Diagnostic and pathological studies of epizootic ulcerative syndrome (EUS) outbreak in cultured leucistic Channa argus in Sichuan Province of China
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摘要: 四川地区养殖的白乌鳢 (Channa argus) 在2021年秋冬阴雨季节频繁发生溃疡性死亡事件。为确定白乌鳢溃疡性疾病的原因，通过临床观察、分离培养、组织学和分子生物学等技术开展了研究。大体病理研究发现，患病鱼主要表现为皮肤脱落并暴露皮下肌肉层，肌肉出现深层溃疡的情况；在光镜下，发现肌肉触片中有直径为10~20 μm的无隔膜分枝状菌丝，通过霉菌分离纯化和ITS基因序列分析，鉴定该病原菌为侵入性丝囊霉菌 (Aphanomyces invadans)。组织病理学显示，在皮肤真皮层和肌肉中的溃疡边缘包围着成熟的肉芽肿，而这些肉芽肿可侵袭至肉眼所观察到的正常肌肉处，对病鱼造成进一步的影响。研究结果表明，此次白乌鳢暴发性死亡的原因是侵入性丝囊霉菌引起的流行性溃疡综合征 (Epizootic Ulcerative Syndrome, EUS)，这是关于白乌鳢流行性溃疡综合征的首次报告。研究结果为侵入性丝囊霉菌的鉴定和临床诊断提供了理论参考，也是侵入性丝囊霉菌宿主进一步扩大的证明。Abstract: In order to determine the causes of the frequent occurrence of diseases in leucistic northern snakehead (Channa argus) in Sichuan Province of China during the cloudy, rainy autumn and winter, we carried out the reseach by techniques such as clinical observation, isolation and culture, as well as histology and molecular biology, etc.. Generally, the pathological study shows that the main manifestations of the diseased fish were skin peeling, exposing the subcutaneous muscle layer, and the deep ulcer of the muscle. Moreover, non-septate branching fungal hyphae with a diameter of 10–20 µm were observed in squash preparations under light microscopy. The pathogen was identified as invasive Aphanomyces invadans by isolation and purification and ITS sequence analysis. Histopathology reveals that the ulcer edge in the skin dermis and muscle was surrounded by mature granuloma. These granulomas could invade the normal muscles observed by naked eye and caused a further impact on the diseased fish. The findings indicate that the disease was Epizootic Ulcerative Syndrome (EUS), which is the first report of EUS in leucistic C. argus, providing the basic data for the identification and clinical diagnosis of A. invadans. The findings also suggest that a risk of host expansion of this fungus may exist.
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流行性溃疡综合征 (Epizootic ulcerative syndrome, EUS) 是一种由侵入性丝囊霉菌 (Aphanomyces invadans) 引起鱼类皮肤和肌肉溃烂、坏死的疾病，可导致鳢 (Channa maculata)、鲤 (Cyprinus carpio)、南方大口鲶 (Silurus meridionalis) 和小口黑鲈 (Micropterus dolomieu) 等多种淡水鱼类发病死亡[1-4]。目前，侵入性丝囊霉菌已出现在全世界四大洲26个国家的100多种鱼类中，是一种被世界动物健康组织 (World Organisation for Animal Health, OIE) 要求必须通报的水生动物疾病[5]，目前仍是中国二类疫病[6]。自从1971年在日本发现[7]以来，流行性溃疡综合征已蔓延至亚洲、澳大利亚、南美洲和非洲的水产养殖区，对渔业造成了巨大的经济损失[8]。
白乌鳢是乌鳢 (C. argus) 的白化种，其体色呈白色，俗称白乌鱼，是一种在四川和重庆地区重要的自然分布和养殖鱼类，其代表性养殖品种乌鳢“玉龙1号”由四川省内江市农业科学院选育而成，为2022年农业农村部审定的新品种[9]。与野生品种相比，养殖白乌鳢具有较强的生长能力和体色稳定性，因此该产业发展迅速。而疾病是阻碍白乌鳢大规模繁殖和养殖产业健康发展的主要原因。2021年秋冬季，白乌鳢养殖区出现了一种由未知病原体引起的皮肤和肌肉溃烂的复发性传染病。为了确定病因，本研究通过临床观察、分离和培养、组织学和分子生物学方法明确了该病的病理损伤特征，推测了其致病原因，以期为类似疾病的诊断提供参考。
1. 材料与方法
1.1 病鱼来源
患病白乌鳢样本采自四川省内江市东兴区赵家坝某养殖场，品种为乌鳢“玉龙1号”。发病池塘水温14 ℃，发病鱼体质量30~150 g，主要表现为大面积死亡，体表皮肤溃烂明显。
1.2 剖检与组织病理学
从发病池塘随机抽取6尾背部有溃疡的病鱼进行临床和病原学检查，样品鱼体质量为53~101.6 g。对每尾鱼进行全面的剖检，并取肝、肾、脾、肌肉等组织，迅速固定在体积分数为10%的中性缓冲甲醛中以进行组织病理学检查。样品经体积分数分别为75%、85%、95%、100%的乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红 (Hematoxylin-Eosin, H&E) 和过碘酸六胺银 (Periodic acid-silver methenamine, PASM) 染色[10]，中性树脂胶封片后，在Nikon电子显微镜 (Nikon，日本) 下观察，并拍照记录。
1.3 病原分离与纯化
收集溃疡病灶、鳃丝和血液，制备压片/涂片进行微生物检查。在无菌条件下从肝、肾、脾中分离细菌和病毒，并进行完整的寄生虫学检查。根据OIE[5]的建议，从自然发生的溃疡病灶中无菌切取小块肌肉，在葡萄糖-蛋白胨-酵母肉汤中于25 ℃下培养12 h，将菌丝转移到葡萄糖-蛋白胨琼脂中。然后将有活力的菌丝置于肉汤培养基，20 ℃培养4 d，用无菌池塘水清洗后在20 ℃的无菌池塘水中过夜，最后进行光学显微镜观察。
1.4 病原鉴定
用侵入性丝囊霉菌的两对ITS特异性引物进行PCR扩增和测序[11-13]。用苯酚/氯仿提取总DNA，并作为PCR反应模板。分别扩增ITS1 (Ainvad-2F: 5'-TCATTGTGAGTGAAACGGTG-3'和Ainvad-ITSR1: 5'-GGCTAAGGTTTCAGTATGTAG-3'，目标条带：234 bp) 和ITS2基因 (ITS11: 5'-GCCGAAGTTTCGCAAGAAAC-3'和ITS23: 5'-GTATAGACACAAGCACCA-3'，目标条带：550 bp) 。反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ l min，72 ℃ 1 min，循环32次。PCR产物经10 g·L−1琼脂糖凝胶电泳检测，并测序。获得的序列与GenBank数据库进行Blast比对，并通过Mega-X的邻接法构建系统发育树[14]。
2. 结果
2.1 病鱼临床症状
患病的白乌鳢往往在短时间内表现出剧烈和持续的死亡 (图1)。通过大体病理观察发现，病鱼的皮肤呈现坏死和脱落，并暴露下层骨骼肌，严重者可见深层溃疡的出现 (图2)。病鱼的皮肤上有白色棉花状的菌丝附着生长，而从水中取出鱼时该棉花状菌丝肉眼不可见。病鱼发病较为严重，但并未延伸到腹腔和颅腔中引发脏器病变。此外，在体内和体外均未发现寄生虫，也未从内部器官中分离出细菌或病毒等病原。
2.2 病鱼组织病理分析
组织病理学结果显示，皮肤和肌肉是本次患病白乌鳢的主要病变靶器官，而其他器官的病变不典型。可见患病鱼溃疡的皮肤和肌肉边缘包围着成熟肉芽肿组织 (图3-a)。真皮层的成熟肉芽肿周围观察到较多红细胞，大量肉芽肿已经取代了正常的肌肉纤维。这种肉芽肿不仅出现在溃疡的边缘，还侵入了附近的正常肌肉 (图3-b)。在病变区和成熟肉芽肿中的真菌菌丝周围可见巨噬细胞呈环状存在，偶尔也观察到多核巨细胞。最后，通过PASM染色 (图4)，可见肉芽肿中心呈黑染的真菌菌丝。
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图 3 病鱼肌肉的组织病理学分析注：a. 真菌入侵后形成的肉芽肿变化，箭头表示被肉芽肿占据的残余肌纤维；b. 肉芽组织入侵肌肉的概况；b'. 肉芽组织入侵皮肤和肌肉示意图，黄色区域表示肉芽组织入侵区域，绿色区域表示正常组织。Fig. 3 Histopathological analysis of muscles of diseased fishNote: a. Change in granulomas formed after fungal invasion, and the arrows indicate remnant muscle fibres occupied by granulomas; b. Overview of the invasion of muscle by granulation tissue; b'. Schematic illustration of granulation tissue invading skin and muscle. The yellow area indicates the area occupied by granulation tissue and the green area indicates the unoccupied area.2.3 病原的形态与分子鉴定
光镜下，在肌肉触片中观察到直径为10~20 μm的无隔膜、分支的菌丝 (图5-a)。经过培养和纯化后，得到细长的丝状菌丝，可观察到初级孢子在菌丝中被运输，并在菌丝顶端形成集群，次级孢子将从该部位被释放 (图5-b)。两对侵入性丝囊霉菌的特异引物被用于扩增和测序，结果显示纯化培养的菌丝与肌肉患处样本的DNA一致，均能扩增出侵入性丝囊霉菌的ITS的两条特定条带。本次分离到的真菌被命名为bwl1，将通过测序和拼接后的包括ITS1和ITS2基因的bwl1序列 (MZ674417) 进一步用于该菌的系统进化分析。结果表明，bwl1与从其他地区分离的侵入性丝囊霉菌同源性最高，聚为一支 (图5-c)，证明分离病原是侵入性丝囊霉菌。此外，bwl1与美国 (DQ403202) 和印度 (MN814020) 分离株之间的系统发育关系非常接近，同源性均为99.44%。
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图 5 侵入性丝囊霉菌的形态特征和分子鉴定注：a. 临床样本的肌肉压片；b. 纯化的真菌菌株；c. 基于菌株bwl1ITS基因序列构建的系统进化树。Fig. 5 Morphological characteristics and molecular identification of A. invadansNote: a. Muscle compression of clinical samples; b. Purified fungal strains; c. Phylogenetic tree based on ITS gene sequence of the strain bwl1.3. 讨论
通过OIE推荐的标准以及对患病鱼大体病变特征[15-17]的判断，可对流行性溃疡综合征进行诊断[5]。目前已有的乌鳢流行性溃疡综合征视觉评分系统[16]分为4级：1级为皮肤发白；2级为红斑和肿胀明显；3级为溃疡性病变；4级为肌肉深层次的溃疡。本次白乌鳢暴发的流行性溃疡综合征的病变程度为3~4级。虽然病鱼的损伤较为明显，但并没有深入到腹腔和颅腔中，这与Saylor等[15]报道的结果不同，这可能与两种鱼生活的环境有关，本研究的发病地点为高密度养殖池塘，水质受环境影响较大，丝囊霉菌引起的病变可快速引发白乌鳢死亡，而Saylor等[15]研究的发病地点为运河，水环境具有较强的稳定性，丝囊霉菌有更多的时间在病鱼上生长发育。以往研究发现，流行性溃疡综合征的暴发与盐度、溶解氧、pH急剧下降以及水体浑浊度增加等密切相关[18-20]。因此，了解环境的作用及其对丝囊霉菌生长的影响，对改善针对流行性溃疡综合征感染的疾病防治系统非常重要。本次白乌鳢流行性溃疡综合征的暴发出现于暴雨之后，水环境质量和温度突然下降，这与Das等[21]研究的发病条件类似，再次证明流行性溃疡综合征暴发的环境因素之间存在关联，其发生取决于一些生物和非生物因素的变化，这些变化可影响水生环境中的真菌感染和病变诱导的程度[22-23]。
在流行性溃疡综合征病例的研究中，分离出的病原包括病毒 (主要为弹状病毒)、气单胞菌 (Aeromonas sp.)、产碱杆菌 (Alcaligenes sp.)、假单胞菌 (Pseudomonas sp.) 和弧菌 (Vibrio sp.)[8]，但没有实际证据表明这些病原体会导致流行性溃疡综合征的发生[24-25]。由于流行性溃疡综合征的肌肉溃疡暴露在外，需要考虑并发感染导致白乌鳢死亡的可能性[26]。已有研究发现，感染流行性溃疡综合征后杂交鳢 (C. maculate♀×C. argus ♂) 皮肤菌群发生了显著改变，Anaerosinus属、Anaervorax属等潜在致病菌数量显著增加，而Arthrobacter属、Dysgonomonas属、乳球菌属 (Lactococcus) 及链球菌属 (Streptococcus) 等菌种显著减少[27]，以上结果表明，治疗流行性溃疡综合征不应仅考虑控制丝囊霉菌属的繁殖，还应重点关注感染鱼的皮肤微生物群。本研究从溃疡皮肤处分离出嗜水气单胞菌 (A. hydrophila) 和维氏气单胞菌 (A. veronii) 两株常见的条件病原菌，但内脏中并未发现病原微生物的存在，这与前述的研究结果类似，表明在疾病的发展阶段皮肤表面微生物群多样性会发生改变。此外，经过标准的寄生虫学检查[8,28]，在皮肤、鳍、鳃和各种内脏器官，以及胃和肠内容物的样本中均未发现寄生虫病原体。虽然白乌鳢死亡的最终原因尚不清楚，但是Shariff和Cruz-Lacierda[29]研究指出，机会性细菌感染经常在开放性病变中迅速发展，开放性病变可通过引起血液中的血红蛋白和血清蛋白水平在感染期间急剧下降，导致致命的血清稀释风险。综上所述，笔者推断流行性溃疡综合征可能是导致白乌鳢体表溃疡的主要原因，肉芽肿的发展扩散预示着机体无法对丝囊霉菌的侵袭形成有效的阻挡机制，导致病变进一步扩大，从而扰乱了鱼体的渗透压并进一步导致其死亡，而继发性感染将加剧这一进程的发展。此外，Wada等[30]发现鲤在实验室感染溃疡综合征后，在注射部位会迅速形成肉芽肿对丝囊霉菌进行阻拦，而易感的香鱼 (Plecoglossus altivelis) 在此过程中并不会快速形成肉芽肿[29]。肉芽肿在肌肉中的不断发展预示着白乌鳢可能和香鱼类似，无法对丝囊霉菌产生有效的防御机制，同时本次发病的白乌鳢养殖池塘中套养的少量草鱼亦未见相关临床症状，因此对此类易感鱼类的养殖应该严加注意流行性溃疡综合征的暴发。
本研究表明，分子诊断有助于确定疾病的来源。根据ITS基因的序列比对，bwl1与美国 (DQ403202) 和印度 (MN814020) 分离株之间的系统发育关系非常接近，而且印度株与珠江地区的HN20170224 (MK855505) [2]非常相似，这也说明珠江水产养殖区和四川水产养殖区之间可能通过大宗水产品贸易紧密相连，尽管没有进一步的证据支持这种可能性，但这种联系可能提供了一条使该病原体在中国入侵和传播的途径。提示在水产品输入、输出时，需要强调检疫的作用，以保护公共安全和健康。
流行性溃疡综合征爆发的精准抗病是未来研究的重点，鱼类在很大程度上依赖于先天免疫。尽管其不能抵抗病原体，但在感染过程中，某些关键的体液先天免疫分子被触发，可进一步激活各种分子系统，包括超氧化物歧化酶 (SOD)、蛋白酶和蛋白酶抑制剂、半胱天冬酶和抗菌肽，这些分子系统通过大量有效表达，可起到免疫调节作用[31]。同时，可结合适当的免疫增强药物 (壳聚糖[32])，控制真菌繁殖速度，减少鱼类对环境的应激从而提高其对流行性溃疡综合征的免疫反应。
4. 结论
本研究对四川地区养殖白乌鳢溃疡性死亡进行了调查，通过临床观察、分离培养、组织学和分子生物学等技术，确定该病是由侵入性丝囊霉菌引起的流行性溃疡综合征；这是关于白乌鳢流行性溃疡综合征的首次报告，研究结果可为侵入性丝囊霉菌的鉴定和临床诊断提供理论参考。
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图 2 患病白乌鳢的大体病变特征
Figure 2. General pathological features of diseased leucistic C. argus
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图 3 病鱼肌肉的组织病理学分析
注：a. 真菌入侵后形成的肉芽肿变化，箭头表示被肉芽肿占据的残余肌纤维；b. 肉芽组织入侵肌肉的概况；b'. 肉芽组织入侵皮肤和肌肉示意图，黄色区域表示肉芽组织入侵区域，绿色区域表示正常组织。
Figure 3. Histopathological analysis of muscles of diseased fish
Note: a. Change in granulomas formed after fungal invasion, and the arrows indicate remnant muscle fibres occupied by granulomas; b. Overview of the invasion of muscle by granulation tissue; b'. Schematic illustration of granulation tissue invading skin and muscle. The yellow area indicates the area occupied by granulation tissue and the green area indicates the unoccupied area.
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图 5 侵入性丝囊霉菌的形态特征和分子鉴定
注：a. 临床样本的肌肉压片；b. 纯化的真菌菌株；c. 基于菌株bwl1ITS基因序列构建的系统进化树。
Figure 5. Morphological characteristics and molecular identification of A. invadans
Note: a. Muscle compression of clinical samples; b. Purified fungal strains; c. Phylogenetic tree based on ITS gene sequence of the strain bwl1.
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