Analysis on differences of microbial community structure and main flavor substances of Cyprinus carpio var. Jinbei cultured in paddy fields and ponds
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摘要: 探讨不同养殖模式下金背鲤 (Cyprinus carpio var. Jinbei) 肠道菌群和鱼肉风味品质差异，对金背鲤的繁殖优化具有重要意义。采用高通量测序技术对稻田放养和池塘养殖模式下金背鲤的肠道微生物进行测序，利用液相色谱和顶空固相微萃取-气相色谱-离子迁移谱联用 (HS-SPME-GC-IMS) 技术测定其滋味物质、挥发性风味化合物，结合感觉阈值计算滋味活性值和相对气味活度值。结果显示：两种养殖模式的金背鲤肠道细菌群落结构差异显著，稻田放养 (FGF) 组以弧菌 (Vibrio)、拟杆菌 (Bacteroides)、交替单胞菌 (Alteromonadales)、希瓦氏菌 (Shewanella)、嗜冷假单胞菌 (Pseudomonas psychrophile) 和Brevinema属为主，池塘养殖 (FGP) 组以莫拉克斯氏菌 (Moraxella) 和克雷伯菌属 (Klebsiella) 为主；FGF组中鲜味肌苷酸含量及其滋味活性值 (1.676 g·kg−1, 6.705) 远高于FGP组 (0.246 g·kg−1, 0.985)，FGF组鲜味氨基酸和甜味氨基酸含量 (0.143和2.052 g·kg−1) 高于FGP组 (0.109和2.001 g·kg−1)，而其苦味氨基酸 (3.193 g·kg−1) 却低于FGP组 (3.836 g·kg−1)；金背鲤的挥发性化合物组分复杂，其关键气味化合物 (ROAV≥1) 和对整体风味有修饰作用的化合物 (0.1≤ROAV<1) 的种类存在差异。菌属与风味物质的相关性分析显示弧菌属、拟杆菌属、克雷伯菌属和摩根菌属 (Morganella) 与风味物质呈显著相关 (0.01≤P<0.05 & 0.001≤P<0.01 & P<0.001)。研究表明，养殖模式影响了金背鲤的肠道微生物，并间接影响了其风味品质。Abstract: It is important to study the differences of intestinal flora and fish flavor quality of Cyprinus carpio var. Jinbei under different culture modes for its breeding optimization. We applied illumina high-throughput sequencing technology to analyze intestinal microflora of C. carpio var. Jinbei cultured in paddy fields (FGF) and ponds (FGP), respectively. Besides, we used liquid chromatography (LC) to determine the flavor substances, and used headspace solid phase microextraction combining with gas chromatography-ion mobility spectrometry (HS-SPME-GC-IMS) to determine the volatile flavor substances. Then we calculated the taste activity value and relative odor activity by combining the sensory threshold. Significant difference analysis shows that Vibrio, Bacteroides, Alteromonadales, Shewanella, Pseudomonas psychrophila and Brevinema were the main bacteria in FGF group, while Moraxella and Klebsiella were the main bacteria in FGP group. The contents of IMP and flavor activity in FGF group (1.676 g·kg−1 and 6.705) were significantly higher than those in FGP group (0.246 g·kg−1 and 0.985). The contents of umami amino acids and sweet amino acids in FGF group (0.143 and 2.052 g·kg−1) were higher than those in FGP group (0.109 and 2.001 g·kg−1). However, the contents of bitter amino acids in FGF group (3.193 g·kg−1) were lower than those in FGP group (3.836 g·kg−1). Moreover, the components of volatile compounds were complex, and the types of key odor compounds (ROAV≥1) and compounds that could modify the overall flavor (0.1≤ROAV<1) were different. The correlation analysis between bacteria genera and flavor substances shows that Vibrio, Bacteroides, Klebsiella and Morganella were significantly correlated with flavor substances (0.01≤P<0.05 & 0.001≤P<0.01 & P<0.001). The results indicate that cultivation mode affects the intestinal microbes of fish, and affects the flavor quality of fish indirectly.
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近海海域在中国经济发展中具有重要的服务功能和战略地位。随着对近海海域的开发和利用，其环境逐渐面临诸多污染问题，其中石油类污染是主要污染问题之一。据国际油轮船东防污染联合会 (International Tanker Owners Pollution Federation, ITOPF) 的数据显示，2023年约有2 000 吨石油意外泄漏到环境中。国际海事组织 (International Maritime Organization, IMO) 和国际能源署 (International energy agency, IEA) 的报告显示，全球海上运输的油品中，原油和柴油的运输占比较高[1]，因此原油和柴油污染对海洋生物的影响值得关注。此外，原油和柴油可以引起鱼类代谢紊乱、心脏速率减缓，甚至幼鱼发育畸形等问题[2]；也会对多毛类[3]、虾类[4]、海洋藻类[5]、贝类[6]等生物的生长发育造成影响。因此，研究溢油污染对海洋生物生长发育的毒性效应，对保护海洋生态环境和渔业经济具有重要意义。
生物标志物是指环境因子对生物体产生的影响所导致的可测定变化，具有高敏感性的特点[7]。抗氧化酶系统和基因表达水平常用作生物标志物，指示污染及评估其生物毒性效应。蒋凤华等[8]使用超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化氢酶 (CAT) 2种抗氧化酶生物标志物评估了不同浓度原油水溶性组分 (Water soluble fraction of crude oil, WSF) 对栉孔扇贝 (Chlamys farreri) 鳃和消化腺的毒性效应，结果显示SOD和CAT的活性随WSF暴露时间的增加呈降低-升高-降低的趋势；Xia等[9]通过测定菲律宾蛤仔 (Ruditapes philippinarum) 的抗氧化酶活性，发现石油类污染与该生物标志物之间存在剂量-效应和时间-效应关系。
综合生物标志物响应 (Integrated biological response, IBR) 指数通过将多个生物标志物与图形结合，从而更全面地判断生物的毒性响应，评估生态系统的健康状态[10]。Wang等[11]通过IBR指数评价重金属汞对鲢 (Hypophthalmichthys molitrix) 幼体的慢性毒性效应，发现汞会降低其抗氧化能力，导致机体功能受损；Jiang等[12]使用IBR指数评估缢蛏 (Sinonovacula constricta) 4种抗氧化酶对柴油和原油含水馏分 (Water accommodated fraction, WAF) 的氧化应激反应，结果显示不同浓度的石油污染物对4种抗氧化酶的诱导程度不同，且柴油的毒性大于原油。
凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 又名南美白对虾，其生长快、抗逆性强、出肉率高且经济价值高，是全球养殖产量最高的经济虾类，2023年中国的养殖产量达220万吨[13]。凡纳滨对虾作为具有开放式血淋巴管系统的变温动物，其生理状态更易受到水体环境变化的影响[14]。本研究探讨了LH原油和0# 柴油对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性及相关功能基因表达的影响，以期为评估石油类污染对海洋生物的毒性效应提供基础数据支持。
1. 材料与方法
1.1 实验生物
凡纳滨对虾来自中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地，平均体质量为(6.50±0.21) g。正式实验前，将对虾置于室内300 L养殖桶中暂养7 d，养殖期间保持水温 (29.2±0.5) ℃、盐度30‰、pH 7.8~8.0，24 h连续充气，每天早晚各投喂1次，每日对虾配合饲料投喂量为虾体质量的5%，对虾日死亡率低于1‰ 时开始正式实验。
1.2 实验试剂及母液制备
1.2.1 试剂
南海LH原油来源于中国南海流花油田；0# 柴油采购自广州市加油站；富肯-3号溢油分散剂由广州富肯环保科技有限公司提供；正己烷、乙醇、乙醚等试剂购自国药控股广州有限公司，均为分析纯。
1.2.2 南海LH原油和0# 柴油母液及工作液制备
南海LH原油和0# 柴油乳化母液的配制方法参考文献 [15]：将分散剂分别按体积比1∶1与南海LH原油、0# 柴油混合后，置于超声波洗涤器中超声处理5 min，然后将混合液按体积比1∶10与过滤海水混合，连续超声处理3 h，再置于分液漏斗中静置3 h，取其下层水相液置于棕色瓶中，即为LH原油和0# 柴油母液。制备后的LH原油和0# 柴油母液参照GB 17378.4—2007《海洋监测规范 第4部分：海水分析》，采用紫外分光光度计法测定石油烃含量。在每次配制工作液前，先测定1次母液的石油烃浓度，随后使用分散剂梯度稀释母液用于制备实验用工作液，以保证每组工作液中分散剂浓度一致。工作液均为现用现配。
1.3 胁迫实验及样品采集
根据前期本实验室开展的急性毒性实验结果[15]，LH原油和0# 柴油均设置3个实验浓度组，分别为低浓度组 (A组，25 μg·L−1)、中浓度组 (B组，50 μg·L−1) 和高浓度组 (C组，250 μg·L−1)，和1个分散剂对照组 (D组，0 μg·L−1)。将240尾对虾分为4组，每组3个平行，每个平行20尾。连续胁迫15 d，每8 h换水1次，换水后使用工作液调节石油烃浓度至所设置浓度，分别于胁迫第1、第7和第15天在投喂及换水前取样，每组6尾，取肝胰腺迅速在液氮中冷冻，并储存于 −80 ℃冰箱。
1.4 样品处理及生理指标测定
将对虾肝胰腺取出，液氮研磨后分为2份，分别用于生理指标测定和基因表达分析。按照试剂盒说明书 (南京建成生物工程研究所) 测定SOD、CAT、过氧化物酶 (POD)、谷胱甘肽S转移酶 (GST)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx) 的活性及还原型谷胱甘肽 (GSH) 的含量。
1.5 基因表达分析
根据已发表的文献，以凡纳滨对虾Lvactin为内参基因，选择细胞凋亡因子caspase2—caspase5、延伸因子 (EF)、SOD、CAT、GPx、过氧化物还原酶 (Prx)、酚氧化酶原 (proPO) 和溶菌酶 (LZM) 基因进行表达量的测定。引物序列见表1。
表 1 荧光定量PCR引物Table 1. Primers for fluorescent quantitative PCR引物名称
Primer引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'−3')退火温度
Annealing temperature/
℃参考文献
Reference引物名称
Primer引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'−3')退火温度
Annealing temperature/
℃参考文献
ReferenceLvcasp2-F ATGGCTCGTGGTTCATTCAG 57.8 [16] LvCAT-F ATCCATTCGACCTTACCA 52.7 [17] Lvcasp2-R CATCAGGGTTGAGACAATACAGG 60.2 [16] LvGPx-F GGCACCAGGAGAACACTAC 59.7 [17] Lvcasp3-F AGTTAGTACAAACAGATTGGAGCG 58.6 [16] LvCAT-R ACGCAATCTGCTCCACCT 57.3 [17] Lvcasp3-R TTGTGGACAGACAGTATGAGGC 60.1 [16] LvGPx-R CGACTTTGCCGAACATAAC 55.4 [17] Lvcasp4-F CATGCTTGACATACCCGATG 57.8 [16] LvPrx-F AGGAAGGTGGTCTTGGTACA 57.8 [17] Lvcasp4-R TGTCCGGCATTGTTGAGTAG 60.2 [16] LvPrx-R GCAGATCATTGATTGTTACCT 54.1 [17] Lvcasp5-F GAAGGAGTGAAGCTAAACGAGAC 60.3 [16] LvPro-F CGGTGACAAAGTTCCTCTTC 57.8 [18] Lvcasp5-R CAGTAGACCAGCAGATAAGGAAGT 61.9 [16] LvPro-R GCAGGTCGCCGTAGTAAG 59.6 [18] LvEF-1α-F GAAGTAGCCGCCCTGGTTG 61.9 [16] LvLZM-F GGACTACGGCATCTTCCAGA 59.8 [18] LvEF-1α-R CGGTTAGCCTTGGGGTTGAG 61.9 [16] LvLZM-R ATCGGACATCAGATCGGAAC 57.8 [18] LvSOD-F GAATTGGGTGAGGAACGA 55.0 [17] Lvactin-F CAAGATGTGTGACGACGAAG 57.8 [17] LvSOD-R ATGTAGCCCTGGTGATGC 57.3 [17] Lvactin-R AGCTCGTGGTGCATCGTC 59.6 [17] 1.6 荧光定量PCR
采用TaKaRa SYBR® Green I荧光定量试剂盒在罗氏LC480荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR分析，体系配制及PCR反应条件参照试剂盒说明书。
1.7 数据分析
荧光定量结果分析使用2−ΔΔCt法计算基因的相对表达量[19]；IBR指数采用第二代综合生物标志物响应法 (Integrated biological response version 2, IBRv2)，计算方法参照文献 [20-21]；实验数据用Excel 2019软件进行统计整理，以“平均值±标准差 ($\overline { x}\pm s $)”表示；利用IBM SPSS 19.0软件进行单因素方差分析 (One-way ANOVA)，差异显著性通过Tukey's HSD法检验，显著性水平α为 0.05；采用GraphPad Prism 9.0和Origin 2021软件制图。
2. 结果
2.1 生理指标分析
随LH原油胁迫时间的延长，中、高浓度组SOD、CAT、POD、GST和GPx活性总体呈升高趋势，并显著高于对照组 (p<0.05)，表现出一定的时间-效应和剂量-效应 (图1)。低浓度组SOD、CAT、GST和GPx活性在第1和第7天均与对照组无显著性差异 (p>0.05)。GSH含量总体呈先上升后下降的趋势，各浓度组均在第7天达到最大值，在第15天时各浓度组GSH含量均显著低于对照组 (p<0.05)。
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图 1 不同浓度LH原油乳化液对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶的影响注：* 表示组间存在显著性差异 (p<0.05)；** 表示组间存在非常显著性差异 (p<0.01)；*** 表示组间存在极显著性差异 (p<0.001)。Figure 1. Effects of LH crude oil emulsion on hepatopancreatic antioxidant enzyme activities of L. vannameiNote: * represents significant differences among the groups (p<0.05); ** represents very significant differences among the groups (p<0.01); *** represents extremely significant differences among the groups (p<0.001).随0# 柴油胁迫时间的延长，SOD、CAT、GST活性和GSH含量均显著低于对照组 (p<0.05)，表现出一定的时间-效应关系 (图2)。中、高浓度组POD活性总体呈先升高后降低的趋势，至胁迫后期 (第15天) 各浓度组均显著低于对照组 (p<0.05)。GPx活性总体呈上升趋势，各浓度组均在第15天达最大值 (p<0.05)。
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图 2 不同浓度0# 柴油乳化液对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶的影响注：* 表示组间存在显著性差异 (p<0.05)；** 表示组间存在非常显著性差异 (p<0.01)；*** 表示组间存在极显著性差异 (p<0.001)。Figure 2. Effects of No.0 diesel oil emulsion on hepatopancreatic antioxidant enzyme activities of L. vannameiNote: * represents significant differences among the groups (p<0.05); ** represents very significant differences among the groups (p<0.01); *** represents extremely significant differences among the groups (p<0.001).2.2 相关功能基因表达分析
随LH原油胁迫时间的延长，中、高浓度组SOD、CAT和GPx基因表达量逐渐上升并显著高于对照组 (p<0.05)；中、高浓度组LZM、EF、proPO表达量呈先上升后下降的趋势；各浓度组caspase2、Prx表达量均显著低于对照组 (p<0.05，图3)。
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图 3 不同浓度LH原油乳化液对凡纳滨对虾肝胰腺功能基因表达的影响注：* 表示组间存在显著性差异 (p<0.05)；** 表示组间存在非常显著性差异 (p<0.01)；*** 表示组间存在极显著性差异 (p<0.001)。Figure 3. Effects of LH crude oil emulsion on hepatopancreatic relative gene expression of L. vannameiNote: * represents significant differences among the groups (p<0.05); ** represents very significant difference among the groups (p<0.01); *** represents extremely significant differences among the groups (p<0.001).随0# 柴油胁迫时间的延长，各浓度组SOD表达量呈先升高后下降的变化趋势；高浓度组CAT、LZM、caspase2、EF表达量呈下降趋势；低、高浓度组Prx和各浓度组proPO表达量呈先下降后升高的趋势；至胁迫第15天，SOD、CAT、LZM、caspase2表达量被显著抑制 (p<0.05)，而GPx、Prx、proPO和低、中浓度组EF表达量均显著高于对照组 (p<0.05，图4)。
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图 4 不同浓度0# 柴油乳化液对凡纳滨对虾肝胰腺功能基因表达的影响注：* 表示组间存在显著性差异 (p<0.05)；** 表示组间存在非常显著性差异 (p<0.01)；*** 表示组间存在极显著性差异 (p<0.001)。Figure 4. Effects of NO.0 diesel oil emulsion on hepatopancreatic relative gene expression of L. vannameiNote: * represents significant differences among the groups (p<0.05); ** represents very significant differences among the groups (p<0.01); *** represents extremely significant differences among the groups (p<0.001).2.3 综合生物标志物响应 (IBR) 变化
不同浓度LH原油和0# 柴油胁迫下，凡纳滨对虾肝胰腺生物标志物IBRv2结果如图5所示。胁迫第1天时，高浓度组均具有最大覆盖面积；胁迫第7天时，中浓度组均具有最大覆盖面积；胁迫第15天时，原油中浓度组覆盖面积最大，柴油低浓度组覆盖面积最大。
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图 5 LH原油和0# 柴油乳化液胁迫下凡纳滨对虾生物标志物IBRv2分析注：抗氧化酶指标包括SOD、CAT、POD、GST、GPx及GSH；基因表达指标包括SOD、CAT、GPx、LZM、caspase2、Prx、EF及proPO；a—c分别代表LH原油胁迫组第1、第7和第15天各生物标志物的IBRv2分析；d—f分别代表0# 柴油胁迫组第1、第7和第15天各生物标志物的IBRv2分析。Figure 5. IBRv2 analysis of biomarkers in L. vannamei after exposure to emulsion of LH crude oil and No.0 diesel oilNote: The antioxidant enzyme indicators include SOD, CAT, POD, GST, GPx and GSH, and the gene expression indicators include SOD, CAT, GPx, LZM, caspase2, Prx, EF and proPO. a−c and d−f represent the IBRv2 analysis of the biomarkers in the LH crude oil and NO.0 diesel oil exposure groups on 1st, 7th and 15th day, respectively.LH原油胁迫第1天时，低浓度组对Prx表达量有较大影响，中、高浓度组对EF、CAT表达量影响较大；第7天时，EF表达量在低浓度组中的响应水平较高，POD活性在中浓度组中的响应水平较高，CAT活性及其基因表达量在高浓度组中的响应水平较高；第15天时，GPx活性及其基因表达量在各浓度组中均有较高的响应水平。在0# 柴油胁迫的3个时间节点中，各浓度组GPx活性及其基因表达量均有较高的响应水平；胁迫第1天时，CAT表达量在低浓度组中的响应水平较高；第15天时，高浓度组caspase2基因表达量和CAT活性均有较高的响应水平。
对14种生物标志物的偏差系数绝对值进行求和，得到IBRv2值 (图6)。随LH原油和0# 柴油胁迫浓度的增加和时间的延长，IBRv2值呈剂量-效应和时间-效应关系。在胁迫的3个时间点中，其IBRv2值大小均为低浓度组<中浓度组<高浓度组；在相同浓度的LH原油和0# 柴油胁迫下，其IBRv2值随胁迫时间的延长呈升高趋势，均表现为第1天<第7天<第15天，且柴油组生物标志物基因表达量的IBRv2值变化范围均大于原油组。
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图 6 LH原油 (a) 和0# 柴油 (b) 胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺生物标志物IBRv2值的时间变化 (n=6)Figure 6. Variation of IBRv2 along with exposure time in hepatopancreatic biomarkers of L. vannamei underLH crude oil (a) and No.0 diesel oil (b) stress (n=6)2.4 生物标志物PCA分析
对LH原油胁迫下的14个生物标志物进行PCA分析 (图7-a)，主成分1 (PC1) 和主成分2 (PC2) 分别解释了总变异的46.81%和15.32%。其中，PC1与SOD、CAT、GPx的活性和表达量具有较强的相关性，上述抗氧化酶活性及其基因表达量与中、高浓度组LH原油的长期胁迫 (15 d) 具有较强的相关性；PC2与EF、caspase2基因表达有关，说明低浓度组长期胁迫及高浓度组短期胁迫 (1 d) 与延伸因子、细胞凋亡因子有较强的相关性。
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图 7 LH原油 (a) 和0# 柴油 (b) 乳化液胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺中生物标志物的PCA分析注：抗氧化酶指标包括SOD、CAT、POD、GST、GPx和GSH；基因表达指标包括SOD、CAT、GPx、LZM、caspase2、Prx、EF及proPO。图中不同颜色的点分别代表各胁迫组，例如7-a中的红点“A15d”代表低浓度组 (A组，25 μg·L−1) 原油胁迫凡纳滨对虾15 d，其他颜色的点以此类推。Figure 7. Results of PCA analysis of biomarkers in hepatopancreas of L. vannamei exposed to emulsion of LH crude oil (a) and No.0 diesel oil (b)Note: The antioxidant enzyme indicators include SOD, CAT, POD, GST, GPx and GSH, the gene expression indicators included SOD, CAT, GPx, LZM, caspase2, Prx, EF and proPO. The different colored dots represent the stress groups. For example, the red dot "A15d" in Fig. 7-a means that the low concentration group (group A, 25 μg·L−1) of crude oil was stressed for 15 d, and the other colored dots are similar.对0# 柴油胁迫下的14个生物标志物进行PCA分析 (图7-b)，PC1解释了40.56%，与SOD、CAT、GSH活性和caspase2、proPO表达量的相关性较强，表明低、中浓度组短期胁迫和高浓度组长期胁迫对抗氧化酶活性、酚氧化酶原系统和细胞凋亡基因的影响较大；PC2解释了19.02%，与POD活性和GPx、SOD表达量相关性较强，表明中浓度组长期胁迫 (7 d) 和高浓度组短期胁迫对抗氧化酶的影响较大。
3. 讨论
3.1 LH原油和0# 柴油对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性的影响
在环境胁迫下，生物机体会通过氧化代谢产生过量的活性氧自由基 (Reactive oxygen species, ROS)，当ROS含量超过机体的清除能力将引发氧化应激反应，从而损伤细胞膜、使酶失活，并造成遗传物质等重要细胞成分氧化损伤，进一步诱导细胞凋亡[22]。研究表明，肝胰腺由于在消化、物质储备、脂质代谢、解毒等方面具有较高的代谢率，因此在环境胁迫中更容易受到氧化应激的影响[23]。
本研究中，SOD、CAT活性随着LH原油浓度的增加和胁迫时间的延长而逐渐上升，可能是由于机体在LH原油长期胁迫下，应激生成大量SOD、CAT用于清除过量的ROS，以减轻污染物胁迫所带来的伤害。相似的结果在李磊等[24]的研究中也有体现，在0.45和0.05 μg·L−1苯并[a]芘 (BaP) 胁迫下，脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 的SOD活性均逐渐上升，在第15天时2个实验组的SOD活性分别为第0天的3.04和2.38倍；王琪等[25]的研究也发现，随着菲胁迫浓度的增加，各浓度组泥鳅 (Misgurnus anguillicaudatus) 肝脏中的CAT活性显著上升。暴露于0# 柴油乳化液中第1天时，SOD、CAT活性与对照组无显著性差异，但随着胁迫时间延长和浓度增加，SOD、CAT活性逐渐降低，可能是因为在柴油胁迫初期，ROS积累远高于抗氧化酶的清除效率，造成机体损伤[26]。相似的结果也见于黑鲷 (Sparus macrocephalus) 肝脏[27]，SOD和CAT活性随0# 柴油浓度的增加和胁迫时间的延长呈下降趋势，可能是由于ROS积累使SOD和CAT的酶蛋白结构、底物亲和力等受到损伤[28]。
研究表明，生物体在轻度胁迫时POD活性通常会升高，但长期胁迫会导致氧化损伤并引发细胞病变[29]。本研究中，随着LH原油胁迫时间的延长，各浓度组POD活性呈先升后降的变化趋势，说明原油短期胁迫可激活凡纳滨对虾的抗氧化防御系统，POD活性增强以减少ROS对机体的损伤，这与李传慧[30]的研究结果一致；但高浓度组的活性比中浓度组要低，可能是因为高浓度组胁迫超出了机体的生理调节范围，对机体的刺激作用增强[31]。与原油不同，0# 柴油长期胁迫时，各浓度组POD活性均被显著抑制，说明0# 柴油长期胁迫使凡纳滨对虾肝胰腺细胞严重损伤，导致其氧化应激能力下降。
从剂量-效应和时间-效应关系分析，LH原油胁迫使GST活性逐渐上升，以减少ROS的伤害，表明机体对胁迫产生了适应性反应。而高浓度组柴油的GST活性先升后降，可能是因为在相II反应酶系中，GST与各种亲电性化合物或某些相I代谢产物结合，并催化GSH反应生成水溶性的GSH硫结合物，起到脱毒作用。但高浓度组长期胁迫削弱了结合能力，破坏氧化还原平衡而抑制了GST活性。相似的结果在张先勇等[32]和任加云等[33]的研究中也有体现，BaP长期胁迫马氏珠母贝 (Pinctada martensii) 导致GST活性降低，多环芳烃 (PAHs) 长时间胁迫栉孔扇贝也会抑制其GST活性。
在本研究中，GPx活性与2种石油污染物之间呈显著的时间-效应和剂量-效应正相关关系。GSH含量在石油类短期胁迫中显著上升，可能是因为GPx催化GSH将过氧化氢 (H2O2) 分解为水，使得GPx活性增加，从而加速GSH对H2O2 的分解以清除过量的ROS[34]。随着柴油胁迫时间的延长，GSH含量显著下降，可能是由于GSH与石油烃中的有毒物质结合解毒，或是GSH在清除ROS时被GPx催化为了二硫化谷胱甘肽 (Glutathione disculfide, GSSG)[35-36]。
从2种石油对SOD、CAT、POD活性的时间影响来看，柴油各浓度组的最大诱导出现的时间 (第1天) 要早于原油 (第7和第15天)，且在胁迫15 d后，柴油组抗氧化酶 (除GPx外) 的活性基本低于对照组，0# 柴油对酶活性的影响更显著，这与黄南建等[15]的研究结果一致。2种石油的毒性差异可能是由于其所含组分不同；通常，柴油中的饱和烷烃和芳香烃占比均高于原油[37]，因此0# 柴油对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性的影响大于LH原油。
3.2 LH原油和0# 柴油对凡纳滨对虾肝胰腺功能基因表达的影响
本研究中，凡纳滨对虾在低浓度组石油污染物胁迫下，SOD和CAT基因表达的显著诱导时间 (1 d) 早于其酶活性，且在高浓度组LH原油胁迫下，抗氧化酶的基因表达量诱导倍数也大于酶活性的诱导倍数，说明相关功能基因表达量作为生物标志物可能具有更高的敏感性。在镉 (Cd)胁迫暗纹东方鲀 (Takifugu obscurus)[38]和锌离子 (Zn2+) 胁迫花斑裸鲤 (Gymnocypris eckloni)[39]的研究中也有体现，SOD、CAT、GPx表达量在肝脏中显著升高，表明相关功能基因表达量可能是氧化应激反应的重要生物标志物。
氧化应激会改变caspase家族等凋亡相关基因的表达，从而诱导细胞凋亡[40]，其中的caspase2是关键基因。在本研究中，caspase2表达量在2种石油污染物胁迫下均呈现先升高后下降的趋势，高浓度组显著低于对照组，可能是胁迫初期机体上调基因表达应对初步损伤并诱发细胞凋亡[41-42]，随着胁迫时间延长和毒素浓度增加，细胞的应激响应被抑制，caspase2表达量下降可能意味着细胞凋亡的终止或损伤修复机制的激活。本研究中，EF表达量在LH原油胁迫下先升高后下降，可能是胁迫初期机体诱导EF表达以提高蛋白质的合成速率，修复氧化损伤，但因长期胁迫无法维持正常代谢和生理状态，导致EF表达量下降。在0# 柴油胁迫下，低、中浓度组EF表达量均显著升高，说明EF可能参与了响应氧化应激的凋亡程序，通过肌动蛋白束缚等方式保护细胞免受caspase家族介导的细胞凋亡[43]。因此，推测caspase2表达量的下降是由于EF的抑制作用；高浓度组可能导致过量的细胞毒性，损伤细胞的代谢和蛋白合成路径。
在原油和柴油的胁迫下，各浓度组LZM表达量呈先升高后下降的趋势，这与柴油胁迫虹鳟 (Oncorhynchus mykiss)[44]的研究结果一致，可能是胁迫初期凡纳滨对虾增加LZM表达量以应答环境胁迫；随胁迫时间的延长，机体生理功能紊乱，免疫能力降低，LZM表达量下降。在原油胁迫下，各浓度组proPO表达量呈先升高后下降的趋势，低浓度组表达量在暴露第7天时达到峰值，高浓度组的表达量显著低于对照组。表明凡纳滨对虾在受原油胁迫时可以激活proPO系统，产生大量的酚氧化酶 (Phenoloxidase, PO) 应对环境变化，但随胁迫时间的延长，过量ROS积累导致细胞组织受损，proPO表达量下降。这与盐碱胁迫中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 的变化趋势相似[45]。而在柴油胁迫下，proPO表达量先降再升，可能是因为柴油直接抑制了proPO，导致细胞应激反应机制暂时失调，持续胁迫后机体产生了适应并激活了免疫系统。
本研究中，原油胁迫下的Prx表达量显著低于对照组，可能是因为原油中的PAHs损伤了相关的信号传递路径，破坏了细胞的抗氧化防御系统。而柴油胁迫下的Prx表达量呈上升趋势，可能是细胞通过增加Prx表达量应对氧化应激，保护自身免受损伤。相似的结果在Zhuang等[46]的研究中也有体现，将桡足类分别暴露在2种PAHs中，1, 2-NAPH胁迫下Prx表达量显著上调，芘胁迫下则显著下调，说明生物对不同的PAHs胁迫表现出敏感性差异，会导致不同的基因表达模式。
3.3 LH原油和0# 柴油暴露对凡纳滨对虾毒性效应的IBR及PCA分析
有研究表明，一般情况下，基因表达通常在氧化应激早期迅速变化，酶活反应则较为缓慢[47]。本研究中，SOD表达量在低浓度LH原油胁迫初期已显著上升，而SOD活性在高浓度胁迫下才显著上升。在低氧胁迫鲢的研究中也有相似的结果[48]，SOD表达量在浮头组已显著上升，而SOD活性在窒息组才显著下降。说明基因表达变化可能比酶活性变化更早发生，而酶活性显著变化可能在较高浓度或长时间胁迫后才出现。
本研究的IBRv2分析结果显示，石油污染物短期胁迫凡纳滨对虾时，高浓度组对生物标志物的影响最大；随胁迫时间的延长，低、中浓度组柴油对凡纳滨对虾的影响更大，原油组则是中浓度组影响最大，高浓度组次之。在0硫柴油和平湖原油WAF分别胁迫缢蛏的研究中发现，2种油品的毒性差异源于组分不同，且柴油毒性大于原油[12]。因此，本研究中高浓度组柴油短期胁迫可能已对对虾造成了不可逆转的氧化损伤，而低、中浓度组长时间胁迫可能损伤细胞结构和功能。随2种油品胁迫浓度的增加和时间的延长，IBRv2值呈剂量-效应和时间-效应关系，类似结果在菲胁迫泥鳅的研究中也有体现[25]，其综合毒性应激水平随着菲的暴露水平和时间的增加而上升。柴油组生物标志物基因表达量的IBRv2值变化范围均大于原油组，说明其表现出了更高的响应水平。Xu等[49]和Lu等[50]的研究也表明，生物标志物基因表达量在胁迫初期就显著变化，早于酶活性。
PCA分析结果显示，LH原油和0# 柴油的长期和短期胁迫均显著影响抗氧化酶活性及其基因表达，同时也影响细胞凋亡相关基因的表达。但2种油品所影响的生物标志物存在差异：低浓度组LH原油长期胁迫和高浓度组短期胁迫显著影响EF，而低、中浓度组0# 柴油短期胁迫和高浓度组长期胁迫显著影响proPO系统。可能是由于0# 柴油含有更多低分子量的化合物和芳香烃，毒性大于LH原油[15]；EF通常与维持细胞蛋白质稳定性相关，其表达量增加是促氧化剂诱导细胞凋亡的早期事件[43]，LH原油中的芳香烃等应激因素可能会引起蛋白质氧化等细胞损伤，导致EF表达量变化[51]；而在PAHs类污染物屈 (Chrysene) 胁迫斑节对虾 (Penaeus monodon) 实验[52]中，proPO表达量显著下调，表明PAHs影响生物的生长和免疫系统。
研究表明，测定生物标志物CAT和GPx等的酶活性，可以显著区分不同养殖模式污染下的虾类[53]。在本研究中，PCA与IBRv2的分析结果相似，CAT和GPx的活性及表达量在2种油品胁迫下均受到显著影响，因此推测CAT和GPx的活性及表达量可以作为预测LH原油和0# 柴油污染暴露的早期预警生物标志物。
4. 结论
在LH原油和0# 柴油胁迫下，凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性和抗氧化防御、细胞凋亡及免疫相关基因的表达均随油品浓度增加和胁迫时间延长而显著变化，其中0# 柴油的影响更为显著，表明凡纳滨对虾对0# 柴油的敏感性高于LH原油。IBRv2值的变化也显示出不同浓度和时间下的生物毒性差异，说明该指数可作为评估不同油品污染对凡纳滨对虾综合毒性效应的有效工具。此外，CAT和GPx的活性及表达量与油品暴露有较强的相关性，推测其可作为预测石油污染暴露的早期预警指标。
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图 1 两种养殖模式的金背鲤肠道菌的特征韦恩图
Figure 1. Venn diagram of features of intestinal bacteria in C. carpio var. Jinbei of FGF and FGP groups
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图 2 两种养殖模式的金背鲤肠道微生物Alpha多样性指数
Figure 2. Alpha diversity of intestinal microorganisms in C. carpio var. Jinbei of FGF and FGP groups
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图 3 门水平上的物种相对丰度及差异分析
注：*. 差异显著 (P<0.05)。图4同此。
Figure 3. Relative abundance and differences of species at phylum level
Note: *. Significant differences (P<0.05). The same case in Fig. 4.
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图 4 属水平上的物种相对丰度及差异分析
Figure 4. Relative abundance and differences of species at genus level
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图 5 两种养殖模式的金背鲤肠道微生物菌群的差异性分析
Figure 5. Difference analysis of microbial flora in intestine of C. carpio var. Jinbei of FGF and FGP groups
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图 6 两种养殖模式的金背鲤肌肉中挥发性化合物GC-IMS 指纹图谱
Figure 6. GC-IMS gallrey plot of volatile compounds in muscle of C. carpio var. Jinbei of FGF and FGP groups
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图 7 肠道菌群结构与风味物质的相关性热图分析
Figure 7. Correlation heat map analysis of intestinal flora structure and flavor substances
表 1 两种养殖模式的金背鲤肌肉中核苷酸及其关联产物含量及K值 (N=3)
Table 1 Nucleotides contents, their related products and K value in muscle of C. carpio var. Jinbei of FGF and FGP groups (N=3)
核苷酸种类
Nucleotide阈值[17]
Threshold/
(g·kg−1)呈味特征
Taste characteristics核苷酸含量
Nucleotide content/(g·kg−1)滋味活性值
TAV稻田放养
FGF池塘养殖
FGP稻田放养
FGF池塘养殖
FGP腺苷三磷酸 ATP — — 0.051±0.0066a 0.07686±0.0012b 腺苷二磷酸 ADP — — 0.885±0.0271b 1.935±0.0163a 腺苷酸 AMP 0.50 鲜甜味 0.1747±0.0173a 0.146±0.00026b 0.349 0.291 肌苷酸 IMP 0.25 鲜味 1.676±0.1109a 0.246±0.0055b 6.705 0.985 次黄嘌呤核苷 HXR — 苦味 0.0162±0.0021b 0.0342±0.0017a 次黄嘌呤 HX — 苦味 0.0826±0.0062b 0.193±0.0035a Σ呈味核苷酸 ΣFlavoring nucleotide 2.885±0.17a 2.63±0.028b K值 K value/% 8.805 21.305 注：“—”表示未查到相关阈值和呈味特征；同行中不同字母间存在显著性差异 (P<0.05)；下同。 Note: "—" indicates that the relevant threshold and flavor characteristics are not found; values with different letters within the same line are signifi-cantly different (P<0.05). The same case in the following tables. 
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表 2 两种养殖模式下金背鲤肌肉中游离氨基酸与滋味活性值
Table 2 Amino acid and taste activity value in muscle of C. carpio var. Jinbei of FGF and FGP groups
氨基酸
Amino acid阈值[18-19]
Threshold/
(g·kg−1)呈味特征[20-22]
Taste characteristics游离氨基酸含量
Free amino acid content/(g·kg−1)滋味活性值
TAV稻田放养
FGF池塘养殖
FGP稻田放养
FGF池塘养殖
FGP苏氨酸 Thr★ 2.60 甜 (+) 0.312±0.0042b 0.362±0.0041a 0.119 0.138 赖氨酸 Lys★ 0.50 甜/苦 (−) 0.254±0.0081b 0.495±0.011a 0.495 0.991 缬氨酸 Val▲ 0.40 甜/苦 (−) 0.297±0.0031b 0.357±0.0023a 0.737 0.888 蛋氨酸 Met▲ 0.30 苦/甜/硫 (−) 0.031±0.00002b 0.0459±0.0002a 0.103 0.153 色氨酸 Trp◆ 0.90 苦/芳香 (−) 0.0284±0.0004a 0.0256±0.0002b 0.035 0.031 苯丙氨酸 Phe◆ 0.90 苦/芳香 (−) 0.091±0.0004b 0.119±0.0027a 0.101 0.13 异亮氨酸 Ile▲ 0.90 苦 (−) 0.0501±0.0006b 0.819±0.0003a 0.055 0.091 亮氨酸 Leu▲ 1.90 苦 (−) 0.0982±0.0026b 0.137±0.00007a 0.051 0.072 Σ必需氨基酸 ΣEAA 1.162±0.019b 1.623±0.021a 1.69 2.49 组氨酸 His▲ 0.20 酸/苦 (−) 1.825±0.002b 2.139±0.016a 9.117 10.64 精氨酸 Arg▲ 0.50 甜/苦 (−) 0.0816±0.0018b 0.181±0.001a 0.161 0.36 Σ半必需氨基酸 ΣSEAA 1.907±0.0038b 2.32±0.017a 9.28 11.00 天冬氨酸 Asp● 0.03 鲜/酸 (+) 0.0281±0.0005a 0.0143±0.0003b 0.923 0.483 谷氨酸 Glu● 0.05 鲜/酸 (+) 0.114±0.0014a 0.0949±0.004b 2.268 1.954 丙氨酸 Ala★ 0.60 鲜/甜 (+) 0.315±0.015a 0.251±0.014b 0.542 0.401 丝氨酸 Ser★ 1.50 甜 (+) 0.131±0.0027b 0.159±0.0001a 0.086 0.106 甘氨酸 Gly★ 1.30 甜 (+) 1.088±0.017a 0.905±0.0018b 0.827 0.697 脯氨酸 Pro★ 3.00 甜/苦 (+) 0.124±0.0016b 0.174±0.012a 0.041 0.055 肌氨酸 Sar — — 0.125±0.012a 0.122±0.001a 酪氨酸 Tyr◆ 0.91 苦/芳香 (−) 0.0693±0.0015b 0.0869±0.001a 0.075 0.095 半胱氨酸 Cys▲ — 苦/甜/硫 (−) 0.639±0.027a 0.550±0.007b Σ非必需氨基酸 ΣNEAA 2.689±0.083a 2.357±0.041b 4.279 2.868 羟脯氨酸 Hyp — — 0.575±0.01a 0.604±0.02a 谷氨酰胺 Gln — — 0.08±0.0019b 0.102±0.0009a 天冬酰胺 Asn — — 0.0031±0.0001a 0.0034±0.0004a 瓜氨酸 Cit — — 0.0357±0.0006b 0.0654±0.0001a 游离氨基酸总量 Total free amino acid 6.361±0.12b 7.137±0.098a ● 鲜味氨基酸总量/占比 Total delicious amino acid/Proportion 0.1425±0.0019a/2.24% 0.109±0.0042b/1.53% ★ 甜味氨基酸总量/占比 Total Sweet amino acid/Proportion 2.052±0.013a/32.26% 2.031±0.033a/28.46% ▲ 苦味氨基酸总量/占比 Total bitter amino acid/Proportion 3.193±0.01b/50.19% 3.836±0.0071a/53.74% ◆ 芳香氨基酸总量/占比 Total aromatic amino acids/Proportion 0.189±0.0021b/2.96% 0.232±0.0039a/3.25%
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表 3 两组养殖模式的金背鲤肌肉中挥发性化合物相对含量及其ROVA值
Table 3 Volatile compounds and relative odor activity value in muscle of C. carpio var. Jinbei of FGF and FGP groups μg·kg−1
化合物
Compound阈值[28-29]
Threshold/
(μg·kg−1)气味特征[28]
Odour characteristics稻田放养 FGF 池塘养殖 FGP 相对含量
Relative content相对气味
活度值
ROAV相对含量
Relative content相对气味
活度值
ROAV醛类 Aldehydes 21.42% 9.54% 壬醛 Nonanal 1 脂香、青草味 12.07±2.45a 100 4.384±0.63b 100 辛醛 Octanal 0.7 果香叶 6.32±1.1a 74.80 3.633±0.49b 43.01 庚醛 Heptanal 3 鱼腥、烤鱼、哈喇味 9.67±1.43a 26.71 5.641±1.34b 15.58 E-2-己烯醛 (E)-2-Hexenal 17 青香、脂香、果香味 3.42±1.48a 1.67 2.54±0.26b 1.24 己醛-M Hexanal-M 4.5 鱼腥、青草味 44.35±3.09a 81.56 30.11±4.64b 55.44 己醛-D Hexanal-D 4.5 鱼腥、青草味 31.66±3.85a 58.29 11.60±4.72b 21.36 戊醛 Pentanal 20 果香味 13.1±0.77a 5.43 6.623±0.85b 2.74 2-甲基丁醛2-Methylbutanal 1 果香味 4.08±0.29b 33.8 6.80±1.2a 56.34 3-甲基丁醛 3-Methylbutanal 1.1 巧克力味、腐臭味 2.71±0.14b 20.41 4.84±1.11a 36.45 丁醛 Butanal 1.3 花香、水果香味 5.07±0.72a 32.31 5.66±0.53a 36.07 苯甲醛 Benzaldehyde 350 苦杏仁味 2.6±0.44a 0.062 1.63±0.42b 0.038 醇类 Alcohols 12.79% 19.19% 1-庚醇 1-Heptanol 330 脂味、酒香 2.07±0.33a 0.052 1.35±0.31b 0.034 1-辛烯-3-醇 1-Octen-3-ol 10 蘑菇味、泥土味 3.64±0.54b 3.16 5.80±2.38a 4.81 1-己醇 1-Hexanol 5.6 青草味 3.38±0.54b 5.00 6.22±2.01a 9.20 正戊醇 1-Pentanol 150.2 面包酒香、果香 3.29±0.19b 0.18 5.33±0.3a 0.29 1-戊烯-3-醇 1-Penten-3-ol 358.1 肉香味、鱼腥味 10.68±1.09a 0.25 9.03±2.05b 0.021 1-丁醇 1-Butanol 5 000 温和的杂醇油气息 1.21±0.08a <0.01 1.04±0.07a <0.01 乙醇 Ethanol 100 000 酒味 29.21±6.39a <0.01 26.75±2.58a <0.01 异丙醇 2-Propanol — — 2.85±0.09b 21.92±3.37a 3-甲基-1-丁醇 3-Methyl-1-butanol 250 发酵味、油脂味、 1.26±0.12b 0.04 3.34±0.69a 0.11 正丙醇 1-Propanol 8 505 — 18.04±1.36b 0.018 80.69±4.78a 0.079 异丁醇 Isobutanol 7 000 — 1.26±0.09b <0.01 2.16±0.27a <0.01 Z-3-己烯-1-醇 (Z)-3-Hexen-1-ol 250 — 0.39±0.06b 0.013 1.15±0.04a 0.038 芳樟醇 Linalool 30 000 热带香辛料味 1.96±0.14a <0.01 1.46±0.36a <0.01 2-甲基-1-丁醇 2-Methyl-1-butanol 1 200 — 1.4±0.04a <0.01 1.65±0.25a 0.01 酮类 Ketones 55.46% 58.01% 3-辛酮 3-Octanone 28 酮香、青香 2.35±0.15a 0.70 1.76±0.31b 0.52 3-羟基-2-丁酮 3-Hydroxy-2-butanone 800 脂香味 24.67±1.85a 0.26 16.73±0.34b 0.17 1-戊烯-3-酮 1-Penten-3-one 1 蘑菇味、烤焦味 4.54±1.32a 37.61 1.72±0.16b 14.25 2-戊酮 2-Pentanone 13 800 果味 4.7±0.2a <0.01 4.27±0.42b <0.01 2-丁酮-D 2-Butanone-D 50 000 醚香、果香、樟脑香 18.42±1.83b <0.01 72.65±3.42a 0.012 2-丁酮-M 2-Butanone-M 50 000 醚香、果香、樟脑香 35.87±0.82b <0.01 40.29±1.69a <0.01 2-丙酮 2-Propanone — 青草味 259.14±7.81b 370.14±8.67a 酯类 Esters 2.06% 0.94% 甲酸丁酯 Butyl formate — 2.95±0.45a 1.841±0.11b 乙酸乙酯-M Ethyl Acetate-M 5 醚香、果香 7.65±0.9a 12.68 4.70±0.37b 7.79 乙酸乙酯-D Ethyl Acetate-D 5 醚香、果香 2.36±0.5a 3.91 1.72±0.29a 2.85 酸类 Acids 1.25% 3.36% 2-甲基丙酸 2-Methylpropanoic acid — — 2±0.12a 2.14±0.15a 3-甲基丁酸 3-Methylbutanoic acid — — 0.57±0.07b 1.44±0.12a 丙酸 Propanoic acid — — 5.29±0.75b 25.86±0.47a 烃类 Hydrocarbon 0.77% 0.19% β-罗勒烯 beta-Ocimene 34 脂香、甜味 4.85±0.69a 1.18 1.65±0.77b 0.40 醚类 Ethers 5.47% 1.86% 二甲基硫醚 Dimethyl sulfide 300 果香、青香味 34.46±2.78a 0.95 16.28±0.45b 0.045 其他类 Others 0.78% 6.89% 未鉴定物质1 Unidentified substance 1 — — 2.49±0.34b 7.76±0.33a 未鉴定物质2 Unidentified substance 2 — — 2.04±0.04b 50.80±4.06a 未鉴定物质3 Unidentified substance 3 — — 0.41±0.03b 1.71±0.06a
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