Identification and evolutionary analysis of genome of oyster-associated Microviridae
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摘要:
具有滤食习性的牡蛎富集了水体中包括病毒在内的大量病原体，是一个极具价值的病毒库。为了对牡蛎相关的病毒库进行深入研究，在前期对华南沿海多地采集的香港牡蛎 (Crassostrea hongkongensis) 进行病毒组测序，并对测序数据进行质控、组装及物种注释后，挑选其中5条被鉴定为微病毒科 (Microviridae) 的基因组序列进行多维度分析，包括宿主预测、开放阅读框预测、主要衣壳蛋白系统发育与三维结构预测、主要衣壳蛋白与外部支架蛋白的进化关联以及病毒丰度分析等。结果显示，5个病毒的宿主均为埃希氏菌属 (Escherichia)；其中病毒基因组序列HSd1-5344568聚类在Bullavirinae分支中，说明其为该亚科成员；其余4条未聚类到任何已知亚科中，应属于一个单独的未分类亚科；微病毒主要衣壳蛋白和外部支架蛋白的进化树之间的联系表明两个蛋白的进化规律不同。
Abstract:Oysters with filter feeding habits enrich a large number of pathogens including viruses in water, like a very valuable virus bank. To conduct an in-depth research on oyster-related viruses, we sequeced the Hong Kong oyster (Crassostrea hongkongensis) collected along the South China coast. After the quality control, assembly and taxonomy annotation of the sequencing data, we selected five genomic sequences which were identified as Microviridae for multi-dimensional analyses, such as host prediction, open reading frame and gene function prediction, phylogeny and three-dimensional structure prediction of major capsid proteins, evolutionary association between major capsid proteins and external scaffold proteins, as well as virus abundance analysis. The results show that the hosts of the five viruses were all Escherichia; one of the virus genome sequences was clustered in Bullavirinae branch, which indicates that it is a member of the subfamily; the other four genome sequences were not clustered into any known subfamilies so they should belong to a single unclassified subfamily; the relationship between the evolutionary tree of the main capsid proteins and external scaffold proteins indicates that the evolution rules of the two proteins were different.
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中国是全球最大的水产养殖产品生产国和出口国[1]。当前，中国水产养殖产业正逐步向生态集约化养殖模式转型[2]。陆基循环水养殖模式因其安装灵活、占地面积小以及产出高效等优势，于2021年被农业农村部列为重大引领性技术之一[3]。该模式为鱼类规模化养殖提供了新思路，对产业结构调整具重要意义。目前，已在大口黑鲈 (Micropterus salmoides)[4]、杂交鳢[5]、赤眼鳟 (Squaliobarbus curriculus)[6]、黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco)[7] 等多种鱼类中成功应用陆基循环水养殖模式。但现有的研究主要集中在系统构建和运行管理等方面，有关养殖技术的深入探讨仍较有限。
养殖密度是水产养殖中的关键因素，直接影响鱼类的生长速度、健康状况及养殖经济效益。提高养殖密度被认为是提高鱼产量的重要手段之一[8]。但在集约化养殖中，追求养殖效益的同时，养殖密度的增加通常会对养殖鱼类的生长性能产生不利影响，这与养殖鱼类对生存空间的竞争加剧以及水质恶化等因素密切相关[9-11]。研究发现，在团头鲂 (Megalobrama amblycephala)[12]、尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus)[13]、大西洋白姑鱼 (Argyrosomus regius)[14]、银鲳 (Pampus argenteus)[15] 等鱼类中，养殖密度与其生长性能存在显著相关性。血清生理生化指标可直观地反映机体在应对不同养殖密度时的能量代谢、健康状况和对环境的适应能力[16]。不适宜的养殖密度会导致鱼类产生应激反应，表现出血清葡萄糖 (GLU)、总胆固醇 (TC) 显著降低，皮质醇显著增加[12,17]。鱼类在应对拥挤胁迫时，可通过改变抗氧化酶如超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 的活性来应对机体的氧化损伤[18-19]。此外，Liu等[20] 和Adineh等[21] 研究发现，拥挤胁迫导致尼罗罗非鱼、鲤 (Cyprinus carpio) 的消化酶活性显著下降。因此，探究陆基循环水养殖模式中养殖密度对鱼类生长性能、血清生理生化、抗氧化及消化能力的影响具有重要意义。
瓦氏黄颡鱼 (P. vachelli) 隶属鲇形目、鲿科、黄颡鱼属，是黄颡鱼属鱼类中个体最大的种类，为中国特有种，广泛分布于长江流域。瓦氏黄颡鱼作为长江特色土著鱼类，具有生长速度快、易驯养、肉味鲜美、肌间刺少、抗病力强等优点，是一个极具发展前景的养殖品种[22]。瓦氏黄颡鱼具有一定天然产量，但呈下降趋势，而其市场需求日渐增大，因此瓦氏黄颡鱼的规模化人工养殖极具发展前景和市场潜力[23]。目前，有关瓦氏黄颡鱼的报道主要集中在繁殖[22]、遗传[23-25]、免疫[26-27]、生长及生化[11,28-29] 等方面，而关于其陆基循环水养殖模式下的养殖技术探究却鲜有报道。基于此，本研究探讨了陆基循环水养殖系统中瓦氏黄颡鱼幼鱼生长、血清生化、抗氧化和消化能力对养殖密度的响应，以期为瓦氏黄颡鱼幼鱼放养密度设置和健康养殖管理提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验条件和实验设计
本研究于2023年9—11月在中国水产科学研究院长江水产研究所梁子湖试验场进行。实验鱼初始体质量为 (5.84±0.15) g，实验前所有实验鱼暂养于陆基循环水系统的养殖桶中。该养殖系统依据试验场原有养殖池塘改造而来，养殖池塘面积为666.7 m2，改造为水处理区域，由菌藻区、过滤坝、生态净化区组成。在池塘田埂处架设9个养殖桶作为养殖区域，养殖桶的排放水经水处理区域处理后循环使用。养殖桶直径2 m，高1 m，进水后，维持水深0.8 m。在前期工作基础上，本研究设置3个密度组：低密度组 (LD：2.03±0.09 kg·m−3，即850 尾·桶−1)、中密度组 (MD：3.49±0.37 kg·m−3，即1 500 尾·桶−1) 和高密度组 (HD：5.03±0.11 kg·m−3，即2 200 尾·桶−1)。实验鱼暂养2周后，根据养殖密度对每个养殖桶实验鱼数量进行调整，每个密度组3个重复。暂养期间自然水温 (14~26 ℃) 和自然光周期。实验期间，养殖水体溶解氧质量浓度>5 mg·L−1，pH (7.84±0.11)，氨氮 (0.14±0.02) mg·L−1，亚硝酸盐 (0.02±0.00) mg·L−1。
实验鱼投喂人工配合饲料 (质量分数：粗蛋白≥40%、粗脂肪≥3%、粗纤维≤5%、粗灰分≤17%)，每日8:00和16:00各投喂1次，控制日投喂量为鱼体质量的1.5%~3.0%，具体视水温、鱼摄食情况进行调整。投食2 h后，收集残饵，并做好统计工作。实验为期8周，每周测量1次实验鱼生长情况 (全长、体长、体质量)。
1.2 样品采集
养殖结束时，实验鱼禁食24 h后采集样本。实验鱼使用100 mg·L−1 MS-222麻醉，进行尾静脉采血后，解剖取其肝脏、肌肉样品，冻存待测。血液样品4 ℃静置过夜后，12 000 r·min−1 离心10 min，取上层血清，冷冻待测。每个实验组采集10个样本，每个血液样品使用4~5尾实验鱼血液混合，肝脏、肌肉样品未采集混样。
1.3 指标的测定与计算
1.3.1 生长性能和生长离散情况的指标计算
生长性能评估采用成活率 (Rs)、体质量增长率 (Weight gain rate, RWGR)、体质量特定生长率 (Body mass specific growth rate, RSGR,m)、体质量日增长 (Average daily gain, RADG)、增长率 (Length gain rate, RLGR)、饲料系数 (Feed conversion ratio, RFCR) 和变异系数 (Coefficient variation, RCV)等指标。生长离散情况评估采用体长和体质量变异系数。计算公式分别为：
$$ \mathit{R} _{ \mathrm{s}} \mathrm{=(} \mathit{S} _{ \mathit{t} } \mathrm{/} \mathit{S} _{ \mathrm{0}} \mathrm{)\times 100{\text{%}} } $$ (1) $$ \mathit{R} _{ \mathrm{WGR}} \mathrm{=[(} \mathit{W} _{ \mathit{t} } {\text{−}} \mathit{W} _{ \mathrm{0}} \mathrm{)/} \mathit{W} _{ \mathrm{0}} \mathrm{]\times 100{\text{%}} } $$ (2) $$ \mathit{R} _{ \mathrm{SGR,m}} \mathrm{=[(ln} \mathit{W} _{ \mathit{t} }{\text{−}}\mathrm{ln} \mathit{W} _{ \mathrm{0}} \mathrm{)/} \mathit{t} \mathrm{]\times 100{\text{%}} } $$ (3) $$ \mathit{R} _{ \mathrm{ADG}} \mathrm{=[(} \mathit{W} _{ \mathit{t} } {\text{−}} \mathit{W} _{ \mathrm{0}} \mathrm{)/} \mathit{t} \mathrm{]\times 100{\text{%}} } $$ (4) $$ \mathit{R} _{ \mathrm{LGR}} \mathrm{=(} \mathit{L} _{ \mathrm{2}} {\text{−}}\mathit{L} _{ \mathrm{1}} \mathrm{)/} \mathit{L} _{ \mathrm{1}} \mathrm{\times 100{\text{%}} } $$ (5) $$ \mathit{R} _{ \mathrm{FCR}} \mathrm= \mathit{F} \mathrm{/(} \mathit{W} _{ \mathit{t} } {\text{−}}\mathit{W} _{ \mathrm{0}} \mathrm{)} $$ (6) $$ \mathit{R} \mathrm{cv=} \mathit{S} \mathrm{/} \mathit{X} \mathrm{\times 100{\text{%}} } $$ (7) 式中：St表示养殖t时间时成活尾数 (尾)；S0表示实验开始时放养尾数 (尾)；Wt表示养殖t时间的体质量 (总质量，g)；W0表示放养时的体质量 (总质量，g)；L1表示实验开始时鱼的体长 (cm)；L2表示养殖t时间时鱼的体长 (cm)；F表示各实验组养殖t时间鱼摄入的饲料总质量 (g)；S表示体长或体质量的标准差；X表示体长或体质量的均值。
1.3.2 生化指标测定
各指标均使用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。皮质醇使用酶联免疫法测定，溶菌酶 (LZM) 使用比浊法测定，GLU使用葡萄糖氧化酶法测定，TC使用COD-PAP法测定，甘油三酯 (TG) 使用GPO-PAP酶法测定。SOD使用WST-1法测定，CAT使用钼酸铵法测定，GSH-Px使用比色法测定，丙二醛 (MDA) 使用TBA法测定。淀粉酶 (AMS) 活性使用淀粉-碘比色法测定，胰蛋白酶 (Trypsin) 活性使用紫外比色法测定，脂肪酶 (LPS) 活性使用甲基试卤灵底物法测定。
1.4 数据分析
数据均采用“平均值±标准误 ($\overline { x}\pm s_{\overline{x}} $)”表示。经方差齐性检验后，使用单因素方差分析(One-way ANOVA) 和Duncan’s多重比较检验组间差异。显著性水平α设为0.05。
2. 结果
2.1 生长性能和生长离散情况
如表1所示，3个实验组成活率均达到97%以上，MD组的增长率显著高于其他组 (p<0.05)，饲料系数低于其他组。养殖密度对特定生长率和体质量增长率虽无显著性影响 (p>0.05)，但MD组明显高于其他组，表现出更好的生长性能。表2所示，不同密度组瓦氏黄颡鱼的体长、体质量变异系数无显著性变化 (p>0.05)，但最低值均出现在MD组，表明MD组瓦氏黄颡鱼生长离散情况较好，规格较均匀。
表 1 瓦氏黄颡鱼幼鱼的生长性能Table 1. Growth performance of P. vachelli juvenile指标
Item低密度组
Low density group (LD)中密度组
Medium density group (MD)高密度组
High density group (HD)均值
Mean初始体质量Initial body mass/g 5.91±0.46 5.78±0.30 5.86±0.31 5.85±0.18 终末体质量Final body mass/g 9.52±0.31 10.54±0.52 9.90±0.19 9.99±0.24 初始体长Initial length/cm 7.17±0.18 7.07±0.15 7.25±0.07 7.16±0.08 终末体长Final length/cm 8.29±0.09 8.55±0.13 8.44±0.10 8.43±0.07 成活率Survival rate/% 97.22±0.31 97.69±0.92 97.49±0.46 97.47±0.32 特定生长率Specific growth rate/(%·d–1) 0.86±0.08 1.07±0.05 0.94±0.08 0.96±0.05 体质量增长率Body mass gain rate /% 62.36±7.13 82.71±5.10 69.65±7.89 71.57±4.52 体质量日增长Daily body mass gain/(g·d–1) 0.06±0.00b 0.09±0.01a 0.07±0.00ab 0.07±0.00 增长率Length gain rate/% 15.83±1.76b 20.91±0.81a 16.46±1.02b 17.73±1.02 饲料系数Food coefficient 1.76±0.09a 1.25±0.06b 1.43±0.09b 1.48±0.09 注：同行中不同字母间存在显著性差异 (p<0.05)。 Note: Values with different letters within the same row represent significant differences (p<0.05). 表 2 瓦氏黄颡鱼幼鱼体长、体质量变异系数Table 2. Variation coefficients of final body length and body mass of P. vachelli juvenile指标
Item低密度组
Low density group (LD)中密度组
Medium density group (MD)高密度组
High density group (HD)体长变异系数
Coefficient of variation in body length8.94±0.66 6.81±0.72 7.98±1.05 体质量变异系数
Coefficient of variation in body mass27.34±2.72 19.53±1.42 20.51±3.41 2.2 血清生化指标
如图1所示，血清GLU浓度随着养殖密度的增加呈上升趋势；TG浓度随着养殖密度的增加呈下降趋势；LD组的TC浓度显著高于其他组 (p<0.05)。
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图 1 不同养殖密度对血清中葡萄糖、甘油三酯和总胆固醇水平的影响注：不同小写字母表示实验组间差异显著 (p<0.05)。Figure 1. Effects of different stocking densities on glucose, triglycerides and cholesterol in serumNote: Different lowercase letters represent significant differences among the experimental groups (p<0.05).如图2所示，LZM活性随着养殖密度的增加呈下降趋势 (p<0.05)，而养殖密度对皮质醇水平无显著性影响 (p>0.05)。
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图 2 不同养殖密度对溶菌酶和皮质醇水平的影响注：不同小写字母表示实验组间差异显著(p<0.05)。Figure 2. Effects of different stocking densities on lysozyme and cortisol levelsNote: Different lowercase letters represent significant differences among the experimental groups (p<0.05).2.3 肝脏抗氧化指标
如图3所示，养殖密度对SOD和GSH-Px活性均具有显著性影响 (p<0.05)。SOD活性在MD组显著低于其他组 (p<0.05)，而GSH-Px活性在MD组显著高于其他组 (p<0.05)。CAT活性和MDA含量在各密度组间无显著性变化 (p>0.05)。
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图 3 不同养殖密度对超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛水平的影响注：不同小写字母表示实验组间差异显著 (p<0.05)。Figure 3. Effects of different stocking densities on levels of superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and malondialdehydeNote: Different lowercase letters represent significant differences among the experimental groups (p<0.05).2.4 消化酶活性
如图4所示，肠道胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性均随着养殖密度的增加呈先上升后下降的变化趋势。LD组的肝脏胰蛋白酶活性显著高于其他组 (p<0.05) (图4-a)；肝脏脂肪酶和淀粉酶活性无显著性变化 (p>0.05) (图4-b—4-c)。肝脏胰蛋白酶和淀粉酶活性均高于肠道，而肝脏脂肪酶活性明显低于肠道。
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图 4 不同养殖密度对肝脏和肠道胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性的影响注：不同小写字母表示实验组间差异显著 (p<0.05)。Figure 4. Effects of different stocking density on activities of trypsin, lipase and amylase in liver and intestineNote: Different lowercase letters represent significant differences among the experimental groups (p<0.05).3. 讨论
3.1 养殖密度对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长离散情况和生长性能的影响
养殖密度会影响鱼类的生存空间和饵料资源。当资源分配不均时，具有生长优势的鱼生长速度加快，而处于生长劣势的鱼生长速度下降，鱼群出现生长离散现象[30]。有研究表明，由种群密度高引起的鱼类种群规格分布差异，在种群内部可能会形成社会等级制度，使生长不均[31]。本研究中，不同密度组瓦氏黄颡鱼幼鱼体长和体质量变异系数虽无显著性差异，但最小值均出现在MD组，且体长变异系数较体质量变异系数小，这与刀鲚 (Coilia nasus)[30]、大口黑鲈[32] 等的研究结果相似。
增加养殖密度是显著提升养殖经济效益的有效途径[33]。但当养殖密度过高时，往往出现鱼类生长受抑制情况。厚颌鲂 (Megalobrama pellegrini) 幼鱼[33]、黑鲷 (Acanthopagrus schlegelii) 幼鱼[34]、大黄鱼 (Larimichthys crocea)[35]、黄条鰤 (Seriola aureovittata)[36] 等均出现高密度下生长性能下降的现象。本研究中，MD组瓦氏黄颡鱼增长率显著高于其他组，饲料系数低于其他组，这可能是因为高养殖密度下，瓦氏黄颡鱼受拥挤胁迫强烈，对水域空间的竞争加剧，鱼体用来维持生存和应对应激反应的能量消耗增加，因此饲料转化率降低，饵料系数增大，从而生长性能下降[9]。MD组的体质量增长率、体质量日增长等指标虽无显著性变化，但在MD时其值最大 (3.49 kg·m−3) 。综合以上分析，在本研究中，3.49 kg·m−3是瓦氏黄颡鱼幼鱼在该陆基循环水养殖系统中的最适宜放养密度。
3.2 养殖密度对瓦氏黄颡鱼幼鱼血清生化和免疫指标的影响
血液在物质运输、生理调节和生理防御等方面发挥重要功能，对鱼类的生存和繁衍至关重要。血液生理生化指标能够敏感地反映出鱼体的代谢水平、健康状况以及营养状态[10,37]。葡萄糖作为生命活动的主要能量来源，其浓度在一定范围内的增加反映了鱼体抗逆能力和免疫力的增强，对其生存具有重要意义[38]。本研究中，随着养殖密度的增加，葡萄糖水平呈上升趋势，这与异育银鲫 (Carassius gibelio)[39] 和大口黑鲈[40] 的研究结果相似。研究表明，机体可通过促进糖原分解的途径来满足机体因应激而增大的能量需求，从而出现血清葡萄糖含量升高的现象[41]。血清甘油三酯和总胆固醇浓度可反映鱼体脂肪代谢水平[42]。中华鲟 (Acipenser sinensis) 血清甘油三酯和总胆固醇浓度随养殖密度的增加呈下降趋势[10]。本研究也获得相似的结果，结果表明MD组和HD组的实验鱼均受到一定程度的拥挤胁迫。然而，团头鲂幼鱼[12] 和红鳍东方鲀 (Takifugu rubripes)[42] 的血清总胆固醇浓度随养殖密度的增加显著升高。这表明不同鱼类血清生化指标对养殖密度的响应不同，推测与实验对象、实验条件等因素有关。鱼类应激时，通常伴随着皮质醇浓度的升高[1]。本研究中，皮质醇水平无显著性变化，推测与瓦氏黄颡鱼幼鱼已适应慢性应激，下丘脑-垂体-肾间组织轴 (Hypothalamic-Pituitary-Interrenal Axis, HPI轴) 的负反馈调控机制使皮质醇浓度降低有关[17]。溶菌酶是鱼类非特异性免疫防御系统的重要成员，可以部分反映鱼类的免疫防御和抗病能力[43]。本研究中，瓦氏黄颡鱼的溶菌酶活性随养殖密度增加呈下降趋势，与鲤[21]、黄颡鱼[44] 的研究结果一致。
3.3 养殖密度对瓦氏黄颡鱼幼鱼抗氧化能力的影响
SOD、CAT、GSH-Px是机体抗氧化系统的重要组成部分，在清除多余自由基方面发挥重要作用，避免自身氧化损伤，因此常被用来评估鱼类的抗氧化能力[45]。厚颌鲂 (Megalobrama pellegrini) 幼鱼经42 d养殖，其肠道SOD和CAT活性随养殖密度增大呈下降趋势[33]；翘嘴鳜 (Siniperca chuatsi) 经40 d养殖，其血浆SOD、CAT、GSH-Px活性在超低养殖密度和低养殖密度组显著增大[1]；西伯利亚鲟幼鱼经90 d养殖，低、中密度组肝脏SOD活性显著高于高密度组，肝脏CAT活性随密度增大呈下降趋势[46]。本研究中，SOD活性随养殖密度增加呈先下降后上升的趋势，GSH-Px活性随养殖密度增加呈先上升后下降的趋势，表明不同放养密度激活了瓦氏黄颡鱼幼鱼的抗氧化防御系统。然而，鱼类机体抗氧化酶对养殖密度的响应各不相同，推测这与各物种抗氧化能力和调节机制不同有关[47]。MDA是细胞膜脂质过氧化产物，是细胞氧化损伤的重要标志之一[48]，大量积累会导致细胞膜结构和功能的改变。本研究中，MDA含量无显著性变化，表明在2.03~5.03 kg·m−3内，养殖密度增加并未对鱼体细胞造成氧化性损伤。此外，SOD是机体重要的抗氧化酶之一，能够将体内氧自由基 (${\mathrm{O}}_2^{\text{−}} $) 转化为过氧化氢 (H2O2) 和氧气 (O2)，从而有效清除${\mathrm{O}}_2^{\text{−}} $。而H2O2的清除可通过CAT分解为H2O和O2，也可通过GSH-Px催化谷胱甘肽 (GSH) 的氧化反应来进行，从而保护细胞免受损伤[49]。本研究中，GSH-Px活性变化显著，而CAT无显著性变化，表明GSH-Px在瓦氏黄颡鱼幼鱼机体清除H2O2的过程中起主要作用。
3.4 养殖密度对瓦氏黄颡鱼幼鱼消化能力的影响
消化酶活性是反映鱼体消化能力的重要指标，通常表明鱼体对蛋白质、脂质和碳水化合物等营养物质的利用能力。动物生长与饲料利用密切相关，而饲料利用受动物消化吸收能力的影响[50]。高密度养殖会降低鱼体消化酶活性，而适当密度可使消化酶具有更高的活性，增强肠道的消化能力[51]。本研究中，肠道胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性均随密度增加呈先上升后下降的趋势，与银鲳[52]、大口黑鲈[51] 等的研究结果相似。表明MD组瓦氏黄颡鱼幼鱼的消化能力更好，也从侧面揭示了MD组瓦氏黄颡鱼幼鱼生长情况最佳的原因。此外，本研究中，肝脏胰蛋白酶和淀粉酶活性均高于肠道，而肝脏的脂肪酶活性明显低于肠道且各密度组间无明显变化，表明肝脏在蛋白质和碳水化合物的消化中起到主要作用，在脂肪消化中起辅助作用，且肝脏对脂肪的消化能力不受养殖密度影响。此结果与李晓莉等[43] 的研究结果相似。
4. 结论
养殖密度对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长状况、血液生理、抗氧化能力和消化能力均产生影响。基于增长率、饲料系数、体质量增长率、体质量日增长等指标综合分析，在本研究中，3.49 kg·m−3是瓦氏黄颡鱼幼鱼在陆基循环水养殖系统中的最适宜养殖密度。MD和HD组虽受到一定程度的拥挤胁迫，但皮质醇浓度无显著性变化，表明该程度的拥挤胁迫在瓦氏黄颡鱼幼鱼机体的可调控范围内。不同养殖密度激活了瓦氏黄颡鱼幼鱼的抗氧化防御系统，但本研究中所涉及的养殖密度范围未对细胞脂质造成氧化性损伤。瓦氏黄颡鱼幼鱼肠道胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性均随密度增加呈先上升后下降的趋势，表明MD组的消化能力最佳；肝脏胰蛋白酶和淀粉酶活性均高于肠道，肝脏脂肪酶活性明显低于肠道，表明肝脏在蛋白质和碳水化合物的消化中起到主要作用，在脂肪消化中起辅助作用。
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图 1 主要衣壳蛋白的相似性网络聚类图
注：图中的点表示主要衣壳蛋白序列，绿点代表ICTV分类的微病毒科 (n=15)，橙点表示牡蛎样本中鉴定为微病毒科的序列 (n=220)，蓝点 (n=741) 表示上述两个来源的序列在nr库中最相似的序列，灰线表示连接两个点的边 (即两点序列间blastp打分值)。
Figure 1. Identity network of major capsid proteins
Note: The dots in the figure indicate the major capsid protein sequences, among which the green dots (n=15) represent the Microviridae classified by ICTV; the orange dots (n=220) indicate sequences identified as Microviridae in oyster samples; the blue dots (n=741) indicate the sequences from the two sources mentioned above which are most similar in the NR library; the gray line indicates the edge connecting the two dots (Based on the score values of blastp).
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图 2 主要衣壳蛋白进化树及对应的基因组结构图
注：MAFFT 比对主要衣壳蛋白的氨基酸序列，TrimAl 序列对齐，用iqtree建树，itol可视化，最大似然数；自展值：1 000，自动选择最佳替代模型，临界值70%。进化树上的红色星形表示来自牡蛎样品的微病毒科序列，序列号为：GX1-198598、T4S1-854210、T4S1-22425、ML1-11067和HSd1-5344568；ID的背景色表示用Cherry预测的宿主类型；ID右边一列表示ICTV分类的亚科和属，以及未分类病毒的样品来源；右侧为基因组结构示意图，不同颜色表示不同的标志基因。
Figure 2. Phylogenetic tree of major capsid proteins and related schematic maps of genome structure
Note: The amino acid sequences of the major coat proteins were aligned by using MAFFT, trimmed by using trimAL sequences, phylogenetic tree was drawn by using iqtree, visualized by itol, Maximum Likelihood Estimation tree; bootstrap replication: 1 000, automatic selection of the best alternative model, and site coverage cutoff is 70%. The red ID on the phylogenetic tree indicates the sequence from the oyster sample. The background color of ID represents the host type predicted by Cherry; the column on the right side of ID shows the subfamilies and genera of ICTV classification, as well as the sample sources of unclassified viruses; and on the right side is a schematic map of genome structure, with different colors indicating different marker genes.
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图 4 微病毒科噬菌体主要衣壳蛋白三维结构预测图
Figure 4. Three-dimensional structure prediction of replication proteins of oyster-related Microviridae
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图 5 微病毒科噬菌体主要衣壳蛋白与外部支架蛋白的进化关系
注：使用 MAFFT 进行基因组序列比对，TrimAl 对齐氨基酸序列，iqtree 建树，itol可视化，最大似然数；自展值：1 000，替代模型：自动选择。图中紫色序列ID为Gokushovirinae序列，红色序列ID为牡蛎相关微病毒科序列，粉色序列ID为Bullavirinae序列。左边为主要衣壳蛋白的进化树，右边为外部支架蛋白的进化树，同一个基因组的两个蛋白用直线连接。
Figure 5. Linkage between phylogenetic tree of major coat protein and that of external scaffolding protein of Microviridae phage
Note: The amino acid sequences of the major coat proteins were aligned by using MAFFT, trimmed by using trimAL sequences, phylogenetic tree was drawn by using iqtree, visualized by itol, Maximum Likelihood Estimation; bootstrap replication: 1 000, automatic selection of the best alternative model, and site coverage cutoff value is 70%. The purple ID in the figure is Gokushovirinae; the red ID is the oyster-associated Microviridae sequence, and the pink ID is the Bullavirinae sequence. The phylogenetic tree of the major capsid protein is shown on the left, and the evolutionary tree of the external scaffold protein is shown on the right, with two proteins of the same genome connected by straight lines.
表 1 牡蛎相关微病毒在各测序文库中的 TPM 丰度
Table 1 TPM abundance of oyster-related microviruses in sequencing libraries
样本 ID
Sample ID病毒基因组 ID Genome of virus ID HSd1-5344568 GX1-198598 T4S1-22425 T4S1-854210 ML1-11067 GX170519 0 0.0 012 0 0 0 S1-DR 0.0 006 0 0 0 0 S2-D-2 0.0 010 0 0 0 0 S2-DR 0.0 005 0 0 0 0 S3-D-2 0.0 002 0 0 0 0 S3-D 0.0 055 0 0 0 0 样本 ID
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