Untargeted metabolomics analysis of metabolic differences of crayfish (Procambarus clarkii) meat with different diets
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摘要:
采用液相色谱-质谱联用非靶向代谢组学方法,研究了两种日粮饲喂下克氏原螯虾 (Procambarus clarkii) 肌肉代谢物的差异及变化,为提升其养殖品质提供参考。通过样本主成分分析 (Principal components analysis, PCA),并与基因组百科全书数据库 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG) 进行比对,筛选出虾肉中的差异代谢物并分析原因。结果显示:通过代谢组学分析,在正离子和负离子模式下共筛选出27种显著差异代谢物;与常规饲料相比,发酵饲料实验组中腺苷酸基琥珀酸、丝氨酸、磷酯酰胆碱、奎尼酸、补骨脂素、磷酯酰丝氨酸、谷氨酸等显著增加;经KEGG通路分析,变化显著的前4条通路分别是组氨酸代谢通路、精氨酸-脯氨酸代谢通路、蛋白质消化与吸收代谢通路和氨酰-tRNA合成通路。研究结果初步表明,日粮在调节克氏原螯虾氨基酸代谢、蛋白质合成和辅助合成氨酰-tRNA酶类等方面起积极作用。
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关键词:
- 克氏原螯虾 /
- 非靶向代谢组学 /
- 液相色谱-质谱联用技术 /
- 差异代谢通路
Abstract:To provide references for improving the quality of crayfish (Procambarus clarkii) meat, we studied the differences in muscle metabolites of crayfish fed with two diets by a non-targeted metabolomic method using liquid chromatography mass spectrometry. Different metabolites in meat were screened by principal components analysis (PCA), cluster analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analysis. The results show that 27 significantly different metabolites were screened under the positive and negative ion modes. Compared with the control group (General feed), the contents of adenylsuccinic acid, phosphatidylcholine, quinate, psoralen, phosphatidylserine and glutamic in the experimental group (Fermented feed) increased significantly. According to KEGG pathway analysis, the top four pathways with the highest concentration of metabolites were histidine metabolism pathway, arginine proline metabolism pathway, protein digestion and absorption metabolism pathway, as well as -tRNA synthesis pathway. The results indicate that diets play a positive role in regulating amino acid metabolism, protein synthesis and assisting in the synthesis of aminoacyl-tRNA enzymes in organisms.
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海湾是陆地与海域相接的半封闭海域,受陆地和人类活动影响显著,随着近年来海水养殖、海洋工程和滨海旅游等行业的发展以及城镇化的快速推进,海湾生态环境发生了显著变化[1-4]。海湾食物网结构随着生态环境的变化产生了哪些改变,其主要渔业生物营养级如何变化,尚了解不多,尤其是华南海域。华南海域生境类型多样,地形地貌、经济发展水平和海域生态环境状况差别显著。海陵湾和陵水湾是华南地区的两个重要海湾,分别位于广东西部和海南南部。近年来两个海湾的海水水质[5]、沉积物[6]和浮游生物[7]等均发生了显著变化,但关于这2个海湾食物网营养结构特征的研究仍十分欠缺,仅见于海南新村湾海草床中主要鱼类及大型无脊椎动物食物来源的研究[8]。
在食物网研究中,稳定同位素技术的使用日益普遍,根据加拿大342 种鱼的营养级分析结果[9],发现稳定同位素法得出的结果与胃含物分析法无显著差异,证明了用稳定同位素技术研究鱼类营养级的可靠性。由于碳稳定同位素比值在捕食者和食物间变化很小,平均富集0~1‰,故可用于区分食物来源和贡献量[10];氮稳定同位素比值在捕食者和食物间通常能富集3‰左右,可用来确定生物在食物网中的营养位置[11-12]。在长江口和南黄海春季拖网渔获物营养级的研究[13]中发现,生物资源种类的营养级存在空间和生物种类差异,显示出渔业生物营养级对生境差异的响应。华南典型海域主要渔业生物营养级对生境差异有哪些响应特征,有待进一步了解。本研究应用稳定同位素技术分析了华南典型海湾主要渔业生物的碳、氮稳定同位素组成和营养结构,以期能了解渔业资源群落结构和食物网对生态环境变化的响应,为科学认知人类活动影响下的海湾生态系统演化规律提供基础数据。
1. 材料与方法
1.1 样品采集
2个海湾的定点底拖网调查站位见图1。拖网船均系当地渔民渔船,网口高4 m﹑宽5 m,网囊网目3 cm×3 cm。所有渔获样品均进行现场低温冷冻保存。带回实验室后随机选取主要的渔业生物进行取样分析。
1.2 样品处理与分析
1.2.1 环境样品
现场使用5 L有机玻璃采水器采集水样,温度和盐度由YSI (556 MPS) 多参数水质测量仪测得。营养盐分析均参照Liu等[14]的方法,使用Lachat QC8500 流动注射比色法测定营养盐。
1.2.2 生物样品
鱼类样品取其背部白色肌肉,蟹类去壳取第一螯足肌肉,头足类取胴体肌肉。所有样品经冷冻干燥48 h后,研磨过筛 (80目),最后置于干燥器中保存。
所有样品的δ13C和δ15N均在中国科学院水生生物研究所分析完成。样品的稳定同位素分析仪器为Finnigan delta plus和Flash EA1112联用仪,为了保证测试结果的准确性,每测试10个样品后加测一个标准样,并且对个别样品进行2~3次的复测,样品δ13C和δ15N分析精度为±0.2‰。
碳、氮稳定同位素值计算公式:
δ=[(Rsample/Rstandard) −1]×1 000
式中δ代表碳、氮同位素 (δ13C和δ15N);Rsample表示所测样品的同位素比值 (13C/12C或15N/14N);Rstandard是国际上通用的标准物的重轻同位素丰度之比,碳稳定同位素标准物为美洲拟箭石 (PDB),氮稳定同位素标准物为大气氮。
1.3 数据分析
根据Layman等[15]提出的构建δ13C-δ15N二维坐标系来代表群落的营养生态位,本文选取6种度量参数:δ15N差值 (NR),表示营养层次和多样性水平;δ13C差值 (CR) 表示摄食来源多样性水平;总面积 (TA),表示食物网中营养多样性的总程度;平均离心距离 (CD),表示食物网中营养多样性平均水平;平均最邻近距离 (NND),表示群落的整体密度;平均最邻近距离标准差 (SDNND),表示营养生态位分布范围水平。在这6种参数中,前4种参数 (NR、CR、TA和CD) 用来反映营养结构多样性,后2种参数 (NND和SDNND) 用来研究营养冗余度。参数数值通过MATLAB软件进行计算。
2. 结果
2.1 环境特征
海陵湾水环境要素主要由丰头河的陆源冲淡水及外海水控制,其夏季平均水温略高于陵水湾 (表1),但盐度低于陵水湾。陵水湾与新村港相通,因此其水环境质量既受南海海水影响,又受新村港影响。近年来,由于陵水湾新村港内养殖面积激增,养殖污水、船坞废水及生活污水的大量排放,致海域内水质变差。陵水湾总溶解无机氮平均浓度是海陵湾的6倍多,而溶解无机磷平均浓度也是海陵湾的3倍多。
表 1 海陵湾和陵水湾海水环境参数特征Table 1. Characteristics of environmental parameters of Hailing Bay and Lingshui Bay${ {\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}}}}{\bf \pm {{SD}}}$ 参数
parameter海陵湾
Hailing Bay陵水湾
Lingshui Bay水温/℃
temperature29.71±1.20 29.61±0.83 盐度
salinity34.53±1.06 35.37±0.29 溶解无机磷/mg∙L−1
dissolved inorganic phosphorus0.005±0.001 0.016±0.006 溶解无机氮/mg∙L−1
dissolved inorganic nitrogen0.023±0.009 0.153±0.077 2.2 渔业生物碳氮稳定同位素值
海陵湾共分析了14种渔业生物的稳定同位素值 (表2),其中鱼类12种﹑蟹类2种。δ13C介于−16.41‰~−13.97‰,均值为 (−15.36±0.62)‰,其中丽叶鲹 (Alepes djedaba) 的δ13C最低,少鳞 (Sillago japonica) 的δ13C最高;δ15N变化从短尾小沙丁 (Sardinella sindensis) 的12.94‰到多齿蛇鲻 (Saurida tumbil) 的16.7‰,均值为(15.53±0.94)‰。
表 2 海陵湾主要渔业生物的稳定同位素比值 (δ13C和δ15N) 和取样体长 (L)Table 2. Stable isotope signature (δ13C and δ15N) and length (L) for major fishery species in Hailing Bay种
species碳稳定同位素/‰
δ13C氮稳定同位素/‰
δ15N长度 (L)/mm
length多齿蛇鲻 Saurida tumbil −15.35 16.70 45~278 丽叶鲹 Alepes djedaba −16.41 15.90 74~90 平鲷 Rhabdosargus sarba −15.50 15.58 95~115 细鳞䱨 Terapon jarbua −15.92 16.09 51~120 汉氏棱鳀 Thryssa hamiltonii −15.61 16.19 89~157 六指马鲅 Polydactylus sextarius −15.02 16.17 120~127 长棘鲾 Leiognathus fasciatus −14.78 15.73 58~85 少鳞 Sillago japonica −13.97 16.48 111~140 南方䲗 Callionymus meridionalis −15.32 15.29 82~98 斑头舌鳎 Cynoglossus puncticeps −15.73 15.97 92~123 短尾小沙丁 Sardinella sindensis −15.52 15.23 106~115 黄斑篮子鱼 Siganus canaliculatus −16.12 13.71 98~146 远海梭子蟹 Portunus pelagicus −14.96 13.635 13~70 红星梭子蟹 Portunus sanguinolentus −14.82 14.69 26~59 范围/‰ range −16.41~−13.97 12.94~16.7 − 平均值/‰ $ \overline X \pm {\rm{SD}} $ −15.36±0.62 15.53±0.94 − 陵水湾共分析了15种渔业生物的稳定同位素值 (表3),其中鱼类11种、蟹类2种和头足类2种。δ13C介于−19.8‰~−15.35‰,均值为 (−17.44±1.21)‰,其中黄斑篮子鱼 (Siganus canaliculatus) 的δ13C最低,锈斑蟳 (Charybdis feriatus) 的δ13C最高;δ15N介于10.91‰~15.57‰,均值为 (13.78±1.31) ‰,其中带鱼 (Trichiurus lepturus) 拥有最高的δ15N。
表 3 陵水湾主要渔业生物的稳定同位素比值 (δ13C 和 δ15N) 和取样体长 (L)Table 3. Stable isotope signature (δ13C and δ15N) and length (L) for major fishery species in Lingshui Bay种类
species碳稳定同位素/‰
δ13C氮稳定同位素/‰
δ15N长度 (L)/mm
length多齿蛇鲻 Saurida tumbil −17.44 14.63 113~215 二长棘犁齿鲷 Evynnis cardinalis −17.20 14.77 72~189 短尾大眼鲷 Priacanthus macracanthus −18.15 10.91 70~84 长尾大眼鲷 Priacanthus tayenus −16.80 14.29 132~134 竹䇲鱼 Trachurus japonicus −18.15 13.54 110~159 花斑蛇鲻 Saurida undosquamis −18.09 13.18 49~121 日本鳗鲡 Anguillidae japonica −15.60 15.14 280~322 篮圆鲹 Decapterus maruadsi −18.44 13.97 103~169 黄斑篮子鱼 Siganus canaliculatus −19.80 11.41 167~176 刺鲳 Psenopsis anomala −18.24 14.00 130~145 带鱼 Trichiurus lepturus −17.30 15.57 118~212 看守长眼蟹 Podophthalmus vigil −15.96 12.74 40~53 锈斑蟳 Charybdis feriatus −15.35 15.07 51~80 杜氏枪乌贼 Loligo duvauceli −18.31 13.74 30~200 日本无针乌贼 Sepiella japonica −16.73 13.78 34~222 范围/‰ range −19.8~−15.35 10.91~15.57 − 平均值/‰ $ \overline X \pm {\rm{SD}}$ −17.44±1.21 13.78±1.31 − 2.3 营养结构
基于δ13C-δ15N的双位图,并根据双位图计算出基于稳定同位素量化的营养结构的群落范围指标 (表4)。结果表明2个海湾的食物链长度和食物来源广泛度均不高。
表 4 典型海域食物网营养结构Table 4. Trophic structure of food web in typical sea areas区域
area年份
year总面积
TA平均离心距离
CD平均最邻近距离
NND平均最邻近距离标准差
SDNNDδ13C差值
CRδ15N差值
NR海陵湾
Hailing Bay2015 5.10 0.93 0.55 0.35 2.44 3.06 陵水湾
Lingshui Bay2015 11.18 1.49 0.60 0.54 4.45 4.66 海州湾[16]
Haizhou Bay2014 13.00 1.37 0.61 0.64 3.70 6.40 海州湾[16]
Haizhou Bay2015 7.15 1.36 0.42 0.24 1.70 6.04 南海西南陆架区[17]
southwestern continental shelf of South China Sea2013 5.8 1.0 0.37 0.43 3.4 4.3 海陵湾CR和NR分别为2.44和3.06,TA约为5.1,CD为0.93,显示出海陵湾主要渔业生物营养结构多样性较低。NND和SDNND分别为0.55和0.35,表明海陵湾食物网营养冗余较高 (图2)。
陵水湾的CR和NR分别为4.45和4.66,TA约为11.18,CD为1.49,显示出陵水湾营养结构多样性较低,但好于海陵湾。NND和SDNND分别为0.60 和0.54,表明陵水湾食物网营养冗余较高,但冗余程度低于海陵湾 (图3)。
与海州湾和南海西南陆架区相比,海陵湾和陵水湾均呈现出食物链长度不足的特征,TA、CD、NND、SDNND均相差不大,处于较低水平,说明这些海湾和近海区域均存在食物链长度不足、捕捞压力大、食物网营养结构冗余的现象 (表4)。
3. 讨论
3.1 生态环境差异和人类活动对渔业生物碳氮同位素的影响
浮游生物等基础饵料生物δ13C和δ15N的变化,通过捕食者的摄食影响到鱼类,进而传递到整个食物网[18]。许思思等[19]分析了近50年来渤海捕捞渔获物资源结构的变化特征及影响因素,指出营养盐的变化会改变浮游植物的群落结构,导致渔业资源结构的改变。陵水湾渔业生物CR高于海陵湾,可能与陵水湾物质输入导致渔业生物食物来源更广泛有关。陵水湾内存在大量的水产养殖,陆源输入营养物质也较多[20],因此陵水湾渔业生物的CR高于海陵湾,但整体CR均不高。
陵水湾渔业生物NR值和TA值都高于海陵湾,显示陵水湾较海陵湾食物链更长,多样性水平更高。以3.4‰作为一个营养级的氮稳定同位素富集度来计算,陵水湾渔业生物营养级级距仅为1.37,而海陵湾主要渔业生物营养级级距小于1,说明陵水湾和海陵湾均处于高营养级生物较少、食物网受干扰较多 (捕捞活动造成高营养级生物损失) 的状态。
3.2 主要渔业生物不同发育阶段碳氮稳定同位素值变化
渔业生物随着个体生长,食性会发生变化,渔业生物可选择和利用的食物来源更多样;摄食会趋向于高营养层次的生物,从而改变其营养级,占据更多的营养层次[21-24],如南海鸢乌贼 (Symplectoteuthis oualaniensis) δ15N随胴长增加变化显著,呈指数增长[25]。本研究中,主要渔业生物在不同发育阶段δ15N 和δ13C 发生变化。以陵水湾多齿蛇鲻和日本无针乌贼(Sepiella japonica)为例,由于取样体长有较大差异,δ15N和δ13C均随体长增加而增大,其中多齿蛇鲻和日本无针乌贼δ15N分别变化了1.42‰和2.78‰。以3.4‰作为一个营养级的氮稳定同位素富集度来计算[11],多齿蛇鲻和日本无针乌贼的营养级分别变化了0.42和0.82;而δ13C分别变化了0.19 ‰和0.86‰,表明随着多齿蛇鲻和日本无针乌贼的生长发育,其食物来源发生了改变。由此可见,陵水湾主要渔业生物在不同发育阶段食性发生变化,营养级亦随之变化。
4. 结论
海陵湾主要渔业生物的δ13C和δ15N均显著高于陵水湾,但CR和NR低于陵水湾。陵水湾渔业生物NR和TA均高于海陵湾,表明陵水湾较海陵湾食物链更长,多样性水平较高。陵水湾渔业生物营养级级距仅为1.37,而海陵湾营养级级距小于1,说明陵水湾和海陵湾均处于高营养级生物较少、食物网受干扰较多的状态。
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表 1 基础饲料组成及营养水平 (干物质基础)
Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet (Dry matter basis) %
项目
Item发酵饲料
Fermented diet常规饲料
General diet原料 Ingredient 鱼粉 Fish meal 6 16 豆粕 Soybean meal 50 12 菜籽粕 Rapeseed meal 12 15 亚麻粕 Flaxseed meal 8 0 玉米淀粉 Corn starch 8 28 小麦粉 Wheat flour 8 19 鱼油 Fish oil 5 3 豆油 Soybean oil 0 4 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 1.4 1.4 维生素① Vitamin 0.5 0.5 矿物质① Mineral 1 1 防霉剂 Mould inhibitor 0.1 0.1 合计 Total 100 100 营养水平 Nutrient Level 粗蛋白 Crude protein 32.00 32.00 粗脂肪 Crude fat 6 6 灰分 Ash 12 18 粗纤维 Crude fiber 14 8 赖氨酸 Lys 1.5 1.5 水分 Moisture 18 10 注:① 维生素和矿物质均为预混料,维生素主要含 VC、VE、VB、VD等,其他成分及含量保密。 Note: ① Vitamins and minerals are premixes, and vitamins mainly contain VC, VE, VB, VD, etc.. Other components and contents are confidential. 表 2 不同饲料对克氏原螯虾生长性能的影响
Table 2 Effect of different feeds on growth performance of crayfish
指标
Index发酵饲料组
Fermented diet (T)常规饲料组
General diet (CK)初始体质量 IBM/g 5.95±0.42a 6.15±0.51a 终末体质量 FBM/g 28.29±2.86a 28.44±2.69a 体质量增长率 WGR/% 375.46±9.21a 362.40±8.88a 特定生长率 SGR/(%·d−1) 2.59±0.12a 2.55±0.19a 注:同行数据不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)。 Note: Values with different letters within the same row are significantly different (P<0.05). 表 3 发酵饲料组和常规饲料组的显著差异代谢物列表
Table 3 List of significant different metabolites of fermented diet group and general diet group
模式
Mode差异代谢物
Differential metabolite变量投影
重要度
VIP差异倍数
FC质荷比
m/z显著性分析
P value保留时间
RT/s正离子 Positive ion 肌酸苷 Creatinine 3.41 0.32 114.06 0.0007 161.13 正离子 Positive ion 肌酸 Creatine 15.31 0.24 132.08 0.006 334.67 正离子 Positive ion 甲基组胺 Methyl-histamine 3.58 2.83 126.10 0.011 380.87 正离子 Positive ion 苦马豆素 Swainsonine 1.17 0.20 156.10 0.012 352.39 正离子 Positive ion 组氨酸 L-Histidine 7.81 0.39 156.08 0.015 441.29 正离子 Positive ion 精氨酸-谷氨酸 Arg-Glu 2.08 2.16 304.16 0.016 474.58 正离子 Positive ion 4-氨基吡啶 4-aminopyridine 2.78 2.94 95.06 0.024 377.41 正离子 Positive ion 腺苷酸琥珀酸 Adenylosuccinic acid 2.00 3.21 464.08 0.024 483.46 正离子 Positive ion 精氨酸 Arginine 24.77 0.74 175.12 0.027 507.05 正离子 Positive ion 磷脂酰胆碱 Lpc 16:0 6.96 2.01 496.34 0.029 183.71 正离子 Positive ion 戊二醛 Glutaraldehyde 1.82 0.58 83.06 0.029 350.75 正离子 Positive ion 鞘氨醇磷酰胆碱
N-oleoyl-d-erythro-sphingosylphosphorylcholine3.68 1.82 729.59 0.030 168.18 正离子 Positive ion 1-乙基-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮
2h-benzimidazol-2-one,1-ethyl-1,3-dihydro-1.52 3.13 163.09 0.048 61.25 正离子 Positive ion 组氨-丝氨酸 His-Ser 1.83 2.12 243.11 0.044 330.91 正离子 Positive ion 肌氨酸 Sarcosine 1.89 2.49 134.01 0.044 338.91 正离子 Positive ion 3'-岩藻糖基乳糖 3'-fucosyllactose 1.62 17.32 114.06 0.048 391.17 正离子 Positive ion 辅酶 I Coenzyme I 2.22 0.61 664.11 0.049 423.70 负离子 Negative ion 3,4-二氯酚 3,4-dichlorophenol 1.11 1.43 160.94 0.014 315.87 负离子 Negative ion 奎尼酸 Quinate 1.39 14.33 191.05 0.019 330.78 负离子 Negative ion 丁基磷酸 Butylphosphonic acid 1.36 2.38 275.09 0.023 448.38 负离子 Negative ion 苹果酸 Malate 6.21 1.59 133.01 0.028 394.31 负离子 Negative ion 谷氨酸 L-Glutamate 1.01 1.80 168.03 0.029 385.65 负离子 Negative ion N-乙酰蛋氨酸 N-acetyl-l-methionine 1.45 2.49 190.05 0.029 187.41 负离子 Negative ion 磷酸丝氨酸 Phosphoserine 1.71 2.15 369.02 0.042 436.39 负离子 Negative ion 补骨脂定 Psoralidin 1.03 2.15 335.08 0.043 384.21 负离子Negative ion 东革内酯 Eurycomalactone 3.80 5.22 347.17 0.047 26.15 负离子 Negative ion 亚麻木酚素 Secoisolariciresinol 1.95 5.63 361.18 0.049 25.53 -
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