Effect of enzymolysis alginate oligosaccharide on myofibrillar protein in simulated oral digestion
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摘要: 将鲢 (Hypophthalmichthys molitrix) 加工成肉糜制品能增加消费者的接受度从而提高其经济价值，酶解褐藻寡糖 (Enzymolysis alginate oligosaccharide, EAO) 能与鲢肌原纤维蛋白 (Myofibrillar protein, MP) 快速反应，提高食品的功能特性。食物经口腔加工后会发生明显的物理、化学变化。为了解肌原纤维蛋白在鲢消化过程中的结构变化，明确口腔消化对褐藻寡糖修饰后的肌原纤维蛋白的影响，从新鲜鲢中提取了肌原纤维蛋白，并向其中添加0.45 mg·mL−1的酶解褐藻寡糖获得寡糖-蛋白复合物 (EAO-MP)，考察了鲢肌原纤维蛋白 (M组) 与寡糖-蛋白复合物 (A组) 在模拟口腔消化中的傅里叶红外光谱、内源性荧光光谱、紫外吸收光谱、巯基含量、氢键含量、表面疏水性的变化差异。结果显示：经过模拟口腔消化后，M组无规卷曲结构、总巯基含量增加，表面疏水性显著降低 (P<0.05)，说明肌原纤维蛋白由于模拟口腔消化液的作用，二级、三级结构发生了改变；添加酶解褐藻寡糖后的A组无规卷曲结构下降了2.97%，A组在3个不同消化时间点 (0、5、15 s) α-螺旋结构相比M组分别增加了7.29%、2.73%、5.55%；氢键含量显著增加 (P<0.05)，说明肌原纤维蛋白与酶解褐藻寡糖通过氢键作用结合为共价聚合物；巯基含量显著降低，表面疏水性呈升高趋势，说明酶解褐藻寡糖的加入促进肌原纤维蛋白在模拟口腔消化液中展开蛋白结构。综上，酶解褐藻寡糖的添加能促使鲢肌原纤维蛋白分子结构在模拟口腔消化液中展开，推测这可能有利于蛋白后续的消化吸收。Abstract: Processing silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) into surimi products can improve consumers' acceptance and its economic value. Enzymolysis alginate oligosaccharide (EAO) can quickly react with myofibrillar protein (MP) extracted from silver carp to improve functional characteristics. Food will undergo physical and chemical changes after oral processing. To better understand the effects of oral digestion on the EAO-modified MP, we extracted the MP from fresh silver carp which was added 0.45 mg·mL−1 EAO to create a complex (EAO-MP). Then we investigated the variations of Fourier infrared spectroscopy, endogenous fluorescence spectroscopy, UV absorption spectroscopy, contents of sulfhydryl and active sulfhydryl, surface hydrophobicity, and hydrogen bonds in the simulated oral digestion of silver carp MP (Group M) and EAO-MP (Group A). The results show that, after the simulated oral digestion, the random coil structure and total sulfhydryl content increased, while the surface hydrophobicity decreased significantly in Group M (P<0.05), which demonstrates that the secondary and tertiary structures of MP had changed due to the effect of simulated oral digestive fluid. Besides, the random coil in Group A decreased by 2.97% after adding EAO. At three different digestion times, the α-helix increased by 7.29%, 2.73% and 5.55%, respectively, compared with Group M. Additionally, the hydrogen bond content increased significantly in Group A (P<0.05), revealing that MP and EAO were bonded to a covalent polymer by the hydrogen bond force. The significant increase in surface hydrophobicity and decrease in sulfhydryl content show that the addition of EAO promotes the expansion of the protein structure of MP in simulated oral digestive fluid. In conclusion, the addition of EAO can promote the molecular structure of silver carp MP to expand in the simulated oral digestive fluid, which may be conducive to the subsequent digestion and absorption of protein.
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麦瑞加拉鲮 (Cirrhinus mrigala)，隶属鲤形目、鲤科、野鲮亚科、鲮属，又称麦鲮、印度野鲮，原产自印度洋沿岸地区[1]。在印度，麦瑞加拉鲮是鲤科鱼类中重要的经济品种之一，在鲤科鱼类养殖中的占比约为25%~31% [2]。作为一种重要的淡水养殖鱼类，麦瑞加拉鲮因其具有生长速度快、耐低温、抗病力强等优点，在中国南方地区迅速引入并被广泛养殖 [3]；又因其繁殖季节早、繁殖力高、初孵仔鱼规格小等原因，其鱼苗也用于鲈 (Lateolabrax japonicus)、鳜 (Siniperca chuatsi)、叉尾鲇 (Wallago attu) 等肉食性鱼类的开口饵料[4]。
关于麦瑞加拉鲮的研究主要集中在毒理学[5-6]、营养学[7-9]和养殖学[10-11]等领域。虽已有对其人工繁殖及胚胎发育过程的初步描述[12]，但目前的研究仅停留在简单的观察性描述，未能深入分析其胚胎发育各个阶段的形态学特征。因此，本研究通过系统观察麦瑞加拉鲮的胚胎及仔鱼发育过程，补充其基础生物学资料，详细记录了胚胎从受精到孵化以及仔鱼从孵化到早期发育阶段的形态变化、组织分化等关键生物学特征，为进一步完善麦瑞加拉鲮的人工繁殖技术提供了详实的实验数据和理论依据，为其可持续养殖和产业化发展奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验用鱼为云南省糯扎渡鱼类增殖站人工驯养的麦瑞加拉鲮，所选亲鱼体质健康，体表光滑无伤，3龄以上，体质量大于2.0 kg。繁殖季节雄鱼胸鳍有珠星，较粗糙，轻压腹部有乳白色精液流出，遇水即散开；雌鱼腹部柔软，生殖孔红肿。亲鱼雌、雄数量比为5∶2，称质量后放入产卵池暂养。产卵池为直径4 m、深2 m的圆形水泥池，侧面进水，底部排水。
1.2 催产和受精
催产剂由促黄体激素释放激素类似物 (LRH-A2) 和地欧酮 (DOM) 组成，采用二次注射法，第1针对雌鱼一次性注射LRH-A2 3 μg·kg−1，雄鱼不注射；8 h后对雌鱼亲本一次性注射DOM 3 mg·kg−1 + LRH-A2 6 μg·kg−1，雄鱼注射量为雌鱼一半。注射完毕后将亲鱼放回产卵池内待产，流水刺激，产卵池上方铺设盖网防止亲鱼跳出。
约6 h后，待观察到产卵池内雌雄亲本互相追逐即可进行人工授精。将亲鱼从产卵池捞出，擦干体表水分后将卵子挤出置于洁净的塑料盆中，待所有雌鱼排卵完毕后，再将雄鱼精液挤至卵子上。用羽毛轻轻搅拌均匀，加水激活精子，静置2 min后多次洗去杂质。将受精卵放入消毒后的圆形孵化环道内孵化，水温26~28 ℃，溶解氧质量浓度≥7 mg·L−1。
1.3 胚胎和仔鱼发育观察
随机取30~50粒受精卵，在光学体视显微镜 (T2-HK830，深圳市奥斯微光学仪器有限公司) 下进行观察，当观察到超过50%的受精卵发生形态变化时判定为进入下一发育时期，胚胎发育分期参考文献 [13-15]。原肠期前每次取卵间隔时间不超过10 min，之后每次间隔时间不超过1 h。
1.4 数据分析
积温 (Accumulated temperature, ℃·h) =该发育阶段的平均水温 (℃) ×该发育阶段的持续时间 (h)，胚胎发育的总积温为所有发育阶段的积温相加。
绝对生长率 (Absolute growth rate, AGR, mm·d−1) 计算公式为：
$$ {R}_{\mathrm{A}\mathrm{G}\mathrm{R}}{\mathrm{=}}(L{t}_{2}{\text{−}}L{t}_{1})/({t}_{2}{\text{−}}{t}_{1}) $$ (1) 特定生长率 (Specific growth rate, SGR, %·d−1)计算公式为：
$$ {R}_{\mathrm{S}\mathrm{G}\mathrm{R}}{\mathrm{=}}\left[\right(\mathrm{l}\mathrm{n}L{t}_{2}{\text{−}}\mathrm{l}\mathrm{n}L{t}_{1})/({t}_{2}{\text{−}}{t}_{1}\left)\right]\times 100{\text{%}} $$ (2) 式中：RAGR和RSGR分别为绝对生长率和特定生长率；t1和t2为任意选取的2个测量时间段；Lt1和 Lt2分别为发育到t1和t2时的全长。
使用Excel 2021和GraphPad Prism 8软件对数据进行统计分析和制图，数据以“平均值±标准差 ($\overline { x}\pm s $)”表示，利用Adobe Photoshop CC 2023软件处理胚胎发育图片。
2. 结果
2.1 胚胎发育
麦瑞加拉鲮产漂流性卵，受精卵呈圆球形、淡灰色 (图1-a)。成熟卵子直径为 (1.41±0.08) mm，受精卵吸水膨胀后直径达 (4.98±0.67) mm (图1-b) (灰色部分为吸水膨胀后的卵膜)，膨胀系数为353.19%。麦瑞加拉鲮的胚胎发育过程历经胚盘形成期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官形成期和孵化期共7个阶段32个时期，历时15 h 40 min，孵化积温438.67 ℃·h (图1和表1)。
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图 1 麦瑞加拉鲮发育图谱注：a. 受精卵；b. 吸水膨胀；c. 胚盘期；d. 2细胞期；e. 4细胞期；f. 8细胞期；g. 16细胞期；h. 32细胞期；i. 64细胞期；j. 多细胞期；k. 桑椹胚期；l. 囊胚早期；m. 囊胚中期；n. 囊胚晚期；o. 原肠早期；p. 原肠中期；q. 原肠晚期；r. 神经胚期；s. 胚孔封闭期；t. 肌节出现期；u. 眼囊出现期；v. 心脏原基出现期；w. 嗅囊出现期；x. 耳囊出现期；y. 尾泡出现期；z. 晶体出现期；aa. 肌肉效应期；ab. 尾芽出现期；ac. 耳石形成期；ad. 心跳期；ae. 尾鳍鳍褶出现期；af. 胸鳍原基出现期；ag. 出膜。标尺=1 mm。Figure 1. Embryonic development sequence of C. mrigalaNote: a. Fertilized egg; b. Water-absorbent expansion; c. Blastodisc stage; d. 2-cell stage; e. 4-cell stage; f. 8-cell stage; g. 16-cell stage; h. 32-cell stage; i. 64-cell stage; j. Multicellular stage; k. Morula stage; l. Early blastula stage; m. Mid blastula stage; n. Late blastula stage; o. Early gastrula stage; p. Mid gastrula stage; q. Late gastrula stage; r. Neurula stage; s. Closure of blastopore; t. Appearance of myomere; u. Appearance of optic vesicle; v. Heart rudiment; w. Olfactory capsule; x. Appearance of otic capsule. y. Formation of caudal vesicle; z. Formation of eye len; aa. Muscular effect; ab. Formation of tail bud; ac. Appearance of otolith; ad. Heart pulsation; ae. Caudal fin fold; af. Pectoral fin; ag. Embryo hatching. Bar: 1 mm.表 1 麦瑞加拉鲮发育时序Table 1. Timing of embryonic development sequence of C. mrigala发育时期
Developmental period受精后时间
Time after fertilization持续时间
Duration积温
Accumulative temperature/ (℃·h)图序
Plate受精卵 Fertilized egg 0 12 min 5.60 1-a 胚盘期 Blastodisc stage 12 min 5 min 2.33 1-c 2细胞期 2-cell stage 17 min 8 min 3.73 1-d 4细胞期 4-cell stage 25 min 7 min 3.27 1-e 8细胞期 8-cell stage 32 min 15 min 7.00 1-f 16细胞期 16-cell stage 47 min 12 min 5.60 1-g 32细胞期 32-cell stage 59 min 9 min 4.20 1-h 64细胞期 64-cell stage 1 h 8 min 8 min 3.73 1-i 多细胞期 Multicellular stage 1 h 16 min 11 min 5.13 1-j 桑椹胚期 Morula stage 1 h 27 min 36 min 16.80 1-k 囊胚早期 Early blastula stage 2 h 3 min 19 min 8.87 1-l 囊胚中期 Mid blastula stage 2 h 22 min 28 min 13.07 1-m 囊胚晚期 Late blastula stage 2 h 50 min 44 min 20.53 1-n 原肠早期 Early gastrula stage 3 h 34 min 1 h 4 min 29.87 1-o 原肠中期 Mid gastrula stage 4 h 38 min 58 min 27.07 1-p 原肠晚期 Late gastrula stage 5 h 36 min 51 min 23.80 1-q 神经胚期 Neurula stage 6 h 27 min 28 min 13.07 1-r 胚孔封闭期 Closure of blastopore 6 h 55 min 25 min 11.67 1-s 肌节出现期 Appearance of myomere 7 h 20 min 35 min 16.33 1-t 眼囊出现期 Appearance of optic vesicle 7 h 55 min 44 min 20.53 1-u 心脏原基出现期 Heart rudiment 8 h 39 min 45 min 21.00 1-v 嗅囊出现期 Olfactory capsule 9 h 24 min 42 min 19.60 1-w 耳囊出现期 Appearance of otic capsule 10 h 6 min 1 h 34 min 43.87 1-x 尾泡出现期 Formation of caudal vesicle 11 h 40 min 19 min 8.87 1-y 晶体出现期 Formation of eye len 11 h 59 min 24 min 11.20 1-z 肌肉效应期 Muscular effect 12 h 23 min 9 min 4.20 1-aa 尾芽出现期 Formation of tail bud 12 h 32 min 10 min 4.67 1-ab 耳石形成期 Appearance of otolith 12 h 42 min 1 h 4 min 29.87 1-ac 心跳期 Heart pulsation 13 h 46 min 3 min 1.40 1-ad 尾鳍鳍褶出现期 Caudal fin fold 13 h 49 min 28 min 13.07 1-ae 胸鳍原基出现期 Pectoral fin 14 h 17 min 1 h 23 min 38.73 1-af 出膜 Embryo hatching 15 h 40 min — — 1-ag 2.1.1 胚盘形成期
受精12 min后，原生质向动物极聚集，形成“胚盘”，微丝和微管构成的放射纹结构清晰可见 (图1-c)。
2.1.2 卵裂期
麦瑞加拉鲮受精卵仅胚盘部分进行卵裂，属于盘状卵裂。受精17 min后，首次卵裂开始，胚盘中央凹陷形成两个等大的细胞，进入2细胞期 (图1-d)；再经8 min，出现与第一次卵裂垂直的分裂沟，进入4细胞期 (图1-e)；7 min后，出现2条与初次卵裂平行的分裂沟，进入8细胞期 (图1-f)；15 min后完成第4次卵裂，进入16细胞期 (图1-g)；12 min后，受精卵经历第5次卵裂，细胞数目增至32个，细胞体积和形态出现差异，排列不再规则 (图1-h)；再经9 min，受精卵进行第6次卵裂，分裂为64个细胞 (图1-i)；受精1 h 16 min后，受精卵进入多细胞期，细胞体积进一步缩小，细胞界限模糊，细胞团的高度约为卵黄的1/4 (图1-j)；受精1 h 27 min后，细胞紧密排列成球状团块，呈桑椹胚结构 (图1-k)，桑椹胚期持续时间约36 min。
2.1.3 囊胚期
受精2 h 3 min后，透明的椭圆形细胞团逐渐隆起，胚层与卵黄界限分明，标志着囊胚早期的开始 (图1-l)；19 min后，进入囊胚中期，胚层高度逐渐向植物极扩展，边缘变得更加平滑 (图1-m)；28 min后，囊胚层继续向下扩展至卵黄的约1/3处，逐渐变薄并紧贴卵黄，到达囊胚晚期 (图1-n)。
2.1.4 原肠期
受精3 h 34 min后，胚层继续向下扩展并包裹卵黄，出现明显的胚环结构，进入原肠早期 (图1-o)；经过1 h 4min，胚层扩展至卵黄的约1/2处，胚环增厚形成胚盾，进入原肠中期 (图1-p)；再经过58 min，胚层继续向下扩展，延伸至卵黄的约4/5处，进入原肠晚期 (图1-q)。
2.1.5 神经胚期
受精6 h 27 min后，受精卵进入神经胚期，卵黄仅剩约1/6未被包裹。胚胎背部细胞增厚形成神经板，神经板逐渐向内凹陷形成神经沟，为神经管的形成奠定基础 (图1-r)。28 min后，卵黄被完全包裹，胚孔封闭，胚体环绕卵黄约1/2周，标志进入胚孔封闭期 (图1-s)。
2.1.6 器官形成期
受精7 h 20 min后，胚体中部出现2~3对肌节 (图1-t)；35 min后，胚体头部两侧向外突出形成眼囊原基，眼囊原基逐渐膨胀，形成2个明显的眼囊结构，肌节增加至9~12对 (图1-u)；再经过44 min后，胚体与卵黄之间的围心腔开始形成心脏原基，肌节增加至12~14对 (图1-v)；受精9 h 24 min后，胚体脑部最前方两侧出现明显的隆起结构，形成嗅囊，肌节增加至14~16对 (图1-w)；42 min后，胚体头部两侧的外胚层突出并膨胀，初步形成耳囊，肌节增加至15~16对 (图1-x)；再经过1 h 34 min，胚体尾部区域形成明显的尾泡结构，靠近尾部区域的卵黄出现凹陷，胚体长度明显伸长，肌节增加至16~17对 (图1-y)；受精11 h 59 min后，眼囊出现透明晶体结构，尾部区域的卵黄进一步凹陷，肌节增加至17~18对 (图1-z)；随后经过1 h 24 min，胚体开始扭动，频率8~12 次·min−1，肌节增加至18~20对 (图1-aa)；9 min后，尾芽从胚胎的后端突出并伸展，形成尾部的初步结构和轮廓，肌节增加至20~23对，胚体扭动频率20~25次·min−1 (图1-ab)；在受精12 h 42 min后，耳囊内可观察到清晰的黑色小点，即耳石，肌节增加至23~26对，胚体扭动频率加快至40~53次·min−1 (图1-ac)；经过1 h 4 min后，胚体心脏开始跳动，肌节增加至27~30对，胚体扭动频率加快至76~87次·min−1，心跳频率51~55次·min−1 (图1-ad)；在受精13 h 49 min后，胚体尾部完全脱离卵黄囊，形成尾鳍鳍褶，肌节增加至30~33对，胚体扭动频率89~95次·min−1，心跳频率58~61次·min−1 (图1-ae)；随后又经过1 h 23 min，胚体胸部两侧出现鳍芽，形成胸鳍原基，此时肌节大于33对，胚体扭动频率120~133次·min−1，心跳频率66~69次·min−1 (图1-af)。
2.1.7 孵化期
受精15 h 40 min后，受精卵进入出膜期，由尾部或头部破膜而出。胚体肌节大于33对，扭动频率151~169次·min−1，心跳频率75~80次·min−1 (图1-ag)。
2.2 仔鱼发育
2.2.1 卵黄囊仔鱼
麦瑞加拉鲮初孵仔鱼全长 (4.51±0.19) mm，体表透明，呈淡黄色，鱼体纤细柔软 (图2-a)。卵黄囊分为2个部分，前端椭球形、末端棒形，除头部和尾部外，其余部分紧贴卵黄囊。眼囊较大，无黑色素；各鳍尚处于初步发育阶段，形态简单且结构不完全；肛门原基已形成，尾椎微微上翘。出膜16 h后，仔鱼体型变得更为纤长，各鳍原基进一步发育，鳍褶明显，卵黄囊吸收进一步加快，前后界限模糊，整体呈流线型，头部两侧出现柔软且不规则的对称弯曲结构，即为鳃弓原基 (图2-b)；经过2 h，脑部形成简单的血管网络，脑部血液循环系统开始逐步发育 (图2-c)；再经过2 h，仔鱼躯干内观察到红色血液，开始血液循环 (图2-d)；出膜22 h后，出现口裂 (图2-e)；出膜24 h后，仔鱼晶体中黑色素开始聚集 (图2-f)；再经4 h，仔鱼躯干上出现黑色素斑点，鱼体透明度降低 (图2-g)；出膜41 h后，眼囊充满黑色素，卵黄囊进一步吸收并变得更为细小，仔鱼开始进食饵料，由内源性营养期转为混合营养期 (图2-h)；再经过3 h，仔鱼背部微微拱起，第1鳔室出现 (图2-i)；3日龄仔鱼，胸鳍基本成形，尾鳍开始分化，尾鳍条出现雏形，但背鳍褶和腹鳍褶仍然存在 (图2-j)。
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图 2 麦瑞加拉鲮仔鱼发育注：a. 初孵仔鱼；b. 孵后16 h仔鱼；c. 孵后18 h仔鱼；d. 孵后20 h仔鱼；e. 孵后22 h仔鱼；f. 孵后24 h仔鱼；g. 孵后28 h仔鱼；h. 孵后41 h仔鱼；i. 孵后44 h仔鱼；j. 3日龄仔鱼；k. 4日龄仔鱼；l. 8日龄仔鱼；m. 9日龄仔鱼。标尺=1 mm。Figure 2. Development of C. mrigala larvaeNote: a. Newly hatched larva; b. Larva of 16 h after hatching; c. Larva of 18 h after hatching; d. Larva of 20 h after hatching; e. Larva of 22 h after hatching; f. Larva of 24 h after hatching; g. Larva of 28 h after hatching; h. Larva of 41 h after hatching; i. Larva of 44 h after hatching; j. Larva of 3 days after hatching; k. Larva of 4 days after hatching; l. Larva of 8 days after hatching; m. Larva of 9 days after hatching. Bar: 1 mm.2.2.2 晚期仔鱼
4日龄仔鱼，卵黄囊已完全吸收，消化道充满食物，标志着仔鱼由混合营养期转入外源性营养期 (图2-k)。
8日龄仔鱼，体表黑色斑点明显增多，背鳍鳍褶已分化为背鳍，出现鳍条；尾鳍已分叉且鳍条分明，臀鳍初步形成 (图2-l)。
9月龄仔鱼，臀鳍的鳍条进一步分化，胸鳍、背鳍和尾鳍的发育基本完成，腹鳍褶开始向腹鳍分化，尾柄基部出现黑色素沉积。体表开始形成鳞片，进入稚鱼期 (图2-m)。
2.3 仔鱼生长
麦瑞加拉鲮初孵仔鱼全长为 (4.51±0.19) mm，卵黄囊完全吸收时仔鱼全长为 (7.54±0.31) mm，进入稚鱼期时全长为 (12.77 ± 0.40) mm。如表2所示，仔鱼的肛后长/全长比、尾柄长/全长比随日龄呈递增趋势；1日龄仔鱼的生长速度最快，AGR为1.75 mm·d−1，SGR为32.87%·d−1。仔鱼在各阶段的生长速率呈先增后降再加快的趋势，仔鱼期的AGR和SGR分别为0.92 mm·d−1和11.56%·d−1 (表3和图3)。
表 2 麦瑞加拉鲮仔鱼各发育阶段的生长情况Table 2. Growth of C. mrigala larvae at different developmental stages日龄
Day of age/d全长
Total length/mm肛后长/全长
Postanal length/Total length尾柄长/全长
Caudal peduncle length/Total length全长绝对生长率
AGR/(mm·d−1)全长特定生长率
SGR/(%·d−1)0 4.51±0.19 0.18 0.026 / / 1 6.26±0.15 0.26 0.056 1.75 32.87 2 6.62±0.30 0.30 0.060 1.06 19.21 3 7.27±0.35 0.31 0.071 0.92 15.96 4 7.54±0.31 0.31 0.081 0.76 12.86 5 8.66±0.47 0.32 0.092 0.83 13.07 6 9.61±0.38 0.32 0.105 0.85 12.62 7 10.69±0.37 0.32 0.113 0.88 12.34 8 11.79±0.39 0.32 0.134 0.91 12.02 9 12.77±0.40 0.33 0.151 0.92 11.57 表 3 麦瑞加拉鲮仔鱼各发育阶段的生长率Table 3. Growth rates of C. mrigala larvae at different developmental stages发育阶段
Developmental
stage经历时间
Experience
time/d全长绝对
生长率
AGR/
(mm·d−1)全长特定
生长率
SGR/
(%·d−1)内源性营养期
Endogenous nutrition period1.7 1.16 21.37% 混合营养期
Mixed-nutrition period2.3 0.45 6.48% 外源性营养期
Exogenous nutrition period5 1.05 10.54% 仔鱼期
Larval stage9 0.92 11.56% ![]()
图 3 麦瑞加拉鲮仔鱼全长与出膜后时间的关系Figure 3. Relationship between total length and days after hatching of C. mrigala larvae3. 讨论
3.1 麦瑞加拉鲮胚胎发育特点
麦瑞加拉鲮产漂流性卵，卵径为 (1.41±0.08) mm，吸水膨胀后达 (4.98±0.67) mm，膨胀系数为353.19%。漂流性卵的孵化率受水体流速影响。唐明英等[16]研究表明漂流性卵不发生沉降的流速与其密度呈正相关。在吸水膨胀过程中，鱼卵密度逐渐降低，相应降低了漂流性鱼卵对孵化流速的要求，从而避免因沉降导致与河床发生机械碰撞的受精卵破损[17-18]。在水温26~28 ℃下，麦瑞加拉鲮胚胎发育历经胚盘形成期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官形成期和孵化期7个阶段32个时期，符合硬骨鱼类胚胎发育的基本模式[13]。同时，其胚胎发育过程表现出种的特点，麦瑞加拉鲮眼囊、耳囊和晶体的分化顺序与同亚科的脂孟加拉鲮 (Banganalippa)[14]和露斯塔野鲮 (Labeo rohita)[15]一致，但麦瑞加拉鲮尾芽分化出现在在晶体形成之后，而脂孟加拉鲮和露斯塔野鲮则相反。与南方水系的其他鲤科鱼类相比，麦瑞加拉鲮与黄尾鲴 (Xenocypris davidiBleeker)[19]、长春鳊 (Parabramis pekinensis)[20]、宽鳍鱲 (Zacco platypus)[21]、乌原鲤 (Procypris merus)[22]在眼囊、晶体和耳石等器官上的分化顺序基本一致，但宽鳍鱲和乌原鲤的耳石形成发生在肌肉效应期之后。在鳍条分化方面，麦瑞加拉鲮在出膜前形成了胸鳍原基，胸鳍的发育有助于提高出膜后仔鱼的平衡控制能力，并为后续仔鱼开口摄食饵料奠定运动基础[23]。
温度能通过影响受精卵渗透压以及孵化酶的裂解作用从而干扰孵化速度。总体而言，鱼类受精卵的孵化时间与水温呈负相关[24-25]。在水温26~28 ℃下，麦瑞加拉鲮受精卵孵化时间为15 h 40 min，在水温29~29.5 ℃下，则为13 h 45 min[12]，这与上述研究结论相符。麦瑞加拉鲮与同产漂流性卵的鱼类胚胎发育水温、时间和积温等指标对比如表4所示。麦瑞加拉鲮孵化积温为438.67 ℃·h，低于露斯塔野鲮 (386.80 ℃·h)[15]，高于赤眼鳟 (Squaliobarbus curriculus) (452.67 ℃·h)[26]、鳡 (Elopichthys bambusa) (631.31 ℃·h)[27]、青鱼 (Mylopharyngodon piceus) (658 ℃·h)[28]、黄尾鲴 (763.35 ℃·h)[19]、草鱼 (Ctenopharyngodon idella) (770.5 ℃·h)[29]、长薄鳅 (Leptobotia elongata) (773.50 ℃·h)[30]、鲢 (Hypophthalmichthys molitrix) (806 ℃·h)[31]、鳙 (Aristichthys nobilis) (822.9 ℃·h)[32]和长春鳊 (914.33 ℃·h)[20]。
表 4 漂流性鱼卵胚胎发育时间比较Table 4. Comparison of embryonic development time of drifting fish eggs种类
Species水温
Water temperature/℃发育时间
Embryonic development time/h积温
Accumulative temperature/℃·h参考文献
Reference露斯塔野鲮 Labeo rohita 27.8~29.5 13.50 386.80 [15] 麦瑞加拉鲮 Cirrhinus mrigala 26.0~28.0 15.67 438.67 本研究 赤眼鳟 Squaliobarbus curriculus 28.0~28.5 16.17 452.67 [26] 鳡 Elopichthys bambusa 22~25 27.75 631.31 [27] 青鱼 Mylopharyngodon piceus 22~25 28.00 658.00 [28] 黄尾鲴 Xenocypris davidiBleeker 24.5~25.5 26.58 763.35 [19] 草鱼 Ctenopharyngodon idella 22~24 33.50 770.50 [29] 长薄鳅 Leptobotia elongata 22.0~23.5 34.00 773.50 [30] 鲢 Hypophthalmichthys molitrix 25.5~26.5 31.00 806.00 [31] 鳙 Aristichthys nobilis 18.0~24.2 39.00 822.90 [32] 长春鳊 Parabramis pekinensis 25.5~26.5 35.17 914.33 [20] 3.2 麦瑞加拉鲮仔鱼发育特点
仔鱼期是指从受精卵孵化出膜到形成鳞片的阶段[33]。在水温26~28 ℃下，麦瑞加拉鲮卵黄囊仔鱼期历时3 d，温度升高至29.0~29.5 ℃后，卵黄囊仔鱼期缩短至2 d[12]。与同亚科的其他鱼类相比，麦瑞加拉鲮卵黄囊仔鱼期持续时间短于脂孟加拉鲮 [14]，整个仔鱼期持续时间短于鲮 (Cirrhina molitorella)[34]。麦瑞加拉鲮和鲮具有高度重叠的营养生态位[35]，较短的发育期有利于其在自然竞争中处于优势地位。
麦瑞加拉鲮初孵仔鱼已具备胸鳍原基和尾鳍鳍褶，能够随水流飘动，长薄鳅 [30]、银鮈 (Squalidus argentatus)[36]、圆口铜鱼 (Coreius guichenoti)[37]和长鳍吻鮈 (Rhinogobio ventralis)[38]等产漂流性卵的鱼类在出膜后也具备相同特征。这些器官较早的分化和完善使得仔鱼在较短时间内能够获得运动、摄食和躲避天敌的能力，以更好地适应复杂多变的野外环境。此外，麦瑞加拉鲮仔鱼各鳍条的分化顺序为胸鳍、尾鳍、背鳍、臀鳍和腹鳍，与同产漂流性卵的鳡[27]一致。鳍条分化的先后顺序与其功能有关，胸鳍最先分化有助于仔鱼在流水中保持身体平衡，随后尾鳍分化使得仔鱼初具运动能力，有利于后续摄食饵料；背鳍和臀鳍在发育时间和功能上基本相似，腹鳍主要起到协助身体平衡作用，但对仔鱼运动能力的影响小于其他鳍条，因而最晚分化[23]。
3.3 麦瑞加拉鲮仔鱼生长速率
鱼类根据营养物质摄取方式可分为内源性、混合性和外源性3个时期[39]。初孵仔鱼卵黄囊较大，能够在早期为仔鱼的新陈代谢和生长发育提供充足的营养，此时为内源性营养期，麦瑞加拉鲮在此时期的AGR和SGR分别为1.16 mm·d−1和21.37%·d−1。大部分鱼类卵黄囊在出膜后第1天吸收速率最快，此时卵黄囊吸收主要用于加速身体生长[40]。麦瑞加拉鲮仔鱼在1日龄达到最大生长速度，AGR和SGR分别为1.75 mm·d−1和32.87%·d−1。在出膜41 h后，麦瑞加拉鲮进入混合性营养期，仔鱼生长速度减缓，AGR和SGR分别为0.45 mm·d−1和6.48%·d−1。此时卵黄囊吸收主要用于运动和消化器官的发育，为仔鱼由内源性营养期转入外源性营养期奠定基础[41]。进入外源性营养期后，麦瑞加拉鲮仔鱼开始摄食饵料，全长增长速度再次加快，AGR和SGR分别为1.05 mm·d−1和10.54%·d−1。这种内源性营养期和外源性营养期生长速度快，混合营养期生长速度慢的发育特点与长鳍光唇鱼 (Acrossocheilus longipinnis)[42]、四川华鳊 (Sinibrama taeniatus)[43]和瓦氏雅罗鱼 (Leuciscus waleckii)[44]等多数鲤科鱼类相同。
4. 结论
本研究详细记录了麦瑞加拉鲮胚胎及仔鱼发育过程中各阶段的典型特征。麦瑞加拉鲮胚胎麦瑞加拉鲮产漂流性卵，受精卵呈圆球形、淡灰色，在水温26~28 ℃下，历时15 h 40 min孵化出膜，积温438.67 ℃·h。其胚胎各器官发育顺序与同亚科的鱼类基本一致，积温小于多数产漂流性卵鱼类。出膜后9日龄进入稚鱼期，各鳍条的分化顺序为胸鳍、尾鳍、背鳍、臀鳍和腹鳍，与自然孵化环境相适应；仔鱼生长速率符合内源性营养期和外源性营养期生长速度快，混合营养期生长速度慢的发育特点，与多数鲤科鱼类相同。
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图 1 肌原纤维蛋白和寡糖-蛋白复合物口腔消化产物傅里叶红外光谱 (a) 和二级结构含量 (b)
注：下标1是α-螺旋显著性，下标2是β-折叠显著性，下标3是β-转角显著性，下标4是无规卷曲显著性。
Figure 1. Fourier infrared spectroscopy (a) and secondary structure content (b) of MP and EAO-MP oral digestive products
Note: Endnote subscript 1 is α-helix significance; endnote subscript 2 is β-helix significance; endnote subscript 3 is β-turn significance; endnote subscript 4 is random coil significance.
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图 2 肌原纤维蛋白和寡糖-蛋白复合物口腔消化产物内源荧光光谱 (a) 和最大荧光强度 (b)
注：不同大写字母表示在同一模拟口腔消化时间中，不同消化产物之间存在显著性差异 (P<0.05)；不同小写字母表示在同组消化产物中，不同模拟口腔消化时间之间存在显著性差异 (P<0.05)；表2、图4—图6同此。
Figure 2. Endogenous fluorescence spectra (a) and maximum fluorescence intensity (b) of MP and EAO-MP oral digestive products
Note:Values with different capital letters indicate significant differences among different digestive products at the same simulated oral digestion time (P<0.05); values with different lowercase letters indicate significant differences in the same group of digestion products at different simulated oral digestion time (P<0.05). The same case in Table 2 and Fig. 4−Fig. 6.
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图 3 肌原纤维蛋白和寡糖-蛋白复合物口腔消化产物紫外吸收光谱 (a) 和紫外二阶导数光谱 (b)
Figure 3. UV absorption spectra (a) and second order derivative spectra (b) of MP and EAO-MP oral digestive products
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图 4 肌原纤维蛋白和寡糖-蛋白复合物口腔消化产物总巯基和活性巯基质量摩尔浓度
Figure 4. Molality of total sulfhydryl and active sulfhydryl of MP and EAO-MP oral digestive products
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图 5 肌原纤维蛋白和寡糖-蛋白复合物口腔消化产物氢键质量浓度
Figure 5. Hydrogen bond mass comcentration of MP and EAO-MP oral digestive products
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图 6 肌原纤维蛋白和寡糖-蛋白复合物口腔消化产物蛋白表面疏水性
Figure 6. Surface hydrophobicity of MP and EAO-MP oral digestive products
表 1 口腔消化组别
Table 1 Oral digestion group
组别 Group 名称 Name 未消化鲢肌原纤维蛋白Undigested silver carp myofibrillar protein M0 鲢肌原纤维蛋白模拟口腔消化5 sSilver carp myofibrillar protein after simulated oral digestion for 5 s M5 鲢肌原纤维蛋白模拟口腔消化15 sSilver carp myofibrillar protein after simulated oral digestion for 15 s M15 未消化鲢肌原纤维蛋白-寡糖复合物Undigested silver carp myofibrillar protein-alginate oligosaccharide complex A0 鲢肌原纤维蛋白-寡糖复合物模拟口腔消化5 sSilver carp myofibrillar protein-alginate oligosaccharide complex after simulated oral digestion for 5 s A5 鲢肌原纤维蛋白-寡糖复合物模拟口腔消化15 sSilver carp myofibrillar protein-alginate oligosaccharide complex after simulated oral digestion for 15 s A15 
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表 2 紫外二阶导数生成 r值
Table 2 UV second order derivative generated r value
模拟口腔消化时间Simulated oral digestion time/s 鲢肌原纤维
蛋白组 (M组) MP group寡糖-蛋白
复合物组 (A组)EAO-MP group0 1.11±0.18Aa 1.62±0.88Aa 5 0.98±0.27Aa 1.12±0.16Aa 15 0.97±0.16Aa 1.55±0.31Aa
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