Effects of tea polyphenol on tissue and cell culture of Pinctada martensii mantle
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摘要:
为改善马氏珠母贝 (Pinctada martensii) 外套膜组织和细胞体外培养的效果，探究了添加不同浓度的天然提取物茶多酚对外套膜组织和细胞培养液的优化效果。结果显示，当茶多酚的添加量为0.5%~2.0% (体积分数) 时，马氏珠母贝外套膜细胞的生物活性显著高于对照组 (P<0.05)；当添加量为1.0%时，相对细胞生物活性最高。5组完全培养液 (0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%组) 均能较好地促进细胞的生长增殖，且细胞的生长曲线均呈“S”型；当培养液中茶多酚的添加量为1.0%时，外套膜细胞增殖效果最优。研究表明，马氏珠母贝外套膜组织和细胞在最适培养液中均能大量增殖游离细胞，且正常分泌珍珠质，其中培养液中的钙离子 (Ca2+) 浓度随着组织和细胞增殖过程呈先减后增的趋势，但始终低于初始浓度。研究结果进一步优化了马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养液，为推动马氏珠母贝无核珍珠的培育提供了理论基础。
Abstract:To improve the effects of tea polyphenols on tissue and cell culture of Pinctada martensii mantle, we explored the optimization effect of adding different concentrations of natural extract tea polyphenols on the mantle tissue and cell culture medium. The results show that when the added amount of tea polyphenols was 0.5%–2.0%, the biological activity of P. martensii mantle cells was significantly higher than that of the control group, and the best added amount was 1.0%. The five groups of completely culture medium (0%, 0.5%, 1.0%, 1.5% and 2.0%) all promoted the growth and proliferation of cells, and the growth curves of the cells were all in an "S" shape. When the addition of tea polyphenols was 1%, the proliferation effect of the mantle cells was the best. The mantle tissue and cells proliferated a large number of free cells and secreted nacre normally in the optimal culture medium. The mass concentration of Ca2+ in the culture medium decreased first and then increased along with the process of tissue and cell proliferation, but was always lower than the initial concentration. The study further optimized the P. martensii mantle tissue and cell culture medium, which provides a theoretical basis for promoting the cultivation of P. martensii nuclear pearls.
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Keywords:
- Pinctada martensii /
- Tea polyphenols /
- Mantle /
- Cell culture /
- Cell activity /
- Cell proliferation
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鸢乌贼(Sthenoteuthis oualaniensis)隶属于头足纲、柔鱼科、鸢乌贼属，在印度洋、太平洋热带和亚热带海域广泛分布[1]。南海鸢乌贼资源量较丰富，声学方法评估其资源量达2.36×106 t[2]，是当前中国南海外海最具开发潜力的大洋性渔业资源之一。国内外学者对鸢乌贼的研究主要集中在日龄生长[3-4]、渔场资源状况[5-6]和种群结构[7-8]等方面。耳石是位于头足类平衡囊内的一对钙化组织，起着感应加速度和控制身体平衡的作用[9]。通过分析栖息水环境因子和耳石微量元素的关系，可以了解头足类不同物种间的生长差异[10]以及洄游、产卵[11]等生活史状况，划分种群结构[12]，进一步可以重建温度、盐度等环境因子[13]。耳石微量元素组成受栖息环境物理和化学性质的影响，例如通常情况下锶(Sr)/钙(Ca)[14]和钡(Ba)/Ca[15]与温度呈负相关，所以Sr/Ca和Ba/Ca常用作栖息环境的温度指标。目前，有关南海鸢乌贼的耳石微化学研究较少，对不同群体间的微量元素差异性分析未见报道，耳石微量元素与环境因子之间的关系尚未明确。本文通过激光剥蚀电感耦合等离子体质谱法(laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry，LA-ICP-MS)，测定南海鸢乌贼耳石微量元素的浓度、量化微量元素在耳石中的组成及在不同耳石区域中的分布、计算耳石微量元素浓度与Ca元素的比值及变化、比较不同产卵季节和地理区域鸢乌贼耳石微量元素的差异、结合微量元素与环境因子间的关系推测其栖息环境的变化，从而为更好地利用和开发南海鸢乌贼资源提供参考资料。
1. 材料与方法
1.1 材料来源
鸢乌贼样本采集时间及海区，东沙海域(2017年3—5月) 17°50'N~19°10'N、112°44'E~116°10'E；西沙海域(2017年4月) 17°20'N~17°40'N、110°50'E~111°10'E；南沙海域(2016年10—11月和2017年3—5月) 9°30'N~13°40'N、110°40'E~116°10'E (图1)。作业方式为灯光罩网，每个站位随机抽取鸢乌贼100~200尾，冷冻保存。运至实验室后进行生物学测定及相关实验处理，记录各取样站位的地理坐标和采集时间。
1.2 实验方法
样品解冻后对鸢乌贼进行生物学测定，包括胴长(mantle length，ML，精确至1 mm)、体质量(body weight，BW，精确至1 g)、性别、性成熟度等参数。中型群鸢乌贼背部具有发光器，微型群鸢乌贼背部无发光器，结合性腺发育的快慢，将鸢乌贼分成中型和微型2个种群[7]。
将耳石从平衡囊内轻轻取出，置于1.5 mL的离心管中编号，加入95%的乙醇后冷冻保存。耳石研磨的具体方法参考刘必林等[9]，共选取耳石切片103枚(东沙海域40枚、西沙海域36枚、南沙海域27枚)。耳石切片抛光后在Olympus EX51显微镜(×400)下拍照，图像经PhotoShop 5.0软件叠加处理。轮纹数由2人分别读取，计数值与均值的差值低于5%，则认为计数准确，否则再计数2次求平均值[16]。通过读取样本耳石的轮纹数，结合捕捞时间，推算孵化时间，并划分不同季节的产卵群体 (表1)。
表 1 鸢乌贼样本生物学信息Table 1. Biological information of S. oualaniensis站位
station胴长/mm
ML体质量/g
BW性成熟度
maturity stage日龄/d
age孵化时间
hatching month季节
season1 95 26 Ⅰ 56 2017.01 冬 2 121~189 67~344 Ⅱ~Ⅳ 71~125 2016.11—2017.01 秋、冬 3 89~154 18~153 Ⅱ~Ⅲ 62~80 2017.01—02 冬 4 131~175 107~256 Ⅱ~Ⅲ 77~84 2017.01 冬 5 110~139 35~104 Ⅰ~Ⅲ 69~91 2016.12—2017.01 冬 6 130~157 95~149 Ⅱ 74~90 2016.11 秋 7 122~133 63~96 Ⅰ~Ⅱ 73~84 2017.01 冬 8 112~159 53~184 Ⅰ~Ⅳ 74~119 2016.12—2017.01 冬 9 111~155 44~159 Ⅰ~Ⅲ 64~84 2017.01—02 冬 10 110~171 40~166 Ⅰ~Ⅳ 70~92 2017.01 冬 11 87~182 7~199 Ⅰ~Ⅳ 63~99 2016.12—2017.02 冬 12 80~117 16~51 Ⅱ~Ⅳ 55~68 2016.08—09 夏、秋 13 81~100 17~38 Ⅱ~Ⅲ 60~73 2016.08—09 夏、秋 14 66~92 10~24 Ⅰ~Ⅳ 52~65 2016.08 夏 15 86~110 19~48 Ⅰ~Ⅲ 66~73 2016.08 夏 16 96~112 23~43 Ⅰ~Ⅲ 69~73 2016.08 夏 17 141 128 Ⅳ 84 2017.01 冬 18 117~120 55~71 Ⅰ~Ⅱ 65~69 2017.02 冬 19 120~128 74~91 Ⅱ~Ⅲ 80~83 2016.08 夏 20 117~135 66~103 Ⅱ~Ⅳ 75~87 2016.08 夏 测定前将研磨好的耳石切片置于超声波震荡仪中清洗5 min，以清除切片上的污染物。在耳石研磨平面的核心区(N)、后核心区(PN)、暗区(DZ)、外围区(PZ)以及边缘区(EZ)分别各选取1个取样点(图2)，这些区域依次代表着鸢乌贼发育的胚胎期、幼虫期、幼年期、亚成体和成体期。耳石微量元素浓度测定在上海海洋大学元素分析实验室完成。激光剥蚀系统为NEW WAVE 213，ICP-MS为Agilent 7700x。激光能量密度16~20 MJ·cm–3，频率5 Hz，激光束斑直径40 μm。激光剥蚀过程中以氦气为载气、氩气为补偿气调节灵敏度，两者在1个T型接头中混合后进入ICP。该系统配置了1个信号平滑装置，当激光脉冲频率低达1 Hz时，采用该装置也能获得光滑的分析信号。每个数据分析的时间段包括20~30 s的空白信号和50 s的样品信号[17]。采用多外标，无内标法对元素浓度进行定量计算，对分析数据的离线处理(包括对样品和空白信号的选择、仪器灵敏度漂移校正、元素浓度)采用软件ICPMS Data Cal完成[18]。微量元素校正标准样品有NIST 610、BHVO-2G、BIR-1G和MACS-3，以上样品均为国际标准物质。测定完成后，对取样点的日龄时间段进行估算，获取不同时间段的耳石微量元素浓度。以20 d间隔为一组对鸢乌贼日龄进行划分，并在各年龄段中随机选取一定尾数的鸢乌贼分析耳石微量元素浓度与日龄间的变化趋势。
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图 2 鸢乌贼耳石微量元素采集点1~5分别代表核心、后核心区、暗区、外围区、边缘区Figure 2. Collection points in statolith of S. oualaniensis1−5. N, PN, DZ, PZ and EZ, respectively.不同水层温度和盐度数据采集仪器为RBR concert (configuration：C.T.D；depth rating：500 m；serial number：60481)，测定水深0~100 m，选取表层、50 m、100 m共3个水层，温盐数据采用入水和出水时测定的平均值(表2)。假设鸢乌贼早期主要生活在0~50 m的水层中，对应的生长阶段为胚胎期、幼虫期和幼体期，在此之后进行较远距离的垂直移动，对应的生长阶段为亚成体和成体期。分析幼虫期和幼体期耳石微量元素与0~50 m水层温度、盐度的关系以及亚成体和成体期与100 m水层温度、盐度的关系。
表 2 不同水层温度和盐度数据Table 2. Temperature and salinity data at different water layers站位
station温度/℃ temperature 盐度 salinity 表层 surface 50 m 100 m 表层 surface 50 m 100 m 2 24.5 24.3 23.9 32.8 33 33.1 3 27 25.5 22 31.8 32.3 32.9 4 27.3 24.4 23.6 31.8 33.2 33.3 5 25.3 24.3 24 32.7 33.1 33.2 7 26.3 24.8 19.7 31.7 32.5 33 8 24.9 24.1 20.5 32.2 32.5 33.2 9 26.8 24.6 19.6 32.2 33 33.3 10 26.5 25.5 20.4 32.3 32.4 33 11 26.6 25.1 20.9 32.4 32.5 32.8 1.3 数据分析
1)统计南海鸢乌贼耳石主要微量元素组成和分布，选取变异系数较小(CV)和存在差异性的微量元素进行分析。
2)利用多因素方差分析(MANOVA)分别比较南海鸢乌贼不同种群、性别及耳石区域间微量元素浓度及其与钙元素比值的差异。
3)两两比较不同产卵群体和地理区域耳石微量元素与Ca元素比值的差异。
4)分析耳石微量元素与钙元素比值和温度、盐度的关系。
5)分析软件采用SPSS 21.0。
2. 结果
2.1 耳石微量元素组成
耳石微量元素中Ca元素浓度最高[(3.77~3.94)×105 μmol·mol–1]，不同耳石区域间的Ca元素浓度无显著性差异(P>0.05)，约占元素总量的97%。其次是Sr和钠(Na)，分别约占元素总量的1.5%和1.0%。此外，依次为铁(Fe)、Ba、锰(Mn，表3)。方差分析表明，南海鸢乌贼中型群和微型群及雌雄群体间耳石微量元素组成无显著性差异(P>0.05)。不同耳石区域间除Ca、Fe元素浓度无显著性差异外(P>0.05)，其余微量元素皆存在显著性差异(P<0.01，表4)。
表 3 南海鸢乌贼耳石微量元素浓度及与钙元素比值Table 3. Element concentrations and element/Ca ratios in statoliths of S. oualaniensis元素
element元素浓度/μmol·mol−1 element concentration 元素/Ca element/Ca 范围
range均值±标准差
${\overline X}\pm{\rm{SD}}$范围
range均值±标准差
${\overline X}\pm{\rm{SD}}$钠 Na 370~5 501 4 115±474 (1~14.1)×10−3 (10.5±1.2)×10−3 锰 Mn 0.03~21.6 2.8±2 (0.08~57.3)×10−6 (7.2±5.3)×10−6 铁 Fe 2.3~189.5 39.7±31 (5.8~502)×10−6 (102±79.7)×10−6 锶 Sr 443~7 475 6 076±595 (1.2~19.1)×10−3 (15.5±1.5)×10−3 钡 Ba 2.4~30.8 6.1±2 (6.1~79.8)×10−6 (15.6±5.2)×10−6 表 4 南海鸢乌贼耳石不同区域微量元素浓度及差异Table 4. Difference of trace element concentrations at different growth zones of statoliths元素
element元素浓度/μmol·mol−1 element concentration P 核心区
N后核心区
PN暗区
DZ外围区
PZ边缘区
EZ钠 Na 2 919~4 722 2 802~5 091 2 625~5 146 2 310~5 238 370~5 501 0 锰 Mn 0.03~8.3 0.03~10.6 0.1~13.9 0.11~12.4 0.11~21.6 0 铁 Fe 2.3~151.3 9.6~164.7 12.2~159.4 12~154 9~189.5 0.1 锶 Sr 4 971~7 446 4 296~7 059 3 356~6 622 3 187~6 829 443~7 475 0 钡 Ba 3.3~10.7 2.7~11.8 2.5~18.9 2.4~9.4 2.7~30.8 0 2.2 不同耳石区域微量元素与Ca的比值
Sr/Ca在核心区最高，随后不断下降，在边缘区最低(图3-a)。核心区和后核心区Sr/Ca明显高于其他区域，不同耳石区域Sr/Ca差异显著(P<0.05)。Na/Ca先增大后减小(图3-b)，暗区最高，各相邻区域间差异极显著(P<0.01)，而核心区和边缘区差异不显著(P>0.05)。Mn/Ca在核心区最高，随后减小，外围区最低，在边缘区增大(图3-c)，核心区与后核心区和外围区差异显著，与边缘区差异不显著。Ba/Ca先减小后增大，在暗区最低，核心区与后核心区和边缘区无显著性差异(图3-d)。Fe/Ca在不同耳石区域无显著性差异(图3-e)，两两比较发现，核心区、后核心区和暗区与边缘区存在显著差异(P<0.05)。耳石微量元素Sr/Ca、Na/Ca、Mn/Ca、Ba/Ca、Fe/Ca随着鸢乌贼日龄的增加其变化趋势与耳石区域的微量元素变化较一致(图4)。
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图 3 不同耳石区域耳石微量元素与钙的比值Figure 3. Ratios of elements to Ca at different statolith zones of S. oualaniensis![]()
图 4 不同日龄阶段耳石微量元素与钙的比值Figure 4. Ratios of elements to Ca of different ages of S. oualaniensis2.3 不同产卵群体耳石微量元素与Ca的比值
不同产卵群体鸢乌贼耳石微量元素除Na/Ca和Fe/Ca有显著性差异外(P<0.01)，其余元素无显著性差异(P>0.05)。在不同耳石区域，夏季和冬季产卵群体Fe/Ca差异显著，冬季最高、秋季次之、夏季最低(图5-e)。Na/Ca先增大后减小，夏季和冬季产卵群体的Na/Ca在耳石核心区与后核心区差异性显著，其他区域差异性不显著(图5-b)。耳石微量元素Sr/Ca、Mn/Ca、Ba/Ca在不同耳石区域间不存在季节性差异(图5-a，c，d)。
2.4 不同地理区域耳石微量元素与Ca的比值
根据采样站位，将南海鸢乌贼划分为东沙、西沙和南沙3个地理群体。耳石Fe/Ca在东沙海域最高、西沙海域次之、南沙海域最低。东沙与南沙海域存在显著性差异(P<0.01)，与西沙海域不存在显著性差异；西沙和南沙海域不存在显著性差异(P>0.05)。耳石Sr/Ca、Na/Ca、Ba/Ca和Mn/Ca在不同海域间差异性不显著(图6)。
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图 6 不同地理区域耳石微量元素与钙的比值Figure 6. Ratios of elements to Ca in different geographical areas2.5 微量元素与环境因子
在0~50 m水层中，幼虫和幼体期的鸢乌贼耳石Sr/Ca与温度呈正相关、与盐度呈负相关(图7)，其余微量元素/Ca与温度、盐度无明显的相关性。线性方程为RSr/Ca=0.40T+5.86 (R2=0.50)；RSr/Ca=−0.57x+34.51 (R2=0.21)。亚成体和成体期的鸢乌贼耳石微量元素Ba/Ca与盐度有微弱的正相关性(图8)，其余元素/Ca与温度、盐度无明显的相关性。线性方程为RBa/Ca=2.65x–72.66 (R2=0.20)。
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图 7 幼体期鸢乌贼耳石微量元素比值与温度、盐度的关系Figure 7. Relationship trace element ratio and temperature and salinity of statolith of larvae![]()
图 8 成体期耳石微量元素比值与温度、盐度的关系Figure 8. Relationship among trace element ratio and temperature and salinity of statolith of adult3. 讨论
3.1 不同耳石区域微量元素分析
鸢乌贼耳石微结构一般划分为核心区、后核心区、暗区和外围区[19]。这些生长区对应着不同的个体发育阶段，其中耳石零轮以内的为核心区，代表胚胎期，后核心区代表幼虫期，暗区代表幼年期，外围区则代表亚成体和成体期[20]。耳石核心区的微量元素浓度与其他区域有很大差别。Yatsu等[21]研究认为头足类Sr/Ca在胚胎期可能受到不同方式的影响，在胚胎期，由于胚胎外膜的保护，卵内的发育环境与外界的水环境隔离开，其营养物质主要来源于自身携带的卵黄囊。Bustamante等[22]研究表明墨鱼(Sepia officinalis)卵外的保护膜可以使胚胎免受痕量金属如锌(Zn)和镉(Cd)的影响。分析卵黄囊以及卵内液体的微量元素组成，可以进一步了解耳石核心区微量元素与它们之间的关系。Sr元素在耳石微量元素中的浓度仅次于Ca元素，是耳石发育过程中不可或缺的元素之一，在头足类的耳石生物矿化过程中扮演着重要的角色[13]。南海鸢乌贼耳石Sr/Ca在核心区最高，随后逐渐降低，在边缘区最低，Na/Ca在暗区最高，呈倒置“U”型分布，Ba/Ca在暗区最低，呈“U”型分布。哥斯达黎加外海茎柔鱼不同耳石区域的微量元素均值变化与本研究相同[17]，而迪斯科湾黵乌贼(Gonatus fabricii)[23]和北太平洋柔鱼(Ommastrephes bartrami)[21]核心区至外围区耳石Sr/Ca均值呈“U”型分布。南海鸢乌贼Mn/Ca核心区最高，随后逐渐降低，在边缘区增大。智利外海茎柔鱼耳石Mn/Ca从核心到外围区先减少后增加[24]，而迪斯科湾黵乌贼耳石Mn/Ca呈倒“U”型分布[23]。Arkhipkin等[25]分析认为Mn/Ca产生差异的原因可能来源于物种特定的吸收机制或仪器误差，而非环境因素，并观察发现随着鱿鱼胴长的增加，Mn/Ca减小，本研究中Mn/Ca随着个体日龄的增加整体呈减小趋势。
3.2 不同群体耳石微量元素分析
3个产卵群体中，耳石核心区、后核心区和暗区的Sr/Ca几乎相同，在外围区及边缘区出现微小的变化，外围区夏季群体Sr/Ca较高，而在边缘区最低。虽然Sr/Ca在不同产卵群体中无显著差异，但是可以得出鸢乌贼在亚成体和成体期经历了不同的水环境变化，因为此时的鸢乌贼具有较强的游泳能力。
南海鸢乌贼耳石Na/Ca为(10.5±1.2)×10–3、茎柔鱼Na/Ca为(8.6~12.8)×10–3 [26]，两者相近，低于迪斯科湾黵乌贼 [(15~22)×10–3] [23]。耳石Na/Ca先增大后减小，在幼体期到成体期不断下降，在耳石核心区和后核心区，Na/Ca在夏季和冬季产卵群体中差异显著，可用于不同产卵群体的划分。而Liu等[26]分析认为茎柔鱼Na/Ca在不同产卵群体中无显著性差异，不能用于产卵群体的划分。
Ba/Ca在不同产卵群体中无显著性差异。而Fe元素是海洋初级生产力高低的主要限制因子[27]。徐红云[28]研究表明南海北部海域海洋净初级生产力由北向南递减，在南部海域沿海区域较高，而在南部深水海盆存在低值中心。由此判断东沙海域的净初级生产力高于西沙海域、南沙海域较低，与耳石Fe/Ca在东沙海域最高、西沙海域次之、南沙海域最低相对应。Fe/Ca在不同群体中存在显著性差异，因此可用于南海鸢乌贼不同群体的划分。
3.3 耳石微量元素与环境因子的关系
本研究表明南海海域鸢乌贼幼体期耳石Sr/Ca与温度呈正相关、与盐度呈负相关，但鸢乌贼成体期耳石Sr/Ca与温度和盐度均无相关性。耳石Sr/Ca在胚胎期最高，随后逐渐降低，这与鸢乌贼早期生活在海洋表层，随着个体发育和游泳能力的增强，不断向海洋水层下方移动相对应。成体期的柔鱼类昼夜垂直移动，白天生活在深层冷水区、晚上在表层暖水区活动，生活环境的温度变化较大[17]。南海鸢乌贼耳石Sr/Ca在不同地理区域差异不显著，可以排除水平迁移带来的环境变化。鸢乌贼的昼夜垂直移动可能是导致成体期耳石Sr/Ca与温度无相关性的原因。所以，鸢乌贼幼体期耳石Sr/Ca浓度可以作为温度的指示剂。而随着海水深度的增加，盐度也在增加，鸢乌贼幼体期耳石Sr/Ca与盐度存在微弱的负相关性，进一步佐证了鸢乌贼早期生活阶段栖息环境的变化。
Ba浓度随着海水深度增加而升高[23]，南海鸢乌贼耳石Ba/Ca在成体期与盐度呈弱相关，而深水层的盐度值高，可以推断鸢乌贼成体期生活在较深的海域。南海鸢乌贼耳石Ba/Ca在幼体期最低，成体期最高，这与幼体生活在海洋表层、成体生活在深水层相对应。因而，可以把Ba/Ca作为头足类垂直移动的有效指标。
致谢：中国水产科学研究院南海水产研究所江艳娥在耳石提取方面给予的指导，钟智辉和陈盟基等在样品采集方面提供的帮助，徐亮、王守信和柯兰香等在实验过程中的协作，广东海洋大学侯刚老师在论文写作方面给予的启发和建议，谨此致谢！
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图 1 不同浓度的茶多酚对外套膜细胞活性的影响
注：不同字母间存在显著性差异 (P<0.05)。
Figure 1. Effects of different concentrations of tea polyphenols on cell activity of P. fucata
Note: Different letters indicate significant differences (P<0.05).
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图 3 马氏珠母贝外套膜上皮细胞培养观察 (400×)
注：a. 培养第5天的细胞； b. 培养第10天的细胞；c. 培养第15天的细胞； d. 培养第20天的细胞；e. 培养第25天的细胞；f. 培养第30天的细胞。
Figure 3. Observation on cells of P. fucata mantle (400×)
Note: a. Cell cultured on Day 5; b. Cell cultured on Day 10; c. Cell cultured on Day 15; d. Cell cultured on Day 20; e. Cell cultured on Day 25; f. Cell cultured on Day 30.
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图 4 马氏珠母贝外套膜组织培养观察 (400×)
注：a. 培养第5天的组织；b. 培养第10天的组织；c. 培养第15天的组织；d. 培养第20天的组织；e. 培养第25天的组织；f. 培养第30天的组织。
Figure 4. Observation on tissue of P. fucata mantle (400×)
Note: a. Tissue cultured on Day 5; b. Tissue cultured for on Day 10; c. Tissue cultured on Day 15; d. Tissue cultured on Day 20; e. Tissue cultured on Day 25; f. Tissue cultured on Day 30.
表 1 马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养液中的Ca2+质量浓度变化
Table 1 Change of Ca2+ mass concentration in mantle tissue and cell culture medium of P. fucata
培养时间
Culture time/d组织培养
Tissue culture/(mg·L−1)细胞培养
Cell culture/(mg·L−1)0 200.00±0.00a 200.00±0.00a 5 186.60±5.37bd 168.22±7.24b 10 163.58±8.40c 148.98±6.58c 15 178.73±9.35d 159.54±8.95d 20 188.35±8.78be 179.43±9.63e 25 196.11±6.10ae 183.42±4.42e 注：同列中不同字母间存在显著性差异 (P<0.05)。 Note: Different letters indicate significant differences (P<0.05). 
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