Synergistic effects of pH and phenanthrene on toxicity of juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis)
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摘要:
为探究酸化以及环境污染物菲 (Phenanthrene, PHE) 协同效应对中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 的影响,开展了不同pH (5.5、6.5、7.8) 和PHE质量浓度 (0、50 µg·L−1) 对中华绒螯蟹 [(15.0±2.3) g] 的联合暴露实验 (为期14 d)。结果发现:1) 中华绒螯蟹在pH 5.5×PHE 50的协同处理下,肝胰腺和鳃组织出现严重病理损伤,肝胰腺小管形状改变,肝管细胞萎缩出现大量空泡,鳃轴肿大,鳃丝角质层表皮破损,局部基膜破裂;而pH 6.5×PHE 50对中华绒螯蟹肝胰腺和鳃组织的损伤并不显著。2) PHE处理引起中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺糖原 (Gly) 以及低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 浓度显著降低,表明PHE会导致中华绒螯蟹能量代谢水平下降;相较于对照组,pH 5.5×PHE 50对甘油三酯 (TG)、Gly、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 和LDL-C浓度均有抑制效果,而pH 6.5×PHE 50使得中华绒螯蟹TG浓度较对照组显著升高。3) 实时荧光定量PCR结果表明,多环芳烃受体 (ahr)、芳香烃受体核转位因子 (arnt) 和细胞色素p450 1A1(cyp1a1) 基因的表达量均随pH的降低而升高,并在pH 5.5时达到最高。以上结果表明,酸化和PHE的联合作用改变了中华绒螯蟹的能量代谢,其中pH 5.5时显著加剧了PHE对其肝胰腺组织结构的毒性作用以及对能量代谢的影响。
Abstract:In order to explore the synergistic effects of acidification and environmental pollutant phenanthrene (PHE) on Chinese mitten crabs (Eriocheir sinensis), we carried out a 14-day joint exposure experiment of E. sinensis [(15.0±2.3) g] to different pH (5.5, 6.5, 7.8) and PHE (0, 50 µg·L−1). The results show that: 1) Under the synergistic treatment of pH 5.5×PHE 50 on E. sinensis, the hepatopancreas and gill tissues were severely damaged; the shape of the hepatopancreatic tubules changed; a large number of vacuoles appeared in the atrophy of the hepatic duct cells. The gill axis was enlarged; the cuticle of the gill filament was damaged; the local basement membrane was ruptured. However, pH 6.5×PHE 50 did not significantly damage the hepatopancreas and gill tissues of E. sinensis. 2) PHE treatment significantly reduced the contents of Gly and LDL-C in hepatopancreas of juvenile E. sinensis, indicating that PHE could decrease the energy metabolism level of E. sinensis. Compared with the control group, pH 5.5×PHE 50 inhibited the contents of TG, Gly, HDL-C and LDL-C, while pH 6.5×PHE 50 significantly increased TG content. 3) Real-time fluorescent quantitative PCR experiment shows that AHR, ARNT and CYP1A1 increased significantly with the decrease of pH, and reached the highest values at pH 5.5. The results reveal that the combining effect of acidification and PHE changes the energy metabolism of E. sinensis, and pH 5.5 significantly aggravates the toxic effect of PHE on the hepatopancreas tissue structure of E. sinensis, as well as its energy metabolism.
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Keywords:
- Eriocheir sinensis /
- Acidification /
- Phenanthrene /
- Energy metabolism
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长臀(Cranoglanis bouderius) 隶属鲇形目、长臀科、长臀属,是我国珠江水系特有的名贵经济鱼类,具有重要的开发利用价值[1],在我国被列为易危对象[2]。本研究旨在建立一套适于长臀的扩增酶切片段长度多态性(amplified fragment length polymophism,AFLP)技术体系,为进行长臀的遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、分子标记等研究奠定基础。
AFLP是ZABEAU等[3]于1993年建立的一种DNA分子标记技术。AFLP技术具有所需DNA量少,可以研究未知序列的DNA,实验结果稳定可靠,重复性强,呈典型的孟德尔遗传的特点[4]。在分子生物学及动、植物育种等领域具有广泛的应用前景,尤其是构建动、植物DNA指纹图谱具有重要价值。
1. 材料与方法
1.1 材料
实验材料长臀取自广东罗非鱼良种场,共30尾。实验鱼活体带回实验室,取全血,柠檬酸-葡萄糖抗凝剂(acid-citrate-dextrose,ACD)抗凝、-20℃保存直到DNA提取。所有引物及接头均购自上海申能博采生物工程公司,经聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE胶)纯化。所用试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 基因组DNA的制备
采用苯酚-氯仿法和试剂盒分别从血液中提取基因组DNA,经琼脂糖凝胶电泳,紫外分光光度仪检测其浓度和纯度,并调整DNA浓度至50 ng ·μL-1,4℃保存备用。
1.3 AFLP分析体系的建立
1.3.1 基因组DNA用量
采用限制性内切酶进行酶切时,在20 μL酶切体系中分别加入50、100、200、300、400 ng基因组DNA,比较不同量DNA的酶切效果。
1.3.2 Pst I单酶切
酶切和连接在同一反应中,总体积为20 μL,其中包括: 10×buffer 2 μL,Pst I 20 U,T4连接酶2U,ATP 1 mmol·L-1,BSA 2 μL,Pst I接头2 μL,基因组DNA,加水至20 μL;37℃保温1 h,20℃保温1 h,5个循环,70℃15 min灭活酶。AFLP-PCR反应25 μL反应体系中含10×buffer 2.5 μL,Mg2+ 1.5 mmol·L-1,引物2 pmol,模板10 ng,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP 200 μmol·L-1,反应条件为94℃、1 min,56℃、1 min,72℃、1.5 min,35个循环后72℃、10 min。
1.3.3 双酶切
采用EcoR I/Mse I和Pst I/Taq I 2种限制性内切酶组合进行酶切。酶切和连接分2步进行。酶切反应总体积为20 μL,其中包括: 10×buffer 2 μL,BSA 2 μL,基因组DNA,2种限制性内切酶,加水至20 μL;连接反应总体积为20 μL,其中包括10×buffer 2 μL,接头2 μL,酶切产物10 μL,T4连接酶2 U,加水至20 μL。E/M酶切反应条件是37℃、3 h,65℃、15 min灭活酶;连接反应条件是37℃、10 h,70℃、10 min灭活酶,-20℃保存。P/T酶切反应条件是65℃、2 h,加Pst I,37℃、2 h,80℃、20 min灭活酶;连接反应条件是22℃、5 h,70℃、10 min灭活酶,-20℃存。
1.3.4 预扩增
直接取连接产物1 μL预扩增,总体积20 μL,包括: 10×buffer 2 μL,dNTPs 0.4 μL,引物各0.25 μL,Taq酶0.2 μL,Mg2+ 1.5 mmol·L-1,加水至20 μL。混匀后,按如下PCR条件扩增,95℃、3 min,56℃、1 min,72℃、1.5 min,共25个循环。预扩增结束后,产物-20℃保存备用。
1.3.5 选择性扩增
将预扩增产物稀释10倍、20倍、50倍、100倍进行选择性扩增,取1 μL稀释后的预扩增混合液,加入19 μL如下反应液,dNTPs 0.4 μL;引物各0.4 μL;Taq酶0.2 μL;buffer 2 μL;Mg2+ 1.5 mmol·L-1;加水至20 μL。混匀后,按如下PCR条件扩增,95℃、3 min;94℃、1 min;65℃、30 s;72℃、1 min;每个循环退火温度降0.7℃,共12个循环;然后改为94℃、1 min;56℃、30 s;72℃、1 min,共23个循环。产物-20℃保存备用。
1.3.6 产物电泳检测
用8%的聚丙烯酰胺凝胶结合银染法检测。电泳采用300 V恒压电泳2.5 h;银染按许绍斌等[5]使用的快速银染法进行。
2. 结果与分析
2.1 模板DNA的检测
采用苯酚-氯仿抽提法和试剂盒法提取基因组DNA。从电泳结果看,所提基因组DNA主带清晰,DNA片段在23 kb以上,没有降解(图 1),基因组DNA的光密度值OD260/OD280比值在1.8左右,说明DNA纯度高,蛋白质含量极少,完全能满足AFLP分析对DNA的要求。苯酚-氯仿抽提法提取的DNA浓度差异大,产量不稳定;相比之下试剂盒法提取DNA产量稳定,浓度大,更适合用于AFLP标记分析,但是AFLP标记分析所需DNA量极少(100 ng),从减少费用考虑,苯酚-氯仿抽提法制取DNA用于AFLP标记分析也是完全可行的。
2.2 酶切
AFLP分析一般使用双酶切,即采用稀有碱基切点酶和常见碱基切点酶同时进行消化。酶切时,在20 μL酶切体系中设计基因组DNA用量梯度,比较不同量DNA的酶切效果,从电泳图谱上看,不同量DNA的酶切效果基本一致(图 2)。本试验比较了2种双酶切组合(EcoR I/Mse I、Pst I/Taq I)在长臀中的酶切效果,EcoR I/Mse I组合基因组切点数量多,酶切片段较小,主带消失,呈梯度模糊状,片段大小在50~1 200 bp之间。Pst I/Taq I组合酶切完全,片段大小在100~1 200 bp之间,2种酶切都符合AFLP对酶切片段的要求。此外,实验还进行了Pst I单酶切试验,但酶切片段较大。
图 2 DNA用量梯度EcoR I/Mse I酶切电泳图M. 100bp DNA标记(以下marker相同);1. 50 ng基因组DNA;2. 100 ng基因组DNA;3. 200 ng基因组DNA;4. 300 ng基因组DNA;5. 400 ng基因组DNAFig. 2 The electrophore tic pattern of DNA gradient reaction by EcoR I/Mse I digestionM. 100bp DNA marker (The following maker is same); 1. 50 ng gentics DNA; 2. 100 ng gentics DNA; 3. 200 ng gentics DNA; 4. 300 ng gentics DNA; 5. 400 ng gentics DNA2.3 连接
连接效率的高低主要取决于T4-DNA连接酶的用量、连接温度及连接时间。连接反应中,T4-DNA连接酶的用量以2 U为宜,连接温度一般为37℃,但也需要根据实验调整,如Pst I/Taq I酶切后,使用4 U的T4连接酶,3 h即能完成连接反应。而且,连接温度最好用22℃,过高的连接温度会延长连接时间。
2.4 扩增
AFLP分析中,双酶切使用2次扩增反应,而单酶切只需要一次扩增。在实验中双酶切时,将预扩增产物进行梯度稀释,其选择性扩增产物差别很小(图 3),因此,在实验过程中,一般稀释20倍就足以进行大量选扩。实验中Pst I单酶切长臀的电泳图谱显示单酶切的扩增片段大、数量少,且集中在凝胶的上部,因此,不适用于长臀(图 4)。在进行长臀AFLP分析时,双酶切EcoR I/Mse I、Pst I/Taq I均能得到清晰的电泳图谱(图 5、图 6)。Pst I/Taq I双酶切时,引物P+ATT/T+ACA在珠江长臀中共扩增出44条带,其中8条具有多态性,多态性检测效率为18.2%,EcoR I/Mse I双酶切时,引物E+AAG/M+CTG在珠江长臀中共扩增出64条带,其中22条具有多态性,多态性检测效率为34.3%。P+ATT/T+ACA、E+AAG/M+CTG的指纹图谱扩增带清晰可见,扩增信号强度基本一致,说明AFLP指纹图谱质量很高,从图中还可以看出,片段大小在400 bp以上多态性较丰富,片段在400 bp以下多态性较差。相对来说,Pst I/Taq I酶切扩增带信号强度和分布要好于EcoR I/Mse I双酶切,但EcoR I/Mse I双酶切的扩增条带数和多态性检出率要好。
图 3 预扩增产物梯度稀释选扩电泳图谱1. 预扩增产物稀释10倍;2. 预扩增产物稀释20倍;3. 预扩增产物稀释50倍;4. 预扩增产物稀释100倍Fig. 3 The electrophore tic pattern of gradient amplification reaction after preamplification1. 10 times diluting of production of preamplification; 2. 20 times diluting of production of preamplification; 3. 50 times diluting of production of preamplification; 4. 100 times diluting of production of preamplification3. 讨论
自1993年以来,已有许多研究者开展了AF LP技术及体系研究,但对不同物种,其AFLP关键技术参数不同,因而使用的体系不尽相同[6-10]。AFLP对DNA的质量要求较高,因而提取高纯度无污染的DNA乃是实验成功的先决条件。被污染或降解的DNA不能扩增出条带或条带可重复性差。有研究者认为,如DNA样品中含有少量RNA或蛋白质成分,不会影响扩增;但是,如其中含多糖或多酚成分,则会严重影响DNA聚合酶的活性,干扰引物与模板的结合,导致扩增失败[4]。本试验比较了苯酚-氯仿抽提法和试剂盒法提取基因组DNA。2种方法所提基因组DNA的主带清晰,DNA片段在23 kb以上,几乎没有降解,完全能满足AFLP分析对DNA的要求,但苯酚-氯仿抽提法提取的DNA浓度差异大,产量不稳定;已有研究表明,个体DNA的浓度一致性对AFLP有重要影响;模板的浓度差异过大,会导致假阳性的比例大增[11],因此,在AFLP分析中,试剂盒法更适于提取DNA。
关于酶切的内切酶酶切种类和方式。在长臀的AFLP分析体系中,本试验尝试了3种酶切方式,EcoR I/Mse I双酶切、Pst I/Taq I双酶切、Pst I单酶切。结果表明,2种双酶切组合均能得到理想的结果,而单酶切的酶切片段过大、数量少,且相对集中,因此,在长臀AFLP分析体系中是不宜采用单酶切方式的。
扩增产物的多少主要取决于待测样品基因组大小和引物3′末端选择性碱基的数目。选择性碱基数一般不超过3个,大于108 bp的基因组DNA可选用3个选择性碱基,105~106 bp的基因组DNA可选用2个选择性碱基,在此范围内每增加一个碱基可减少3/4的扩增带谱;而且随着选择性碱基数目的增加,引物与模板的错配频率也相应增加,扩增特异性下降。当选择性碱基数增加到4个时,有假带现象产生[12],如果选择性碱基数过少,扩增产物太多,则扩增条带过密不易分辨。此外,选择性碱基的组成也会影响扩增片段的数量。一般而言,选择性碱基中C、G含量越高,扩增出的产物数目越少;对富含A、T的生物体基因组来说,用富含A、T选择性碱基的引物能获得更多的扩增片段[12]。在本试验中,由于长臀基因组大小未知,选择“3+3”组合的引物扩增,扩增条带数在50条左右,对长臀的AFLP分析是适宜的。
除了以上讨论的因素外,还有许多因素会影响到试验结果。例如在酶切和连接过程中,酶切一定要彻底,连接要充分,最好将酶切与连接在PCR仪上进行,这样能够精确保温,取得满意结果;在胶的制备中,洗板要干净,涂板一定要均匀,否则胶会在洗板过程中脱落,并且制板过程中还要避免出现气泡,因为胶中的气泡会影响样品的泳动,使条带成锯齿形,影响观察;在染色过程中,AgNO3一定要充分混匀,否则胶板会出现斑点,影响照相;染色时间应掌握在10 min左右,过长会出现“白板”或板的背景过深;显影液的温度往往影响显影的效果,一般4℃左右即可,过低会使胶板显带时间延长,背景变深[13]等。
4. 结论
(1) 长臀AFLP指纹分析时,基因组DNA提取宜采用试剂盒法,如考虑到实验成本,采用苯酚-氯仿抽提法也是可行的。
(2) 连接反应中,T4-DNA连接酶的用量以2 U为宜,连接温度一般为37℃。
(3) 酶切反应应该使用双酶切,EcoR I/Mse I双酶切、Pst I/Taq I双酶切都可行;在实验过程中,一般预扩增产物稀释20倍就足以进行大量选扩;选扩首先使用Touch-down PCR,进行12个循环后,再采用常规PCR方法进行23个循环。
(4) 引物3′末端选择性碱基的数目,选择“3+3”组合对长臀的AFLP分析是适宜的。
本试验旨在建立AFLP用于长臀指纹分析的方法体系,因此,对其分析过程中DNA提取、单、双酶切、连接、预扩增、选择性扩增、银染等关键因素进行了优化,建立了长臀稳定的AFLP分析体系,为进一步进行分子标记研究如遗传多样性、遗传相似性奠定了基础。
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图 1 中华绒螯蟹肝胰腺和鳃组织暴露在 PHE (50 µg·L−1) 和 pH (7.8、6.5 和 5.5) 中14 d 后的病理变化
注:a. pH 7.8×PHE 50组肝胰腺;b. pH 6.5×PHE 50组肝胰腺;c. pH 5.5×PHE 50组肝胰腺;d. pH 7.8×PHE 50组鳃;e. pH 6.5×PHE 50组鳃;f. pH 5.5×PHE 50组鳃。
Figure 1. Pathological changes of hepatopancreas and gill tissues of E. sinensis after exposure to PHE (50 µg·L−1) and pH (7.8, 6.5 and 5.5) for 14 d
Note: a. Hepatopancreas in pH 7.8×PHE 50 group; b. Hepatopancreas in pH 6.5×PHE 50 group; c. Hepatopancreas in pH 5.4×PHE 50 group; d. Gill in pH 7.8×PHE 50 group; e. Gill in pH 6.5×PHE 50 group; f. Gill in pH 5.5×PHE 50 group.
图 2 不同 pH 条件下 PHE 浓度对中华绒螯蟹能量代谢指标的影响
注:数值表示为“平均值±标准误”(n=3);方柱上方不同大写字母表示在PHE 0 µg·L−1下差异显著 (P<0.05);不同小写字母表示在PHE 50 µg·L−1下差异显著 (P<0.05);*表示相同pH下组间差异显著 (P<0.05)。图3同此。
Figure 2. Effect of PHE concentration on energy metabolism indexes of E. sinensis under different acidification conditions
Note: Values are represented as Mean±SE (n=3); different uppercase letters above the columns represent significant differences at PHE 0 µg·L−1 (P<0.05); different lowercase letters represent significant differences at PHE 50 µg·L−1 (P<0.05); * represents significant differences between the two groups at the same pH values (P<0.05). The same case in Fig. 3.
表 1 引物名称及序列
Table 1 Primer names and sequnences
基因
Gene对应蛋白
Corresponding protein引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'−3')ahr 多环芳烃受体
Polycyclic aromatic hydrocarbon receptorF: GGCGGTAACACCAGTGAAGAGTC
R: TGGAGATTGTAGGAGGCGAGAAGTarnt 芳香烃受体核转位因子 (ARNT) 重组蛋白
Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocation factor (ARNT) recombinant proteinF: CCAACCTTCATGCGGCAGATGAAC
R: ACACAGGAGCCAGCCAACCAAGcyp1a1 细胞色素
Cytochrome P1A1F: ATTTCGTGCTGGTTTGGC
R: GGAGTTGCTGCGTATTGGT表 2 pH 和 PHE 对中华绒螯蟹肝胰腺甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和糖原含量影响的双因素方差分析
Table 2 Two-way analysis of variance for influence of pH and PHE on contents of TG, HDL
${\text{-}} $ C, LDL${\text{-}} $ C and Gly in E. sinensis hepatopancreas能量代谢指标
Energy metabolism index处理组别
Group自由度
DF均方差
MSF P 甘油三酯 TG PHE 1 0.009 6.591 <0.001 pH 2 0.025 17.585 <0.001 PHE×pH 2 0.018 12.798 <0.001 高密度脂蛋白胆固醇 HDL-C PHE 1 0.000 2 0.301 0.593 pH 2 0.002 201.824 <0.001 PHE×pH 2 0.000 1 18.863 <0.001 低密度脂蛋白胆固醇 LDL-C PHE 1 0.000 1 9.378 0.010 pH 2 0.008 145.710 <0.001 PHE×pH 2 0.001 10.200 0.003 糖原 Gly PHE 1 0.240 39.171 0.020 pH 2 0.677 110.327 <0.001 PHE×pH 2 0.043 6.952 0.010 表 3 pH 和 PHE 对中华绒螯蟹 ahr、 arnt、 cyp1a1 基因表达量影响的双因素方差分析
Table 3 Two-way analysis of variance for effects of pH and PHE on ahr, arnt and cyp1a1 gene expression of E. sinensis
基因
Gene处理组别
Group自由度
DF均方差
MSF P ahr PHE 1 7.889 204.860 <0.001 pH 2 7.760 208.258 <0.001 PHE×pH 2 5.111 134.930 <0.001 arnt PHE 1 8.133 314.861 <0.001 pH 2 8.276 320.375 <0.001 PHE×pH 2 5.697 220.565 <0.001 cyp1a1 PHE 1 51.122 1 643.494 <0.001 pH 2 28.965 931.189 <0.001 PHE×pH 2 4.721 151.787 <0.001 -
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