Cloning and expression analysis of SERCA gene of Sipunculus nudus in oocytes
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摘要: 细胞内钙离子 (Ca2+) 浓度的变化是介导卵母细胞成熟的重要因素。肌质网/内质网Ca2+-ATP酶 (Sarco/endoplasmic reticulum calcium adenosine triphosphatase, SERCA) 属P型ATP酶家族成员，是细胞内Ca2+转运的重要调控蛋白。前期转录组分析显示，光裸星虫 (Sipunculus nudus) SERCA (Sn-SERCA) 的表达量在卵母细胞发育过程中差异显著，为进一步研究SERCA在卵母细胞不同发育阶段中的作用，利用RACE技术得到Sn-SERCA cDNA全长，采用实时荧光定量PCR检测Sn-SERCA在各卵母细胞发育时期的相对表达量。结果表明，Sn-SERCA全长为3 840 bp，5'非编码区 (UTR) 为196 bp，3'UTR为581 bp，开放阅读框3 060 bp，编码1 020 个氨基酸，Sn-SERCA具有P型ATP酶家族进行催化反应所需的两个保守基序“TGES”和“DKTGT”。多序列比对、Motif分析及三级结构预测结果显示SERCA同源蛋白具有较高保守性。系统进化树分析表明Sn-SERCA与粉正蚓 (Lumbricus rubellus)、鸭嘴海豆芽 (Lingula anatine) 等无脊椎动物同源蛋白序列聚为一支。荧光定量结果显示：卵母细胞在体腔液中发育时，Sn-SERCA在卵黄旺盛合成后期高表达；当卵母细胞进入肾管后，Sn-SERCA的表达量大幅上升，显著高于其他时期 (P<0.05)。结合前期卵母细胞发育的超微结构观察，研究结果表明Sn-SERCA在光裸星虫卵母细胞的卵黄积累和生发泡破裂发生过程中起重要作用。Abstract: The change of intracellular calcium (Ca2+) concentration is an important factor in oocyte maturation. As a member of the P-type ATPase family and a crucial regulator of intracellular calcium transport, sarco/endoplasmic reticulum calcium adenosine triphosphatase (SERCA) is a key enzyme. To investigate the function of SERCA in the development of the oocytes of Sipunculus nudus, we obtained the full length of S. nudus SERCA (Sn-SERCA) cDNA by using RACE technique, and determined the Sn-SERCA relative expression level in different oocyte developmental periods by using real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR). The results indicate that the overall length of the Sn-SERCA was 3 840 bp, the 5'UTR was 196 bp, the 3'UTR was 581 bp, and the open reading frame was 3 060 bp, encoding 1 020 amino acids. Sn-SERCA had TGES and DKTGT which were the P-type ATPase family's two conserved motifs and were necessary for catalytic reactions. According to multiple sequence alignment, motif analysis, and predictions of tertiary structures, the SERCA homologous proteins exhibited great conservatism. The phylogenetic tree analysis shows that the Sn-SERCA formed a broad branch with homologous protein sequences from invertebrates such as Lumbricus rubellus and Lingula anatine. The result of qRT-PCR demonstrates that the Sn-SERCA was significantly expressed in the late yolk vigorous synthesis period and had the maximum value during coelomic fluid development. When the oocytes moved to the nephridioduct, the Sn-SERCA expression was considerably higher than that at other time (P<0.05). The variable expression of Sn-SERCA in different periods of oocyte development suggests that Sn-SERCA is crucial in the development and germinal vesicle breakdown in S. nudus oocytes.
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Keywords:
- Sipunculus nudus /
- SERCA gene /
- Oocytes /
- Expression analysis
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琼胶和海藻酸钠是从海藻中提取的亲水性胶体，良好的成膜性和生物降解性使其成为可食性包装膜材料的研究热点之一[1-3]。研究表明，单一成膜基材制备的薄膜的应用性能通常具有一定的缺陷，如海藻酸钠膜机械强度低、琼胶膜柔韧性低，从而限制了其实际应用。而将不同的成膜基材复配可改善其应用性能[4]。Hou等[5]将琼胶与海藻酸钠复合，并在硼酸的作用下制备了阻燃膜；Abdollahi等[6]制备了羧甲基纤维素/琼胶复合膜，增强了膜的柔韧性；Rukmanikrishnan等[7]制备了黄原胶/琼胶复合膜，提高了膜的热稳定性。笔者前期研究了琼胶/海藻酸钠复合膜的制备工艺 (未发表)，发现当琼胶与海藻酸钠质量比为1∶1时，复合膜的断裂伸长率、拉伸强度和水蒸气透过率分别为28.73%、32.76 MPa和0.661 2 g·mm·(m2·h·kPa)−1，相较于琼胶或海藻酸钠单一膜，复合膜的性能指标得到了很好的改善，但其机械强度、阻湿性能与传统的高分子塑料膜相比仍有较大差距。因此，在提高琼胶/海藻酸钠复合膜应用性能方面还需要进一步研究。
交联改性可提高可食性膜材料的机械性能和阻湿性能等理化特性，因此成为膜改性的方法之一[8]。目前，已有学者研究了单一交联剂对可食性复合膜的改性作用并取得了显著效果。如Uranga等[9]用柠檬酸与琼胶/鱼明胶交联，提高了复合膜的阻湿性；庄晓雯等[10]以氯化铁-盐酸溶液 (FeCl3-HCl) 为交联体系，制备了防紫外线的海藻酸钠纤维膜；Belay等[11]以琥珀酸为交联剂，制备了高强度的琼胶膜。可见，交联剂的种类是影响交联膜性能的关键因素。
为提高琼胶/海藻酸钠复合膜的应用性能，本研究在前期研究的基础上，以琼胶和海藻酸钠为成膜基料、以甘油为增塑剂，研究阿魏酸 (Ferulic acid, FA)、单宁酸 (Tannin acid, TA)、柠檬酸 (Citric acid, CA) 和丁二酸 (Succinic acid, SA) 4种食用交联剂，对琼胶/海藻酸钠复合膜机械性能和阻湿性等理化特性的影响，以期为琼胶/海藻酸钠可食性复合膜的开发利用提供理论依据和科学参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
琼胶粉 (汕头市澄海区琼胶厂)；海藻酸钠 [酷尔化学 (北京) 科技有限公司]；甘油、阿魏酸、柠檬酸 [阿拉丁试剂 (上海) 有限公司]；单宁酸 (天津市北辰方正试剂厂)；丁二酸 (西陇科学有限公司)；无水氯化钙 (天津市汇杭化工科技有限公司)。试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
电子拉力试验机 (东莞东日仪器有限公司)；数显磁力搅拌水浴锅 (金坛区西城新瑞仪器厂)；BS224S电子天平 (美国Sartorius公司)；恒温干燥箱 (重庆雅马拓科技有限公司)；恒温恒湿培养箱 (上海力辰邦西仪器科技有限公司)；UV2550紫外-可见分光光度计 (上海美谱达仪器有限公司)；IRAffinity−1红外光谱仪 (日本岛津公司)；数显测厚仪 (浙江德清盛泰芯电子科技有限公司)；Phenom Pro台式扫描电镜 (上海复纳科学仪器有限公司)。其他均为实验室常用仪器。
1.3 方法
1.3.1 复合膜的制备
根据笔者前期实验并参考Hou等[5]的方法制备琼胶/海藻酸钠复合膜。分别称取0.75 g琼胶和海藻酸钠于锥形瓶中，加入100 mL去离子水，加热搅拌至完全溶解。然后加入不同质量分数 (以琼胶和海藻酸钠为基准，下同) 的交联剂 (阿魏酸、单宁酸、柠檬酸、丁二酸)，在70 ℃下水浴搅拌至完全溶解，再分别加入质量分数为30%的甘油，继续搅拌30 min。将所得的溶液抽真空脱除气泡后，倒入18 cm×18 cm×1 cm的亚克力板槽中，移入50 ℃干燥箱恒温干燥24 h，取出、揭膜，再将膜放入90 ℃干燥箱中干燥12 h。最后放入恒温恒湿培养箱中 (25 ℃，相对湿度50%)。
1.3.2 复合膜性能指标测定
1) 厚度测定。采用数显测厚仪 (精度为0.001 mm) 对薄膜厚度进行测定。将薄膜铺平，在中心和四角随机选取10个位置进行测定。薄膜厚度取其平均值。
2) 机械性能测定。参照孙晗等[12]的方法，略作修改。将膜裁成2 cm×8 cm条状，用拉伸试验机测定膜的拉伸强度 (Tensile strength, TS) 和断裂伸长率 (Elongation at break percent, EB)。夹具起始间距为40 mm，拉伸速度为50 mm·min−1，每张膜测3个平行，结果取其平均值。计算公式为：
$$ {σ_{\rm {TS}}}=\frac{F}{S}\times 10^{-6} $$ (1) $$ R_{\mathrm{EB}}=\frac{L}{L_0} \times 100 {\text{%}} $$ (2) 式中：σTS 表示拉伸强度 (MPa)； F 表示试样断裂时承受的最大拉力 (N)； S 表示试样的横截面积 (m2)；REB表示断裂伸长率 (%)；L表示试样断裂时的伸长量 (mm)；L0表示夹具起始间距 (mm)。
3) 溶胀率和水溶性测定。参考Wang等[13]的方法，略作修改。将膜裁成2 cm×2 cm的方块，在105 ℃烘箱干燥至恒质量 (m1)。将烘干后的薄膜放入盛有50 mL蒸馏水的锥形瓶中，在25 ℃下浸泡24 h，取出，用滤纸吸干其表面水分，测其质量 (m2)，再用105 ℃的烘箱干燥至恒质量，取出，测其质量 (m3)。每个样品测3个平行，结果取平均值。膜的溶胀率 (Swelling ratio, RSR, %) 和水溶性 (Water solubility, RWS, %) 计算公式分别为：
$$ R_{\mathrm{SR}}=\frac{m_2-m_1}{m_1} \times 100 {\text{%}} $$ (3) $$ R_{\mathrm{WS}}=\frac{m_1-m_3}{m_1} \times 100 {\text{%}} $$ (4) 4) 水蒸气透过率测定。参照Kurt和Kahyaaglu[14]的方法，略作修改。将膜裁成直径为6 cm的圆片，覆盖在装有无水氯化钙的称量瓶 (50 mm×30 mm) 口上，并用石蜡封好瓶口，测其质量。然后将称量瓶放入底部盛有蒸馏水的玻璃干燥器中 (提前在25 ℃下恒温4 h)，在25 ℃下恒温静置，每隔2 h取出称量瓶测其质量，连续测6次。每个样品做3个平行，结果取平均值。复合膜水蒸气透过率 (Water vapor permeability, WVP) 计算公式为：
$$R_{ \rm { WVP }}=\frac{{v_\rm{WVP}}\times D}{\Delta P} $$ (5) 式中：RWVP表示水蒸气透过率；vWVP表示水蒸气透过速率 [g·(m2·h)−1]；D表示膜的厚度 (mm)；ΔP表示膜两侧水蒸气压差 (3.167 1 kPa)。
5) 不透明度测定。用紫外-可见分光光度计对膜的不透明度进行测定，参照Sukhija等[15]的方法，略作修改。将膜裁成矩形，使其刚好紧贴10 mm比色皿内壁。以空白比色皿为对照，用分光光度计在600 nm下测定吸光度值。每个样品做3个平行，结果取平均值。膜的不透明度计算公式为：
$$ O _{\mathrm{p}}=\frac{A_{600}}{X} $$ (6) 式中：Op表示不透明度；A600表示600 nm下的吸光度；X表示膜的厚度 (mm)。
1.3.3 扫描电镜
参考庄晓雯等[10]的方法，略作修改。将膜样品在液氮中脆断并进行镀金处理，在10 kV加速电压下使用扫描电子显微镜进行微观结构分析。
1.3.4 红外光谱测定
参考Belay等[11]的方法，略作修改。采用傅里叶变换红外光谱 (FT-IR) 对膜的化学结构进行分析。将薄膜在90 ℃下干燥后，以空气为背景，对样品进行测定，扫描波数介于400~4 000 cm−1，扫描32次，分辨率为4 cm−1，用OMNIC 8.2软件进行数据分析。
1.3.5 数据处理
采用IBM SPSS Statistics 22.0软件对实验数据进行统计分析，使用Origin 2018软件绘图。每个样品做3个平行实验，数据以“平均值±标准差 (
$ \overline { X} \pm{{\rm{SD}})} $ ”表示。2. 结果与分析
2.1 交联剂对复合膜机械性能的影响
拉伸强度和断裂伸长率是评价薄膜机械性能的重要指标，良好的机械性能有利于保持薄膜的力学完整性和应用行为。由图1-a可见，随着交联剂添加量的增加，4种交联膜的拉伸强度均呈先升后降的变化趋势。阿魏酸和单宁酸在添加量为0%~5%时，拉伸强度随添加量的增加而直线上升，当添加量为5%时达最大值 (45.13和42.90 MPa)，比对照组 (32.05 MPa) 分别提高了40.8%和33.9%；当添加量为5%~15%时，拉伸强度随添加量的增加而降低，在15%时达最低值 (29.50和31.22 MPa)，相较于最高值分别降低了34.6%和27.2%。当柠檬酸和丁二酸添加量为0%~10%时，拉伸强度由32.05 MPa分别提高至46.97和44.11 MPa，提高了46.6%和37.6%；当添加量超过10%时，拉伸强度快速下降，当添加量为15%时降至最低值 (40.91和39.56 MPa)。这与Cao等[16]制备的阿魏酸/明胶交联膜拉伸强度的变化趋势一致，当阿魏酸添加量为0~30 mg·g−1时，交联膜的拉伸强度随添加量的增加而提高，但当添加量超过30 mg·g−1时，拉伸强度随添加量的增加而降低。适量添加交联剂可提高膜的拉伸强度，这是因为交联剂与琼胶和海藻酸钠分子链中的羟基 (−OH) 和羧基 (−COOH) 发生反应，形成分子间氢键和羰基，形成致密的三维网络结构，从而增加了膜的拉伸强度[17]。但过量的交联剂会游离于薄膜中，降低分子链间的相互作用，导致薄膜结构紊乱，从而降低拉伸强度[18]。另外，过量的交联剂会使琼胶和海藻酸钠发生部分水解而降低薄膜的拉伸强度[19]。
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图 1 不同交联剂对复合膜拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过率水溶性和溶胀率的影响注：图1-d和1-e中同种交联剂不同小写字母间存在显著性差异 (P<0.05)。Figure 1. Effects of different crosslinking agents on tensile strength, elongation at break, water vapor permeability, water solubility, and swelling ratio of composite filmsNote: For the same crosslinking agent, different letters indicate significant differences (P<0.05).由图1-b可知，4种交联剂降低了琼胶/海藻酸钠复合膜的断裂伸长率，且呈先降后升的变化趋势。当阿魏酸和单宁酸添加量介于0%~5%时，薄膜断裂伸长率随添加量的增加而降低，当添加量为5%时，达到最低值 (19.49%和15.44%)，比对照组 (29.21%) 分别降低了33.3%和47.1%。当添加量超过5%时，断裂伸长率又缓慢上升最后趋于平衡，并在15%时达最大值 (25.48%和17.36%)。而柠檬酸和丁二酸在添加量为0%~10%时，薄膜断裂伸长率随添加量的增加而下降，并在10%时达到最低值 (17.87%和18.73%)，比对照组分别降低了38.8%和35.9%，但当添加量超过10%时，断裂伸长率趋于上升，在15%时达最大值 (23.07%和22.56%)。添加交联剂使薄膜断裂伸长率降低，这是因为交联剂与成膜物质反应形成了致密的网络结构，提高了膜拉伸强度，但限制了大分子链的自由运动，减小了成膜基质分子间的距离[20]。而当添加量继续增加，薄膜断裂伸长率又再上升，这是因为交联剂的增塑作用[21]使过量的交联剂分子插入到成膜物质的分子之间，减弱了分子间的作用力，降低了膜的刚性。这与Mathew和Abraham[20]对阿魏酸交联淀粉/壳聚糖复合膜的研究结果相似，该研究发现当阿魏酸添加量为0~75 mg时，复合膜拉伸强度随添加量的增加逐渐提高，但复合膜的断裂伸长率逐渐降低，当添加量超过75 mg时，复合膜拉伸强度下降，但复合膜断裂伸长率提高。
2.2 交联剂对复合膜水蒸气透过率的影响
膜的水蒸气透过率是评价包装材料阻隔性能的重要指标。由图1-c可见，4种交联剂在一定添加范围内均可降低复合膜的水蒸气透过率，且随添加量的增加呈先下降后上升的趋势。当添加量为0%~10%时，柠檬酸和丁二酸交联膜的水蒸气透过率逐渐减小，在10%时分别达最低值 [0.507 3和0.559 8 g·mm·(m2·h·kPa)−1]，比对照组 [0.667 9 g·mm·(m2·h·kPa)−1] 降低了24.0%和16.2%。当添加量超过10%时，水蒸气透过率又逐渐提高；而当阿魏酸和单宁酸添加量为0%~5%时，薄膜水蒸气透过率逐渐降低，并在5%时分别达最低值 [0.591 6和0.571 7 g·mm·(m2·h·kPa)−1]，比对照组分别降低了11.4%和14.4%。当添加量超过5%时，薄膜水蒸气透过率又不断升高。这与阿魏酸对马铃薯淀粉膜水蒸气透过率的影响[18]结论相似，即当阿魏酸添加量为0%~1%时，淀粉膜的水蒸气透过率逐渐降低，在1%时达最低值 [4.52 g·mm·(m2·d·kPa)−1]，而当添加量超过1%时，淀粉膜的水蒸气透过率又随添加量的增加略微提高。交联剂可降低复合膜水蒸气透过率、提高膜的阻隔性，这是因为交联反应使聚合物的网络结构更加紧密，使大分子之间的间隙减小，限制了水分子的渗透作用。而添加过量时，多余的交联剂可减弱成膜物质间的相互作用，增大聚合物的分子距离，增加膜的通透性，从而导致水蒸气透过率升高[22]，降低膜的阻隔性能。
2.3 交联剂对复合膜水溶性和溶胀率的影响
耐水性是作为包装用途的薄膜材料非常重要的指标，而水溶性和溶胀率则是评价薄膜耐水性的主要指标。由图1-d可见，4种交联剂均显著降低了薄膜的水溶性 (P<0.05)，且随添加量的增加先降后升。当阿魏酸和单宁酸添加量为5%时，水溶性降至最低值 (29.88%和29.82%)，比对照组 (48.51%) 分别降低了38.4%和38.5%。当添加量超过5%时，水溶性随添加量的增加又缓慢上升，但仍显著低于对照组 (P<0.05)；当柠檬酸和丁二酸添加量为10%时，水溶性降至最低值 (24.17%和23.08%)，比对照组分别降低了50.2%和52.4%。当添加量为10%~15%时，又随添加量的增加而上升。添加交联剂可使膜的水溶性降至30%以下，与明胶可食膜[23]和大豆分离蛋白可食膜[24]相比，该交联膜具有更优异的耐水性。适量添加交联剂可使薄膜水溶性降低，这是因为交联反应减少了琼胶和海藻酸钠中的亲水性−OH的数量，降低了成膜物质对水分子的吸引力 [25]。而添加过量的交联剂会使琼胶和海藻酸钠发生部分水解，破坏膜的网络结构，水分子更加容易进入成膜物质分子内部，导致薄膜水溶性升高[18]。
溶胀是指溶剂分子扩散进入高分子内部间隙中，宏观上表现出体积增大的现象[26]。由图1-e可见，随着交联剂添加量的增加，薄膜溶胀率先降后升。在添加量为0%~5%时，阿魏酸和单宁酸交联膜溶胀率分别由400%降至207%和167%，比对照组降低了48.3%和58.3%。当添加量超过5%时，薄膜溶胀率又逐渐上升，但在实验剂量范围内显著低于对照组 (P<0.05)；当柠檬酸和丁二酸添加量为0%~10%时，薄膜溶胀率随添加量的增加而显著降低 (P<0.05)，并在10%时达最低值 (38%和42%)，比对照组分别降低了91%和90%。当添加量超过10%时，交联膜溶胀率又逐渐上升，这与水溶性具有相似的变化趋势。适量添加交联剂可以降低膜的溶胀率，如Belay等[11]以丁二酸为交联剂制备琼胶膜，当丁二酸添加量为0%~15%时，琼胶膜溶胀率从804%降至108%。适量添加交联剂会降低膜溶胀率，这是因为交联剂会使大分子间的距离缩小，水分子难以渗透到成膜物质的分子间隙中。但添加过量则会导致薄膜结构松散，水分子更易进入成膜物质分子内部，使薄膜溶胀率升高[27]。
4种交联剂均可显著降低膜的水溶性和溶胀率 (P<0.05)，表明交联剂可显著提高复合膜的耐水性。在相同添加量下，柠檬酸和丁二酸交联膜水溶性和溶胀率均比阿魏酸和单宁酸交联膜低，这是因为柠檬酸和丁二酸的反应活性更高，能与成膜物质间形成更加稳定的网络结构，降低膜的亲水性，水分子也难以进入交联膜的网络结构之中[28-29]。
2.4 交联剂对复合膜不透明度的影响
包装膜的外观会影响消费者对产品的可接受程度，不透明度是评价薄膜对光透过程度的重要指标。由表1可知，4种交联剂对复合膜的不透明度影响显著 (P<0.05)。随着添加量的增加，复合膜的不透明度逐渐升高。4种交联剂添加量由0%增至15%时，交联膜的不透明度分别由1.18增至1.59、3.65、1.41和1.29。单宁酸对复合膜不透明度影响最大，比对照组提高了2.5倍，这是因为单宁酸为浅棕色，随添加量的增加，复合膜颜色逐渐变黄[16]，导致膜不透明度增加；阿魏酸交联膜的不透明度也高于柠檬酸和丁二酸交联膜，这是因为阿魏酸在空气中被部分氧化，导致复合膜颜色变白，从而增加了膜的不透明度；柠檬酸和丁二酸对复合膜透明度的影响，是由于其交联作用使膜的结构变得更加致密，从而降低了可见光的透过率，另外柠檬酸在保温反应过程中会脱水，产生有色不饱和酸，导致复合膜颜色变黄[30]，这也增加了膜的不透明度。
表 1 不同交联剂对复合膜不透明度的影响Table 1. Effect of different crosslinking agents on opacity of composite films交联剂添加量Crosslinking agent
addition/%复合膜不透明度Opacity of composite films 阿魏酸FA 单宁酸TA 柠檬酸CA 丁二酸SA 0 1.18±0.01f 1.18±0.01f 1.18±0.01d 1.18±0.01e 3 1.22±0.01e 1.84±0.02e 1.20±0.02d 1.20±0.01de 5 1.30±0.02d 2.64±0.03d 1.27±0.03c 1.23±0.01cd 7 1.39±0.01c 2.93±0.06c 1.31±0.02b 1.24±0.02bc 10 1.46±0.01b 3.14±0.02b 1.34±0.02b 1.27±0.03ab 15 1.59±0.01a 3.65±0.10a 1.41±0.03a 1.29±0.01a 注：同列不同字母表示差异显著 (P<0.05)。 Note: Different letters within the same column indicate significant differences (P<0.05). 2.5 交联膜扫描电镜分析
对4种琼胶/海藻酸钠交联膜 (阿魏酸和单宁酸添加量5%，柠檬酸和丁二酸添加量10%) 和未交联膜进行扫描电镜分析 (图2)。未交联膜与交联膜表面均较光滑、平整，未出现孔隙、明显颗粒及相分离现象，这说明成膜基质各组分之间的相容性良好，这是因为琼胶与海藻酸钠中含有大量−OH，通过形成分子间氢键提高其相容性。由交联膜和未交联膜的截面可见，未交联膜截面粗糙且出现明显的纵向裂纹，这与成膜基质干燥后呈纤维化取向有关；而交联膜的截面更加光滑、致密且无裂纹出现，这是因为交联剂通过与成膜基质之间形成氢键和酯键，使各组分之间的连接更加紧密，从而改变了其纤维化取向，因此无裂纹出现，截面更加光滑。这与单宁酸和阿魏酸对明胶膜的影响相似，交联剂的添加改变了明胶膜截面的微观结构，形成了更多的网络结构[16]。
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图 2 未交联膜与交联膜表面 (左1 000×) 及截面 (右800×)扫描电镜图Figure 2. SEM images of surfaces (Left 1 000×) and cross sections (Right 800×) of uncrosslinked and crosslinked films2.6 红外光谱
对4种琼胶/海藻酸钠交联膜 (阿魏酸和单宁酸添加量5%，柠檬酸和丁二酸添加量10%) 和对照膜进行了FT-IR分析 (图3)。复合膜在3 379 cm−1处的吸收带是琼胶和海藻酸钠分子中−OH伸缩振动的结果[31]，1 599和1 417 cm−1处的特征峰分别对应−COOH的反对称和对称伸缩振动吸收峰[32]。2 929 cm−1处C−H的对称伸缩振动吸收峰和931 cm−1处的C−O−C拉伸吸收峰均为典型的多糖特征吸收峰[33]。柠檬酸和丁二酸交联膜分别在1 720和1 717 cm−1处出现新的吸收峰，表明分子中形成了C=O，说明柠檬酸和丁二酸的羧基通过与海藻酸钠和琼胶中的−OH形成酯键实现交联[34-35]。然而，阿魏酸和单宁酸交联膜在1 720 cm−1处未出现明显的吸收峰，表明在该反应条件下，阿魏酸和单宁酸未能与海藻酸钠和琼胶发生酯化反应，但在3 379 cm−1处吸收峰强度变大，这是因为分子间形成了更多的氢键[36]，由此可推测阿魏酸和单宁酸与琼胶和海藻酸钠通过分子间氢键而实现交联。
3. 结论
本研究比较了4种交联剂对琼胶/海藻酸钠复合膜性能的影响。结果表明，适量添加交联剂可有效改善琼胶/海藻酸钠复合膜的性能。当阿魏酸和单宁酸添加量为5%、柠檬酸和丁二酸添加量为10%时，各交联膜的性能指标均达到最优值；各交联剂在最适添加量条件下，柠檬酸对复合膜的综合性能指标改善最好，即当添加量为10%时，拉伸强度比对照组提高了46.6%，水溶性和溶胀率分别降低了50.2%和91%，水蒸气透过率降低了24%；4种交联剂均增加了复合膜的不透明度，因此琼胶/海藻酸钠交联改性膜较适宜阻光包装材料；扫描电镜分析表明，成膜基质各组分相容性良好，交联剂使复合膜截面更加致密、光滑；FT-IR分析表明，柠檬酸和丁二酸与琼胶和海藻酸钠分子中的−OH发生酯化反应而改善膜的性能，而阿魏酸和单宁酸与琼胶和海藻酸钠通过形成分子间氢键实现交联。综上，本研究的4种交联剂可不同程度地改善琼胶/海藻酸钠复合膜的应用特性，在生物可降解包装材料领域具有较好的应用前景，也为海藻多糖可食性膜的研究和开发提供了理论基础。
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图 1 光裸星虫卵母细胞各时期总RNA和cDNA琼脂糖凝胶电泳图
Figure 1. Agarose gel electrophoresis diagram of total RNA and cDNA from oocytes of S. nudus
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图 2 Sn-SERCA cDNA序列全长及推导的氨基酸序列
Figure 2. Full length and deduced amino acid sequence of Sn-SERCA cDNA sequence
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图 5 光裸星虫 (a)、粉正蚓 (b)、鸭嘴海豆芽 (c) 和加州海兔 (d) SERCA蛋白三级结构
Figure 5. Tertiary structure of protein of SERCA of S. nudus (a), L. rubellus (b), L. anatina (c) and A. californica (d)
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图 6 SERCA同源氨基酸序列多序列比对
Figure 6. Multiple sequence alignment of SERCA homologous protein
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图 9 光裸星虫各发育时期卵母细胞中Sn-SERCA的相对表达量
Figure 9. Relative expression of Sn-SERCA in different developmental periods of oocytes
表 1 Sn-SERCA基因克隆及实时荧光定量引物序列
Table 1 Primer sequence used in gene cloning and qRT-PCR of Sn-SERCA gene
引物Primer 序列 (5'—3')Sequence (5'–3') 用途Function 5'-outer GTCTGCTGGAACCTTGTC 5'RACE 5'-inner CTGCCATACTCCAACAACT 5'RACE 3'-outer CAACTCAACTACTACCAACTG 3'RACE 3'-inner GTCACTTCTTGTCTCCTCAT 3'RACE M13-F CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 菌落PCR M13-R AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 菌落PCR qRT-PCR-S TGCCTTGTAGCCTCCTTCC qRT-PCR qRT-PCR-A ACTGTCCTCATCTTCCATTGTG qRT-PCR 60SL7-S CAGGCTAACAACTTCTTATGG qRT-PCR (内参) 60SL7-A TGGCTTGACAGATAACACTT qRT-PCR (内参) 
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表 2 Sn-SERCA序列分析所用软件及在线工具
Table 2 Software and online tool for sequence analysis of Sn-SERCA
名称Name 网址Website 用途Function DNAMAN 8 拼接测序结果及多序列比对 ORF Finder https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder 预测ORF及氨基酸序列 ProtParam https://web.expasy.org/protparam 预测蛋白的理化性质 NCBI Blast https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 搜索同源蛋白 SMART http://smart.embl-heidelberg.de 预测保守结构域 SOPMA https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html 预测蛋白二级结构 phyre2 http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index 预测蛋白三级结构 MEME Suit http://meme-suite.org/index.html Motif 搜索
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