牡蛎诺如病毒受体类Lewis抗原合成相关基因CgFUT5的克隆与表达鉴定

桂彬彬, 曲梦, 张蔚然, 李明玉, 江艳华, 姚琳, 王联珠

桂彬彬, 曲梦, 张蔚然, 李明玉, 江艳华, 姚琳, 王联珠. 牡蛎诺如病毒受体类Lewis抗原合成相关基因CgFUT5的克隆与表达鉴定[J]. 南方水产科学, 2023, 19(6): 150-157. DOI: 10.12131/20230060
引用本文: 桂彬彬, 曲梦, 张蔚然, 李明玉, 江艳华, 姚琳, 王联珠. 牡蛎诺如病毒受体类Lewis抗原合成相关基因CgFUT5的克隆与表达鉴定[J]. 南方水产科学, 2023, 19(6): 150-157. DOI: 10.12131/20230060
GUI Binbin, QU Meng, ZHANG Weiran, LI Mingyu, JIANG Yanhua, YAO Lin, WANG Lianzhu. Cloning, expression and identification of CgFUT5 gene associated with Lewis antigen synthesis of Oyster norovirus receptors[J]. South China Fisheries Science, 2023, 19(6): 150-157. DOI: 10.12131/20230060
Citation: GUI Binbin, QU Meng, ZHANG Weiran, LI Mingyu, JIANG Yanhua, YAO Lin, WANG Lianzhu. Cloning, expression and identification of CgFUT5 gene associated with Lewis antigen synthesis of Oyster norovirus receptors[J]. South China Fisheries Science, 2023, 19(6): 150-157. DOI: 10.12131/20230060

牡蛎诺如病毒受体类Lewis抗原合成相关基因CgFUT5的克隆与表达鉴定

基金项目: 国家重点研发计划项目 (2017YFC1600703);国家自然科学基金青年科学基金项目 (31101883);中国水产科学研究院基本科研业务费专项资金 (2023TD76);国家现代农业产业技术体系 (CARS-49)
详细信息
    作者简介:

    桂彬彬 (1996—),男,硕士研究生,研究方向为水产品质量安全与标准化。E-mail: guibinbingo@163.com

    通讯作者:

    姚 琳 (1980—),男,研究员,博士,研究方向为水产品质量安全与标准化。E-mail: yaolin@ysfri.ac.cn

    王联珠 (1963—),女,研究员,研究方向为水产品质量安全与标准化。E-mail: lianzhu_wang@aliyun.com

  • 中图分类号: TS 254.7

Cloning, expression and identification of CgFUT5 gene associated with Lewis antigen synthesis of Oyster norovirus receptors

  • 摘要:

    Lewis抗原被认为是诺如病毒特异性结合受体,作为诺如病毒传播载体,牡蛎中也存在着类Lewis抗原,但牡蛎合成这种碳水化合物的途径尚未阐明。为解析牡蛎中诺如病毒受体类Lewis抗原的合成路径,利用cDNA末端快速扩增 (Rapid amplification of cDNA ends, RACE) 技术克隆得到太平洋牡蛎 (Crassostrea gigas) 的CgFUT5基因全序列并进行生物信息学分析,通过实时荧光定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR) 分析其在5种组织中的表达情况。构建原核表达质粒转化大肠杆菌 (Escherichia coli) 实现异源表达,并通过免疫印迹法 (Western blot) 鉴定免疫原性。克隆得到了具有1 173 bp开放阅读区的CgFUT5基因cDNA序列,系统发育树显示CgFUT5基因与多个物种具有合成Lewis抗原功能的岩藻糖基转移酶基因遗传学关系较近。重组CgFUT5蛋白可在大肠杆菌中过量表达,且表达的重组CgFUT5蛋白与抗人FUT5抗体及抗6×His标签抗体均能特异性结合。研究发现CgFUT5基因在牡蛎鳃组织中大量表达,CgFUT5蛋白与人FUT5蛋白具有相似的免疫原性,推测牡蛎中存在着类Lewis抗原的合成通路,并且调控牡蛎类Lewis抗原合成的基因还具有组织表达差异性。

    Abstract:

    Lewis antigen is regarded as a specific binding receptor for norovirus, and Lewis-like antigen is also present in oysters as a vehicle for norovirus transmission, but the pathway for synthesis of this carbohydrate in oysters has not been elucidated. To clarify the pathway of norovirus receptor-like Lewis antigen synthesis in oysters, we cloned the CgFUT5 gene from Pacific oyster (Crassostrea gigas) genome and analyzed the expression in five tissues. The full sequence of CgFUT5 gene was obtained by rapid amplification of cDNA ends (RACE) and bioinformatically analyzed by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). A prokaryotic expression plasmid was constructed to transform Escherichia coli for heterologous expression, and immunogenicity was identified by immunoblotting (Western blot). The cDNA sequence of CgFUT5 gene with 1 173 bp open reading region was obtained by cloning, and phylogenetic tree shows that CgFUT5 gene was genetically related to the rockweed glycosyltransferase gene that had the function of synthesizing Lewis antigen in several species. The recombinant CgFUT5 protein could be overexpressed in E. coli, and the expressed recombinant CgFUT5 protein specifically bound to both anti-human FUT5 antibody and anti-6×His tag antibody. To sum up, CgFUT5 gene was successfully cloned and found to be abundantly expressed in oyster gill tissue, and CgFUT5 protein has similar immunogenicity to human FUT5 protein. It is hypothesized that a Lewis-like antigen synthesis pathway exists in oysters, and the genes regulating Lewis-like antigen synthesis in oysters also have differential tissue expression.

  • 诺如病毒是人类所有年龄组急性肠胃炎散发和暴发的重要原因[1-3],具有高度传染性,10~100个病毒颗粒即可引发感染[3]。在进入人体后,诺如病毒会特异性地与肠道中的附着因子结合,导致胃肠炎[4]。组织血型抗原 (Histo-blood group antigcns, HBGAs) 已被确定为多种诺如病毒毒株的附着因子[5]。作为一种滤食性双壳软体动物,在被病毒污染的水体中,牡蛎体内的诺如病毒含量比环境中的高100倍,病毒进入其体内难以被清除[6-7],因此牡蛎被认为是诺如病毒的重要传播媒介[8]。多项研究指出,诺如病毒在牡蛎中的富集是由于其能与牡蛎消化道中的碳水化合物特异性结合,而这些碳水化合物具有类似于人类HBGAs的结构[9-11]。因此,有理由假设牡蛎中可能存在与人HBGAs相似的合成途径和关键基因。

    Lewis抗原作为HBGAs的一种,已经在微生物黏附和癌症转移等领域得到了深入研究[12-16],Lewis抗原在多种糖基转移酶依次催化下合成[17],根据不同岩藻糖基转移酶的底物特异性,将岩藻糖从GDP-岩藻糖转移至不同的前体寡糖上,产生不同类型的Lewis抗原。在人类基因组中,FUT5基因的转录产物是合成Lewis抗原的糖基转移酶之一,属于α-1,3/4-岩藻糖基转移酶 (α-1,3/4 fucosyl transferases, α-1,3/4 Fuc Ts)[18],同属于这一类糖基转移酶的还有FUT3、FUT4、FUT6、FUT7、FUT9、FUT10和FUT11[19-20]。FUT5偏好于在二型前体的基础上合成LeX和sLeX抗原,也有研究表明FUT5还参与合成Lea、Leb和sLea抗原[21]。Lewis抗原在诺如病毒结合过程中起重要作用,这些经岩藻糖基化产生的碳水化合物可以和人A/H型HBGAs抗原在结合诺如病毒时产生竞争性抑制[22],在对牡蛎类HBGAs的研究中也有类似发现[23]

    目前已经证实牡蛎中存在Lewis抗原,种类包括Lea、Leb、LeX和LeY[24],然而未见具体合成途径及关键基因的研究。本研究克隆了太平洋牡蛎 (Crassostrea gigas) FUT5基因,通过荧光定量法检测了太平洋牡蛎各组织中FUT5基因的表达量,探讨太平洋牡蛎FUT5基因的组织表达差异性,旨在为牡蛎富集诺如病毒的分子机理研究提供新的证据。

    鲜活太平洋牡蛎 (体长10~13 cm) 样本 (10只) 采集自青岛市黄岛区某贝类养殖场。

    取牡蛎消化腺组织,在液氮中研磨,根据试剂盒的操作说明,用动物组织RNA提取试剂盒 (天根生化科技有限公司,中国) 制备牡蛎消化腺总RNA。用1% (w) 琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。用Nano Photometer Pearl微分光光度计 (Implen,德国) 测定RNA浓度。使用SMATER RACE 5'/3' 试剂盒 (TaKaRa,中国) 对总RNA进行逆转录合成5'/3' cDNA末端 (RACE),使用Evo M-MLV Plus cDNA合成试剂盒 (艾科瑞生物工程有限公司,中国) 对总RNA逆转录合成1st Strand cDNA。

    根据NCBI公布的人 (Homo sapiens, NC_000019.10)、黑猩猩 (Pan troglodytes, NC_036898.1)、热带爪蟾 (Xenopus tropicalis, NC_030680.2)、狗 (Canis lupus familiaris, NC_051824.1) 等物种的FUT5基因序列,使用DNAMAN软件进行多序列比对,选取相似度较高的氨基酸序列在NCBI网站上公布的太平洋牡蛎全基因组中搜索比对,找到预测的太平洋牡蛎FUT5 (CgFUT5) 基因序列 (XM_020069167.2)。利用Primer 5软件设计中间片段扩增引物FT5-1和RT5-1 (表1),以太平洋牡蛎消化腺总RNA反转录合成的1st Strand cDNA为模板,扩增CgFUT5基因中间片段。PCR反应体系 (50 μL) 为:FT5-1、RT5-1 (10 μmol·L−1) 各1 μL,PCR预混液25 μL,cDNA模板3 μL,RNase free water 20 μL。反应条件为:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,48 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 5 min。PCR产物经1% (w) 琼脂糖凝胶电泳后,使用凝胶成像仪对电泳条带进行观察,选择合适条带进行切胶并送至测序公司测序。

    表  1  实验中所用引物
    Table  1.  Primers used in this experiment
    引物
    Primer
    序列 (5'—3')
    Sequence (5'−3')
    用途
    Function
    FT5-1 CCAGAGCCAAAAACCTCACTC 中间片段
    克隆
    RT5-1 TCCCAGCGAAATCTACTTCC
    RRT5 GATTACGCCAAGCTTGTAATGACTGGACACGACACTGTTCTTG RACE
    FRT5 GATTACGCCAAGCTTACGCATCTCCTGAAGAATTGGCTAAGG
    Q-FT5-A TCTGTATTCTGTAAGGCCGGAGTGG 荧光定量组
    织表达分析
    Q-RT5-A AGTTTCGGGACAATGGGATTTCTCG
    F-actin CTGTGCTACGTTGCCCTGGACTT
    R-actin TGGGCACCTGAATCGCTCGTT
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    根据中间片段克隆得到的序列,使用Primer 5软件设计RACE克隆引物FRT5/RRT5 (表1)。以SMATER RACE 5'/3' 试剂盒合成的cDNA做模板,扩增5'/3' 序列。反应体系为:RNase Free Water 15.5 μL,2×seqAmp Buffer 25 μL,SeqAmp DNA polymerase 1 μL,5'/3' RACE cDNA 2.5 μL,10×UPM 5 μL,RRT5/FRT5 1 μL。反应程序为:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,35 个循环;72 ℃ 5 min。

    将RACE PCR产物经1% (w) 琼脂糖凝胶电泳,胶回收纯化后克隆到pUC19线性载体上。将重组载体转化到TOP10感受态细胞,并进行蓝白斑筛选和PCR鉴定。选择结果良好的克隆送至测序公司测序。

    分析测序结果,将中间片段及5'、3' 序列拼接,得到完整的CgFUT5基因序列。使用Snapgene软件预测氨基酸序列并计算出分子量和等电点;运用TMHMM在线系统 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 分析蛋白质跨膜结构域;利用DNAMAN软件进行多序列比对,在MEGA 7.0软件中采用邻接法进行序列比对,构建系统发育树。

    取3只牡蛎的外套膜、鳃、闭壳肌、唇瓣和消化腺组织,在液氮中研磨混合,提取各组织总RNA,使用RT-qPCR反转录试剂盒 (TaKaRa,中国) 制备荧光定量cDNA模板。根据CgFUT5基因序列合成引物Q-FT5-A/Q-RT5-A (表1),以太平洋牡蛎β-actin基因 (NCBI网站登录号AF026063) 为内参基因,设计引物F-actin/R-actin (表1)[25-26]。通过RT-qPCR检测牡蛎外套膜、鳃、闭壳肌、唇瓣和消化腺中的CgFUT5基因表达水平,每个组织样品设置3个平行组,反应体系为: 95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s (收集荧光信号),40 个循环。组织相对表达量使用2−ΔΔCt方法计算[27]

    对前期克隆得到的CgFUT5基因序列依据大肠杆菌密码子偏好性进行稀有密码子优化,使用金斯瑞密码子优化工具 (https://www.genscript.com.cn/gensmart-free-gene-codon-optimization.html) 在线进行。优化后的基因序列在氨基酸序列C端添加6×His标签序列,克隆至pET-28a(+) 质粒,得到的重组质粒命名为pET-CgFUT5。同时构建截断N端部分氨基酸序列并添加6×His标签序列,克隆至pET-28a(+) 质粒,得到的重组质粒命名为pET-His-Δ59-CgFUT5。

    将pET-CgFUT5与pET-His-Δ59-CgFUT5质粒分别转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞,经卡那霉素筛选后挑取单菌落接种于含50 μg·mL−1卡那霉素的液体LB培养基,经36 ℃摇床过夜培养后按体积比1∶50 转移至含有卡那霉素的TB培养基中扩大培养。至菌液OD600为0.6时,加入终浓度为0.6 mmol·L−1的IPTG溶液,设置培养温度为36 ℃,培养时间为6 h。取1 mL诱导后的菌液离心并收集菌体沉淀。加入80 μL 双蒸水 (ddH2O) 重悬菌体沉淀后,加入20 μL 5×蛋白上样缓冲液吹打混匀,煮沸10 min以裂解细菌,12 000 r·min−1离心2 min,取10 μL上清液加入聚丙烯酰胺体积分数为12%的SDS-PAGE凝胶上样孔中,同时加入蛋白标准Marker、BL21空菌阴性对照和pET28a空载阴性对照组菌液。在垂直电泳仪 (百晶生物有限公司,中国) 中经120 V电压分离后,取胶块置于室温摇床中用考马斯亮蓝染色液染色1 h,再经脱色液充分脱色至蛋白条带清晰可见。

    取1 mL 成功表达CgFUT5蛋白的菌液,离心收集菌体后按体积比8∶2加入ddH2O和蛋白上样缓冲液,经煮沸离心后进行SDS-PAGE电泳,同时加入蛋白Marker和pET28a空载阴性对照菌液。电泳完成后在30 V恒定电压下转移蛋白至硝酸纤维素薄膜,置于预冷的TBS缓冲液中洗涤后,转移至含有1% (w) 牛血清白蛋白 (BSA) 的TBST缓冲液中,于4 ℃冰箱孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤过夜孵育后的硝酸纤维素薄膜3次,加入兔抗人FUT5单克隆抗体 (ABnova,中国) (使用TBST缓冲液稀释2 000倍),同时在另一组加入鼠抗6×His标签单抗体 (Abcam,中国) (使用TBST缓冲液稀释3 000倍),室温孵育2 h。孵育结束后使用TBST缓冲液洗涤薄膜3次,加入对应的二抗 (使用含1% BSA的TBST缓冲液稀释3 000倍) 室温孵育1 h,用TBST缓冲液洗涤薄膜3次。按照HRP-DAB底物显色试剂盒 (天根生化科技有限公司,中国) 说明书配制显色液,将显色液滴加于洗涤后的硝酸纤维素薄膜表面,避光放置5 min显色。

    根据设计的中间片段引物FT5-1/RT5-1,扩增得到932 bp的cDNA片段;利用3'RACE克隆扩增得到322 bp的片段,利用5'RACE克隆扩增得到417 bp的片段;将序列拼接,得到一个具有1 173 bp翻译区的完整CgFUT5基因序列,包括一个起始密码子 (ATG) 和一个终止密码子 (TAA)、一个加尾信号 (AATAAA) 以及一段由34个腺嘌呤核苷酸组成的poly(A) 结构 (图1)。

    图  1  太平洋牡蛎 FUT5 基因全长及氨基酸序列
    Figure  1.  Full length and amino acid sequence of FUT5 gene in C. gigas

    CgFUT5基因序列推导出的氨基酸序列进行分析,序列由396个氨基酸组成,经ExPASy-Compute pI-Mw tool在线预测显示该蛋白相对分子质量为46.0 kD,理论等电点为9.65,属于碱性蛋白质。利用TMHMM推算其跨膜结构域,结果显示,CgFUT5具有一个跨膜结构域,由位于7—24的18个氨基酸组成 (图2)。

    图  2  CgFUT5 蛋白跨膜结构分析
    Figure  2.  Transmembrane structure analysis of CgFUT5 protein

    从NCBI网站下载多个物种岩藻糖基转移酶蛋白质序列,构建CgFUT5基因进化树,结果显示,CgFUT5基因与秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans) FUT5 (NC_003280.10) 等具有合成Lewis抗原功能的基因聚为一类 (图3)。

    图  3  FUTs 家族系统发育树
    Figure  3.  Phylogenetic tree of FUTs family

    通过RT-qPCR分析了牡蛎5种组织中的CgFUT5基因表达量,结果表明,CgFUT5基因在各组织中的表达量差异较大,以闭壳肌中的表达量为基准,在鳃、外套膜和唇瓣中的表达量分别为44、7和3倍,而消化腺中的表达量则很低 (图4)。

    图  4  CgFUT5 基因在太平洋牡蛎 5 种组织中的相对表达量
    注:不同字母代表组间极显著性差异 (P<0.01)。
    Figure  4.  Relative expression of CgFUT5 gene in five tissues of C. gigas
    Note: Different letters represent extremely significant differences among the groups (P<0.01).

    使用SDS-PAGE电泳分析经IPTG诱导后的大肠杆菌总蛋白,结果显示,转化pET-CgFUT5质粒的重组大肠杆菌总蛋白在46 kD标准分子量大小处出现了蛋白条带,且阴性对照中无此条带,表明CgFUT5蛋白在大肠杆菌表达系统中成功表达;而转化pET-His-Δ59-CgFUT5质粒的大肠杆菌总蛋白在40 kD标准分子量处出现了蛋白条带,表明截断部分N端氨基酸序列的CgFUT5蛋白也在大肠杆菌中成功表达,且表达量明显高于未截断序列质粒的蛋白 (图5)。

    图  5  CgFUT5 重组蛋白的 SDS-PAGE 电泳分析
    Figure  5.  Analysis of recombinant protein CgFUT5 by SDS-PAGE electrophoresis

    使用鼠抗6×His标签单克隆抗体 (图6) 和兔抗人FUT5蛋白多克隆抗体 (图7) 的免疫印迹分析结果显示,在泳道2中 (目的蛋白组) 有一个约为46.0 kD的条带,而泳道1中 (pET28a空载对照组) 没有出现类似大小的条带。这一结果证实转化后的CgFUT5蛋白成功表达并被转移至硝酸纤维素薄膜,且重组CgFUT5蛋白具有与人FUT5蛋白相似的免疫原性。

    图  6  以鼠抗 6×His 标签单克隆抗体为一抗分析CgFUT5 表达蛋白
    Figure  6.  Expression of CgFUT5 protein analyzed by mouse anti-6×His labelled monoclonal antibody as primary antibody
    图  7  以兔抗人 FUT5 单克隆抗体为一抗分析CgFUT5 表达蛋白
    Figure  7.  Expression protein of CgFUT5 analyzed by rabbit anti-human FUT5 monoclonal antibody as primary antibody

    诺如病毒与牡蛎HBGAs的相互作用及结合机制是目前研究的热点[9,11],关于牡蛎组织血型抗原的合成方式和来源的研究尚处于起步阶段。通过类比人类HBGAs的合成途径,可以假设牡蛎通过与人类相似的途径合成类HBGAs,因此逐一克隆牡蛎中的关键糖基转移酶基因是验证上述假设的必要手段。

    在前期的研究中笔者团队已克隆了2个太平洋牡蛎类HBGAs合成相关的糖基转移酶基因[25,28],其中牡蛎类FUT10基因与CgFUT5基因所预测的功能类似,但是二者在牡蛎中的组织分布规律却差异明显,类FUT10基因在消化腺组织中高表达而CgFUT5基因则几乎不表达,在鳃中类FUT10基因的表达量最低而CgFUT5基因却有极高的表达量。目前在人体中已经发现13种岩藻糖基转移酶,其中FUT3、FUT4、FUT5、FUT6、FUT7、FUT9、FUT10和FUT11均属于α-1,3/4-岩藻糖基转移酶,均具有合成Lewis血型的功能[29-30],部分岩藻糖基转移酶具有相同的底物特异性,但未见关于岩藻糖基转移酶的组织特异性报道,在其他哺乳动物中也未见报道。Kiem等[31]在秀丽隐杆线虫α-1,3-岩藻糖基转移酶的研究中发现存在多种相同功能的岩藻糖基转移酶基因,其中的CEFT-1 (Caenorhabditis elegans fucosyl transferases 1) 基因也只在特定的组织或细胞内表达,推测这种表达模式或许是秀丽隐杆线虫存在多种具有相似功能的岩藻糖基转移酶基因的原因。鉴于牡蛎与秀丽隐杆线虫同属于无脊椎动物,笔者推测太平洋牡蛎中同样具有多种功能相似且底物特异性不同的岩藻糖基转移酶基因,还进化出了复杂的组织特异性表达模式。有研究表明,不同基因型的诺如病毒在牡蛎中的富集具有组织特异性,如GI型主要分布于牡蛎消化腺,GII型主要分布于鳃和外套膜,而GIII型均匀分布于牡蛎各组织中[32]。虽然诺如病毒疫情在我国未大规模暴发,但诺如病毒的区域性感染案例屡见不鲜,其中GII型诺如病毒是引发我国诺如病毒感染的优势毒株[33-36]。牡蛎消化腺组织是目前研究诺如病毒特异性富集的主要靶点,但鳃作为牡蛎的滤食器官是牡蛎接触诺如病毒的第一道屏障,同样具有富集GII型诺如病毒的特点。据此,提出了牡蛎CgFUT5基因在鳃中特异性表达并产生Lewis抗原可能与牡蛎鳃组织特异性富集GII型诺如病毒有关的假设。挖掘牡蛎类HBGAs合成路径中的糖基转移酶基因,进一步了解牡蛎类HBGAs的合成机理,将能验证这一假设,从而为食源性诺如病毒疫情防控提供新的解决方案。

    岩藻糖基转移酶广泛存在于多种动植物及细菌中,种类丰富且应用价值大,但目前成功表征的真核生物来源的岩藻糖基转移酶只有较少的一部分。真核岩藻糖基转移酶属于II型跨膜蛋白,它们具有共同的结构域特征,即具有一个跨膜结构域,其侧翼是一个短的氨基端结构域和一个大的羧基端催化结构域[37],这种特殊结构制约着岩藻糖基转移酶的异源表达与酶活表征。已有研究表明,跨膜结构域对糖基转移酶蛋白在原核或真核系统中的表达有直接影响,如可影响蛋白的可溶性、分泌性及表达量等[38-40]。母乳低聚糖的体外合成中所使用的糖基转移酶通常来自于细菌,这是因为细菌岩藻糖基转移酶不具有跨膜结构域,更容易进行大规模制备[41]。本文构建了截断跨膜域结构的CgFUT5基因原核表达质粒,证明截断后的质粒在大肠杆菌中实现了更高的表达量,不仅为CgFUT5蛋白的提纯及功能验证奠定了基础,也可为牡蛎HBGAs合成路径中的其他糖基转移酶基因的克隆表达研究提供参考。

    本研究主要对太平洋牡蛎FUT5基因进行了克隆,通过对CgFUT5重组蛋白进行免疫印迹分析,证实其具有与人FUT5蛋白相似的免疫原性,表明牡蛎中类HBGAs的合成与人HBGAs的合成路径具有相似之处,为进一步解析牡蛎特异性富集诺如病毒机理研究提供了新的证据。

  • 图  1   太平洋牡蛎 FUT5 基因全长及氨基酸序列

    Figure  1.   Full length and amino acid sequence of FUT5 gene in C. gigas

    图  2   CgFUT5 蛋白跨膜结构分析

    Figure  2.   Transmembrane structure analysis of CgFUT5 protein

    图  3   FUTs 家族系统发育树

    Figure  3.   Phylogenetic tree of FUTs family

    图  4   CgFUT5 基因在太平洋牡蛎 5 种组织中的相对表达量

    注:不同字母代表组间极显著性差异 (P<0.01)。

    Figure  4.   Relative expression of CgFUT5 gene in five tissues of C. gigas

    Note: Different letters represent extremely significant differences among the groups (P<0.01).

    图  5   CgFUT5 重组蛋白的 SDS-PAGE 电泳分析

    Figure  5.   Analysis of recombinant protein CgFUT5 by SDS-PAGE electrophoresis

    图  6   以鼠抗 6×His 标签单克隆抗体为一抗分析CgFUT5 表达蛋白

    Figure  6.   Expression of CgFUT5 protein analyzed by mouse anti-6×His labelled monoclonal antibody as primary antibody

    图  7   以兔抗人 FUT5 单克隆抗体为一抗分析CgFUT5 表达蛋白

    Figure  7.   Expression protein of CgFUT5 analyzed by rabbit anti-human FUT5 monoclonal antibody as primary antibody

    表  1   实验中所用引物

    Table  1   Primers used in this experiment

    引物
    Primer
    序列 (5'—3')
    Sequence (5'−3')
    用途
    Function
    FT5-1 CCAGAGCCAAAAACCTCACTC 中间片段
    克隆
    RT5-1 TCCCAGCGAAATCTACTTCC
    RRT5 GATTACGCCAAGCTTGTAATGACTGGACACGACACTGTTCTTG RACE
    FRT5 GATTACGCCAAGCTTACGCATCTCCTGAAGAATTGGCTAAGG
    Q-FT5-A TCTGTATTCTGTAAGGCCGGAGTGG 荧光定量组
    织表达分析
    Q-RT5-A AGTTTCGGGACAATGGGATTTCTCG
    F-actin CTGTGCTACGTTGCCCTGGACTT
    R-actin TGGGCACCTGAATCGCTCGTT
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  • 期刊类型引用(1)

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出版历程
  • 收稿日期:  2023-03-24
  • 修回日期:  2023-06-28
  • 录用日期:  2023-07-19
  • 网络出版日期:  2023-08-03
  • 刊出日期:  2023-12-04

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