Cloning and transcriptional regulation of slitrk3 gene promoter in large yellow croaker (Larimichthys crocea)
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摘要: 神经突触相关蛋白Slitrk3具有调节抑制性突触发育的作用。研究大黄鱼 (Larimichthys crocea) 神经突触黏附分子slitrk3基因的转录调控机制，可为解决大黄鱼养殖面临的生长、应激及抗逆等问题提供新思路。通过生物信息学方法对大黄鱼及其他物种的Slitrk3氨基酸进行多重序列比对和系统进化树分析，并预测大黄鱼slitrk3基因启动子区域相关的调控元件，采用双荧光素酶报告基因系统检测大黄鱼slitrk3基因启动子区域的转录活性。生物信息学分析结果显示，Slitrk3氨基酸序列在鱼类中具有较高的保守性；大黄鱼slitrk3基因启动子区域预测存在2个潜在的转录起始位点、2个CpG岛以及Sp1、GR、C/EBPα和C/EBPβ等多种转录因子结合位点。双荧光素酶报告基因系统结果显示，大黄鱼slitrk3基因启动子区域的−1970—−1614 bp、−1210—−667 bp存在正调控元件，−1614—−1210 bp、−667—−376 bp、−376—−147 bp存在负调控元件，推测−147—+16 bp为核心启动子。Abstract: Slitrk3, a neurosynaptic-related protein, can regulate the development of inhibitory synapses. To explore the transcriptional regulation mechanism of slitrk3 gene of the large yellow croaker (Larimichthys crocea) can provide a new idea for solving the problems of growth, stress and anti-stress in the L. crocea culture. We conducted a multiple sequence alignment and a phylogenetic tree analysis of amino acids for Slitrk3 in L. crocea and other species to investigate the transcriptional regulation mechanism of the neural cell adhesion molecule for slitrk3 gene. Besides, we predicted the potential core promoter regions, CpG islands and transcription factor binding sites of slitrk3 gene by bioinformatics methods, and detected the Luciferase activity of promoter of slitrk3 gene by the Dual-Luciferase Reporter System. Bioinformatics analysis shows that the amino acid sequences of Slitrk3 were highly conserved in fish. There were two transcription start sites, two CpG islands, and multiple transcription factor binding sites such as Sp1, GR, C/EBPα and C/EBPβ in promoter of slitrk3 gene. Dual-Luciferase Reporter System shows that the regions from −1970 to −1614 bp and from −1 210 to −667 bp contained positive regulatory elements; while the regions from −1614 to −1210 bp, from −667 to −376 bp and from −376 to −147 contained negative regulatory elements; and the regions from −147 to +16 bp might be core promoter of slitrk3 gene. The results lay a theoretical foundation for the further study of transcriptional regulation mechanism of slitrk3 gene in L. crocea.
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Keywords:
- Larimichthys crocea /
- slitrk3 gene /
- Promoter /
- Transcriptional regulation
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中国是水产品生产和加工大国，2019年中国水产品总产量达6 480.36×104 t，其中鱼类产量为3 530×104 t，占渔业总产量的54.5%[1]。随着经济的迅速增长、水产品加工业的发展和人们营养饮食意识的提高，水产品在人们的日常饮食来源中变得越来越重要，其中鱼肉因含有丰富的蛋白质、多不饱和脂肪酸、维生素、微量元素等营养物质而占据主要地位。热煮是鱼肉熟化的普遍加工方式之一，然而在热煮过程中鱼肉的食用品质会发生明显变化，它直接决定了产品的质量和消费者对产品的可接受度，其中质构改变是鱼肉品质变化的重要表现。鱼肉热煮时会发生收缩失水、硬度增加等现象，导致组织脆弱化、结构松散，食用品质下降，从而降低消费者对产品的接受度，也限制了部分鱼类作为水煮鱼、酸菜鱼等调理食品的原料。因此提高鱼肉的质构稳定性，控制其在热煮过程中的品质变化，可以提升其加工价值。目前已有相关研究表明磷酸盐、多糖、淀粉和蛋白质等物质能在一定程度上改善鱼肉的热加工特性。本文综述了热煮对鱼肉质构的影响及引起质构变化的作用机制，总结了3种通过不同作用原理提高鱼肉耐煮性的方法，旨在为鱼肉热煮过程中的质构保持技术提供参考。
1. 热煮对鱼肉质构的影响
鱼肉的质构在热煮过程中不断变化。不同种类的鱼肉各组分组成和含量不同，热煮后质构的变化存在一定差异 (表1)。缪函霖等[2]将金枪鱼蒸煮处理，发现当鱼体温度达到65 ℃时鱼肉硬度、弹性、内聚性和咀嚼性均上升。徐靖彤等[3]进一步研究了加热温度对鲣鱼质构的影响，发现在−10~65 ℃的温度区间内，随着蒸煮温度升高鲣鱼肉硬度、咀嚼性和内聚性总体呈上升趋势，弹性略微下降。鳙 (Aristichthys nobilis)[4]和草鱼 (Ctenopharyngodon idella) [5]肉的硬度和咀嚼性随热煮温度升高呈先升高后下降的变化趋势，而弹性、内聚性和回复性等变化趋势不同。罗非鱼 (Oreochromis mossambicus) 肉[6]和鲈 (Lateolabrax japonicus) [7]经过热煮处理后，硬度、弹性和咀嚼性都有不同程度的下降。此外齐海萍等[8]还发现随着水煮时间延长鲤鱼肉硬度、咀嚼性和内聚性总体升高，弹性和回复性基本不变。综上说明不同品种的鱼经热煮处理质构变化不尽相同，且热煮条件也影响着鱼肉质构，因此为了得到质构保持效果更好的鱼肉制品，需要严格控制热煮温度和时间。
表 1 鱼肉热处理的质构变化Table 1 Texture changes of fish meat by heat treatment鱼类
Fish热处理方式
Heat treatment method质构测定方法或参数
Texture determination method or parameter质构变化
Texture change金枪鱼[2] Tuna 蒸煮 测前速度2 mm·s−1；测试速度1 mm·s−1；测后速度5 mm·s−1；压缩程度30%；时间间隔5 s；压缩次数2次 硬度、弹性、内聚性和咀嚼性均上升 鲣[3] Skipjack tuna 蒸煮 测前速度1 mm·s−1；测试速度1 mm·s−1；测后速度1 mm·s−1；应变比75%；时间间隔5 s；压缩次数2次 随着温度升高，硬度、咀嚼性和内聚性总体上升，弹性略下降 鳙[4] Bighead carp 水煮 测前速度2 mm·s−1；测试速度1 mm·s−1；测后速度5 mm·s−1；压缩程度30%；时间间隔5 s 随着温度升高，硬度、咀嚼性、胶黏性先升高后下降，弹性、凝聚性和回复性先下降后升高再下降 草鱼[5] Grass carp 水煮 测前速度2 mm·s−1；测试速度1 mm·s−1 ；测后速度5 mm·s−1；压缩程度35%；压缩次数2次；时间间隔5 s；自动触发力5 g 随着温度升高，硬度和咀嚼性先升高后下降，弹性和内聚性总体呈上升趋势，黏性和回复性基本不变 罗非鱼[6] Tilapia 水煮 测试速度1 mm·s−1；循环次数2次；触发点负载5 g；下压距离5 mm 硬度、咀嚼性、弹性和胶着性明显下降，内聚性明显上升 汽蒸 硬度、咀嚼性、弹性和胶着性明显下降，内聚性明显上升 空气炸 硬度、咀嚼性和胶着性下降，内聚性和弹性上升 鲈[7] Largemouth bass 水煮 测前速度5 mm·s−1；测试速度5 mm·s−1；测后速度5 mm·s−1；压缩程度50%；时间间隔5 s 硬度和咀嚼性下降，弹性略微下降 汽蒸 硬度和咀嚼性下降，弹性上升 真空低温烹饪 硬度和咀嚼性下降，弹性上升 鲤[8] Carp 水煮 测前速度1 mm·s−1；测试速度1 mm·s−1；测后速度1 mm·s−1；压缩距离5 mm；时间间隔5 s；感应力为5 g 随着加热时间延长，硬度、咀嚼性和内聚性总体呈上升趋势，弹性和回复性基本保持不变 鲫[9] Crucian carp 水煮 测前速度30 mm·min−1；测试速度60 mm·min−1；测后速度30 mm·min−1；形变量35%；时间间隔5 s 随着加热时间延长，硬度和咀嚼性明显上升，弹性和内聚性上升变化不明显 2. 热煮引起鱼肉质构变化的因素
2.1 肌原纤维蛋白的热变性
熟鱼肉的质构首先取决于肌原纤维蛋白，肌原纤维蛋白热变性对鱼肉质构变化具有重要作用[10-11]。鱼肉在热煮过程中，维持蛋白质空间构象的氢键和离子键等化学键被破坏，肌原纤维蛋白二级结构展开，分子内部的氨基酸疏水残基暴露到分子表面，导致蛋白质表面疏水性增加，溶解性降低。升高到一定温度时，肌原纤维蛋白分子内或分子间会形成二硫键，肌球蛋白分子尾部被破坏，α-螺旋减少，β-折叠和无规卷曲增加，肌球蛋白头部发生不可逆的聚集，从而形成三维交联的凝胶网络结构[10-14]。
肌原纤维蛋白热变性程度直接影响了鱼肉质构，如熊舟翼等[10]将团头鲂 (Megalobrama amblycephala) 于料汁中小火煮制75 min，其硬度和胶着性最大，因为此时肌原纤维蛋白热变性程度高并进一步交联，蛋白质分子之间的作用力增强；小火煮制45 min时弹性和内聚性最大，因为煮制时间短，蛋白质热变性程度较低，肌肉间的结合力大，鱼肉组织破坏程度小。鞠健等[11]发现将鲢 (Hypophthalmichthys molitrix) 肉加热到60~80 ℃时蛋白质发生热变性导致硬度和咀嚼性增加，剪切力缓慢增加；当加热到90 ℃时由于肌原纤维蛋白降解，持水力降低，导致鱼肉剪切力下降。因此鱼肉质构变化与肌原纤维蛋白热变性程度紧密相关，热变性程度低时鱼肉的质构及口感保持较好，热变性程度高时组织结构过硬导致鱼肉易碎，肌原纤维蛋白热变性是影响鱼肉质构的主要原因。
2.2 肌肉持水性及水分分布
持水力是指肉制品在受到外部压力或在储存过程中保持自身水分及外加水分的能力，是表征蛋白质与水结合能力的指标[12]。热煮时鱼肉蛋白质发生变性，表面疏水性增加，破坏了水与蛋白质分子之间的结合作用使水分流失，同时肌原纤维蛋白收缩使储存水分的空间网络结构变小产生失水[13]，两者共同作用导致肌肉持水力下降，硬度增加。
鱼肉持水性下降还伴随着肌肉收缩，Blikra等[14]通过模拟鳕鱼片加热过程中的肌肉收缩，证明蒸煮损失量遵循一阶平衡动力学方程，且发现加热到60 ℃以上时鱼肉的蒸煮损失率与收缩率线性相关，因此热煮时鱼片收缩是导致质量下降的主要原因之一。孙瑜嵘等[15]研究发现随着蒸煮温度升高，鲭、鳀、沙丁鱼鱼肉的蒸煮损失率不断增加，并通过低场核磁共振技术检测了3种鱼肉蒸煮后的持水性和水分迁移变化，发现鱼肉持水力下降，同时肌肉蛋白质对水分的束缚力增强，自由度减小，水分迁移不大。综上说明热煮导致肌原纤维蛋白热变性使得蛋白质持水性降低，蛋白质与剩余水分的结合程度提高，同时肌肉收缩，引起质构变化。
2.3 脂肪含量
鱼肉热煮过程会伴随着脂肪氧化，主要影响鱼肉风味和营养状态，而对于质构的影响则有不同的说法，如Johnson等[16]发现鱼肉脂肪含量与鱼肉多汁性呈正相关，与硬度呈负相关；胡芬等[17]同样认为高水分含量与脂肪含量会降低鱼肉的机械强度，使质地更柔软；而Keiko等[18]得出了相反结论，发现鱼肉硬度与脂肪含量呈正相关。但也有研究认为脂肪含量与肌肉质构无相关性[19]，可能是因为不同鱼类脂肪含量差别很大，导致脂肪对鱼肉质构的影响各不相同。因此脂肪含量变化是否影响鱼肉质构还需要进一步探讨。
2.4 肌肉组分之间的相互作用
鱼肉热煮时伴随着蛋白质的热变性、肌纤维收缩和水分含量降低等现象，它们之间会产生相互作用共同影响鱼肉质构。研究表明，当加热温度达到50~60 ℃时，肌纤维开始发生收缩，汁液大量流失导致硬度升高，这些变化可能是由肌原纤维蛋白热变性、胶原蛋白收缩、肌动球蛋白脱水缩合的共同作用引起的。60 ℃以后，随着温度升高鱼肉硬度降低、肉质软化，这是由于胶原蛋白在60 ℃以上会受热溶解形成凝胶，同时肌纤维束受到严重破坏，结构断裂，肌肉形成松散的组织结构[20-21]。肌原纤维蛋白与胶原蛋白受热后会呈现出完全相反的变化，前者发生聚集收缩，变得坚硬，而后者会溶解为松散的弹性聚合物，因此质构在加热过程中的变化取决于哪种蛋白质处于主要地位[20]。
3. 鱼肉热煮过程中质构保持技术研究
由于蛋白质和水分含量变化是导致鱼肉质构发生改变的重要原因，因此从改善肌肉蛋白热稳定性、提高肌肉持水性和提高肌肉凝胶特性3个主要方面来阐述保持鱼肉质构特性的方法。
3.1 改善蛋白质热稳定性
蛋白质稳定剂通过小分子物质和蛋白质分子的结合来提高天然蛋白质的热稳定性，防止热处理后蛋白质理化和功能性质改变导致的产品劣变。常见的蛋白质稳定剂主要为有机渗透剂、氨基酸和表面活性剂等，表2对不同类型的蛋白质稳定剂进行了概括。
表 2 常见蛋白质稳定剂的研究进展Table 2 Research progress of common protein stabilizers蛋白质稳定剂
Protein stabilizer作用机制
Mechanism种类
Type作用效果
Effect有机渗透剂
Organic penetrant通过对大分子物质的空间排阻作用和对溶剂分子结构的影响来稳定蛋白质的结构[21] 卡拉胶和果胶[22] 在球状蛋白表面形成一层“保护膜”作为静电屏障，改善蛋白质热稳定性 魔芋低聚葡甘露聚糖[23] 改变肌球蛋白的氨基酸组成，降低糖蛋白复合物的表面疏水性，提高肌球蛋白的结构稳定性 氨基酸
Amino acid提高蛋白质溶解度，抑制蛋白质聚集，辅助变性蛋白复性[24] 精氨酸[25] 优先与肌球蛋白结合，显著扰乱肌球蛋白主链的氢键，并通过两个氨基与肌球蛋白分子形成新的氢键，明显抑制鳙鱼肌球蛋白热诱导聚集 赖氨酸[26] 在不同pH和离子强度条件下对罗非鱼肉肌球蛋白有明显的增溶效果，抑制热处理后肌肉蛋白质的热聚集 组氨酸[27-28] 在低离子强度条件下会发生肌丝解体，导致溶出率、热凝胶硬度和保水性提高，蛋白质的聚集程度下降 表面活性剂
Surfactant与蛋白质发生静电和疏水相互作用，显著改善蛋白质的溶解性，促进蛋白质复性过程中的构象转变[31] 海藻糖脂[29] 提高蛋白质的热解折叠温度，且蛋白质热解折叠温度随添加量的增加而提高，然而大多以牛血清蛋白为研究对象 硫酸葡聚糖[30] 与肌球蛋白发生强静电相互作用，增大肌球蛋白溶解度，对罗非鱼肌球蛋白热变性具有明显的抑制作用 十二烷基硫酸钠和β-环糊精[31] 作为“人工分子伴侣”，防止蛋白质分子中巯基被破坏，减弱蛋白质分子间的相互作用，抑制肌球蛋白的热变性聚集 3.2 提高肌肉的持水性
鱼肉在热煮过程中持水性降低，使得肉质变硬易碎，口感粗糙，从而造成品质劣变。通过添加保水剂能够提高肌肉持水性，改善鱼肉的质构，提高出品率。保水剂包括磷酸盐和无磷保水剂。
3.2.1 磷酸盐
磷酸盐主要通过影响肉的固有pH，隔离肌动球蛋白中存在的金属离子，解离肌动球蛋白和提高离子强度等来增强肌肉的持水性[32-33]，从而减少鱼肉烹饪损失，改善鱼肉组织结构和感官品质等[32]。常见磷酸盐类型及其溶解度见表3。
表 3 常用磷酸盐类型及溶解度Table 3 Common phosphate types and solubility种类
Type磷酸盐
Phosphate分子式
Molecular
formula溶解度
Solubility/
(g·L−1)正磷酸盐
Orthophosphate磷酸三钠 Na3PO4 120 磷酸二氢钠 NaH2PO4 800 磷酸氢二钠 Na2HPO4 100 磷酸三钾 K3PO4 900 磷酸二氢钾 KH2PO4 330 磷酸氢二钾 K2HPO4 1670 焦磷酸盐
Pyrophosphate焦磷酸钠 Na2H2P2O7 120 焦磷酸四钠 Na4P2O7 65 焦磷酸四钾 K4P2O7 1840 三聚磷酸盐
Tripolyphosphate三聚磷酸钠 Na5P3O10 150 三聚磷酸钾 K5P3O10 1800 六偏磷酸盐
Hexametaphosphate六偏磷酸钠 (NaPO3)n ∞ 研究证明磷酸盐可与NaCl发生协同作用导致肌球蛋白增溶，增强肌肉凝胶结构，提高持水力并减少蒸煮损失[33]，如李振铎等[34]发现添加3%多聚磷酸钠和0.5%NaCl能使鳕鱼和鲽鱼鱼片持水性较好且产品安全无害。磷酸盐还能与其他保水剂进行复配以减少其添加量，张聪[35]以1.0%焦磷酸钠和0.7%黄原胶复配作为罗非鱼片的保水剂并采用低声强超声辅助浸渍，罗非鱼片的保水性明显提高。
3.2.2 无磷保水剂
无磷保水剂因其安全高效的优点而成为磷酸盐的替代物，主要包括糖、糖醇和无机盐等。糖及糖醇含有的羟基能够与蛋白质基团结合，使蛋白质分子处于饱和状态，防止蛋白质聚集变性发生失水，此外糖类中的游离羟基还能与肌肉组织中的水结合从而提高持水性[36]。无机盐则通过螯合金属离子提高pH、增加肌肉离子强度等方面提高肌肉持水性[37]。
无磷保水剂可以通过复配互补作用增强保水效果，且复合无磷保水剂对肉制品的保水能力大于复合磷酸盐，于淑池和周海英[38]发现当复合无磷保水剂的配方为0.4%海藻糖、1.0%柠檬酸钠、2.0%碳酸氢钾和0.6%谷氨酰胺转氨酶 (TG酶) 时能够最好地提高卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus) 鱼片的保水性。古霞[39]对南方大口鲇 (Silurus meridionalis) 保水性进行了研究，发现最佳复合无磷保水剂配方为蔗糖酯0.6%、山梨糖醇1.5%、魔芋葡甘露聚糖2.4%。张晨芳和钟秋平[40]认为罗非鱼片经0.6%乳酸钠、2.5%柠檬酸钠、2.0%碳酸氢钠和0.6%TG酶混合处理时水分保持较好。
3.3 提高肌肉的凝胶特性
肌原纤维蛋白的凝胶特性在鱼肉热煮过程中起到稳定鱼肉组织结构的作用。淀粉、非肌肉蛋白质、TG酶与肌原纤维蛋白相互作用所形成的混合凝胶体系能显著提高鱼肉的凝胶特性。
3.3.1 淀粉
淀粉包括天然淀粉和变性淀粉，当添加到鱼肉中时，在热煮条件下其高吸水率和溶胀能力可以使其填充到肌原纤维蛋白凝胶网络结构中，改善鱼肉产品的凝胶特性，提高肉块间的黏结性，填充孔洞，使产品不易松散成块，稳定产品质构[41]。
有研究显示，添加淀粉不会对肌肉蛋白质的结构产生影响，如Yang等[42]将淀粉添加到罐装午餐鱼肉中不但能提高肌原纤维蛋白的凝胶强度，且不影响肌原纤维蛋白的分子结构。Li等[43]研究发现经过湿法研磨后的木薯淀粉添加到肌原纤维蛋白凝胶网络中会对外围凝胶网络起到填充作用，能够与肌原纤维蛋白产生具有更好质地的复合凝胶。变性淀粉比天然淀粉具有更高的稳定性。吴香等[44]分别添加8%玉米乙酰化二淀粉磷酸酯、木薯乙酰化双淀粉己二酸酯淀粉和木薯醋酸酯变性淀粉，发现肌原纤维蛋白凝胶强度均明显增强，其中木薯乙酰化双淀粉己二酸酯淀粉的效果最好。Fan等[41]对木薯变性淀粉进一步研究，认为低交联/乙酰化木薯淀粉比高交联/乙酰化木薯淀粉具有更好的提高肌原纤维蛋白凝胶特性的能力。
3.3.2 蛋白质
蛋白质添加剂通常用于改善鱼肉质构和营养价值。鱼肉在50~60 ℃的加工温度下会由于内源性热活化蛋白酶诱导肌原纤维蛋白分解而发生凝胶劣变，非肌肉蛋白可以作为蛋白酶抑制剂有效抑制热活化蛋白酶的活性，且自身具有胶凝作用，使热处理的鱼肉凝胶具有相等或更好的质构特性[45-46]。
Borderías等[45]研究发现向肌原纤维蛋白中添加8%和10%豌豆分离蛋白可产生良好耦合的混合凝胶网络，改善混合蛋白网络的凝胶持久性。杜洪振等[46]证明经过预热处理的大豆分离蛋白能够显著提高鲤肌原纤维蛋白的凝胶特性。此外李艳青等[47]也对大豆分离蛋白进行了研究，发现添加量小于20%的氧化大豆分离蛋白会使肌原纤维蛋白凝胶弹性增加，减弱对肌原纤维蛋白功能性的破坏。Duangmal等[54]认为牛血浆蛋白在一定浓度下也可以改善红罗非鱼鱼肉凝胶的质地特性。
3.3.3 谷氨酰胺转氨酶
TG酶是肉制品中用于增强蛋白质分子间共价键的常用制剂之一[48]。在肉制品加工过程中，可通过交联和脱酰胺作用在谷氨酰胺和肉蛋白的赖氨酸之间形成G-L键来增强肌肉蛋白的凝胶强度[49]，从而改善产品质构，且少量的TG酶就能显示出很强的附着力。
Yang等[50]研究表明添加TG酶后南极鱼 (Patagonotothen ramsayi) 鱼肉的凝胶形成能力得到显著提高，且TG酶能够通过温度和时间的协同作用改善鱼肉的凝胶特性。研究发现TG酶也能与其他物质进行复配增强肌肉凝胶强度，如邓思杨等[51]将TG酶与马铃薯淀粉复配，发现在70 ℃的条件下当TG酶和马铃薯淀粉的添加量为0.5%和4%时，其保水性最大，凝胶效果最好。外源添加物如酪蛋白酸钠作为TG酶的最佳底物，与TG酶结合也会增强肌肉蛋白的凝胶特性[52]。
4. 展望
热煮是鱼肉热加工的一种重要方式，然而在热煮过程中鱼肉的质构品质会发生明显劣变，不仅降低了产品出品率，增加了生产成本，还会直接影响消费者对产品的接受程度，造成资源浪费。因此控制鱼肉在热煮时的品质变化，获得食用品质理想且经济价值高的鱼肉产品是目前鱼类加工市场急需解决的问题。深入探讨鱼肉质构在热煮过程中的变化机制，并在此基础上有针对性地对鱼肉热煮预处理加工条件进行优化，提高鱼肉耐煮性，是生产理想食用品质鱼类产品的前提。
目前国内外有关提高鱼肉耐煮性的研究尚不充分，且鱼肉的耐煮性与鱼肉蛋白质各方面特性有关，不同鱼类品种，其蛋白质组成和结构也不尽相同，因此需要采取最合适的预处理方法。随着食品高新技术的快速发展，各种新型技术被逐渐应用于肉制品生产加工中，因此可以考虑将新型食品加工技术与传统热煮处理相结合，或与预处理加工条件相结合，以得到质构保持效果更好的鱼肉制品，为鱼肉热煮处理时的品质调控提供实验思路。
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图 1 大黄鱼及其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列多重序列比对
Figure 1. Multiple alignments of amino acid sequences of Slitrk3 in L. crocea and other species
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图 2 大黄鱼及其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列系统进化树
Figure 2. Phylogenetic tree of amino acid sequences of Slitrk3 in L. crocea and other species
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图 3 大黄鱼 slitrk3 基因启动子 CpG 岛的预测
Figure 3. Prediction of CpG islands of slitrk3 gene promoter in L. crocea
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图 4 大黄鱼 slitrk3 基因启动子不同长度片段的 PCR 产物电泳
注：M. DL2000 DNA Marker；1. slitrk3-P1片段；2. slitrk3-P2片段；3. slitrk3-P3片段；4. slitrk3-P4片段；5. slitrk3-P5片段；6. slitrk3-P6片段。
Figure 4. Electrophoresis of PCR products of slitrk3 gene promoter different length fragments in L. crocea
Note: M. DL2000 DNA Marker; 1. slitrk3-P1 fragment; 2. slitrk3-P2 fragment; 3. slitrk3-P3 fragment; 4. slitrk3-P4 fragment; 5. slitrk3-P5 fragment; 6. slitrk3-P6 fragment.
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图 5 大黄鱼 slitrk3 基因启动子重组质粒酶切电泳
注：M. DL5000 DNA Marker；0. pGL3-Basic质粒；1. pGL3-slitrk3-P1质粒；2. pGL3-slitrk3-P2质粒；3. pGL3-slitrk3-P3质粒；4. pGL3-slitrk3-P4质粒；5. pGL3-slitrk3-P5质粒；6. pGL3-slitrk3-P6质粒。
Figure 5. Electrophoresis of restriction enzymes digestion of slitrk3 gene promoter recombinant plasmids in L. crocea
Note: M. DL5000 DNA Marker; 0. pGL3-Basic plasmid; 1. pGL3-slitrk3-P1 plasmid; 2. pGL3-slitrk3-P2 plasmid; 3. pGL3-slitrk3-P3 plasmid; 4. pGL3-slitrk3-P4 plasmid; 5. pGL3-slitrk3-P5 plasmid; 6. pGL3-slitrk3-P6 plasmid.
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图 6 大黄鱼 slitrk3 基因启动子不同长度片段活性分析
注：数据均以“平均值±标准误”表示 (每个样品3次重复)；不同字母表示差异极显著 (P<0.01)；*. 差异显著 (P<0.05)。
Figure 6. Activity analysis of different length fragments of slitrk3 gene promoter in L. crocea
Note: Data are described as $ {\rm{Mean}} \pm { \rm {SE}}$ (n=3); different letters above the bars indicate extremely significant differences at P<0.01; *. Significant differences at P<0.05.
表 1 大黄鱼及其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列的GeneBank 登录号
Table 1 GeneBank ID of amino acid sequences of Slitrk3 in L. crocea and other species
物种
SpeciesGeneBank登录号
GeneBank ID大黄鱼 Larimichthys crocea XP_010750353.1 棘头梅童鱼 Collichthys lucidus TKS81208.1 金钱鱼 Scatophagus argus XP_046245335.1 大西洋鲷 Sparus aurata XP_030298892.1 黃鲈 Perca flavescens XP_028430026.1 大鳍弹涂鱼 Periophthalmus magnuspinnatus XP_033832314.1 斑马鱼 Danio rerio XP_021323398.1 大鼠 Rattus norvegicus NP_001101153.1 小鼠 Mus musculus NP_001344780.1 智人 Homo sapiens NP_001305739.1 
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表 2 大黄鱼 slitrk3 基因启动子不同长度片段的扩增引物
Table 2 Primers used for fragments amplification primers of L. crocea slitrk3 gene
引物
Primer序列 (5'—3')
Sequence (5'−3')扩增区域
Amplification region/bp产物大小
Amplification size/bpslitrk3-P1 F: ctatcgataggtaccGAGCTCATCCGTAGCTCATTCACATGC −1970—+16 2029 R: cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCG slitrk3-P2 F: ctatcgataggtaccGAGCTCGCGGAATCAATCATTTCTGGA −1614—+16 1673 R: cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCG slitrk3-P3 F: ctatcgataggtaccGAGCTCGAATCCTCGATCAGCCGATGT −1210—+16 1269 R: cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCG slitrk3-P4 F: ctatcgataggtaccGAGCTCCAAACTGACACCTATTTTTCC −667—+16 726 R: cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCG slitrk3-P5 F: ctatcgataggtaccGAGCTCTGTCTGAGTGGAGAGATTTGT −376—+16 435 R: cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCG slitrk3-P6 F: ctatcgataggtaccGAGCTCCTTTGTGAGGGTGTGTGTATC −147—+16 206 R: cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCG 注：单下划线为Sac I酶切位点，下划线为Hind III酶切位点，小写字母为质粒同源序列。 Note: The single underline are the Sac I restriction enzyme digestion sites; the underline is the Hind III restriction enzyme digestion site; and the lowercase letters are the plasmid homologous sequences.
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表 3 大黄鱼 slitrk3 基因启动子转录因子结合位点的预测
Table 3 Prediction of transcription factor binding sites of slitrk3 gene promoter in L. crocea
转录因子
Transcription factor起始
Star/bp终止
End/bp序列 (5'—3')
Sequence (5'−3')Sp1 −1 901 −1 889 gtgcccccccctc −1 422 −1 413 gctcaggcca −1 037 −1 028 cgcccactgc −646 −637 ccgtcctctt −520 −511 gtctcctcac −504 −495 cctcacccac −145 −136 tgtgagggtg −107 −98 tccctccttt −84 −75 cccatcccct GR −1 893 −1 884 ccctctgttc −1 801 −1 792 aacagaacac −78 −69 ccctctgttc C/EBPα −1 697 −1 688 ttattttttt −551 −542 tgttatgtaa −361 −352 tttgtttgca −312 −303 tatattttgt −67 −58 gttttgcagt C/EBPβ −979 −970 attggaaaat GATA-1 −1 735 −1 726 gacatgataa TBP −1 691 −1 682 tttttagatt TEC1 −1 577 −1 568 cggaatgaaa RAP1 −1 327 −1 318 gtgtttgtgt NF-1 −757 −748 tggcacccat MEB-1 −698 −689 ttatttttaa GLO −698 −689 ttatttttaa E1 −498 −489 ccacctgctg Myf-3 −498 −489 ccacctgctg Oct-1 −339 −330 aaattatcca IRF-1 −72 −63 gttctgtttt
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