Effect of low temperature stress on antioxidant stress, apoptosis and histological structure of gills in cobia (Rachycentron canadum)
-
摘要: 军曹鱼 (Rachycentron canadum) 鳃组织对水温变化敏感。为探究低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织的影响，揭示该鱼应对低温胁迫的响应机制，实验设置2个低温胁迫组 (18 ℃、21 ℃) 和1个对照组 (28 ℃)，比较分析鳃组织在胁迫后第0、第4和第7天的氧化应激状态、细胞凋亡和组织结构情况。结果显示，低温胁迫下鳃组织超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性显著低于对照组 (P<0.05)，丙二醛 (MDA) 浓度显著高于对照组 (P<0.05)；低温胁迫组鳃组织凋亡相关基因bax、caspase-9、caspase-3、p53和mdm2表达量在第4和第7天时相较于对照组显著升高 (P<0.05)，bcl-2基因表达量显著降低 (P<0.05)；TUNEL检测显示低温组鳃组织细胞凋亡率升高；组织学分析表明低温胁迫下鳃组织出现了不同程度的鳃小片排列紊乱、基部增生、融合，上皮细胞和泌氯细胞空泡化等现象。研究表明，低温胁迫抑制了军曹鱼幼鱼的鳃组织抗氧化酶活性，造成氧化损伤，进一步诱导细胞凋亡，破坏鳃组织结构完整性。Abstract: The gill tissue of cobia (Rachycentron canadum) is sensitive to water temperature changes. In order to investigate the effect of low temperature stress on juvenile cobia, and reveal its response mechanism to low temperature stress, we designed two low temperature groups (18 ℃ and 21 ℃) and one control group (28 ℃), to analyze the antioxidant responses, expression of apoptosis-related genes and histological structure of the gills on 0, 4th and 7th day after the stress. The results show that the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in the low-temperature groups were significantly lower than those in the control group (P<0.05), while the malondialdehyde (MDA) mass concentration in the low-temperature groups was significantly higher than that in the control group (P<0.05). The expression of apoptosis-related genes bax, caspase-9, caspase-3, p53 and mdm2 increased significantly in the low-temperature groups, while the expression of Bcl-2 decreased significantly on 4th and 7th day (P<0.05). The TUNEL results reveal that low-temperature treatment increased the cell apoptosis rate of the gills, and caused lesions including fusion of secondary lamellae, necrosis of epithelial cell and hyperplasia of chloride cells. The results indicate that low-temperature stress causes oxidative stress, induces apoptosis and damages the structural integrity of the gills, which suggests that normal physiological functions of juvenile cobia can be affected by low temperature significantly.
-
Keywords:
- Rachycentron canadum /
- Low temperature stress /
- Gill /
- Antioxidant enzyme /
- Apoptosis /
- Organization structure
-
温度对于鱼类生长、发育和繁殖等生命活动产生直接影响。据报道，水温骤降导致的低温胁迫对鱼类增养殖业造成的不良影响呈加剧趋势[1-3]。已有研究表明，水温骤降会导致动物机体产生氧化应激反应[4]，鱼类可通过激活抗氧化酶活性、释放神经递质和激素等生理过程的调控，减少低温胁迫对其机体造成的氧化损伤[5]。鱼类含酶和非酶抗氧化防御系统在应对低温胁迫的过程中发挥着关键作用[6]，例如，超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 作为具有抗氧化防御功能的重要酶，可有效清除活性氧(ROS)，将细胞内的ROS浓度维持在正常生理水平[7]。研究表明，低温胁迫下绿腹丽鱼 (Etroplus suratensis) [8]和七彩神仙鱼 (Symphysodon spp.)[9]通过提高SOD、CAT和GSH-Px活性来激活鳃组织的抗氧化反应，降低机体损伤程度。然而，当水温降低程度超出鱼类应对能力范围时，机体内线粒体的ROS产生和清除间的动态平衡被打破，导致ROS水平迅速或缓慢升高[10-11]。ROS过量累积导致线粒体损伤，进而诱导细胞凋亡[12]。
细胞凋亡是细胞主动发生的程序性死亡，涉及凋亡相关基因的激活、表达和调控，维持组织结构及细胞内环境的稳定[13-14]。细胞凋亡机制复杂，目前已知的细胞凋亡途径主要有线粒体途径、内质网途径以及死亡受体途径[15]。研究表明，低温胁迫下水生动物可通过线粒体途径介导细胞凋亡，其主要涉及bcl-2和caspase基因家族调控[16-17]。当应激超出细胞应对能力时，细胞线粒体内膜和外膜通透性发生变化，bcl-2家族中抗凋亡基因 (bcl-2、bcl-xl) 和促凋亡基因 (bax、bad、bid) 相互作用调节细胞色素C从线粒体释放到细胞质[18]。在细胞质中，细胞色素C与Apaf1和dATP结合，从而激活caspase-9，随后激活“执行者”caspase-3，诱发caspase家族级联反应，最终导致细胞凋亡[19]。
此外，低温环境引发的细胞和组织的生理生化反应，可能会导致组织结构和功能发生变化[20]。据报道，鱼类处于低温环境下可能会造成鳃组织结构损伤[21]。例如，尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus)[3]、鲤 (Cyprinus carpio L.)[22]和花鲈 (Lateolabrax maculatus)[23]通过鳃小片增生、肥大等，增加外界刺激与机体血液间的距离来响应低温胁迫，恶劣的低温环境会使鳃组织出现上皮破裂脱离、细胞空泡化等不可逆损伤，导致机体缺氧死亡[24]。
军曹鱼 (Rachycentron canadum) 因具有饲料转化率高、生长速度极快、肉质鲜美等特点，已在中国、越南、澳大利亚和美国等多个国家开展人工养殖[25-26]。然而，作为一种暖水性经济鱼类，军曹鱼对低温较为敏感，其适宜生长水温为25~32 ℃，水温低至21 ℃时摄食量明显降低，18 ℃时静止于水底[27]。寒潮来临时，水温降低且通常持续时间较长，不利于军曹鱼的生长及生存，造成经济损失。目前关于低温胁迫对军曹鱼影响的研究主要集中在血清生理生化水平[28]、肝组织脂代谢[29]和氧化防御[28]等方面。鳃作为鱼类气体交换、渗透压调节和离子转运的重要器官，与外界环境直接接触且接触面积较大，水温变化会影响鳃组织状态[23]；因此与其他组织器官相比，鳃组织对于水温变动更为敏感[30-32]。因此，阐明低温胁迫对鳃组织的影响对于揭示军曹鱼应对低温胁迫的响应机制具有重要意义。本文通过研究军曹鱼鳃组织在低温胁迫下的氧化应激指标，细胞凋亡和凋亡相关基因的表达及组织结构的变化，旨在揭示低温胁迫对其幼鱼鳃组织功能和结构完整性的影响，为研究军曹鱼低温适应调控机理提供基础数据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料及实验设计
军曹鱼幼鱼由广东海洋大学海洋生物研究基地提供，在广东恒兴饲料股份有限公司863基地的室内24 h流水养殖系统暂养2周。暂养期间每天8:00和17:00投喂配合饲料 (广东东腾饲料有限公司)，养殖水体保持溶氧质量浓度5 mg·L−1以上，氨氮质量浓度小于0.02 mg·L−1，pH 7.6~8.0，温度27~29 ℃、盐度28‰~30‰。
暂养结束后挑选180尾体质健康、规格一致 [平均体质量 (39.11±1.01) g，平均体长 (19.71±0.73) cm] 的军曹鱼幼鱼随机分配到9个水槽中，每个水槽20尾。实验分为3个温度组，分别为28 ℃对照组及21 ℃和18 ℃低温组，每组3个重复。降温方式参考文献[23,33-34]并做适当调整，以6 h· ℃−1匀速降温至23 ℃后以12 h·℃−1匀速降温。低温组使用冰块 (将冰块置于四层虾苗袋中密封放入水槽) 降温，在水槽上方覆盖塑料薄膜并在水槽周围粘贴隔热棉减少温度波动，通过散气石连续曝气使水温均衡。实验期间24 h连续关注水温 (每2 h测量1次)，当水温偏离实验温度0.5 ℃以上时即调整冰块数量。低温组和对照组静水养殖，每日更换50%的等温海水，除水体温度改变外，其余水质条件与暂养期间保持一致。
1.2 样品采集
低温组水温降至实验温度后开始计时并于第0、第4和第7 天进行取样。每组随机挑选12尾鱼 (每个水槽取4尾)，使用40 mg·L−1丁香酚快速麻醉后解剖分离鳃组织。6尾鱼鳃组织快速放入液氮速冻，并转移至−80 ℃冰箱保存，用于酶活性和实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 分析。6尾鱼鳃组织固定在4% (体积分数) 多聚甲醛 (Paraformaldehyde, PFA) 中，用于检测细胞凋亡和组织学染色。
1.3 抗氧化指标分析
CAT、SOD和GSH-Px活性，丙二醛 (MDA) 浓度均使用南京建成生物工程有限公司试剂盒测定，具体实验操作参照说明书。测定时，取鳃组织约0.4 g，按质量体积比1∶9加入预冷的生理盐水，在冰上充分匀浆后在4 ℃下3000×g离心15 min，取上清液立即用于检测。
1.4 RNA提取和定量PCR试验
样品在液氮中研磨后，使用TransZol Up Plus RNA Kit (北京全式金生物有限公司) 试剂盒提取总RNA，1% (质量分数) 琼脂糖凝胶电泳和Simpli Nano超微量核酸蛋白测定仪检测其纯度和浓度。取2 μg RNA使用EasyScript First−Strand cDNA Synthesis SuperMix (北京全式金生物有限公司) 反转录试剂盒合成cDNA。
根据军曹鱼全基因组数据 (NCBI BioProject ID: PRJNA634421)，筛选出注释为bax、bcl-2、caspase-9、caspase-3、p53、mdm2和β-actin的基因序列信息，经NCBI数据库Blast比对验证，使用Primer Premier 6.0设计qRT-PCR 引物 (表1)。qRT-PCR反应程序：94 ℃预变性30 s；94 ℃ 5 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40 个循环。实验结果使用2−ΔΔCt法计算基因的相对表达量。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequence引物
Primer引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'−3')基因序列
Accession No.caspase-9-F GTGGAGCTCCTGCTGTTCAT OP546050 caspase-9-R ACGGGCTGGCATCCATTTTA caspase-3-F ACCAGACAGTGGACCAGATAA OP546051 caspase-3-R GTGGAGAAGGCATAAAGGAAG bcl-2-F CCACCACGGCGAAGAGAAGATT OP546048 bcl-2-R CTGCGGTGTCATCTCCTCCTTG p53-F GAGACCTTCAGGAAGTACCAGC OP546053 p53-R TCTCCGGTTTGTCCTTGTTGG bax-F GCAGAGTGGTCGCACTGTTCT OP546049 bax-R AATGCCCTCCCAGCCTCCTT mdm2-F ATCCTCGCAAGAGGTTGGTG OP546052 mdm2-R TCCACAGAGGAAAGCGTCAC β-actin-F AGGGAAATTGTGCGTGAC EU266 539.1 β-actin-R AGGCAGCTCGTAGCTCTT 1.5 TUNEL检测和组织学分析
通过TUNEL细胞凋亡检测试剂盒 (赛维尔，中国)，使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的 dUPT 缺口末端标记 (TUNEL) 技术对鳃组织样本进行染色。在正置荧光显微镜 (Eclipse Ci-L, Nikon, Japan) 下对样本进行成像。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0软件分析，其中凋亡细胞为绿色荧光，正常细胞为蓝色。阳性率=阳性细胞数/总细胞数×100%。
鳃组织在4% (体积分数) 多聚甲醛中固定24 h后，进行乙醇 (体积分数为50%、70%、80%、95%和100%) 逐级脱水、二甲苯透明和浸腊包埋处理。石蜡包埋后使用Leica RM2125手动轮转式切片机切成薄片 (5~6 μm) 进行苏木精-伊红 (HE) 染色。切片风干后用中性树脂封片，在Nikon E80i显微镜下观察并拍照记录。
1.6 数据处理
实验数据采用单因素方差分析和Duncan's法多重比较进行显著性差异分析，P<0.05表示差异显著，使用GraphPad Prism 8软件作图。
2. 结果
2.1 低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织抗氧化酶活性的影响
低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织抗氧化酶活性的影响见图1。低温组鳃组织SOD和CAT活性在第0、第4和第7 天时均显著低于对照组，且酶活性最低值均在18 ℃组 (P<0.05，图1-a、1-b)；GSH-Px活性在第0天与对照组无显著性差异 (P>0.05)，在第4和第7 天时则显著低于对照组 (P<0.05，图1-c)；MDA浓度在第0、第4和第7 天时，低温组均显著高于对照组 (P<0.05，图1-d)。
![]()
图 1 低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性及丙二醛质量摩尔浓度的影响Figure 1. Effects of low temperature stress on activities of SOD, CAT, GSH-Px and MDA molality in gill of R. canadum2.2 低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织凋亡相关基因相对表达量的影响
低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织凋亡相关基因相对表达量的影响见图2。鳃组织caspase-9、mdm2和bax基因表达量在低温组的所有时间点均显著高于对照组 (P<0.05，图2-a、2-d和2-e)。在第4和第7 天时，低温组caspase-3和p53基因的表达量显著高于对照组 (P<0.05，图2-b、2-c)。在第0、第4和第7 天，bcl-2基因在21 ℃组的表达量与对照组无显著性差异 (P>0.05)，18 ℃组显著低于对照组 (P<0.05，图2-f)。
![]()
图 2 低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织凋亡相关基因表达量的影响Figure 2. Relative expression of genes in gill of R. canadum at low temperature stress2.3 低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织细胞凋亡的影响
TUNEL 染色法检测鳃组织的细胞凋亡情况如图3所示。对照组军曹鱼幼鱼鳃组织细胞凋亡较少 (图3-a—3-c)，低温组鳃组织在第0天时显示零星的绿色荧光，表明有少量细胞凋亡 (图3-d、3-g)，第4天时细胞凋亡数量增加 (图3-e、3-h)，第7天时细胞大量凋亡 (图3-f、3-i) 。
![]()
图 3 低温胁迫下军曹鱼幼鱼鳃组织细胞凋亡情况注：a—c分别表示28 ℃(对照组)在第0、第4和第7 天时鳃组织细胞凋亡图；d—e分别表示21 ℃胁迫第0、第4和第7 天时鳃组织细胞凋亡图；g—i分别表示18 ℃胁迫第0、第4和第7 天时鳃组织细胞凋亡图；红色箭头表示凋亡，标尺=100 μm。Figure 3. Apoptosis of gill of R. canadum at low temperature stressNote: a−c. Apoptosis of the gill at 28 ℃ on 0, 4th and 7th day (Control group); d−e. Apoptosis of the gill at 21 ℃ on 0, 4th and 7th day; g−i. Apoptosis of the gill at 18 ℃ on 0, 4th and 7th day. The red arrows indicate apoptotic cells; bar=100 μm.2.4 低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织结构的影响
低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织结构的影响如图4所示。对照组军曹鱼幼鱼鳃组织未见组织学病变，鳃丝结构完整清晰，两侧鳃小片排列整齐规律，上皮细胞和泌氯细胞排列致密有序，细胞核清晰可见，排布均匀 (图4-a—4-c)。在第0 天时21 ℃组部分鳃小片末端轻微弯曲，基部增生，上皮细胞水肿 (图4-d)，18 ℃组鳃组织损伤明显，部分鳃小片上皮细胞破裂并轻微出血，上皮隆起 (图4-g)；在第4 天时21 ℃组鳃组织出现细胞空泡化，且基部增生程度加深 (图4-e)，18 ℃组鳃组织上皮隆起明显，细胞空泡化严重，出现动脉瘤 (图4-h)；在第7 天时21 ℃组鳃组织出现鳃小片融合、缩短，上皮破裂并伴有轻微出血 (图4-f)，18 ℃组鳃组织的鳃小片融合、缩短现象更为明显，鳃小片上皮细胞脱离、坏死，鳃丝整体偏离正常形态 (图4-i)。
![]()
图 4 低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织结构的影响注：a—c. 分别表示为28 ℃ (对照组) 在第0、第4和第7 天鳃组织显微结构图；d—e. 分别表示为21 ℃胁迫第0、第4和第7 天鳃组织显微结构图；g—i. 分别表示为18 ℃胁迫第0、第4和第7 天鳃组织显微结构图；标尺=50 μm。Figure 4. Histopathological features in gill tissue of R. canadum after exposure to low temperature stressNote: a–c. Microscopical gill structure at 28 ℃ on 0, 4th and 7th day (Control group); d–e. Microscopical gill structure at 21 ℃ on 0, 4th and 7th day; g–i. Microscopical gill structure of at 18 ℃ at 0, 4th and 7th day; bar=50 μm.3. 讨论
低温胁迫下鱼类通常会发生氧化应激现象。SOD、CAT和GSH-Px作为抗氧化防御系统的第一道防线，可将机体内ROS保持在稳定水平[35]，从而起到维持机体功能的正常运转和适应胁迫环境的作用。然而，长时间的低温胁迫可能导致ROS大量累积，超出抗氧化酶清除能力阈值并抑制抗氧化酶活性[4]。抗氧化酶活性在低温胁迫下的变化取决于生物品种、胁迫强度和持续时间等因素[36]。本研究中低温组军曹鱼幼鱼鳃组织SOD、CAT和GSH-Px活性显著降低，MDA水平显著升高，推测其原因是低温胁迫会降低机体的代谢率和活动水平，导致抗氧化酶活性降低[37]；此外抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活性的降低可能由于低温环境下水体氧气溶解度增加或线粒体膜流动性下降从而干扰了电子转移，导致其活性被过量增加的ROS所抑制[38]，MDA浓度显著增加也从一定程度上反映了机体内大量ROS无法被有效清除，造成了氧化损伤[39]。这与滨岸护胸鲶 (Hoplosternum littorale) 幼鱼在10 ℃低温胁迫1 d后鳃组织CAT活性显著降低[38]，尼罗罗非鱼在13 ℃低温环境下养殖24 h后鳃组织MDA浓度显著升高[3]的反应相似。但银鲳 (Pampus argenteus)在8 ℃水温下胁迫2 d后抗氧化防御能力加强，鳃组织中SOD、CAT和GSH-Px活性显著升高[21]，与本研究的趋势相反，可能是银鲳适宜温度为18~26 ℃，低于军曹鱼适宜温度，对低温耐受性更强，且该实验降温速率较为缓慢 (每2~3 d降温0.5 ℃)，更有助于机体适应温度变化。
已有研究表明，氧化应激可诱导细胞凋亡[12]。军曹鱼幼鱼鳃组织细胞的TUNEL染色结果表明，低温胁迫下鳃组织细胞凋亡率显著升高。结合上述抗氧化酶活性结果可推测，军曹鱼幼鱼鳃组织出现大量细胞凋亡，可能是抗氧化防御未能及时有效地清除由低温胁迫引起的过量ROS，进而导致鳃组织细胞凋亡，机体保护性生理过程失败[40]。
细胞凋亡率显著升高会对机体产生负面影响[41]。对此，本研究检测了p53、mdm2、caspase和bcl-2家族等细胞凋亡相关的关键基因的表达水平变化，以了解低温胁迫下鳃组织发生细胞凋亡的主要途径。据报道，细胞处于应激状态时可激活p53基因表达[42]，本研究发现p53基因表达水平显著升高，p53基因是一种核转录因子，调节细胞生长、分化、DNA修复和凋亡等关键的细胞活动过程，p53基因相关信号通路的激活可诱导细胞凋亡[43]。p53被激活后促进mdm2基因表达，mdm2基因表达产物对p53具有负调控作用[44-45]，在本研究中mdm2表达水平升高后未见p53表达水平降低，可能是负反馈调控具有延迟性或机体出现紊乱[46]。此外，p53可通过上调促凋亡基因bax和下调抗凋亡基因bcl-2的表达水平[47]，改变线粒体膜通透性，将凋亡相关蛋白释放到细胞质后间接激活caspase-9基因表达，再激活caspase-3基因表达[47-49]，从而调控细胞凋亡。暗纹东方鲀 (Takifugu obscurus)[50]，青鳉 (Oryzias latipes)[51]在低温胁迫后caspase-3、caspase-9和 p53基因表达量显著升高，提示低温胁迫导致鱼类发生细胞凋亡的途径可能是内在的线粒体途径。相似地，本研究中bax 、caspase-9和 caspase-3基因表达水平显著上调，bcl-2基因表达水平显著下调，结合上述TUNEL染色结果可推测，低温胁迫可能通过caspase-线粒体途径导致军曹鱼幼鱼鳃组织细胞凋亡。
研究表明，鳃组织在温度胁迫下发生明显的形态结构变化[52-54]。本研究中，军曹鱼幼鱼鳃组织在低温胁迫下的组织形态变化主要表现为鳃小片卷曲、融合、变短，上皮组织增生，细胞空泡化，上皮细胞排列紊乱等。这些形态变化与黄姑鱼 (Nibea albiflora)[55]、南亚野鲮 (Labeo rohita)[56]、四指马鲅 (Eleutheronema tetradactylum)[57]和三刺鱼 (Gasterosteus aculeatus)[58]在温度胁迫下的鳃组织形态变化结果相似。低温胁迫下军曹鱼幼鱼首先出现鳃小片上皮组织增生和水肿现象，结合上述抗氧化酶活性降低，MDA浓度显著升高，从一定程度说明组织发生了氧化损伤，可能是由于细胞功能受损，影响了细胞膜上钠钾泵的功能，导致溶质等物质在上皮细胞中累积和水渗透流入造成[59-60]。随着胁迫时间的延长，氧化损伤程度加深，细胞凋亡破坏了物理屏障，鳃组织开始出现上皮破裂脱离、细胞空泡化、鳃小片基部空洞等不可逆损伤，表明持续的低温胁迫可破坏鳃组织结构的完整性，从而损害鳃组织呼吸功能[61]，导致机体缺氧甚至死亡[62]。
国内已开展水生经济动物的耐温性遗传改良工作。卢其西等[63]对家系选育获得的罗非鱼群体进行低温胁迫后检测其耐寒相关指标，进行耐寒性初步评估；胡小玲[64]通过耐低温性能研究和分子标记等方式对大黄鱼 (Pseudosciaena crocea) 开展了耐低温选育的初步探索；唐扬等[65]通过检测血细胞数量、酚氧化酶原活力及抗菌活力等免疫相关指标，揭示低温胁迫对凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 免疫力的影响并在此基础上选择耐低温的对虾开展家系选育工作。适当的加大环境因素的影响，有利于激活鱼类温度调控的相关功能，提高其应对温度胁迫的能力，增强耐寒性等[66]。军曹鱼属暖水性鱼类，低温可直接降低其生长速率、成活率等。深入了解低温胁迫对军曹鱼的影响，可在此基础上选择表型，为耐低温胁迫能力较强的健康军曹鱼进行家系选育，为进一步开展以耐寒抗逆性为家系选择方向的遗传育种工作提供基础数据。
4. 结论
低温胁迫 (18 ℃、21 ℃) 对军曹鱼幼鱼鳃组织有明显的负面效应，导致其SOD、CAT和GSH-Px活性显著降低，MDA浓度显著升高，抑制抗氧化防御能力，造成机体发生氧化损伤。氧化损伤诱导鳃组织细胞凋亡率显著升高，最终影响鳃的正常组织结构；随着低温胁迫进一步加剧，鳃组织结构出现不可逆损伤，影响其生理功能。
-
![]()
图 1 低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性及丙二醛质量摩尔浓度的影响
Figure 1. Effects of low temperature stress on activities of SOD, CAT, GSH-Px and MDA molality in gill of R. canadum
![]()
图 2 低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织凋亡相关基因表达量的影响
Figure 2. Relative expression of genes in gill of R. canadum at low temperature stress
![]()
图 3 低温胁迫下军曹鱼幼鱼鳃组织细胞凋亡情况
注：a—c分别表示28 ℃(对照组)在第0、第4和第7 天时鳃组织细胞凋亡图；d—e分别表示21 ℃胁迫第0、第4和第7 天时鳃组织细胞凋亡图；g—i分别表示18 ℃胁迫第0、第4和第7 天时鳃组织细胞凋亡图；红色箭头表示凋亡，标尺=100 μm。
Figure 3. Apoptosis of gill of R. canadum at low temperature stress
Note: a−c. Apoptosis of the gill at 28 ℃ on 0, 4th and 7th day (Control group); d−e. Apoptosis of the gill at 21 ℃ on 0, 4th and 7th day; g−i. Apoptosis of the gill at 18 ℃ on 0, 4th and 7th day. The red arrows indicate apoptotic cells; bar=100 μm.
![]()
图 4 低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织结构的影响
注：a—c. 分别表示为28 ℃ (对照组) 在第0、第4和第7 天鳃组织显微结构图；d—e. 分别表示为21 ℃胁迫第0、第4和第7 天鳃组织显微结构图；g—i. 分别表示为18 ℃胁迫第0、第4和第7 天鳃组织显微结构图；标尺=50 μm。
Figure 4. Histopathological features in gill tissue of R. canadum after exposure to low temperature stress
Note: a–c. Microscopical gill structure at 28 ℃ on 0, 4th and 7th day (Control group); d–e. Microscopical gill structure at 21 ℃ on 0, 4th and 7th day; g–i. Microscopical gill structure of at 18 ℃ at 0, 4th and 7th day; bar=50 μm.
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequence
引物
Primer引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'−3')基因序列
Accession No.caspase-9-F GTGGAGCTCCTGCTGTTCAT OP546050 caspase-9-R ACGGGCTGGCATCCATTTTA caspase-3-F ACCAGACAGTGGACCAGATAA OP546051 caspase-3-R GTGGAGAAGGCATAAAGGAAG bcl-2-F CCACCACGGCGAAGAGAAGATT OP546048 bcl-2-R CTGCGGTGTCATCTCCTCCTTG p53-F GAGACCTTCAGGAAGTACCAGC OP546053 p53-R TCTCCGGTTTGTCCTTGTTGG bax-F GCAGAGTGGTCGCACTGTTCT OP546049 bax-R AATGCCCTCCCAGCCTCCTT mdm2-F ATCCTCGCAAGAGGTTGGTG OP546052 mdm2-R TCCACAGAGGAAAGCGTCAC β-actin-F AGGGAAATTGTGCGTGAC EU266 539.1 β-actin-R AGGCAGCTCGTAGCTCTT 
下载: 导出CSV
-
[1] IONA A, THEODOROU A, SOFIANOS S, et al. Mediterranean Sea climatic indices: monitoring long-term variability and climate changes[J]. Earth Syst Sci Data, 2018, 10(4): 1829-1842. doi: 10.5194/essd-10-1829-2018
[2] LAZOGLOU G, ANAGNOSTOPOULOU C, TOLIKA K, et al. A review of statistical methods to analyze extreme precipitation and temperature events in the Mediterranean region[J]. Theor Appl Climatol, 2019, 136(1): 99-117.
[3] PHROMPANYA P, PANASE P, SAENPHET S, et al. Histopathology and oxidative stress responses of Nile tilapia Oreochromis niloticus exposed to temperature shocks[J]. Fish Sci, 2021, 87(4): 491-502. doi: 10.1007/s12562-021-01511-y
[4] XU Z H, REGENSTEIN J M, XIE D, et al. The oxidative stress and antioxidant responses of Litopenaeus vannamei to low temperature and air exposure[J]. Fish Shellfish Immunol, 2018, 72: 564-571. doi: 10.1016/j.fsi.2017.11.016
[5] YANG S Y, YAN T, ZHAO L W, et al. Effects of temperature on activities of antioxidant enzymes and Na+/K+-ATPase, and hormone levels in Schizothorax prenanti[J]. J Therm Biol, 2018, 72: 155-160. doi: 10.1016/j.jtherbio.2018.02.005
[6] BIRBEN E, SAHINER U M, SACKESEN C, et al. Oxidative stress and antioxidant defense[J]. World Allergy Organ J, 2012, 5(1): 9-19. doi: 10.1097/WOX.0b013e3182439613
[7] CAO L, HUANG W, SHAN X J, et al. Tissue-specific accumulation of cadmium and its effects on antioxidative responses in Japanese flounder juveniles[J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2012, 33(1): 16-25. doi: 10.1016/j.etap.2011.10.003
[8] JOY S, ALIKUNJU A P, JOSE J, et al. Oxidative stress and antioxidant defense responses of Etroplus suratensis to acute temperature fluctuations[J]. J Therm Biol, 2017, 70: 20-26. doi: 10.1016/j.jtherbio.2017.10.010
[9] JIN S R, WANG L, LI X X, et al. Integrating antioxidant responses and oxidative stress of ornamental discus (Symphysodon spp.) to decreased temperatures: evidence for species-specific thermal resistance[J]. Aquaculture, 2021, 535: 736375. doi: 10.1016/j.aquaculture.2021.736375
[10] SIES H. Oxidative stress: oxidants and antioxidants[J]. Exp Physiol, 1997, 82(2): 291-295. doi: 10.1113/expphysiol.1997.sp004024
[11] ZHANG X J, NIU Y G, ZHANG H Y, et al. The effect of long-term cold acclimation on redox state and antioxidant defense in the high-altitude frog, Nanorana pleskei[J]. J Therm Biol, 2021, 99: 103008. doi: 10.1016/j.jtherbio.2021.103008
[12] COIMBRA-COSTA D, ALVA N, DURAN M, et al. Oxidative stress and apoptosis after acute respiratory hypoxia and reoxygenation in rat brain[J]. Redox Biol, 2017, 12: 216-225. doi: 10.1016/j.redox.2017.02.014
[13] ZHA J M, HONG X S, RAO H O, et al. Benzo (a) pyrene-induced a mitochondria-independent apoptosis of liver in juvenile Chinese rare minnows (Gobiocypris rarus)[J]. Environ Pollut, 2017, 231: 191-199. doi: 10.1016/j.envpol.2017.08.005
[14] WANG J, WANG Q, LIU N, et al. Hydrogen peroxide leads to cell damage and apoptosis in the gill of the freshwater crab Sinopotamon henanense (Crustacea, Decapoda)[J]. Hydrobiologia, 2014, 741(1): 13-21. doi: 10.1007/s10750-013-1760-x
[15] 郭梓沣, 孙斌斌, 柯文杰, 等. 病原诱导水产动物细胞凋亡途径研究进展[J]. 水产科技报, 2022, 49(3): 164-170. doi: 10.7541/2021.2019.212 [16] JIN Y X, LEE J Y, CHOI S H, et al. Heat shock induces apoptosis related gene expression and apoptosis in porcine parthenotes developing in vitro[J]. Anim Reprod Sci, 2007, 100(1/2): 118-127.
[17] ZHANG H, HUANG H, ZHENG P, et al. The alleviative effect of thyroid hormone on cold stress-induced apoptosis via HSP70 and mitochondrial apoptosis signal pathway in bovine Sertoli cells[J]. Cryobiology, 2022, 105: 63-70. doi: 10.1016/j.cryobiol.2021.11.181
[18] CHENG C H, YANG F F, LIAO S A, et al. High temperature induces apoptosis and oxidative stress in pufferfish (Takifugu obscurus) blood cells[J]. J Therm Biol, 2015, 53: 172-179. doi: 10.1016/j.jtherbio.2015.08.002
[19] TASSABEHJI N M, VANLANDINGHAM J W, LEVENSON C W. Copper alters the conformation and transcriptional activity of the tumor suppressor protein p53 in human Hep G2 cells[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2005, 230(10): 699-708. doi: 10.1177/153537020523001002
[20] ELABD H, WANG H P, SHAHEEN A, et al. Anti-oxidative effects of some dietary supplements on yellow perch (Perca flavescens) exposed to different physical stressors[J]. Aquac Rep, 2017, 8: 21-30. doi: 10.1016/j.aqrep.2017.09.002
[21] ZHANG M , HU J B, ZHU J J, et al. Transcriptome, antioxidant enzymes and histological analysis reveal molecular mechanisms responsive to long-term cold stress in silver pomfret (Pampus argenteus)[J]. Fish Shellfish Immunol, 2022, 121: 351-361. doi: 10.1016/j.fsi.2022.01.017
[22] SABER H T. Histological adaptation to thermal changes in gills of common carp fishes Cyprinus carpio L.[J]. Rafidain J Sci, 2011, 22(1): 46-55. doi: 10.33899/rjs.2011.32464
[23] WANG Z, DONG Z D, YANG Y T, et al. Histology, physiology, and glucose and lipid metabolism of Lateolabrax maculatus under low temperature stress[J]. J Therm Biol, 2022, 104: 103161. doi: 10.1016/j.jtherbio.2021.103161
[24] NIE M M, HU J W, LU Y L, et al. Cold effect analysis and screening of SNPs associated with cold-tolerance in the olive flounder Paralichthys olivaceus[J]. J Appl Ichthyol, 2019, 35(4): 924-932.
[25] 王维政, 曾泽乾, 黄建盛, 等. 低氧胁迫对军曹鱼幼鱼抗氧化、免疫能力及能量代谢的影响[J]. 广东海洋大学学报, 2020, 40(5): 12-18. doi: 10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.002 [26] BENETTI D D, SUAREZ J, CAMPERIO J, et al. A review on cobia, Rachycentron canadum, aquaculture[J]. J World Aquac Soc, 2021, 52(3): 691-709. doi: 10.1111/jwas.12810
[27] 石琼, 张勇, 范明君. 中国经济鱼类志[M]. 武汉: 华中科技大学出版社, 2015: 277-278. [28] 李豫, 黄建盛, 陈有铭, 等. 低温胁迫对军曹鱼幼鱼血清生化指标、肝脏抗氧化酶活性及凋亡相关基因表达量的影响[J]. 广东海洋大学学报, 2022, 42(5): 1-9. doi: 10.3969/j.issn.1673-9159.2022.05.001 [29] 蔡润佳, 张静, 黄建盛, 等. 低温胁迫对军曹鱼幼鱼脂代谢相关生理生化的影响[J]. 广东海洋大学学报, 2021, 41(3): 123-130. doi: 10.3969/j.issn.1673-9159.2021.03.016 [30] ABOKA E R, JIAN Z, SHENGMING S, et al. Histopathological changes in gills, liver, and kidney tissues of bighead carp (Aristichthys nobilis) due to the effects of acute high-temperature stress[J]. Isr J Aquac, 2017, 69(1). DOI: 10.46989/001c.21062.
[31] MATEY V, RICHARDS J G, WANG Y, et al. The effect of hypoxia on gill morphology and ionoregulatory status in the Lake Qinghai scaleless carp, Gymnocypris przewalskii[J]. J Exp Biol, 2008, 211(7): 1063-1074. doi: 10.1242/jeb.010181
[32] HWANG P P, LEE T H, LIN L Y. Ion regulation in fish gills: recent progress in the cellular and molecular mechanisms[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2011, 301(1): R28-R47. doi: 10.1152/ajpregu.00047.2011
[33] ISLAM M A, UDDIN M H, UDDIN M J, et al. Temperature changes influenced the growth performance and physiological functions of Thai pangas Pangasianodon hypophthalmus[J]. Aquac Rep, 2019, 13: 100179. doi: 10.1016/j.aqrep.2019.100179
[34] WEN B, JIN S R, CHEN Z Z, et al. Physiological responses to cold stress in the gills of discus fish (Symphysodon aequifasciatus) revealed by conventional biochemical assays and GC-TOF-MS metabolomics[J]. Sci Total Environ, 2018, 640: 1372-1381.
[35] WANG J, REN R, YAO C L. Oxidative stress responses of Mytilus galloprovincialis to acute cold and heat during air exposure[J]. J Molluscan Stud, 2018, 84(3): 285-292. doi: 10.1093/mollus/eyy027
[36] MENG X L, LIU P, LI J, et al. Physiological responses of swimming crab Portunus trituberculatus under cold acclimation: antioxidant defense and heat shock proteins[J]. Aquaculture, 2014, 434: 11-17. doi: 10.1016/j.aquaculture.2014.07.021
[37] 龙勇, 葛国栋, 李西西, 等. 鱼类低温应激反应的调控机制[J]. 水生生物学报, 2021, 45(6): 1405-1414. [38] ROSSI A, BACCHETTA C, CAZENAVE J. Effect of thermal stress on metabolic and oxidative stress biomarkers of Hoplosternum littorale (Teleostei, Callichthyidae)[J]. Ecol Indic, 2017, 79: 361-370. doi: 10.1016/j.ecolind.2017.04.042
[39] LUSHCHAK V I. Environmentally induced oxidative stress in aquatic animals[J]. Aquat Toxicol, 2011, 101(1): 13-30. doi: 10.1016/j.aquatox.2010.10.006
[40] LACY B, RAHMAN M S, RAHMAN M S. Potential mechanisms of Na+/K+-ATPase attenuation by heat and pesticides co-exposure in goldfish: role of cellular apoptosis, oxidative/nitrative stress, and antioxidants in gills[J]. Environ Sci Pollut Res, 2022, 29: 57376-57394. doi: 10.1007/s11356-022-19779-7
[41] WEN P J, WEI X M, LIANG G Q, et al. Long-term exposure to low level of fluoride induces apoptosis via p53 pathway in lymphocytes of aluminum smelter workers[J]. Environ Sci Pollut Res, 2019, 26(3): 2671-2680. doi: 10.1007/s11356-018-3726-z
[42] MARTÍNEZ-MORENTIN L, MARTÍNEZ L, PILOTO S, et al. Cardiac deficiency of single cytochrome oxidase assembly factor scox induces p53-dependent apoptosis in a Drosophila cardiomyopathy model[J]. Hum Mol Genet, 2015, 24(13): 3608-3622. doi: 10.1093/hmg/ddv106
[43] LIN T, MAK N K, YANG M S. MAPK regulate p53-dependent cell death induced by benzo[a]pyrene: involvement of p53 phosphorylation and acetylation[J]. Toxicology, 2008, 247(2): 145-153.
[44] 刘林, 赵群芬, 金凯星, 等. 纳米氧化锌对斑马鱼肝脏的毒性效应[J]. 环境科学, 2015, 36(10): 3884-3891. doi: 10.13227/j.hjkx.2015.10.044 [45] 陈小雁, 熊真真, 尤姗姗, 等. FLASH 结合 p53 并增强其转录活性[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2021, 37(10): 1345-1356. [46] 刘明丽, 杨文意, 王金凤, 等. 低温胁迫下鱼类鳃中RPL11/MDM2/P53信号通路相关基因及蛋白表达差异分析[J]. 大连海洋大学学报, 2021, 36(1): 51-56. doi: 10.16535/j.cnki.dlhyxb.2020-008 [47] ZHANG Y, LI Q, SHU Y M, et al. Induction of apoptosis in S180 tumour bearing mice by polysaccharide from Lentinus edodes via mitochondria apoptotic pathway[J]. J Funct Foods, 2015, 15: 151-159. doi: 10.1016/j.jff.2015.03.025
[48] JIAO W Y, HAN Q, XU Y, et al. Impaired immune function and structural integrity in the gills of common carp (Cyprinus carpio L.) caused by chlorpyrifos exposure: through oxidative stress and apoptosis[J]. Fish Shellfish Immunol, 2019, 86: 239-245. doi: 10.1016/j.fsi.2018.08.060
[49] TANG J, ZHANG Z X, MIAO J J, et al. Effects of benzo[a]pyrene exposure on oxidative stress and apoptosis of gill cells of Chlamys farreri in vitro[J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2022, 93: 103867. doi: 10.1016/j.etap.2022.103867
[50] CHENG C H, YE C X, GUO Z X, et al. Immune and physiological responses of pufferfish (Takifugu obscurus) under cold stress[J]. Fish Shellfish Immunol, 2017, 64: 137-145. doi: 10.1016/j.fsi.2017.03.003
[51] 胡玲红, 王映, 王化敏, 等. 不同温度胁迫对青鳉鳃凋亡的影响[J]. 大连海洋大学学报, 2021, 36(6): 929-936. doi: 10.16535/j.cnki.dlhyxb.2021-053 [52] LIU Y F, MA D Y, XIAO Z Z, et al. Histological change and heat shock protein 70 expression in different tissues of Japanese flounder Paralichthys olivaceus in response to elevated temperature[J]. Chin J Oceanol Limnol, 2015, 33(1): 11-19. doi: 10.1007/s00343-015-4028-7
[53] MOHAMAD S, LIEW H J, ZAINUDDIN R A, et al. High environmental temperature and low pH stress alter the gill phenotypic plasticity of Hoven's carp Leptobarbus hoevenii[J]. J Fish Biol, 2021, 99(1): 206-218. doi: 10.1111/jfb.14712
[54] ZHENG X, FENG L, JIANG W D, et al. The regulatory effects of pyridoxine deficiency on the grass carp (Ctenopharyngodon idella) gill barriers immunity, apoptosis, antioxidant, and tight junction challenged with Flavobacterium columnar[J]. Fish Shellfish Immunol, 2020, 105: 209-223. doi: 10.1016/j.fsi.2020.07.036
[55] 罗胜玉. 低温胁迫对黄姑鱼生理生化指标和Hsp70基因表达模式的影响[D]. 舟山: 浙江海洋大学, 2016: 7-11. [56] DASH G, YONZONE P, CHANDA M, et al. Histopathological changes in Labeo rohita (Hamilton) fingerlings to various acclimation temperatures[J]. Chronicles Young Scientists, 2011, 2(1): 29-36. doi: 10.4103/2229-5186.79347
[57] 区又君, 刘奇奇, 温久福, 等. 急性低温胁迫对四指马鲅幼鱼肝脏、肌肉以及鳃组织结构的影响[J]. 生态科学, 2018, 37(5): 53-59. doi: 10.14108/j.cnki.1008-8873.2018.05.008 [58] GIBBONS T C, MCBRYAN T L, SCHULTE P M. Interactive effects of salinity and temperature acclimation on gill morphology and gene expression in threespine stickleback[J]. Comp Biochem Physiol A, 2018, 221: 55-62. doi: 10.1016/j.cbpa.2018.03.013
[59] 王萌, 潘阳阳, 岳亚辉, 等. 5种非甾体类抗炎药对小鼠的肝损伤作用[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2021, 49(8): 9-16. doi: 10.13207/j.cnki.jnwafu.2021.08.002 [60] HUANG C, FENG L, LIU X A, et al. The toxic effects and potential mechanisms of deoxynivalenol on the structural integrity of fish gill: oxidative damage, apoptosis and tight junctions disruption[J]. Toxicon, 2020, 174: 32-42. doi: 10.1016/j.toxicon.2019.12.151
[61] ZHANG W X, XIA S L, ZHU J, et al. Growth performance, physiological response and histology changes of juvenile blunt snout bream, Megalobrama amblycephala exposed to chronic ammonia[J]. Aquaculture, 2019, 506: 424-436. doi: 10.1016/j.aquaculture.2019.03.072
[62] DUTRA F M, RÖNNAU M, SPONCHIADO D, et al. Histological alterations in gills of Macrobrachium amazonicum juveniles exposed to ammonia and nitrite[J]. Aquat Toxicol, 2017, 187: 115-123. doi: 10.1016/j.aquatox.2017.04.003
[63] 卢其西, 林勇, 宾石玉, 等. 罗非鱼6个家系的低温耐寒测定分析[J]. 广西师范大学学报(自然科学版), 2011, 29(2): 104-109. doi: 10.16088/j.issn.1001-6600.2011.02.016 [64] 胡玉珍. 低温选择大黄鱼子代SSR分析及越冬季节生理生化指标变化[D]. 宁波: 宁波大学, 2011: 9-18. [65] 唐扬, 孟小菲, 沈瑞福, 等. 凡纳滨对虾家系选育的研究与应用[J]. 水产科学, 2018, 37(4): 555-563. doi: 10.16378/j.cnki.1003-1111.2018.04.020 [66] ANGILLETTA M J, NIEWIAROWSKI P H, NAVAS C A. The evolution of thermal physiology in ectotherms[J]. J Therm Biol, 2002, 27(4): 249-268. doi: 10.1016/S0306-4565(01)00094-8
-
期刊类型引用(5)
1. 郭美莎，李钰静，梁延鹏，马雲，王海琴，车佳祥，宋晓红. 对羟基苯甲酸丙酯(PrP)对雌性食蚊鱼的组织损伤及相关基因表达的影响. 生态毒理学报. 2024(03): 373-386 . 
百度学术
2. 蒋永生，周珊珊，周永东，徐开达，镇小蔓，焦礼诗，张秋宏，渠遥. 运输水温对曼氏无针乌贼成体死亡率及生理指标的影响. 南方水产科学. 2024(04): 107-115 . 本站查看
3. 何静怡，郑伟，黄卉，岑剑伟，赵永强，王田，魏涯，郝淑贤，杨少玲，陈琛. 不同温度、盐度条件对草鱼暂养及应激保活的影响. 大连海洋大学学报. 2024(04): 597-605 . 百度学术
4. 廖嘉仪，熊梓彤，李志力，刘其根，孙佳敏. 急性低温和复温对青田田鱼鳃组织代谢的影响. 南方农业学报. 2024(09): 2813-2823 . 百度学术
5. 李欣阳，艾力扎提·哈力夫，高居杰，姜志强. 急性低温胁迫对许氏平鲉鳃组织抗氧化能力和组织结构的影响. 河北渔业. 2024(11): 16-20 . 百度学术
其他类型引用(2)
计量
- 文章访问数: 505
- HTML全文浏览量: 182
- PDF下载量: 43
- 被引次数: 7
粤公网安备 44010502001741号
