.1−10.2.2.2 密度和生物量
浮游植物密度介于 (0.02~122.21)×106 个·L−1，平均为 (1.04±3.05)×107 个·L−1，10号塘密度最高，其次是8号和9号塘，7号塘最低 (图4)。咸水塘8—10号密度较高的主要原因是蓝藻密度在这几个样点占据绝对优势，密度占比达88.51%~99.23%。沙咀码头高潮位的蓝藻密度占总密度的74.36%。其他样点以硅藻门种类为主，尤其在观鸟屋、凤塘河口、沙咀码头低潮位和5号塘，密度占比达77.17%~99.56%。
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图 4 福田红树林湿地浮游植物密度和生物量注：H1G和H1D. 观鸟亭高和低潮位；H2G和H2D. 凤塘河口高和低潮位；H2G和H3D. 沙咀码头高和低潮位；X1—X10. 1—10号咸水鱼塘。Fig. 4 Density and biomass of phytoplankton in Futian mangroves wetlandNote: H1G and H1D. The high and low tide levels at the Bird-watching pavilion; H2G and H2D. The high and low tide levels at the Fengtang Estuary; H2G and H3D. The high and low tide levels at the Shazui Wharf; X1−X10. Brackish water fish ponds No.1−10.浮游植物生物量介于18.04~999.71 μg·L−1，平均为 (264.93±292.49) μg·L−1，9号塘生物量最高，其次是10号塘，7号塘最低 (图4)。除6号、8号和10号塘外，硅藻门在其余调查样点的生物量均占优势 (39.47%~99.21%)；9号和10号塘的甲藻门生物量较高，分别占总生物量的34.76%和46.10%；裸藻门在沙咀码头高潮位样点的生物量占比达57.21%；隐藻门在1号和6号塘的生物量占比分别达42.40%和65.10%。
2.2.3 优势种群及优势度
以优势度≥0.02为判断标准，调查区域浮游植物的优势种以硅藻门、蓝藻门和隐藻门的种类为主 (表1)，包括硅藻门的短柄曲壳藻 (Achnanthes adnate)、梅尼小环藻 (C. meneghiniana)、小环藻 (Cyclotella sp.)、颗粒直链藻极狭变种 (Melosira granulata var. angustissima)、钝脆杆藻 (Fragilaria capucina)、克尼角毛藻 (Chaetoceros knipowitschii)、高山冠盘藻 (Stephanodiscus alpinus)，蓝藻门的拉氏拟柱孢藻 (Raphidiopsis raciborskii)、浮鞘丝藻 (Planktolyngbya sp.)、湖生假鱼腥藻 (Pseudanabaena limnetica)、等丝浮丝藻 (Planktothrix tsothris)、极小假鱼腥藻 (Pseudanabaena minima)、铜绿席藻 (Phormidium aerugineocoeruleum)、泽丝藻 (Limnothrix sp.)、细小平裂藻(Merismopedia tenuissima)、隐球藻 (Aphanocapsa sp.)，隐藻门的尖尾蓝隐藻 (Chroomonas acuta) 和具尾蓝隐藻 (C. caudata)。其中，观鸟屋高、低潮位、凤塘河口低潮位和5号塘以短柄曲壳藻占优势 (0.70~0.97)，1号和6号塘以尖尾蓝隐藻占优势 (0.54和0.75)，8号和10号塘以细小平裂藻占优势 (0.52和0.79)。
表 1 福田红树林湿地浮游植物优势种群及优势度Table 1 Dominant species and dominance degree of phytoplankton in Futian mangrove wetland样点
Site物种名 (优势种前三位)
Species name (Top 3 of
dominant species)优势度
Berger-Parker
dominance
indexH1G 短柄曲壳藻 Achnanthes adnate 0.96 H1D 短柄曲壳藻 0.97 H2G 梅尼小环藻 Cyclotella meneghiniana 0.11 小环藻 Cyclotella sp. 0.12 拉氏拟柱孢藻 Raphidiopsis raciborskii 0.05 H2D 梅尼小环藻 0.06 短柄曲壳藻 0.70 尖尾蓝隐藻 Chroomonas acuta 0.02 H3G 浮鞘丝藻 Planktolyngbya sp. 0.23 湖生假鱼腥藻 Pseudanabaena limnetica 0.28 等丝浮丝藻 Planktothrix tsothris 0.23 H3D 颗粒直链藻极狭变种
Melosira granulata var. angustissima0.10 梅尼小环藻 0.10 极小假鱼腥藻 P. minima 0.04 X1 尖尾蓝隐藻 0.54 X2 尖尾蓝隐藻 0.29 铜绿席藻 Phormidium aerugineo-coeruleum 0.14 钝脆杆藻 Fragilaria capucina 0.14 X3 克尼角毛藻 Chaetoceros knipowitschii 0.20 尖尾蓝隐藻 0.17 具尾蓝隐藻 Chroomonas caudata 0.32 X4 角毛藻 Chaetoceros spp. 0.25 颗粒直链藻极狭变种 0.25 等丝浮丝藻 0.25 X5 短柄曲壳藻 0.88 尖尾蓝隐藻 0.04 X6 梅尼小环藻 0.06 泽丝藻 Limnothrix sp. 0.13 尖尾蓝隐藻 0.75 X7 高山冠盘藻 Stephanodiscus alpinus 0.11 湖生假鱼腥藻 0.44 具尾蓝隐藻 0.06 X8 浮鞘丝藻 0.04 细小平裂藻 Merismopedia tenuissima 0.52 隐球藻 Aphanocapsa sp. 0.34 X9 湖生假鱼腥藻 0.09 细小平裂藻 0.16 隐球藻 0.44 X10 泽丝藻 0.06 细小平裂藻 0.79 隐球藻 0.12 注：H1G和H1D. 观鸟亭高和低潮位；H2G和H2D. 凤塘河口高和低潮位；H2G和H3D. 沙咀码头高和低潮位；X1—X10. 1—10号咸水鱼塘。 Note: H1G and H1D. The high and low tide levels at the bird-watching pavilion; H2G and H2D. The high and low tide levels at the Fengtang Estuary; H2G and H3D. The high and low tide levels at the Shazui Wharf; X1−X10. Brackish water fish ponds No.1−10. 2.2.4 生物多样性水平
福田红树林调查区域浮游植物群落的H' 介于0.22~2.40，平均为1.39；d介于0.76~2.16，平均为1.31；J' 介于0.09~0.59，平均为0.34。凤塘河口高潮位、沙咀码头高潮位、2号、7号和9号塘的多样性较高；观鸟屋高、低潮位、凤塘河口低潮位和5号塘的多样性较低 (图5)。根据H' 的评价分级标准，沙咀码头高潮位、2号和7号塘均为轻度干扰；观鸟屋高、低潮位、凤塘河口低潮位、5号、6号和10号塘均受到重度干扰；其余样点为中度干扰。
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图 5 福田红树林湿地浮游植物生物多样性指数注：H1G和H1D. 观鸟亭高和低潮位；H2G和H2D. 凤塘河口高和低潮位；H2G和H3D. 沙咀码头高和低潮位；X1—X10. 1—10号咸水鱼塘。Fig. 5 Diversity indices of phytoplankton in Futian mangrove wetlandNote: H1G and H1D. The high and low tide levels at the bird-watching pavilion; H2G and H2D. The high and low tide levels at the Fengtang Estuary; H2G and H3D. The high and low tide levels at the Shazui Wharf; X1−X10. Brackish water fish ponds No.1−10.2.3 福田红树林保护区浮游植物群落年际动态变化
与福田红树林保护区历史调查数据相比，2023年红树林林区浮游植物的物种数较2018—2020年有所增加 (图6)。浮游植物密度由2016年的3.65×107个·L−1逐年下降至2023年的0.14×107个·L−1。福田林区2019—2023年浮游植物H' 均处于中度干扰水平，低于2016—2018年的水平。此外，与往年相比，2023年浮游植物的J' 相对较低，主要原因是本次调查区域各样点优势种比较突出，而物种分布却不均匀。2019—2023年咸水塘内浮游植物的物种数较2016—2018年有所减少，密度则由2016年的2.82×107个·L−1逐渐降至2023年的0.009 1×107个·L−1，H' 呈现与物种数类似的年际变化规律。
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图 6 福田红树林林区浮游植物群落年度变化Fig. 6 Annual change of phytoplankton community in Futian mangrove forest2.4 浮游植物群落与环境因子的相关性分析
多元方差分析表明，红树林林区和咸水塘间浮游植物群落组成存在显著性差异(p<0.05)。基于Bray-Curtis距离的PCoA分析研究了两者浮游植物的差异，前两轴分别解释了浮游植物群落中24.36%和14.22%的总变异 (图7-a)。由随机森林模型可知 (图7-b—7-d)，pH是显著影响福田红树林湿地浮游植物丰度和生物量的环境因子 (p<0.05)，盐度是显著影响浮游植物生物量的环境因子 (p<0.05)，电导率则是显著影响浮游植物生物量和H' 的环境因子 (p<0.05)。基于浮游植物广布种与环境因子的Pearson相关性分析可知 (图7-e)，短柄曲壳藻与pH存在极显著的强负相关关系 (r=0.80, p<0.001)；谷皮菱形藻 (N. palea) 与氧化还原电位和pH存在极显著的负相关关系 (r=0.65, p<0.01)，与石油类浓度存在显著的正相关关系 (r=0.56, p<0.05)；小球藻与盐度存在显著的负相关关系 (r=−0.55, p<0.05)。
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图 7 福田红树林浮游植物群落结构差异及其与环境因子间的关系注：a. 红树林浮游植物群落PCoA分析；b. 影响浮游植物群落密度的环境因子重要性排序；c. 影响浮游植物群落生物量的环境因子重要性排序；d. 影响浮游植物群落香农-威纳多样性的环境因子重要性排序；e. 浮游植物广布物种 (≥50%的样点均有检出) 与环境因子间的皮尔森相关性；*. p<0.05；**. p<0.01；***. p<0.001。Fig. 7 Differences in phytoplankton community structure in Futian mangrove and its relationship with environmental factorsNote: a. PCoA analysis of the mangrove phytoplankton community; b. Importance ranking of environmental factors affecting the density of the phytoplankton community; c. Importance ranking of environmental factors affecting the biomass of the phytoplankton community; d. Importance ranking of environmental factors affecting the Shannon-Wiener diversity of the phytoplankton community; e. Pearson correlation between the widely-distributed species of phytoplankton (Detected in ≥50% of the sampling sites) and environmental factors; *. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001.3. 讨论
3.1 福田红树林水环境变化
经调查发现福田红树林水质属于III类水，处于中度富营养化状态，该结果明显优于2014—2015年对福田红树林水环境的评价结果[15]—福田红树林总体为劣V类，处于严重富营养化水平；观鸟屋和基围鱼塘的DO属于III—IV类海水水质标准，凤塘河口和沙咀码头的DO处于劣IV类以下；几乎所有监测点位的总氮 (TN) 和总磷 (TP) 浓度均超出IV类水质标准。本研究中福田红树林水体DO介于2.02~7.32 mg·L−1，除观鸟屋低潮位外，均达到III类海水水质标准及以上；DIN和${\mathrm{PO}}_4^{3{\text{−}}}{\text{-}}{\mathrm{P}}$除2号塘和凤塘河口外，均达到III类海水水质标准。结果表明，与2014—2015年相比，福田红树林水质得到了明显改善，这归因于2016年以来深圳湾的水污染全面整治。2016年深圳市举全市之力开展了治水攻坚战，全面开展以流域为单元的水污染治理和城市管网雨污分流，随河流排入深圳湾的污染物得到了有效控制，于2019年底基本消除黑臭水体[13]。据相关文献统计，深圳市河网综合整治工程对NH4 +-N、COD和TP的削减量分别可达16.01、20.29和288.24 t·a−1[16]。
3.2 福田红树林浮游植物群落特征
2023年福田红树林浮游植物检出物种数为122种，是陈叶花等[17]对毗邻红树林保护区的深圳福田红树林生态公园5个样点调查结果 (69种) 的近2倍，可能由于本研究中样点数量 (16个) 较多且生境复杂度较高。调查区域浮游植物密度介于 (0.02~122.21)×106个·L−1，除10号塘因明显的蓝藻水华导致的高密度外，其余样点与陈叶花等[17]的调查结果接近 (最高10×106个·L−1)。总体上，福田红树林浮游植物是以硅藻门为主的特有浮游植物群落结构，与以往的研究结果一致[17-18]。研究指出红树林生长能持续向附近水域输出硅 (Si)，促进硅藻群落生长；同时受潮汐作用影响，底栖硅藻悬浮进入水体，增加了浮游植物中的硅藻占比[19]。此外，主要优势种为中-富营养指示种或喜好生活在有机质丰富的水体中的种类[20]，说明调查区域仍处于一定程度的富营养化状态，这与调查区域的III类水质监测结果相吻合。
本研究中福田红树林咸水塘和红树林林区浮游植物群落组成存在显著性差异。一方面可归因于红树林林区和咸水塘间差异显著的pH、氧化还原电位、NH4 +-N和石油类浓度，研究表明水体环境是影响浮游植物群落组成的关键因素[21-22]；另一方面可归因于红树林区与咸水塘间明显不同的水文动力条件。红树林区受规律的潮汐作用影响，是浮游植物群落变化的关键因子[23]；咸水塘则是相对封闭的静水体系，水体与外界交换较少，给8—10号咸水塘蓝藻等藻华物种的生长创造了适宜条件[24]。郑鑫[25]对围堤工程内外的浮游植物群落的研究发现，围堤内水域浮游生物的物种多样性和均匀度指数降低以及密度和生物量的爆发，导致围堤内外水域浮游生物的群落存在显著性差异。
3.3 福田红树林浮游植物群落年际变化
福田红树林林区浮游植物密度由2016年的3.65×107个·L−1逐年下降至2023年的0.14×107 个·L−1，且2023年密度监测结果明显低于王雨等[9] 2005—2006年的监测结果 (平均0.43×107个·L−1)。表明福田红树林保护区海域水体富营养化程度在逐年降低，该结果与深圳湾近年来水质由2014—2015年的劣IV类逐渐转变为III类相一致[15]。深圳湾近20年的赤潮爆发记录由2006—2010年和2011—2014年的6和3次，降至2016—2023年的1次，也印证了深圳湾富营养化程度逐渐降低的趋势[26-27]。福田林区2023年浮游植物多样性指数较2019—2020年的差异不显著，较2019年之前的低，该结果与陈叶花等[17]对福田红树林生态公园老河口的调查结果类似，其调查区域的多样性指数年均值为1.32。浮游植物多样性指数可表征水体受污染程度[28]，然而福田红树林区浮游植物多样性指数并未随着水质的改善呈现逐渐升高的趋势。浮游植物多样性指数对水质的指示作用受多种因素的影响，在某些研究中其适用性欠佳，例如有研究在重污染水体中检出了较高的浮游植物多样性指数，在极清洁的水体中多样性指数也较低[29-30]。
由H' 和J' 可知，2016—2023年间咸水塘总体为中污-轻污-寡污型。咸水塘的浮游植物平均密度则由2016年的2.82×107个·L−1逐年降至2023年的0.009 1×107个·L−1。据水体富营养化的浮游植物评分标准[31] [即浮游植物密度小于3×105个·L−1为贫营养；密度介于 (3~10)×105个·L−1为中营养；密度大于10×105个·L−1为富营养] 可知，咸水塘由2016年的总体富营养化状态逐渐好转为总体贫营养状态。该结果可归因于深圳湾污染治理和深圳河等河流污染物入湾通量的持续降低[32]，在不存在外源污染输入的条件下，咸水塘定期与深圳湾海水进行水体交换，水体质量随深圳湾水质提升而改善。
3.4 环境因子对福田红树林浮游植物群落的影响
随机森林模型分析表明，电导率、pH和盐度是影响福田红树林浮游植物群落密度、生物量和多样性的最重要的环境因子。电导率是反映水环境质量的重要指标，可表征水体N、P等可溶性营养盐浓度，可驱动浮游植物群落结构和功能群群落结构的演变[33]。对丰水期的鄱阳湖、拉林河水系和雅鲁藏布江浮游植物群落的研究也发现，电导率是驱动浮游植物群落变化的关键影响因子[33-35]。本研究中盐度对浮游植物密度发挥着关键作用，与对福田红树林保护区、崇明东滩湿地和河北抚宁海湾的浮游植物的研究结果一致[11,25,36]。盐度作为海水的重要指标，通过影响浮游植物细胞的渗透调节机制，在浮游植物细胞结构维持和酶活性的保持等生物过程中发挥着重要作用[37]。本研究中，小球藻与盐度呈显著的负相关关系，表明盐度的升高对小球藻的生长存在抑制作用。研究表明高盐度会降低小球藻的产热量，抑制小球藻生长[38]。
pH变化可以通过影响胞内部分酶活性或跨膜质子梯度来影响浮游植物的光合作用过程，从而影响浮游植物生长和发育[39-40]。周希志等[41]和赵茜等[42]的研究也发现pH是影响海域浮游植物群落结构的主要环境因子。本研究调查区域的平均pH为7.76，呈弱碱性，有利于浮游植物对空气中CO2的吸收和固定，适宜浮游植物的生长[39]。值得注意的是，本研究中短柄曲壳藻和谷皮菱形藻2种硅藻均与pH呈极显著的负相关关系。有研究表明pH是影响硅藻群落结构的最主要决定因子，偏酸性环境利于硅藻硅酸化形成硅壳和吸收硅酸盐[43]，然而也有研究发现海洋酸化对以硅藻为主的浮游植物群落生长或初级生产力存在抑制作用[44-45]。Vitug和Baldia[46]对谷皮菱形藻最佳培养条件的研究发现，随pH上升 (6~9)，其生长速率增加，实验室最佳培养pH为9。本研究中自然咸水水体的pH介于6.79~8.24，波动范围更小。同时也有研究发现同一分类群的钝脆杆藻、N. paleaeformis和卡里舟形藻 (Navicula aff. cari) 可耐受较低的pH，是嗜酸性藻类[47]。综合来看，pH对咸水水体中硅藻类生长的影响还有待进一步研究，但其作为影响浮游植物群落结构的关键环境因子已被广泛认同。
谷皮菱形藻与石油类呈显著正相关关系，可能归因于该藻种对石油类污染物的耐受性和降解能力。研究表明谷皮菱形藻因富含油脂、较快的生长速度和环境适应能力，表现出良好的生物柴油生产潜力[48]。同时，有研究报道该物种是石油类重污染区的指示生物，并具有较强的石油类污染降解修复能力[49]。因此，谷皮菱形藻能适应福田红树林水域较低浓度的石油类污染物环境，并以其为营养物质，促进种群的生长。
4. 结论
深圳福田红树林调查区域共检出122种浮游植物，优势种以硅藻门、蓝藻门和隐藻门的种类为主，包括硅藻门的短柄曲壳藻、梅尼小环藻、小环藻等，蓝藻门的拉氏拟柱孢藻、浮鞘丝藻、湖生假鱼腥藻等，隐藻门的尖尾蓝隐藻和具尾蓝隐藻。多数优势种为中-富营养指示种，表明福田红树林水体仍存在一定程度的富营养化，与红树林水质监测结果——中度富营养化水平一致。红树林林区和咸水塘间浮游植物群落组成存在显著性差异。从年际变化来看，福田红树林湿地浮游植物密度呈逐年下降的趋势。pH、电导率和盐度是影响调查区域浮游植物群落的关键环境因子。总体上，福田红树林保护区水环境质量需要进一步改善。
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图 3 黄鳝16个微卫星标记基于不同亲本数的模拟分析
Figure 3. Simulation analysis of 16 pairs microsatellite markers of M. albus based on different candidate parent
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图 4 110个黄鳝家系聚类分析图
注：右侧数字代表家系，其中1-07和101-07为聚类错误的子代编号。
Figure 4. Cluster analysis diagram of 110 families of M. albus
Note: The numbers on the right represent families, and 1-07 and 101-07 are clustered incorrectly.
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图 5 亲子鉴定应用聚类分析
注：“-”前的数字代表家系、后面的数字代表子代标号，M代表家系对应的母本，F代表家系对应的父本，其中10-04为聚类错误的子代编号。
Figure 5. Cluster analysis of parentage test application
Note: The number before "-" represents the family; the number after "-" represents the offspring label; M represents the female parent corresponding to the family; F represents the male parent corresponding to the family, and 10-04 was clustered incorrectly.
表 1 黄鳝 2 组微卫星多重PCR的引物信息
Table 1 Primer information of two multiplex PCR sets of microsatellites in M. albus
分组
Group位点
Locus重复单元
Reapet motif退火温度
Tm/℃引物序列
Primer sequence荧光标记
Fluorescence label片段长度
Size/bp比例
RatioA Mta027 (GCA)7 52 F: CTGCGGTAACAAGCGTATCA
R: CTGGGGATCCCAGTCAAACTFAM 147~154 3 Mta141 (GT)17 52 F: CAGAGATGGTCGACTGGTGA
R: AGAGCCATGGGAAGCACTTAFAM 185~312 2 Mta031 (ATG)8 52 F: AGAGGCAGCTCATGGACACT
R: TTCATGGCTGAGCTGACTTGFAM 242~265 3 Ma28 (ATC)7 52 F: GGGATTGTCTGGAATGCTGT
R: GTGAACCCTGAACAGACGGTHEX 144~168 3 Ma39 (GAT)8 52 F: AGGTGAAGGGGAACACACTG
R: TTGCCCTGTCCATTTTTCTCHEX 193~224 3 Ma71 (TCA)13 52 F: TCACATTGCCCAGAGAACAG
R: GGCAGCATCAAGAGACCTTCHEX 258~269 2 Ma24 (CTG)9 52 F: TCGTCTGGCTCAGAGGAGAT
4R: AGCTGCAGCAGGAGGAATACTAMRA 125~143 7 Mta026 (CAG)8 52 F5: TGAACATCCCTTCTTCCACC
R: GTCATGGGTTTGTGTTGCTGTAMRA 171~182 4 Ma85 (TGC)9 52 F: GTGGAAGAAGCTGGATGAGC
R: CACATGGGGTGTTCTCACTGTAMRA 208~236 5 Mta013 (AGG)9 52 F: GAGCGTCTTTTCCATCCTTG
R: CCTACTGCTGCTTCTGGTCCROX 131~150 4 Mta025 (GCT)7 52 F: GCCAAGCAAACGTGTGAGTA
R: AACGAGCTGCGTGTTAAGGTROX 172~184 3 Ma78 (TAAGA)5 52 F: CTGACGGTTGTGTGTAACGG
R: CACGTACGCCGGTTAAACTTROX 214~235 3 B Mta033 (TGT)7 52 F: TGGAGGCAGGAGAAGGAGTA
R: TGAAAGACTCCTCGCAACCTFAM 158~170 1 Mta021 (TGT)7 52 F: AGAGTCTTGCTCGGTTTCCA
R: AGAGTCTTGCTCGGTTTCCAFAM 201~210 1 Ma5 (TCTAC)7 52 F: TTCAGGTTCGGGACTTTGAC
R: AGACGGTTGTGTCAGGAAGGFAM 231~256 1 Mta148 (GT)15 52 F: TTTTCCCAGCAGCTGATTTC
R: CATGACAACAGGACGCAAACHEX 158~174 1 
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表 2 16 个微卫星位点的遗传参数
Table 2 Genetic parameters of 16 SSR loci
位点
Locus等位基因数
Na观测杂合度
Ho期望杂合度
He多态信息含量
PICNE-1P NE-2P NE-PP 无效等位基因频率
FNullMa5 5 0.758 0.704 0.647 0.723 0.555 0.380 −0.037 6 Ma24 6 0.550 0.546 0.513 0.833 0.662 0.472 −0.018 2 Ma28 9 0.679 0.660 0.613 0.747 0.574 0.384 −0.017 3 Ma39 9 0.771 0.797 0.766 0.570 0.393 0.206 0.004 0 Ma71 5 0.485 0.494 0.444 0.873 0.732 0.579 0.005 4 Ma78 4 0.489 0.490 0.401 0.880 0.780 0.662 −0.001 5 Ma85 8 0.583 0.717 0.676 0.682 0.504 0.308 0.106 6 Mta013 4 0.583 0.647 0.586 0.775 0.615 0.444 0.046 6 Mta021 4 0.667 0.578 0.485 0.830 0.714 0.574 −0.076 9 Mta025 4 0.652 0.588 0.522 0.822 0.676 0.517 −0.055 4 Mta026 4 0.636 0.621 0.545 0.799 0.657 0.498 −0.020 5 Mta027 3 0.432 0.382 0.347 0.928 0.803 0.675 −0.086 5 Mta031 8 0.756 0.746 0.714 0.640 0.457 0.259 −0.019 3 Mta033 4 0.606 0.509 0.430 0.870 0.756 0.625 −0.100 9 Mta141 8 0.735 0.764 0.732 0.620 0.438 0.244 0.018 8 Mta148 5 0.644 0.666 0.603 0.760 0.600 0.430 0.008 3 双亲未知时单个亲本的累积非亲排除率 Combined non-exclusion probability (First parent): 0.013 807 65 已知单亲时另一个亲本的累积非亲排除率 Combined non-exclusion probability (Second parent): 0.000 339 45 双亲未知时父母本组合的累积非亲排除率 Combined non-exclusion probability (Parent pair): 0.000 001 26 注：NE-1P代表双亲基因型未知时，单个位点的单亲排除率；NE-2P表示已知单亲基因型时，另一亲本单个位点的排除率；NE-PP表示双亲基因型未知时，单个位点的双亲排除率。 Note: NE-1P represents exclusion probability and of the first parent given only the genotype; NE-2P represents exclusion probability for one candidate parent given the genotype of a known parent of the opposite sex; NE-PP represents exclusion probability probability of a parent pair given only the genotype.
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表 3 黄鳝子代和亲本群体的遗传多样性
Table 3 Genetic diversities of offsprings and parents of M. albus
群体
Population平均等位基因数
Mean Na平均观测杂合度
Mean Ho平均期望杂合度
Mean He平均多态信息含量
Mean PIC子代-1 Offspring-1 2.750 0.619 0.495 0.408 子代-41 Offspring-41 2.813 0.688 0.554 0.453 子代-68 Offspring-68 2.375 0.669 0.475 0.375 子代-70 Offspring-70 2.063 0.488 0.386 0.301 子代-77 Offspring-77 2.563 0.719 0.536 0.436 子代-79 Offspring-79 2.125 0.575 0.430 0.334 子代-81 Offspring-81 2.563 0.806 0.574 0.457 子代-85 Offspring-85 2.125 0.494 0.384 0.311 子代-88 Offspring-88 2.375 0.556 0.466 0.373 子代-96 Offspring-96 2.438 0.639 0.506 0.411 子代-101 Offspring-101 3.188 0.700 0.574 0.474 亲本 Parents 5.625 0.556 0.636 0.570
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