Identification and denitrification performance of a high ammonia nitrogen-resistant aerobic denitrifying bacteria
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摘要:
氨氮 (NH4 +-N)、硝态氮 (NO3 −-N)、亚硝态氮 (NO2 −-N) 等含氮 (N) 化合物是工厂化养殖系统中的主要污染物,水中N浓度较高易造成养殖水体污染并危害水生动物的安全,而好氧反硝化细菌被广泛用于养殖尾水的N降解。为获得一株能安全高效处理高NH4 +-N废水的菌株,对从养殖池塘筛得的耐高NH4 +-N好氧反硝化细菌WM28进行了研究。运用形态学观察、生理生化及16S rRNA基因测序对该菌株进行种属鉴定;采用抗生素实验、斑马鱼(Danio rerio) 攻毒实验对菌株进行了环境及生物安全性评估;在3种单一氮源模拟废水下测定其生长与脱氮性能,并在高浓度NH4 +-N模拟废水中对其进行脱氮能力测试。经鉴定,WM28为红球菌属赤红球菌 (Rhodococcus ruber);有较高的抗生素敏感性及较好的生物安全性。在单一NH4 +-N、NO3 −-N、NO2 −-N模拟废水中,培养48 h后N去除率分别为100%、76.3%、66.99%;高浓度NH4 +-N模拟废水结果显示:100~500 mg·L−1高浓度NH4 +-N模拟废水在48 h后的NH4 +-N去除率为100%;700 mg·L−1 NH4 +-N在116 h后的去除率在88%以上;在第120小时,NH4 +-N初始质量浓度为1 000 mg·L−1时仍有脱氮能力,去除率为74.38%,说明菌株WM28具有较好的高NH4 +-N耐受性。综上所述,菌株WM28是一株耐NH4 +-N、安全且高效的好氧反硝化菌,在处理养殖尾水、工业废水上有较好的应用前景。
Abstract:Ammonia (NH4 +-N), nitrate (NO3 −-N) and nitrite (NO2 −-N) are the main contaminants in industrial aquaculture systems. High nitrogen concentration in water is likely to cause aquaculture water pollution and endanger the safety of aquatic animals. Aerobic denitrifying bacteria are widely used to remove nitrogen-containing aquaculture wastewater. In order to obtain a strain that can safely and efficiently treat wastewater with high ammonia nitrogen concentration, we studied the aerobic denitrifying bacteria WM28 with high ammonia nitrogen resistance screened from aquaculture ponds. The strain was identified through morphological observation, physiological and biochemical tests and 16S rRNA gene sequencing. The environmental and biological safety of the strains were evaluated through antibiotic tests and zebrafish (Danio rerio) toxicity tests. The growth and denitrification performance were measured in three single nitrogen source simulated wastewater, and the denitrification capacity was tested in high concentration ammonia nitrogen simulated wastewater. WM28 was identified as Rhodococcus ruber with high antibiotic sensitivity and good biosafety. The removal rates were 100%, 76.3% and 66.99% after 48 h incubation in single NH4 +-N, NO3 −-N and NO2 −-N media, respectively. Their removal rates of NH4 +-N reached 100% at high concentrations of 100–500 mg·L−1 NH4 +-N in simulated wastewater experiment after 48 h. 700 mg·L−1 NH4 +-N was removed by more than 88% after 116 h. At 120th hour, the initial NH4 +-N concentration of 1 000 mg·L−1 was still capable of denitrification with a removal rate of 74.38%, which indicates that strain WM28 has great tolerance to high ammonia nitrogen. In summary, strain WM28 is a safe and efficient aerobic denitrifying bacteria with high ammonia tolerance, and has promising application prospects in the treatment of aquaculture and industrial wastewater.
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Keywords:
- Rhodococcus ruber /
- Aerobic denitrifying bacteria /
- Denitrification /
- Biosafety
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臭氧层是地球的天然紫外线屏障,70%~90%的高强度紫外线辐射都被其吸收,使地球上的生物能够在不受紫外线伤害的情况下得以生存和繁衍[1-2]。近年来由于人类活动的影响,大气臭氧层不断遭到破坏,导致到达地球表面的紫外线不断增强,对地球气候、生态环境、尤其是人类健康的影响很大,比如白内障、皮肤癌等的发病率大幅增加[3-5]。因此,人们一般通过涂抹含紫外线屏蔽剂的护肤品来降低其对人体的伤害。目前,护肤品中添加的紫外线吸收剂一般均为人工合成的化学物质,如水杨酸衍生物、对氨基苯甲酸类、肉桂酸、滑石粉、金属氧化物等,它们虽然可以抵御紫外线,但很容易堵塞毛孔,损害皮肤甚至导致皮肤过敏[6-7]。天然抗紫外线物质可吸收照射至真皮层中的紫外线,以保护真皮层中的胶原和弹性蛋白,具有无毒无刺激等优点,还具备清除氧自由基、延缓皮肤衰老等功效,因此对天然的抗紫外线活性物质的研究成为新的研究热点[8-18]。
类菌胞素氨基酸 (Mycosporine-like amino acids, MAAs) 作为天然的紫外吸收剂,最初由Leach于1965年在真菌中首次发现[19]。MAAs是以环己烯酮为基本骨架,与不同类型氨基酸通过胺缩合作用形成的一大类小分子、水溶性化合物[20]。由于共轭双键和侧链上不同活性基团的影响,在310~360 nm的紫外光区MAAs具有很强的吸收能力[21]。MAAs吸收紫外光后,会以热的形式散发,而不分解产生新的化学物质,因此是安全无害的防辐射剂[22]。此外,MAAs化合物具有较高的摩尔吸收率,能减少紫外线对细胞的损伤[23],因此在作为化妆品中的防辐射剂方面有着重要的应用价值。目前从海洋生物中发现了约29种MAAs[24]。MAAs主要存在于红藻和褐藻中,其中红藻门的含量最多[25-26]。但目前针对MAAs的研究主要集中于提取工艺优化、生物活性等方面[27-29],对其在化妆品体系中的稳定性研究尚未见报道。
本研究以中国南方资源丰富的坛紫菜 (Porphyra haitanensis) 为原料,从中提取抗紫外辐射物质MAAs,通过液相色谱-质谱联用技术确定MAAs的种类,并探究了pH、光照、温度以及化妆品中各种添加剂对坛紫菜MAAs化合物稳定性的影响,为该类物质用作护肤品的抗紫外辐射添加剂提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 试剂与仪器
坛紫菜购于福建省古田松田商贸有限公司;尼泊金甲酯、维生素A、维生素E、胶原蛋白、卡松、乙内酰脲 (DMDMH)、丁羟甲苯 (BHT)、透明质酸、甘油均由佛山市安安美容保健品有限公司提供,化妆品级;小分子肽由中国科学院南海海洋研究所提供,分子量≤3 000 D;无水乙醇、氢氧化钠、磷酸、磷酸氢二钠、盐酸均为国产分析纯,甲醇为色谱纯。
UV2600紫外可见分光光度计 (日本岛津);N-1210BV-WB旋转蒸发仪 (埃朗科技);LGJ-10冷冻干燥机 (上海精科);SHZ-82A水浴恒温振荡器 (新瑞仪器);GHP-9270隔水式恒温培养箱 (上海一恒);LCQ Deca XP MAX液相色谱-质谱联用仪 (美国Thermo);TG16-WS台式高速离心机 (湖南湘仪);BJ-800A多功能粉碎机 (拜杰);PHS-3C精密pH计 (上海雷磁);BSA224S-CW分析天平 (赛多利斯);RCT基本型加热磁力搅拌 (IKA)。
1.2 MAAs化合物的提取和鉴定
1.2.1 原料预处理
将坛紫菜用搅拌机粉碎后,经20~60目筛过筛后备用。
1.2.2 坛紫菜中MAAs的提取[30]
取经预处理的坛紫菜原料,加入去离子水提取 (提取温度45 ℃,提取时间2 h,料液质量比为1∶8,初始pH为2),离心收集上层清液,加入无水乙醇,调节乙醇体积分数为80%,在−20 ℃下冷冻浸沉6 h,以除去其中的核酸、蛋白质等杂质,最后经离心、旋蒸、冷冻干燥后得到粗产品。
1.2.3 MAAs化合物种类的确定
取少量冻干产品经去离子水溶解定容后,于紫外可见分光光度计测定其在200~780 nm的最大吸收波长。
1.2.4 MAAs化合物含量的确定
通过液相色谱-质谱联用仪分析,确定提取液中MAAs化合物的含量及相对分子量。液相色谱的条件为:ODS-C18色谱柱(5 μm,250×4 mm I.D);流动相: A相色谱纯甲醇,B相乙酸体积分数0.2% (体积比A∶B=10∶90);流速1.0 mL·min−1;柱温25 ℃;进样量1 μL。
1.3 MAAs化合物稳定性的研究
1.3.1 pH对MAAs化合物稳定性的影响
配置0.2 mol·L−1的磷酸盐缓冲溶液, 用0.1 mol·L−1的氢氧化钠溶液和磷酸调节pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,加入MAAs化合物使质量分数为0.05%,分别测试其在334 nm处的吸光度。
1.3.2 光照对MAAs化合物稳定性的影响
将质量分数为0.05%的MAAs水溶液分别置于紫外灯箱、自然光室内和暗室中,每隔1 h取样测试其在334 nm处的吸光度。
1.3.3 温度对MAAs化合物稳定性的影响
将质量分数为0.05%的MAAs水溶液 (含质量分数0.2%卡松、防腐剂) 分别置于−20、25、48 ℃中56 d,定期取样测试其在334 nm处的吸光度。
1.3.4 防腐剂对MAAs化合物稳定性的影响
将3份质量分数0.05%的MAAs水溶液分别加入卡松 (质量分数为0.3%)、尼泊金甲酯 (质量分数为0.3%)、DMDMH (质量分数为0.3%),再分成2份后,分别置于25和48 ℃下56 d,定期取样测试其在334 nm处的吸光度。
1.3.5 抗氧化剂对MAAs化合物稳定性的影响
将2份质量分数为0.05%的MAAs水溶液 (含质量分数0.2%卡松) 分别加入不同抗氧化剂BHT (质量分数为0.3%) 和维生素E (质量分数为0.3%),再分成2份后,分别置于25和48 ℃下56 d,定期取样测试其在334 nm处的吸光度。
1.3.6 功能性添加剂对MAAs化合物稳定性的影响
将5份质量分数为0.05%的MAAs水溶液 (含质量分数0.2%卡松、防腐剂) 分别加入不同功能性添加剂透明质酸 (质量分数为0.2%)、甘油 (质量分数为8%)、胶原蛋白 (质量分数为0.2%)、小分子肽 (质量分数为0.2%)、维生素A (质量分数为0.2%),再分成2份后,分别置于25和48 ℃下56 d,定期取样测试其在334 nm处的吸光度。
2. 结果与分析
2.1 MAAs化合物种类和含量的确定
2.1.1 MAAs提取液的定性分析
MAAs的定性一般是通过MAAs的特征吸收波长来初步判断。图1为坛紫菜提取液于波长200~780 nm处的扫描图谱。可以看出,提取液的紫外最大吸收波长λmax=334 nm。MAAs化合物中Porphyra-334和Shionrine两者的最大吸收波长均为λmax=334 nm[31],由此可推测坛紫菜中含有的MAAs化合物可能为Porphyra-334和Shionrine。由于所提取的粗产品没有经过进一步的纯化,可能含有色素等杂质,因此在200 nm处出现1个吸收峰。
2.1.2 坛紫菜提取液的定量分析
坛紫菜提取液经过液相色谱-质谱联用仪分析,得到总离子流图 (图2),具体参数见表1。坛紫菜提取液中Porphyra-334和Shinorine对应的出峰时间为4.326和6.095 min (图2),各峰对应的峰面积占比分别为19.529%和19.911% (表1),即坛紫菜提取液含MAAs化合物Shinorine和Porphyra-334的质量分数均为20%,因此提取液中MAAs化合物总质量分数约为40%。
表 1 总离子流图的具体峰参数Table 1 Specific peak parameters of total ion chromatogram峰
Peak出峰时间
peak time峰类型
Peak type峰高
Peak height修正面积
Corrected area修正面积占总比数
Percentage/%1 4.326 47 rVB 4 503 618 7 485 541 19.529 2 6.059 186 rVV 3 124 289 7 248 372 19.911 3 8.296 360 rBV 2 802 473 7 692 893 20.070 4 9.146 440 rBV2 677 378 7 131 761 18.606 5 9.971 503 rBV3 392 427 3 211 642 8.379 对图2中的峰1含有的化合物A和峰2含有的化合物B进行质谱分析,得到其一级和二级质谱图 (图3)。化合物A对应的核质比为347,化合物B对应的核质比为333,结合前面紫外可见光谱定性分析的结果和相关文献[32],可以确定坛紫菜提取液中含有2种MAAs类化合物,化合物A为Porphyra-334,化合物B为Shinorine。
2.2 MAAs化合物稳定性研究结果
2.2.1 pH对MAAs化合物稳定性的影响
图4-a为pH对坛紫菜MAAs化合物吸光度的影响。坛紫菜MAAs化合物在微酸性 (pH=6) 下具有最大的吸光度,说明此条件下坛紫菜MAAs化合物的浓度最高、稳定性最好。在酸性和碱性条件下稳定下较差,随着酸度或碱度的增大,吸光度逐渐下降,说明稳定性也不断下降。因此,在储存和制备MAAs化合物时应尽量避免过酸或过碱的环境,以保证MAAs化合物的稳定存在。
2.2.2 光照对MAAs化合物稳定性的影响
图4-b为不同光源紫外、室内自然光和避光下坛紫菜MAAs化合物吸光度随时间变化的结果。随着时间的延长,在不同光源的照射下,MAAs化合物的吸光度均呈下降趋势。尤其是紫外灯照射10 h后溶液吸光度由0.991减至0.055,降低了94.4%,而自然光照射10 h吸光度降至0.883,下降10.9%,暗室保存10 h后吸光度仍能保持在0.905,仅下降8.7%,这说明紫外灯直射对MAAs化合物有明显的破坏作用,自然光存在的条件下,也能稍微加速MAAs化合物的分解,但影响不大。因此MAAs化合物在储存的过程中应该尽量放置在暗室避光处。
2.2.3 温度对MAAs化合物稳定性的影响
图4-c为不同温度下坛紫菜MAAs化合物吸光度在56 d内变化的结果。−20 ℃下MAAs化合物的吸光度基本上保持不变,可以稳定存在,在常温下保存56 d吸光度下降了9.4%,而在48 ℃下保存56 d吸光度下降了28.3%,说明坛紫菜中MAAs化合物的吸光度随着温度的升高下降越明显,稳定性随着温度的升高而降低。因此,低温更有利于MAAs化合物的存放。
2.2.4 防腐剂对MAAs化合物稳定性的影响
图5为坛紫菜MAAs化合物在加入化妆品中3种常用的防腐剂卡松、尼泊金甲酯和DMDMH放置56 d吸光度的变化趋势。随着存放时间的增加,加入不同防腐剂的MAAs化合物的吸光度均有下降趋势,在25 ℃保存时,所有加入防腐剂样品的吸光度下降幅度与未添加防腐剂的基本相同,说明这3种防腐剂在室温下对MAAs化合物的稳定性均不会产生明显的影响,但在48 ℃时,坛紫菜MAAs化合物在防腐剂尼泊金甲酯体系中的吸光度较未添加防腐剂的溶液低且下降更为明显,即含防腐剂尼泊金甲酯不利于MAAs化合物的稳定性,而卡松和DMDMH体系中的吸光度高于未添加防腐剂的溶液,因此更有利于MAAs化合物的稳定。
2.2.5 抗氧化剂对MAAs化合物稳定性的影响
图6为坛紫菜MAAs化合物在加入2种抗氧化剂BHT和维生素E放置56 d吸光度的变化趋势。在常温下含抗氧化剂BHT的坛紫菜MAAs化合物溶液的吸光度与未添加抗氧化剂的相当,说明常温下MAAs化合物能稳定存在于2种抗氧化剂体系中,但在48 ℃下,MAAs化合物在BHT体系中的吸光度明显低于对照组,说明高温下BHT的存在能加速MAAs化合物的分解。同时也可以看出维生素E的加入可以提高MAAs化合物的吸光度,表明这种抗氧化剂对MAAs化合物有一定的保护作用,有利于维持其稳定。
2.2.6 功能添加剂对MAAs化合物稳定性的影响
图7为坛紫菜MAAs化合物在加入多种化妆品添加剂 (透明质酸、甘油、胶原蛋白、小分子肽、维生素A) 放置56 d吸光度的变化趋势。25 ℃时含维生素A样品的吸光度与未添加功能性添加剂的相当,但在48 ℃保存15 d后,其吸光度的下降幅度最大且低于未添加功能性添加剂的,说明高温下维生素A的存在可促进MAAs 化合物的分解;含甘油和胶原蛋白样品的吸光度的下降速度与未添加功能性添加剂的溶液持平,它们对MAAs化合物的稳定性无影响;而含小分子肽和透明质酸添加剂的样品的吸光度无论在高温还是低温均明显高于对照组,能显著增强MAAs化合物的稳定性,比如48 ℃下添加小分子肽溶液的吸光度提高了82%,添加透明质酸溶液的吸光度提高了18.6%。因此维生素A的存在能降低MAAs化合物的稳定性,而小分子肽和透明质酸能更有效地保持MAAs化合物的稳定性。
3. 结论
本研究从坛紫菜中提取了MAAs化合物,采用紫外可见光谱、液质联用确定了坛紫菜提取液中含有的MAAs化合物种类为Shionrine和Porphyra-334,质量分数各为20%,总质量分数约为40%。在化妆品体系中各个因素对MAAs化合物稳定性的影响研究中得到以下结论:1) 微酸、弱光、低温环境下,有利于MAAs化合物的稳定,更有利于保存;2) 防腐剂卡松最有利于MAAs化合物的长时间保存;3) 抗氧化剂维生素E可以提高MAAs化合物的稳定性;4) 48 ℃下功能性添加剂小分子肽使样品的吸光度增加了82%,透明质酸样品则增加了18.6%,它们的添加能有效保护MAAs化合物的稳定性。综上,化妆品配方中的不同添加剂对MAAs化合物的稳定性有不同程度的影响,在使用MAAs作为化妆品中的防晒成分时,应注意选择适当的其他各类添加剂来保护MAAs化合物的稳定性,研究成果可为MAAs化合物在化妆品中的应用提供参考和指导。
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图 3 菌株WM28在单一NH4 +-N (a)、NO3 −-N (b)、NO2 −-N (c)模拟废水中的生长及脱氮性能
注:初始无机氮质量浓度 (C0, mg·L−1),NH4 +-N为197.06,NO3 −-N为211.70,NO2 −-N为194.04。
Figure 3. Growth and denitrification performance of strain WM28 under a single NH4 +-N (a), NO3 −-N (b) and NO2 −-N (c) simulated wastewater
Note: Initial inorganic nitrogen mass concentration (C0, mg·L−1): NH4 +-N 197.06; NO3 −-N 211.70; NO2 −-N 194.04.
表 1 菌株WM28生理生化鉴定结果
Table 1 Physiological and biochemical identification results of strain WM28
项目
Project结果
Result模式菌株
Standard strain项目
Project结果
Result模式菌株
Standard strain革兰氏反应 Gram reaction + + 甘油 Glycerol + + 氧化酶反应 Oxidase reaction − − D-(+)-麦芽糖 D-(+)-Maltose monohydrate − +/− 明胶液化 Gelatin liquefaction − − 乳糖 Lactose + − 淀粉水解 Starch hydrolysis − + D-半乳糖 D-Galactose + \ 吲哚生成 Indole production − − 甘露醇 Mannitol + + 甲基红 Methyl red − \ L-苯丙氨酸 L-Phenylalanine + \ V-P试验 Vogs-Proskauer text − \ 甘氨酸 Glycine + \ 脂酶 (Tween 80) Tween 80 hydrolysis + + L-赖氨酸 L-Lysine + − 生长:4 ℃ Growth at 4 ℃ − − L-酪氨酸 L-tyrosine + + 生长:41 ℃ Growth at 41 ℃ + + D-木糖 D-Xylose + \ 反硝化 Denitrification + \ L-精氨酸 L-Arginine − − 蔗糖 Sucrose + + D-果糖 D-Fructose + + 酒石酸盐 Potassium tartrate − \ 柠檬酸盐 Citrate + + D-(+)-葡萄糖 D-(+)-Glucose + + L-(+)-阿拉伯糖 L-(+)-Arabinose + +/− 肌酸 Creatine + \ 苯甲酸盐 Benzoate − \ 注:+. 阳性;−. 阴性;\. 未测定。 Note: +. Positive; −. Negative; \. Not measured. 表 2 抗生素耐药性实验结果表
Table 2 Experimental results of antibiotic resistance
抗生素种类
Types of antibioticsall抑菌环大小
Bacteriostatic ring
size/nm敏感种类
Sensitive
species诺氟沙星 Norfloxacin 16.33±0.58 I 环丙沙星 Ciprofloxacin 19.67±0.58 I 氯霉素 Chloromycetin 25.67±0.58 S 盐酸四环素 Tetracycline hydrochloride 26±1 S 硫酸庆大霉素 Gentamicin sulfate 18.67±1.15 S 左氧氟沙星 Levofloxaci 28.33±0.58 S 头孢他啶 Ceftazidime 0 R 链霉素 Streptomycin 0 R 注:R. 耐药;I. 中介;S. 敏感。 Note: R. Resistance to drugs; I. Intermediary; S. Sensitive. 表 3 菌株WM28在不同质量浓度NH4 +-N模拟废水中培养120 h后的生长及去除情况
Table 3 Growth and removal of strain WM28 in simulated wastewater with different concentrations of NH4 +-N for 120 h
初始质量浓度
Initial mass concentration/(mg·L−1)光密度
OD600剩余质量浓度
Residual mass concentration/(mg·L−1)去除率
Removal rate/%100 0.366±0.007 0 100 200 0.896±0.038 0 100 500 1.492±0.006 0 100 700 1.547±0.011 85.597±3.319 88.004±0.375 1 000 1.825±0.027 248.167±2.917 74.381±0.381 -
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