水产品在加工和贮藏过程中，其脂质变化显著。脂质通过水解、氧化等反应，一般会生成风味物质，但也会产生大量不良物质，而这些物质可作为评价水产品营养和安全的指标^[1-2]。以往对于水产品脂质的研究多基于整体脂质和脂肪酸的组成和含量^[3-4]。近期大量研究发现脂质以脂滴 (Lipid droplet, LD) 的形式存在。脂滴不再是人们传统认知的惰性细胞器，而是一种高度复杂、进化稳定，几乎存在于所有动植物当中的动态细胞器。脂滴在细胞内有维持细胞能量稳定、保护细胞不受脂毒性物质侵害等作用^[5]。同时，脂滴与其他细胞器也有密切的相互作用^[6-7]，如脂滴和线粒体的紧密接触便于疏水性脂肪酸从脂滴转运到线粒体^[8]，内质网合成模型显示脂滴在内质网小叶上合成^[9-10]。

脂滴是细胞中常见的重要细胞器，脂滴包被的单层磷脂膜上镶嵌着多种蛋白，如“PAT”家族蛋白^[5,11]，脂滴的中性脂质核心也存在许多蛋白^[12]。在脂滴表面和内部的蛋白被统称为脂滴相关蛋白 (Lipid droplet-related protein, LDRP)。不同LDRP之间的差异会影响脂滴在细胞中的功能^[13]，脂滴的完整性对脂质代谢具有重要意义^[14]。脂滴出现聚集或者是数量变化，与脂质的合成或吸收有密切关系^[15]；脂质成分在降解之前，LDRP发生降解^[16-17]。

目前关于脂滴的研究主要集中在微生物、植物及畜禽类动物^[6,18-20]。密度梯度离心法是脂滴提取的常用方法，其原理是先通过低速离心去除颗粒较大的杂质，使脂滴聚集；再利用不同密度缓冲液进行高速离心，使脂滴和杂质彻底分离。通常依据离心次数分为两步离心法^[21-22]和三步离心法^[23-24]，二者均在最后一次离心中加入不同密度的缓冲液，利用高速离心使脂滴和杂质彻底分离。不同物种提取脂滴的条件不同，需要针对样品种类和特性进行调整^[25]。目前，关于水产动物脂滴的研究较少，分析脂滴提取过程和影响因素的研究尚未见报道。罗非鱼是我国主要的经济鱼类，其脂质在加工及贮藏过程中的变化一直是加工企业及科研工作者关注的焦点。掌握鱼类脂滴及LDRP提纯方法，对解析鱼类脂质变化及影响机制，寻求适宜的调控途径至关重要。

1.   材料与方法

1.1   材料与试剂

鲜活罗非鱼 (400~600 g) 购自广州超市。三甲基甘氨酸 (Tricine)、4% (体积分数) 多聚甲醛通用型固定液购自兰杰柯科技有限公司；Bradford蛋白浓度测定试剂、Bradford蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 (5×)、考马斯亮蓝染色液、BeyoColor™彩色预染蛋白 (10~170 kD) 购于上海碧云天生物技术有限公司；NUPAGE 12% (体积分数) Bis-Tris蛋白预制梯度胶板 (厚1.0 mm、15孔)、NUPAGE MES SDS缓冲液 (20×) 购于英潍捷基 (上海) 贸易有限公司；二甲基亚砜、4-羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)、苯甲烷磺酰氟 (PMSF) 、十二烷基磺酸钠 (SDS) 购于北京索莱宝科技有限公司。二甲苯、中性树胶购于国药集团化学试剂有限公司；环保脱蜡液、HE染液、油红染液、苏木素染液分化液、返蓝液、甘油明胶封片剂 购于武汉赛维尔生物科技有限公司。其他均为实验室常用试剂。

1.2   试剂配制

配制磷酸盐缓冲液 (PBS)、蔗糖溶液 (2.5 mol·L⁻¹)。

苯甲基磺酰氟 (PMSF) (0.2 mol·L^–1)：将0.35 g PMSF溶解于10 mL二甲基亚砜，−20 ℃下避光保存。

缓冲液A (Buff A)：1.79 g Tricine用400 mL去离子水溶解，用氢氧化钾 (KOH) 调pH至7.8；加入50 mL蔗糖溶液(2.5 mol·L⁻¹)，定容至500 mL。

缓冲液B (Buff B)：0.95 g HEPES、1.49 g 氯化钾 (KCl) 和0.038 g 氯化镁 (MgCl₂)，用180 mL去离子水溶解， 用KOH 调pH至7.4，定容至200 mL。

1.3   仪器与设备

H1850R冷冻离心机 (湖南湘仪公司)；IKA-T25均质机 (德国IKA公司)；D1008E掌上离心机 [大龙兴创实验仪器(北京)股份公司]；SYNERGY/H1酶标仪 (美国伯腾公司)； Alpha1-4冷冻干燥机 (德国Christ公司)；DYY-6C型电泳仪 (北京六一生物科技有限公司)；Mini Gel Tank PAGE电泳系统、CRYOSTAR NX5O冰冻切片机(美国赛默飞科技公司)；J-12J脱水机、JB-P5包埋机、JB-L5冻台 (武汉俊杰电子有限公司)；RM2016病理切片机、LEICA 819切片刀(上海徕卡仪器有限公司)；KD-P组织摊片机 (浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；Nikon Eclipse E100正置光学显微镜、NIKON DS-U3成像系统 (日本尼康)；其他均为实验室常用设备。

1.4   方法

1.4.1   肠系脂肪样品处理

参考Tian等^[23]的方法并稍加改动。取罗非鱼肠系脂肪，用PBS洗涤3次，沥干水分，备用。

1.4.2   肠系脂肪H&E染色与观察

参考Tian等^[23]和崔留娟^[26]的方法并进行调整。取肠系脂肪用 4% (质量分数) 多聚甲醛固定48 h，用75%~95% (体积分数)乙醇进行梯度脱水，二甲苯进行透明处理，石蜡固定、切片。切片样品经二甲苯脱蜡、无水乙醇脱水后，进行苏木素染色、分化液分化、返蓝液返蓝、伊红染色，再进行脱水和透明处理，用中性树胶封片。显微镜进行观察与分析。

1.4.3   肠系脂滴提取

参考Tian等^[23] 、Ding等^[25]和Mirza等^[27]的方法，提取过程见图1。取3 g脂肪样品置于离心管中，加入10 mL Buff A和0.2 mL PMSF均质，冰浴放置20 min，匀浆液为全细胞裂解液 (Whole cell lysate, WCL)。将匀浆液于4 ℃条件下进行二次离心，首次离心 (1 000×g) 后取上层液 (Supernatant, S) 进行再次离心 (3 000×g) ，2次离心时间均为10 min，经2次离心后获得的上清液为去核上清液1 (Postnuclear supernatant 1, PNS1)。将PNS1与Buff B (5 mL)混合，离心 (45 min, 4 ℃, 10 200×g)，收集粗脂滴。将粗脂滴用5 mL Buff B混合充分后进行重悬处理 (10 min, 4 ℃, 10 200×g)，脂滴重悬步骤重复3次。

图  1  肠系脂肪组织脂滴提取过程

Figure  1.  Extraction process of lipid droplet in intestinal adipose tissue

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1.4.4   脂滴相关蛋白 (LDRP) 增溶

1) 溶解剂增溶。参考Brasaemle 和Wolins^[28]的方法并进行调整。取0.1 g脂滴，加入1 mL 10% (质量分数) SDS超声水浴孵化1 h，期间每隔10 min将样品用涡流搅拌器搅拌5 s。孵化结束后常温离心10 min (10 200×g) ，收集下层清液。

2) 脱脂增溶。参考闫峻等^[24] 、Brasaemle和Wolins^[28]及郭玉^[29]的方法并调整。取0.1 g脂滴，加入−80 ℃预冷的丙酮1 mL，−20 ℃孵育过夜后，4 ℃离心 (10 200×g) 60 min去上清。沉淀先后经1 mL丙酮、丙酮-乙醚混合溶剂 (V∶V=1∶1) 及乙醚溶解后进行离心处理，3次离心温度均为4 ℃，低速长时离心参数为4 300×g，30 min，高速短时离心参数为10 200×g，10 min。干燥后的样品加100 μL去离子水复溶进行分析。

1.4.5   蛋白质含量测定

一般样品用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定。溶解增溶后的蛋白质溶液稀释10倍后，用Bradford蛋白浓度测定试剂盒 (去垢兼容型) 测定浓度。

1.4.6   SDS-PAGE凝胶电泳

参考郭玉^[29]、闫峻等^[24]和Huang等^[30]的方法并调整，用12% (质量分数) 的预制凝胶进行SDS-PAGE分析。取20 μL蛋白样品溶液与5 μL的上样缓冲液 (5×) 混合，98 ℃变性5 min，上样量为10 μg或10 μL。120 V恒压90 min，电泳结束用考马斯亮蓝染液进行染色和脱染色。条带的相对分子量与标准蛋白Maker (10~170 kD) 进行比较确定。

1.5   数据分析

实验重复3次，使用SPSS 22.0软件对数据进行单因素方差分析和差异显著性 (P<0.05) 分析，采用Origin 2021b 软件绘图。

2.   结果

2.1   肠系脂肪细胞特点

由图2可见，肠系脂肪细胞排列紧密，形状呈圆形或椭圆形。大量的脂质空泡说明肠系脂肪细胞含量丰富，其他细胞器含量低。王雅文^[31]和林婉玲等^[32]认为鱼类肠系脂肪在代谢方面表现比较不活跃，主要的功能是储能，所以脂质沉积更多。

图  2  肠系脂肪组织学观察

Figure  2.  Histological observation of tilapia's mesenteric adipose tissue

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2.2   脂滴的提取过程

如图3-a所示，经过细胞裂解步骤，最初的混合溶液 (I) 浑浊呈橘粉色，粗脂滴分布不均，部分脂质黏附在试管壁上。经过初步离心分离后 (II)，裂解液分层，脂滴上浮，下层溶液浑浊，底部有未破碎的肠脂组织薄膜^[33]。经过二次离心 (III)，脂滴上浮，溶液明显分层，说明细胞核、细胞碎片和未破碎的细胞除去较为彻底^[23,25]。经过10 200×g离心分离后 (IV)，分为4个部分，由上至下依次为黄色油状物、微黄色脂滴、透明溶液和沉淀物。取脂滴层进行3次重悬之后 (V—VII)，脂滴从微黄色变成乳白色，下层溶液基本无沉淀。初步判断经过以上步骤可以获得较为纯净的脂滴。

图  3  脂滴提取过程

Figure  3.  Extraction process of lipid droplet

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为进一步判断肠系脂肪组织脂滴提取过程中杂质的去除情况，收集脂滴提取过程中各步骤的样品，分别为WCL、S、PNS1-5、Cyto和TM，用SDS-PAGE进行分析，结果如图3-b所示。WCL和S条带相似，说明WCL经1 000×g离心仅去除了少量质量较大的未破碎的肠系脂肪组织外膜，其上层液S与WCL蛋白组成未发生明显变化 。PNS1的蛋白质条带颜色变深，因为3 000 ×g离心将更多的杂质沉淀分离出来，所以条带丰度明显增加^[34-35]；PNS1在100 kD附近的条带比WCL和S要明显， PNS2与PNS1相比100 kD附近的条带减弱，说明脂滴得到进一步纯化。Cyto和TM的条带组成类似，35 kD附近出现了WCL和S没有的蛋白质条带，说明通过3次离心能将破碎细胞膜等杂质充分沉淀。经过重悬处理后PNS3—PNS5的电泳条带几乎消失，表明脂滴纯化基本完成。闫骏等^[24]、Jolivet等^[36]和Ding等^[37]均认为离心和重悬操作有利于脂滴提纯。肠系脂肪经过提取纯化后，脂滴的提取率约为55%。

2.3   脂滴蛋白的增溶

脂滴由疏水核心和磷脂单分子层组成，疏水核心中最主要的物质是三酰基甘油^[38]。有研究表明，LDRP可能通过两亲性螺旋的疏水侧与磷脂单分子层紧密结合^[39]，通过一般的离心步骤无法将LDRP与脂质部分很好地分开。因此，需要将LDRP增溶，使LDRP与脂质分离。增溶方式主要分为溶解剂增溶和脱脂增溶2种。

2.3.1   溶解剂增溶

本实验在SDS与超声的共同作用下，将LDRP从脂滴上洗脱下来，经过离心后得到含LDRP清液。离心后上层不溶于水的白色物质为脂质层，下层微浑浊的溶液为LDRP。王丽娜等^[40]研究认为脂质被表面活性剂完全溶解后下层溶液呈澄清透明状，而本实验的下层溶液微浑浊，推测脂滴未能完全增溶。

取LDRP清液进行SDS-PAGE分析。图4-b结果显示LDRP清液蛋白质条带少、颜色浅且有拖尾的现象，说明溶解剂增溶的效果不理想。这可能是由于LDRP堆积在电泳孔道中，不能充分迁移到凝胶中^[28]；也可能是高浓度SDS溶液使LDRP构象改变^[40-41]。

图  4  溶解剂增溶

Figure  4.  Solubilization by solubiliser

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2.3.2   脱脂增溶

脱脂增溶结果如图5所示，增溶后蛋白质条带多且清晰、丰度高，说明脱脂增溶的效果较理想。

图  5  脱脂增溶的SDS-PAGE分析

Figure  5.  SDS-PAGE analysis of delipidation and solubilization

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2.3.3   溶解剂增溶与脱脂增溶的比较

图6为两种增溶处理后样品蛋白含量分析结果。由图可知溶解剂增溶提取的LDRP蛋白浓度高，但电泳时蛋白质条带少、拖尾明显，说明溶解剂增溶对脂质的脱除效果不理想。

图  6  溶解剂增溶和脱脂增溶的LDRP质量浓度

Figure  6.  LDRP's mass concentration of solubilization by solubiliser and delipidation and solubilization

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2.3.4   影响脱脂增溶的因素

1) 增溶步骤对增溶效果的影响。脂滴样品先后经低温丙酮、常温丙酮、丙酮-乙醚混合溶剂 (V∶V=1∶1) 及乙醚处理，分析各步骤处理对LDRP的增溶效果，结果见图7-a。经过冷冻丙酮增溶后，复溶时试管壁上有大量附着物，复溶溶液呈浑浊状，说明单一丙酮增溶脂质去除效果差；经常温丙酮二次增溶处理后，增溶样品复溶效果略好于单一冷冻丙酮处理，虽然仍存在脂滴附壁现象，但部分溶解液澄清透明 (见黑框透明三角形区域)；经过丙酮-乙醚混合溶剂脱脂后，试管壁有少量点状附着物存在 (见黑框方形区域)；经过乙醚再次增溶后，试管壁几乎无附着物残留，增溶样品能完全溶于水中。对脱脂增溶得到的LDRP进行SDS-PAGE和蛋白浓度分析，见图7-b和图7-c。由结果可知冷冻丙酮脱脂增溶后得到的LDRP质量浓度最低，且蛋白条带丰度低，25 kD以下的小分子量蛋白质缺失；随着脱脂步骤的增加，LDRP蛋白质量浓度变化差异不明显 (P<0.05)，结合复溶效果选择4组溶解剂协同处理。

图  7  脱脂增溶过程分析

Figure  7.  Analysis of process of delipidation and solubilization

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2) 离心和干燥的方式对增溶效果的影响。离心和干燥是增溶过程中必不可少的步骤。根据现有研究报道，离心方式分为低速长时离心 (4 300×g, 30 min) 和高速短时离心 (10 200×g, 10 min)。干燥可采用氮吹、冻干、自然风干。离心和干燥方式对LDRP增溶的影响结果见图8。SDS-PAGE电泳图表明不同离心和干燥方式的LDRP蛋白条带基本一致 (图8-a)，蛋白丰度也无显著变化；蛋白浓度分析也表明离心和干燥方式对增溶的LDRP含量影响差异不显著 (P<0.05，图8-b)。说明离心方式和干燥方式不会影响LDRP提取增溶效果，研究中可根据条件进行选择。

图  8  离心和干燥方式对脱脂增溶的影响

Figure  8.  Effects of centrifuge and drying method on delipidation and solubilization

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3) 冷冻对于脱脂增溶的影响。为分析提取后脂滴存放是否会影响后续LDRP增溶，以新鲜脂滴样品和冷冻脂滴样品 (−20 ℃, 7 d) 为原料，经上述增溶处理提取LDRP。由结果可知新鲜脂滴样品和冷冻脂滴样品的LDRP条带无显著性差异 (图9-a)，样品间LDRP浓度无显著性差异 (图9-b)，说明脂滴在−20 ℃冷冻储藏7 d不会影响后续LDRP的增溶。有报道称冷冻脂滴进行增溶处理后，得到的LDRP回收率低^[23,28]，与本实验结果略有差异，这可能与实验冷冻时间有关。本实验发现冷冻脂滴样品试管底部出现少量水分，这可能是由于冷冻贮藏过程中，脂滴之间发生聚集所致^[42-44]。

图  9  冷冻对脱脂增溶的影响

Figure  9.  Effect of freezing on delipidation and solubilization

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3.   讨论

3.1   脂滴提取

脂滴几乎存在于所有动植物中，但不同物种、部位所含脂滴量不同^[32]，提取方法也有差异。鱼类脂滴存储位点主要有肠系脂肪组织、肝胰脏、腹部两侧脂肪块^[45]。故本文选择脂滴丰富的肠系脂肪组织作为研究对象。

提取脂滴是利用脂滴中性酯密度小的特征^[46]，通过离心和重悬等操作，使脂滴能够浮于水溶液顶部。为保护细胞器，提取中会使用含有蔗糖的Buff A进行均质；为保护脂滴和LDRP不被酶解，加入PMSF防止蛋白酶进行分解^[47-48]；通过梯度离心后，脂滴得以悬浮在液面顶部，这时得到的脂滴仍然有杂质的存在。向脂滴中加入Buff B进行洗涤，3次重悬后，脂滴中的杂质多数被去除。离心过程保留了绝大部分脂滴，但有部分尺寸特小和特大的脂滴丢失^[25]。

3.2   LDRP的增溶

SDS溶液是常用的蛋白质提取增溶剂，其增溶原理是利用SDS的表面活性剂特征^[49]，溶解磷脂，使生物膜的通透性增大，实现蛋白增溶的目的^[50]。有研究表明SDS可抑制内源蛋白酶对蛋白质的酶解，从而在蛋白质提取过程中起到保护作用^[51]。本研究在溶解增溶过程中，经孵化后的样品溶液浑浊，有大量泡沫产生 (图3-a)。这是由于SDS作为两亲性化合物本身就具有起泡性^[52]，在孵化过程中经超声及涡旋处理产生大量泡沫。

脱脂增溶的原理是利用有机溶剂溶解脂质，使蛋白质沉淀析出^[53]。 LDRP与脂质结合比较牢固，不易溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用丙酮和乙醚等有机溶剂进行增溶^[54]。脱脂增溶是目前研究较为常用的方法^[26,30]，脂滴经过脱脂增溶后，得到白色LDRP粉末。与溶解剂增溶的方式相比，脱脂增溶得到的LDRP含量虽然较低，但条带多且清晰，适宜用作LDRP的提取分析。

有研究指出LDRP的提取受离心方式的影响^[28,30]。本研究发现离心方式不会影响LDRP的提取效果，说明低速长时和高速短时的离心条件下，LDRP均能实现沉降，与有机溶剂很好地分离。同时，干燥方式也不会影响LDRP，这可能是由于有机溶剂易挥发、干燥时间短，所以LDRP不易发生变性。

虽然冷冻过后LDRP回收率低，但蛋白质条带无显著差异，说明脂滴性质仍然稳定，短时间内 (7 d) 可将脂滴置于−20 ℃冰箱中储藏，而长时间储藏则需置于−80 ℃冰箱中。

4.   结论

肠系脂肪细胞脂质丰富，适合作为研究脂滴提取方法的模板。经过3次离心、3次重悬后能得到较为纯净的脂滴。对LDRP进行分析的重要手段是SDS-PAGE凝胶电泳，不同的增溶方式对于LDRP的增溶有截然不同的效果，溶解剂增溶后的LDRP 蛋白质浓度高，有脂质残留；脱脂增溶后的LDRP条带多但蛋白质浓度低。离心方式、干燥方式和冷冻贮藏对于LDRP提取无显著性差异。