Synergistic effects of pH and phenanthrene on toxicity of juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis)
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摘要:
为探究酸化以及环境污染物菲 (Phenanthrene, PHE) 协同效应对中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 的影响，开展了不同pH (5.5、6.5、7.8) 和PHE质量浓度 (0、50 µg·L−1) 对中华绒螯蟹 [(15.0±2.3) g] 的联合暴露实验 (为期14 d)。结果发现：1) 中华绒螯蟹在pH 5.5×PHE 50的协同处理下，肝胰腺和鳃组织出现严重病理损伤，肝胰腺小管形状改变，肝管细胞萎缩出现大量空泡，鳃轴肿大，鳃丝角质层表皮破损，局部基膜破裂；而pH 6.5×PHE 50对中华绒螯蟹肝胰腺和鳃组织的损伤并不显著。2) PHE处理引起中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺糖原 (Gly) 以及低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 浓度显著降低，表明PHE会导致中华绒螯蟹能量代谢水平下降；相较于对照组，pH 5.5×PHE 50对甘油三酯 (TG)、Gly、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 和LDL-C浓度均有抑制效果，而pH 6.5×PHE 50使得中华绒螯蟹TG浓度较对照组显著升高。3) 实时荧光定量PCR结果表明，多环芳烃受体 (ahr)、芳香烃受体核转位因子 (arnt) 和细胞色素p450 1A1(cyp1a1) 基因的表达量均随pH的降低而升高，并在pH 5.5时达到最高。以上结果表明，酸化和PHE的联合作用改变了中华绒螯蟹的能量代谢，其中pH 5.5时显著加剧了PHE对其肝胰腺组织结构的毒性作用以及对能量代谢的影响。
Abstract:In order to explore the synergistic effects of acidification and environmental pollutant phenanthrene (PHE) on Chinese mitten crabs (Eriocheir sinensis), we carried out a 14-day joint exposure experiment of E. sinensis [(15.0±2.3) g] to different pH (5.5, 6.5, 7.8) and PHE (0, 50 µg·L−1). The results show that: 1) Under the synergistic treatment of pH 5.5×PHE 50 on E. sinensis, the hepatopancreas and gill tissues were severely damaged; the shape of the hepatopancreatic tubules changed; a large number of vacuoles appeared in the atrophy of the hepatic duct cells. The gill axis was enlarged; the cuticle of the gill filament was damaged; the local basement membrane was ruptured. However, pH 6.5×PHE 50 did not significantly damage the hepatopancreas and gill tissues of E. sinensis. 2) PHE treatment significantly reduced the contents of Gly and LDL-C in hepatopancreas of juvenile E. sinensis, indicating that PHE could decrease the energy metabolism level of E. sinensis. Compared with the control group, pH 5.5×PHE 50 inhibited the contents of TG, Gly, HDL-C and LDL-C, while pH 6.5×PHE 50 significantly increased TG content. 3) Real-time fluorescent quantitative PCR experiment shows that AHR, ARNT and CYP1A1 increased significantly with the decrease of pH, and reached the highest values at pH 5.5. The results reveal that the combining effect of acidification and PHE changes the energy metabolism of E. sinensis, and pH 5.5 significantly aggravates the toxic effect of PHE on the hepatopancreas tissue structure of E. sinensis, as well as its energy metabolism.
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Keywords:
- Eriocheir sinensis /
- Acidification /
- Phenanthrene /
- Energy metabolism
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美拉德反应 (Maillard reaction, MR)，又称“非酶棕色化反应”，主要是指羰基化合物与氨基化合物之间的复杂反应[1]。该反应不仅给食品带来特殊的色泽与风味，还产生大量抗氧化活性物质，能有效延长食品的货架期[2-3]。目前已有关于氨基酸或多肽与不同种类还原糖的美拉德反应产物的抗氧化活性和特定香料的生产研究，但美拉德反应机制尚未明确[4]。方菲等[5]研究了鲷鱼鳞多肽-木糖的美拉德反应产物的结构与抗氧化活性，表明肽链结构发生变化，形成了新的化合物，反应产物抗氧化活性显著增加，且具有多酚氧化酶抑制活性。
裂壶藻 (Schizochytrium limacinum)，又称裂殖壶菌，属单细胞海洋真菌微藻[6]。裂壶藻富含油脂，占干质量的40%以上，目前已实现工业化生产DHA藻油[7]，且异养发酵培养时绿色环保无污染。然而，裂壶藻经提取不饱和脂肪酸后会产生蛋白质含量高达干质量40%以上的藻渣，目前该藻渣大多被当作动物饲料或肥料使用，造成该蛋白资源高值化利用程度低。本实验以提取油脂后的裂壶藻渣为原料，采用复合蛋白酶对其进行水解，得到裂壶藻酶解物 (S. limacinum hydrolysate, SLH)，加入还原糖对SLH进行美拉德反应修饰，通过单因素实验探究美拉德反应条件对SLH抗氧化活性的影响，再借助超滤、葡聚糖凝胶层析色谱等技术对SLH进行逐级分离纯化，测定不同分子量的美拉德反应产物 (Maillard reaction products, MRPs) 的抗氧化能力，并分析其氨基酸组成，为进一步实现裂壶藻藻渣的高值化和资源再利用提供理论依据和思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
裂壶藻渣购自广东润科生物工程有限公司。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH, 美国Sigma公司)。复合蛋白酶、核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、盐酸、无水乙醇、铁氰化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、三氯化铁 (广州齐云生物技术有限公司)。
1.2 仪器与设备
BS224S型电子精密天平 (德国Sartorius公司)；N & DN系列 (LCD) 超声波细胞粉碎机 (宁波新芝生物科技股份有限公司)；THZ-82水浴恒温振荡器 (精达仪器制造有限公司)；UV2550型紫外可见分光光度计 (日本岛津)；SynergyH1型酶标仪 (美国伯腾仪器有限公司)；超纯水系统 (德国Milipore公司)；凝胶层析柱Sephadex G-25 (Φ=1.6 cm×78 cm, 瑞典Pharmacia)；Alpha1-4 型冷冻干燥机 (德国Christ)；Labscale TFF system小型切向流超滤系统 (德国Milipore公司)；AvantiJ26XP型高速离心机 (美国Beckman Coulter)；3K30型高速冷冻离心机 (德国Sigma公司)；AKTA purifier UPC100型蛋白质纯化系统 (美国GE Healthcare)。
1.3 方法
1.3.1 酶解产物的制备
按照高颖等[8]的方法制备SLH。称取一定质量的藻渣于烧杯中，按料水质量比1∶12加入蒸馏水，混匀，超声处理25 min (功率调至70%) 后，将pH调至7.5，按酶总量质量分数0.5%加入复合蛋白酶，于50 ℃水浴锅恒温酶解3 h。酶解完成后，将酶解液置于沸水浴中灭酶10 min，冷却后以10 000 r·min−1离心15 min，冷冻干燥上清液后所得粉末即为SLH。
1.3.2 单因素实验
采用单因素实验分别研究糖种类、糖肽质量比、反应pH、反应温度和反应时间对反应产物的影响，以MRPs褐变程度和抗氧化活性为指标，确定美拉德反应条件；选取核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和果糖作为参与美拉德反应的糖类，反应条件为糖肽质量比1∶1、pH 7.0、反应温度80 ℃、反应时间1 h，探讨单糖的种类对美拉德反应程度及其产物抗氧化活性的影响；以核糖作为美拉德反应修饰物，反应条件为pH 7.0、反应温度80 ℃、反应时间1 h，研究糖肽质量比 (1∶1、2∶1、1∶2) 对美拉德反应程度及其产物抗氧化活性的影响；以核糖作为美拉德反应修饰物，反应条件为糖肽质量比1∶1、反应温度80 ℃、反应时间1 h，研究不同反应pH (4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0) 对美拉德反应程度及其产物抗氧化活性的影响；以核糖作为美拉德反应修饰物，糖肽质量比为1∶1、pH为9.0、反应时间1 h来考察反应温度 (30、40、50、60、70、80、90、100 ℃) 对美拉德反应程度及其产物抗氧化活性的影响；以核糖作为美拉德反应修饰物，糖肽质量比1∶1、pH 9.0、反应温度100 ℃，考察反应时间 (1、2、4、6、8 h) 对美拉德反应程度和抗氧化能力的影响。
1.3.3 MRPs褐变程度的测定
美拉德反应的中间产物随反应的进行不断增加，使溶液颜色逐渐变深。将样品稀释至25~250倍，测定产物在294和420 nm处的吸光值来表示美拉德反应的程度[4]。
1.3.4 DPPH自由基清除能力
参照Zhang等[9]的测定方法加以修改。预实验以确定样品需要稀释的倍数。取0.5 mL样液于10 mL离心管中，再加入0.5 mL 2×10−4 mol·L−1的DPPH乙醇溶液，混匀后室温避光20 min，以10 000 r·min−1离心10 min，用酶标仪测定517 nm处的吸光度。DPPH自由基清除能力的计算公式为：
$$ {\rm{DPPH}}{\text{清除率}}=\left( {1-\frac{{A}_{i}-{A}_{j}}{{A}_{0}}} \right)\times 100{\text{%}} $$ (1) 式中Ai为样液与DPPH溶液混合后的吸光值；Aj为样液与乙醇混合后的吸光值；A0为不含样液的DPPH溶液的吸光值。
1.3.5 还原力
参照李瑞杰等[10]的测定方法并略作修改。取1 mL待测样液于10 mL离心管中，分别加入1 mL 0.2 mol·L−1的磷酸盐缓冲液 (pH 6.6)，1 mL质量分数1%的铁氰化钾溶液，振荡混匀后于50 ℃水浴保温20 min。取出，加入1 mL质量分数10%三氯乙酸，振荡混匀后以10 000 r·mim−1离心10 min。取1 mL上清液，加入1 mL去离子水和0.2 mL质量分数0.1%的氯化铁溶液，振荡混匀后于50 ℃保温10 min，溶液体系变为蓝色，用酶标仪于700 nm处测定吸光度。以去离子水代替样品作空白对照。
1.3.6 超滤分离
将SLH依次通过截留分子量为50、10、5 kD的超滤膜，收集过完膜的组分，得到分子量为50 kD以下、10 kD以下及5 kD以下的多肽，经冷冻干燥后于−20 ℃备用。分别比较<5 kD (SLH-1)、<10 kD (SLH-2)、<50 kD (SLH-3) 组在美拉德反应前后的DPPH自由基清除能力及还原力。其中测量DPPH清除能力所用样品质量浓度为5 mg·mL−1，还原力所用样品质量浓度为2 mg·mL−1。
1.3.7 Sephadex G-25纯化
选取SLH-1组通过Sephadex G-25凝胶柱 (Φ=1.6 cm×78 cm) 纯化，将收集到的各峰冷冻干燥，得到不同分子量的多肽，将各个峰组分进行美拉德反应，对其产物DPPH自由基清除率和还原力大小进行测定。其中测量DPPH清除能力所用样品质量浓度为5 mg·mL−1，还原力所用样品质量浓度为2 mg·mL−1。
1.3.8 氨基酸组成分析
参考国标GB 5009.124—2016进行。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 糖种类
在美拉德反应初期，氨羰缩合会产生酮、醛等无色小分子物质，这些小分子在294 nm处会有吸收，吸光值越大，中间产物越多；而美拉德反应最终产物——类黑精在420 nm检测有吸收值，吸光值越大，褐变程度越高[11]。褐变程度用来评价美拉德反应的程度。SLH与核糖的美拉德反应中间产物和终产物的含量最多，与葡萄糖、果糖反应得到的产物含量较少 (图1-a)。SLH与核糖的美拉德反应产物的抗氧化活性高于其他糖类，其还原力 (5 mg·mL−1) 和DPPH自由基清除率 (12.5 mg·mL−1) 分别为1.39和86.73% (图2-a)。还原糖的开链程度对美拉德反应进程和速率起着重要作用[12]。上述结果表明，核糖可能更易于裂解参与美拉德反应，生成更多的类黑精，增加褐变程度，从而产物抗氧化能力较高。这与其他研究结果[13-15]一致。因此，选用核糖作为与SLH进行美拉德反应的糖类。
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图 1 裂壶藻酶解物与不同糖、糖肽质量比、反应pH、反应温度和反应时间对美拉德反应产物吸光值的影响Figure 1. Effect of SLH and different sugars, mass ratio of sugar to peptide, reaction pH, reaction temperature and reaction time on absorbance of Maillard reaction products![]()
图 2 裂壶藻酶解物与不同糖、糖肽质量比、反应pH、反应温度和反应时间对美拉德反应产物其还原力与1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率的影响Figure 2. Effect of SLH and different sugars, mass ratio of sugar to peptide, reaction pH, reaction temperature and reaction time on reducing power activity and DPPH free radical scavenging rate of Maillard reaction products2.1.2 糖肽质量比
随着糖肽质量比的增加，SLH发生美拉德反应的程度和抗氧化活性均先增加后下降。糖肽质量比为1∶1时，在294和420 nm处吸光值达到最高值 (图1-b)，表明美拉德反应最强烈，此时产物的还原力为1.35，DPPH自由基清除率为86.59% (图2-b)。反应底物的用量不同会影响美拉德反应进程，适当的糖肽用量比例可以减少副反应的发生。核糖分子与SLH之间的有效碰撞随核糖浓度的升高而增加，促进美拉德反应进行。然而，随着比例继续升高，核糖分子与多肽分子会受到空间阻碍，影响了美拉德反应进程，导致各项指标降低[16]。周冬香等[17]控制L-赖氨酸与还原糖质量比分别为1∶1、2∶1和1∶2，测得质量比为1∶1的美拉德反应产物的DPPH自由基清除效果相对最好。因此，美拉德反应时，核糖与SLH的质量比为1∶1较为适宜。
2.1.3 反应pH
美拉德产物的吸光值随着pH递增而逐渐上升，当pH>9时变化趋于平缓 (图1-c)。美拉德产物的抗氧化活性随着pH的增加而增强，反应pH为10.0时还原力和DPPH自由基清除率较高 (图2-c)，说明pH为10.0时有利于美拉德反应的发生。这可能是由于氨基在酸性条件下以-NH3 +的存在阻碍了羰氨缩合，影响美拉德反应；而在碱性条件下，氨基态氮被游离出来参与反应，pH越高，越有利于美拉德反应[18]。这与康乐和宋焕禄[19]及胡礼等[20]的研究结果一致。由于pH 9.0同pH 10.0的各项指标无显著差异 (P<0.05)，因此选择反应 pH为9.0较为适宜。
2.1.4 反应温度
反应温度对美拉德反应产物的抗氧化性影响较大，随着温度的升高，美拉德反应产物的吸光值增大，反应越来越强烈，100 ℃时产物在294和420 nm的吸光值分别为0.866、0.995 (图1-d)。随着温度的升高，美拉德反应产物的抗氧化活性增强，温度到达100 ℃时，还原力达1.17，DPPH清除率为88.02% (图2-d)，表明高温有利于SLH进行美拉德反应且促进其抗氧化活性。这可能是温度的升高带来了焦糖化和美拉德反应速率的增加，使得褐变程度加深，同时也导致了肽的降解和交联发生[21]。杨璐等[22]在羊骨胶原肽与还原糖的美拉德反应体系中也发现在一定温度范围内，提升温度可使反应产物的抗氧化能力提高。因此在常压条件下，选取反应温度100 ℃较为合适。
2.1.5 反应时间
随着反应时间的延长，美拉德反应产物在294和420 nm的吸光值逐渐增加，当反应时间达6 h后吸光值变化缓慢 (图1-e)。产物的抗氧化活性随反应时间的增加而逐渐增强，反应6 h时其还原力和DPPH清除率分别为1.24 (5 mg·mL−1) 和88.62% (12.5 mg·mL−1)，继续延长反应时间其抗氧化活性变化不显著 (图2-e)。这可能是由于SLH与核糖反应产生了大量具有还原性的酮类物质，因此随着时间的延长，其反应程度、还原力及清除DPPH自由基的能力迅速提升。当达到一定时间之后反应完全，继续增加反应时间，其反应程度、还原力及清除DPPH自由基的能力不再有太大的变化[23-24]。故选择反应时间为6 h较为合适。
综上，美拉德反应的最佳条件确定为：SLH与核糖质量比为1∶1，反应pH为9.0，反应温度为100 ℃，反应时间为6 h，在此条件下的美拉德反应产物具有较好的抗氧化活性。
2.2 超滤分离
分别比较其超滤组SLH-1 (<5 kD)、SLH-2 (<10 kD)、SLH-3 (<50 kD) 在美拉德反应前后的抗氧化活性。不同分子量的各组分及其MRPs之间的抗氧化活性存在显著性差异 (P<0.05，图3-a)，其中SLH-1组及其MRPs的抗氧化活性均高于其他组。SLH-1组的美拉德反应前的还原力为0.561，DPPH自由基清除率为71.01%，其经过美拉德反应后的还原力为0.591，DPPH自由基清除率为74.81%。分析可知，裂壶藻不同分子量多肽均具有一定的抗氧化能力，小分子量的肽能更易在生物体内运转，可更有效地通过细胞膜，清除自由基，抗氧化能力更高[25]，此结论与王传幸和李国英[26]及徐浩等[27]的结果一致；美拉德反应能够提高多肽抗氧化活性，尤指低分子量多肽易于和还原糖结合[28]，与韩佳润等[29]对虾夷扇贝 (Patinopecten yessoensis) 生殖腺酶解物与核糖反应生成的MRPs的抗氧化实验的结论相似。为了获得更好的分离效果，本实验对SLH-1组继续分离纯化。
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图 3 不同超滤组分和Sephadex G-25凝胶柱层析组分的美拉德反应产物还原力和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率Figure 3. Comparison of reducing power activity and DPPH free radical scavenging rate of Maillard reaction products prepared by different ultrafiltration fractions and Sephadex G-25 gel column separated fraction2.3 Sephadex G-25分离
SLH-1组经葡聚糖凝胶分离出4个分离峰，分别记为SLH-1-I、SLH-1-II、SLH-1-III、SLH-1-IV (图4)。根据凝胶层析法原理可知组分SLH-1-I的分子量较大，SLH-1-IV的较小[30]。SLH-1-I组的抗氧化活性远高于其他3组，其对DPPH自由基的清除率为78.95%，还原力为0.715 (图3-b)。SLH-1-IV的抗氧化活性较差，其对 DPPH自由基的清除率为3.84%，还原力为0.198。经美拉德反应后，4个分离组的美拉德反应产物的抗氧化活性在一定程度上得到提升，其中SLH-1-I组的MRPs抗氧化活性最好，其对DPPH自由基的清除率达79.41%，还原力为0.741。肽的抗氧化活性与其分子量分布和氨基酸组成有关[31-32]，一般认为小分子肽的抗氧化活性要高于大分子多肽或蛋白质，但Yu等[31]发现分子量较大的大豆多肽 (1~3 kD) 抗氧化活性较高，与本结果一致。同时美拉德反应的修饰提高了抗氧化性，可能是在加热过程中生成呋喃、还原酮、吡嗪等中间产物参与反应增强了其活性。
2.4 氨基酸组成分析
裂壶藻蛋白肽经美拉德反应修饰时主要是氨基酸参与反应，这可能会导致氨基酸组成发生较大变化，通过比较美拉德反应前后的氨基酸组成可以反映出各种氨基酸参与美拉德反应的程度[33-34]。美拉德反应会导致裂壶藻蛋白肽中的酪氨酸 (Tyr)、赖氨酸 (Lys)、组氨酸 (His)、精氨酸 (Arg)、色氨酸 (Trp) 等氨基酸含量显著降低 (P<0.05，表1)，其中Arg和Lys含量降幅最大，分别减少了71.88%和70.56%，表明Arg和Lys是参与美拉德反应的主要氨基酸，这极有可能是因为在反应过程中，与核糖或其降解产物之间的相互作用 (交联) 大量消耗了体系中的氨基酸[21]。从美拉德反应前后的必需氨基酸含量来看，其含量由反应前的34.97%变为反应后的33.09%，变化不显著 (P>0.05)，表明美拉德反应并未明显降低裂壶藻蛋白肽的营养价值。
表 1 美拉德反应前后的氨基酸含量比较Table 1. Comparison of amino acid content before and after Maillard reaction氨基酸种类
Amino acid type含量 Content/% 美拉德反应前
Before Maillard reaction美拉德反应后
After Maillard reaction天冬氨酸 Asp 10.46±0.61 11.74±0.54 苏氨酸* Thr 5.12±0.30 5.77±0.38 丝氨酸 Ser 4.70±0.21 4.78±0.33 谷氨酸 Glu 20.18±2.13 24.07±2.69 脯氨酸 Pro 4.32±0.20 6.17±0.39 甘氨酸 Gly 6.22 ±0.31 6.76±0.27 丙氨酸 Ala 8.64±0.42 8.75±0.33 缬氨酸* Val 5.82±0.36 6.76±0.41 蛋氨酸* Met 2.33±0.24 2.19±0.17 异亮氨酸* Ile 4.24±0.23 4.78±0.37 亮氨酸* Leu 7.08±0.44 6.96±0.30 酪氨酸 Try 3.30±0.28 1.83±0.10 苯丙氨酸* Phe 4.21±0.32 4.78±0.29 赖氨酸* Lys 4.45±0.25 1.31±0.08 组氨酸 His 1.82±0.09 1.29±0.06 精氨酸 Arg 5.37±0.36 1.51±0.11 色氨酸* Trp 1.72±0.16 0.54±0.04 必需氨基酸
Essential amino acids34.97±2.31 33.09±2.05 注：*. 必需氨基酸Note: *. Essential amino acids 3. 结论
本研究采用单因素实验分别考察了还原糖种类、糖肽质量比、pH、反应温度和反应时间对SLH发生美拉德反应的影响。研究表明当参与反应的糖为核糖、糖肽质量比为1∶1、pH为9、反应温度为100 ℃、反应时间为6 h时，MRPs生成量较多，其还原力和DPPH清除率分别为1.24 (5 mg·mL−1) 和88.62% (12.5 mg·mL−1)。此外，采用超滤与葡聚糖凝胶柱对SLH-1超滤组进行分离纯化后发现SLH-1-I组的抗氧化活性最好，且该组的MRPs抗氧化活性也最高，其还原力 (2 mg·mL−1) 为0.741、DPPH自由基清除率 (5 mg·mL−1) 为79.41%。由于在美拉德反应过程中会产生呋喃、噻唑和噻吩等杂环类挥发性物质，SLH-1-I组的电子转移能力 (DPPH自由基清除活性) 和还原铁氰化钾的能力 (还原力) 均得到了提升。对比美拉德反应前后的氨基酸含量发现，美拉德反应导致了裂壶藻蛋白肽中的Tyr、Lys、His、Arg、Trp等氨基酸的含量降低，但对其必需氨基酸总含量的影响不大，未明显降低其营养价值。本研究结果可为裂壶藻渣蛋白资源的高值化利用以及抗氧化产品的开发提供一定参考。
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图 1 中华绒螯蟹肝胰腺和鳃组织暴露在 PHE (50 µg·L−1) 和 pH (7.8、6.5 和 5.5) 中14 d 后的病理变化
注：a. pH 7.8×PHE 50组肝胰腺；b. pH 6.5×PHE 50组肝胰腺；c. pH 5.5×PHE 50组肝胰腺；d. pH 7.8×PHE 50组鳃；e. pH 6.5×PHE 50组鳃；f. pH 5.5×PHE 50组鳃。
Figure 1. Pathological changes of hepatopancreas and gill tissues of E. sinensis after exposure to PHE (50 µg·L−1) and pH (7.8, 6.5 and 5.5) for 14 d
Note: a. Hepatopancreas in pH 7.8×PHE 50 group; b. Hepatopancreas in pH 6.5×PHE 50 group; c. Hepatopancreas in pH 5.4×PHE 50 group; d. Gill in pH 7.8×PHE 50 group; e. Gill in pH 6.5×PHE 50 group; f. Gill in pH 5.5×PHE 50 group.
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图 2 不同 pH 条件下 PHE 浓度对中华绒螯蟹能量代谢指标的影响
注：数值表示为“平均值±标准误”(n=3)；方柱上方不同大写字母表示在PHE 0 µg·L−1下差异显著 (P<0.05)；不同小写字母表示在PHE 50 µg·L−1下差异显著 (P<0.05)；*表示相同pH下组间差异显著 (P<0.05)。图3同此。
Figure 2. Effect of PHE concentration on energy metabolism indexes of E. sinensis under different acidification conditions
Note: Values are represented as Mean±SE (n=3); different uppercase letters above the columns represent significant differences at PHE 0 µg·L−1 (P<0.05); different lowercase letters represent significant differences at PHE 50 µg·L−1 (P<0.05); * represents significant differences between the two groups at the same pH values (P<0.05). The same case in Fig. 3.
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图 3 不同 pH 条件下 PHE 浓度对中华绒螯蟹肝胰腺基因表达量的影响
Figure 3. Effect of different PHE concentrations on expression of hepatopancreas genes in E. sinensis under acidification conditions
表 1 引物名称及序列
Table 1 Primer names and sequnences
基因
Gene对应蛋白
Corresponding protein引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'−3')ahr 多环芳烃受体
Polycyclic aromatic hydrocarbon receptorF: GGCGGTAACACCAGTGAAGAGTC
R: TGGAGATTGTAGGAGGCGAGAAGTarnt 芳香烃受体核转位因子 (ARNT) 重组蛋白
Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocation factor (ARNT) recombinant proteinF: CCAACCTTCATGCGGCAGATGAAC
R: ACACAGGAGCCAGCCAACCAAGcyp1a1 细胞色素
Cytochrome P1A1F: ATTTCGTGCTGGTTTGGC
R: GGAGTTGCTGCGTATTGGT
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表 2 pH 和 PHE 对中华绒螯蟹肝胰腺甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和糖原含量影响的双因素方差分析
Table 2 Two-way analysis of variance for influence of pH and PHE on contents of TG, HDL
${\text{-}} $ C, LDL${\text{-}} $ C and Gly in E. sinensis hepatopancreas能量代谢指标
Energy metabolism index处理组别
Group自由度
DF均方差
MSF P 甘油三酯 TG PHE 1 0.009 6.591 <0.001 pH 2 0.025 17.585 <0.001 PHE×pH 2 0.018 12.798 <0.001 高密度脂蛋白胆固醇 HDL-C PHE 1 0.000 2 0.301 0.593 pH 2 0.002 201.824 <0.001 PHE×pH 2 0.000 1 18.863 <0.001 低密度脂蛋白胆固醇 LDL-C PHE 1 0.000 1 9.378 0.010 pH 2 0.008 145.710 <0.001 PHE×pH 2 0.001 10.200 0.003 糖原 Gly PHE 1 0.240 39.171 0.020 pH 2 0.677 110.327 <0.001 PHE×pH 2 0.043 6.952 0.010
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表 3 pH 和 PHE 对中华绒螯蟹 ahr、 arnt、 cyp1a1 基因表达量影响的双因素方差分析
Table 3 Two-way analysis of variance for effects of pH and PHE on ahr, arnt and cyp1a1 gene expression of E. sinensis
基因
Gene处理组别
Group自由度
DF均方差
MSF P ahr PHE 1 7.889 204.860 <0.001 pH 2 7.760 208.258 <0.001 PHE×pH 2 5.111 134.930 <0.001 arnt PHE 1 8.133 314.861 <0.001 pH 2 8.276 320.375 <0.001 PHE×pH 2 5.697 220.565 <0.001 cyp1a1 PHE 1 51.122 1 643.494 <0.001 pH 2 28.965 931.189 <0.001 PHE×pH 2 4.721 151.787 <0.001
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