凡纳滨对虾淡化养殖池塘浮游细菌群落时空变化及其对理化因子的响应

祁峰, 热比古丽·沙吾提, 咸玉兰, 韩军军, 米乃瓦尔·木衣提, 陈韩飞, 孙世萍, 马燕武, 陈朋

祁峰, 热比古丽·沙吾提, 咸玉兰, 韩军军, 米乃瓦尔·木衣提, 陈韩飞, 孙世萍, 马燕武, 陈朋. 凡纳滨对虾淡化养殖池塘浮游细菌群落时空变化及其对理化因子的响应[J]. 南方水产科学, 2023, 19(2): 50-61. DOI: 10.12131/20220192
引用本文: 祁峰, 热比古丽·沙吾提, 咸玉兰, 韩军军, 米乃瓦尔·木衣提, 陈韩飞, 孙世萍, 马燕武, 陈朋. 凡纳滨对虾淡化养殖池塘浮游细菌群落时空变化及其对理化因子的响应[J]. 南方水产科学, 2023, 19(2): 50-61. DOI: 10.12131/20220192
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QI Feng, SHAWUTI Rebiguli, XIAN Yulan, HAN Junjun, MUYITI Minawaer, CHEN Hanfei, SUN Shiping, MA Yanwu, CHEN Peng. Spatio-temporal changes of bacterioplankton communities in Litopenaeus vannamei desalinated ponds and their responses to physicochemical factors[J]. South China Fisheries Science, 2023, 19(2): 50-61. DOI: 10.12131/20220192
Citation: QI Feng, SHAWUTI Rebiguli, XIAN Yulan, HAN Junjun, MUYITI Minawaer, CHEN Hanfei, SUN Shiping, MA Yanwu, CHEN Peng. Spatio-temporal changes of bacterioplankton communities in Litopenaeus vannamei desalinated ponds and their responses to physicochemical factors[J]. South China Fisheries Science, 2023, 19(2): 50-61. DOI: 10.12131/20220192
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凡纳滨对虾淡化养殖池塘浮游细菌群落时空变化及其对理化因子的响应

  • 1.

    新疆维吾尔自治区水产科学研究所，新疆 乌鲁木齐 830099

  • 2.

    农业农村部西北地区渔业资源环境科学观测实验站，新疆 乌鲁木齐 830099

基金项目: 新疆维吾尔自治区自然科学计划 (自然科学基金) 面上项目 (2020D01A102)
详细信息
    作者简介:

    祁　峰 (1981—)，男，高级工程师，硕士，研究方向为水域生态学。E-mail: 6481135@qq.com

    通讯作者:

    陈　朋 (1983—)，男，高级工程师，硕士，研究方向为渔业生态学。E-mail: 290189260@qq.com

  • 中图分类号: S 917.1

Spatio-temporal changes of bacterioplankton communities in Litopenaeus vannamei desalinated ponds and their responses to physicochemical factors

  • 1.

    Institute of Fishery Research of Xinjiang Uygur Autonenous Region, Urumqi 830099, China

  • 2.

    Scientific Observing and Experimental Station of Fishery Resources and Environment in Northwest China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Urumqi 830099, China

摘要

    摘要
  • 摘要: 浮游细菌调控是对虾养殖水体环境控制策略的核心内容，探究浮游细菌群落构建的一般规律，可进一步推动对虾养殖水体水质调控技术的研究。运用16S rRNA高通量测序技术，对凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 淡化养殖池塘进行了12次周际调查。结果显示，48个样品共获得2 854个操作分类单元 (Operational taxonomic units, OTU，97%相似性)，序列比对发现古细菌2门1纲1科1属，细菌30门59纲98目199科433属，其中优势菌群25属。优势菌群在组成上有较高的相似性，但各池优势菌群在分布和相对丰度变动上有较大差异。各池系统发育多样性指数总平均值为77.57，变幅为24.39~111.65；香农多样性指数总平均值为3.96，变幅为2.64~5.06；物种丰富度指数总平均值为716，变幅为229~1 054。非度量多维标度分析 (Non-metric multidimensional scaling, NMDS) 表明各池塘浮游细菌群落在养殖初期差异较大，中、后期差异减小，冗余分析 (Redundancy analysis, RDA) 显示活性磷、碱度、溶解氧和硫化物可显著影响浮游细菌的群落结构。
    Abstract: The regulation of bacterioplankton is the core content of the environmental control strategy in shrimp aquaculture. Exploring the general rules of the construction of bacterioplankton community can further promote the research on water quality regulation for shrimp ponds. Using 16s rRNA high-throughput sequencing technology, we conducted 12 weekly surveys in Litopenaeus vannamei desalinated ponds.The results indicate that a total of 2 854 OTUs (97% similarity) were obtained from 48 samples (Archaea belonged to 2 phyla, 1 class, 1 family and 1 genus; and bacteria belonged to 30 phyla, 59 classes, 98 orders, 199 families and 433 genera, among which 25 genera were dominant flora). The dominant flora had high similarity in the composition, but with great differences in the distribution and relative abundance in each pond. The total average phylogenetic diversity index was 77.57, ranging from 24.39 to 111.65; the total average Shannon diversity index was 3.96, ranging from 2.64 to 5.06; the total average species richness index was 716, ranging from 229 to 1 054. NMDS analysis shows that the community structure of bacterioplankton in each pond varied greatly at the early stage of aquaculture, but not so greatly at the middle and late stages. The results of redundancy analysis shows that the labile phosphorus, total alkalinity, dissolved oxygen and sulfide were the main environmental factors affecting the distribution characteristics of community structure of bacterioplankton.
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  • 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 因具有耐高温、耐低盐、生长快、抗病力强等优点，近年在我国内陆地区的养殖规模迅速扩大。根据养殖现状，很多从业者为了维持高生产力，投喂大量饵料，已远超对虾的需要量，并且长期使用抗生素预防和治疗病害[1]。过量投饵和滥用药物等不当措施会引起水质逐渐恶化并滋生大量病原体，在养殖中后期尤为严重[2]，会引发病害并造成经济损失。水产养殖池塘水环境主要受人为调控，如何通过环境控制策略改善水质环境、降低病害发生，是目前生产上亟待解决的问题。

    浮游细菌作为有机物的分解者和高营养级的食物源，可促进碳 (C)、氮 (N)、磷 (P)和硫 (S) 的生物化学循环[3]以及其他一些生态过程[4]，是淡水生态系统物质循环和能量流动的主要驱动因子[5-6]。作为水环境不可或缺的重要组成部分，浮游细菌会直接影响对虾的健康状况[7]。因此，生产中浮游细菌的调控是人工养殖水体环境控制策略的核心。浮游细菌群落多样性是重要研究方向之一，生物多样性的变动会对水生态系统各项生化反应产生重要影响，并且群落多样性会对水环境状态、污染等情况迅速响应[8]，可用于水环境变化的监控。

    已有研究表明，不同水体浮游细菌群落结构及多样性特征存在明显差异[9-11]，并受到水体不同理化因子的影响[12-13]，其中有关对虾养殖池塘的报道主要集中在我国沿海地区，且多为海水养殖池塘[14-17]。因此，对我国内陆干旱、半干旱地区开展对虾养殖池塘浮游细菌群落和多样性研究，具有显著的地域特色和生态学意义。本文通过对新疆凡纳滨对虾淡化池塘水体采样调查，阐述了浮游细菌群落结构特征和多样性变化，并分析其对不同水体理化因子的响应程度及差异，以期为进一步开展凡纳滨对虾养殖池塘水质调控技术研究提供科学依据，推动西北内陆地区对虾产业的健康可持续发展。

    1.   材料与方法

    1.1   池塘条件及样品采集

    试验区位于新疆维吾尔自治区昌吉市森淼渔业专业合作社，随机选择3口池塘 (编号分别为A、B和C) 进行监测，池塘面积均约为6 667 m2，凡纳滨对虾苗种首先在池塘内设的温棚中进行淡化养殖，温棚养殖密度约为 2 000~3 000  尾·m−3，入塘初始盐度为18.2‰，淡化期每天降低2‰~3‰左右，至盐度0.8‰左右。淡化后拆除池塘内的温棚逐渐升高水位，至平均水深约1.6 m，池塘养殖阶段3口池塘的放养密度均约为45 尾·m−3。

    池塘A从温棚淡化养殖投放苗种当天开始取样，池塘B和C从虾苗淡化后的池塘养殖当天开始第一次采样，养殖期间每周采样1 次，固定采样时间为上午12:00左右。池塘A水深大于1.5 m时进行分层采样，每层水样形成一个样方，表层样品在水下20 cm处采集，底层样品距池底约20 cm，中层为水深的1/2处取样。池塘B和C每次仅采集表层菌样。采水器置于所需水层，弃去前端水样后将样品收集到500 mL无菌采样瓶中，4 ℃车载冰箱保存带回实验室进行样品的处理。池塘A各样品编号记作S1—S25，池塘B各样品编号记作S26、S28、S30、S32、S34、S36、S38、S40、S42、S44、S46、S48，池塘C各样品编号记作S27、S29、S33、S35、S37、S39、S41、S43、S45、S47、S49。

    现场采集浮游细菌样品的同时，同位测定水体理化参数。理化因子包括水温、pH、溶解氧 (DO)、铵态氮 (NH4-N)、亚硝酸态氮 (NO2-N)、硝酸态氮 (NO3-N)、活性磷 (PO4-P)、可溶性硅酸盐 (SiO3-Si)、高锰酸盐指数 (CODMn)、叶绿素a (Chl-a)、硫化物 (Sul)、矿化度、碱度 (ALK) 和水总硬度等14项指标。

    采用哈希HQ30d便携式溶解氧测试仪现场测定水温和溶解氧，哈希HQ11d型pH检测仪测定pH值，其他水化学参数取5 L水样低温保存带回实验室检测。测定方法按照《水和废水检测分析方法 (第四版)》[18]进行测定。理化因子实验结果以“平均值±标准差 ($ \overline X \pm {\rm{SD}} $)”表示。

    1.2   DNA提取与测序

    每个样品采用孔径为0.22 μm的无菌滤膜 (WondaDisc，MCE水系，50 mm，中国) 进行过滤，滤液约200 mL，为避免微藻等其他微生物的影响，每个样品使用2~3个滤膜进行浮游细菌收集，以保证滤膜的通透性。然后样品迅速送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司，以OMEGA试剂盒E.Z.N.A™ Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒提取浮游细菌DNA。第一轮采用引物314F (CCTACGGGNGGCWGCAG) 和805R (GACTACHVGGGTATCTAATCC) 对浮游细菌V3—V4区进行扩增，反应体系为30 μL，包含2×Hieff® Robust PCR Master Mix 15 μL、正反向引物各1 μL、模板DNA 15 ng，补充ddH2O至30 μL，PCR反应条件为 95 ℃ 3 min；5×(94 ℃, 30 s; 45 ℃, 20 s; 65 ℃, 30 s)；20×(94 ℃, 20 s; 55 ℃, 20 s; 72 ℃, 30 s)；72 ℃10 min；10 ℃直到停止。第二轮扩增引入Illumina桥式PCR兼容引物，反应体系和条件与第一轮相同。后使用MiSeq测序仪 (Illumina Inc. San Diego，美国) 进行高通量测序。

    1.3   数据分析

    使用cutadapt软件去除Read1 3'端测序引物接头和Read2 3'端测序引物接头；根据PE reads之间的重叠关系使用PEAR将成对reads拼接成一条序列；根据各样本barcode序列和引物序列从拼接后数据中分割出各样本数据，并校正序列方向；使用PRINSEQ软件切除reads尾部质量值20以下的碱基，设置10 bp的窗口，过滤质控后的含N序列和短序列，最终过滤掉低复杂度的序列，得到各样本有效数据。基于有效数据，利用Usearch软件[19]，对各样本优化序列提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量，所有样本去冗余序列合并后去除没有重复的单序列，将具有不小于97%相似性的序列进行聚类，形成不同的操作分类单元(Operational taxonomic units, OTU）。使用RDP classifier比对RDP数据库，获得每个OTU代表序列的分类学信息。基于OTU，利用R语言vegan包和picante包计算优势度、系统发育多样性指数和群落多样性指数等。利用pheatmap包绘制优势菌群组成热图，用ggrepel包、ggplot2包和vegan包等进行非度量多维标度 (Non-metric multidimensional scaling, NMDS) 和冗余分析 (Redundancy analysis, RDA)，用anosim函数进行群落差异显著性比较，利用aov函数进行组间数据方差分析。通过Galaxy在线分析平台 (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/) 对属水平的相对丰度矩阵进行线性判别分析 (Linear discriminant analysis, LDA)，并识别不同组间统计学上潜在的标志性功能菌群 (biomarkers)。非参数因子克鲁斯卡尔-沃利斯和秩验检 [Kruskal-Wallis (KW) sum-rank test] α为0.05，LDA得分阈值为4.0。因池塘A温棚养殖阶段与池塘养殖阶段水环境和养殖密度等差异较大，在进行群落多样性和RDA分析比较中，去除了池塘A温棚养殖阶段的S1、S2和S3样方。

    优势度 (Y) 用来评价浮游细菌的优势类群[20]，计算公式为:

    $$ {\text{Y}} = \frac{{{n_i}}}{N} \cdot {f_i} $$ (1)

    式中：ni为第i属调查期间的相对丰度；N为浮游细菌总相对丰度；fi为该属出现的频率。

    系统发育多样性的计算选用广泛使用的Faith系统发育多样性指数 (PD)[21]，按下式计算：

    $$ {\rm{PD}} = \sum\limits_{\{ {\text{c}} \in {\text{C}}\} } {{{\text{L}}_{\text{C}}}} $$ (2)

    式中：C为连接系统发育树上所有物种的最短路径上的所有分支之和；c为连接节点的一段分支；LC为C的分支长度。

    物种多样性指数的计算采用 Shannon指数 (H')[22] ，计算公式为:

    $$ {\text{H}{{{\text{'}}}}} = - \sum\limits_{i = 1}^S {{P_i}{{\log }_2}{P_i}} $$ (3)

    式中：S为群落中的总物种数；Pi为第i种的个体数与样品中总个数的比值。

    2.   结果

    2.1   主要理化因子状况

    各池塘14项理化因子状况见表1。各池塘DO质量浓度基本保持在较高水平，变幅介于6.15~10.48 mg·L−1。各池塘NH4-N、NO3-N、NO2-N和PO4-P浓度养殖前、中期变动不大，后期显著升高，其中池塘A中NO2-N质量浓度显著高于池塘C (P<0.05)，池塘B中PO4-P质量浓度显著高于池塘A (P<0.01)。各池塘SiO3-Si质量浓度均值分别为11.2、12.38和4.03 mg·L−1，池塘C中SiO3-Si质量浓度显著低于池塘A和B (P<0.01)，各池塘SiO3-Si质量浓度在养殖前、中期较高 (最高达17.2 mg·L−1)，后期显著降低 (最低值为0.88 mg·L−1)。各池塘ALK质量浓度均值分别为138.18、115.32和84.46 mg·L−1，各池塘ALK质量浓度差异极显著 (P<0.01)。其余各变量在各池塘间差异均不显著 (P>0.05)。

    表  1  凡纳滨对虾养殖池塘水体主要理化因子
    Table  1.  Environmental factors in L. vannamei ponds
    环境因子
    Environmental factor    		池塘A
    Pond A    		池塘B
    Pond B    		池塘C
    Pond C
    水温 Temperature/℃ 26.19±2.01 26.15±1.57 26.37±2.00
    pH 8.10±0.50 8.29±0.37 8.30±0.38
    溶解氧质量浓度 DO/(mg·L−1) 8.00±0.68 8.45±1.17 8.11±1.15
    铵态氮质量浓度 NH4-N/(mg·L−1) 0.45±0.73 0.44±0.39 0.33±0.27
    亚硝酸氮质量浓度 NO2-N/(mg·L−1) 0.01±0.01 0.01±0.01 0.01±0.01
    硝酸态氮质量浓度 NO3-N/(mg·L−1) 0.34±0.44 0.41±0.42 0.48±0.53
    活性磷质量浓度 PO4-P/(mg·L−1) 0.12±0.14 0.37±0.24 0.22±0.28
    活性硅酸盐质量浓度 SiO3-Si/(mg·L−1) 11.2±3.55 12.38±7.38 4.03±2.98
    高锰酸盐指数 CODMn/(mg·L−1) 8.34±7.19 6.12±3.18 5.34±2.91
    叶绿素 a 质量浓度 Chl-a/(mg·L−1) 75.78±131.01 56.13±42.81 58.36±61.48
    硫化物质量浓度 Sul/(mg·L−1) 0.03±0.04 0.02±0.01 0.02±0.01
    矿化度质量浓度 Mineralization degree/(mg·L−1) 1209.44±2445.58 813.39±171.69 814.35±41.91
    碱度 ALK/(mg·L−1) 138.18±12.06 115.32±33.82 84.46±14.73
    总硬度 Total hardness/(mg·L−1) 362.76±395.28 476.5±227.34 349.36±60.18
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    2.2   浮游细菌群落结构及变动

    2.2.1   各池塘浮游细菌门水平群落组成

    48个浮游细菌样品共测得3 403 929条优化序列，平均69 467条，变幅介于41 169~100 945 条，序列长度介于350~476 bp (表2)。数据分析共获得2 854个OTU (97%相似性)，序列比对发现古细菌2门1纲1科1属，细菌30门59纲98目199科433属。池塘A调查期间共鉴出浮游细菌29门，相对丰度占比前9位的门类共占99.5% (变幅为0.21%~38.8%)，按相对丰度占比依次为变形菌门、放线菌门、蓝细菌门、拟杆菌门、疣微菌门、浮霉菌门、厚壁菌门、Parcubacteria、芽单胞菌门 (图1-a)；池塘B调查期间共鉴出浮游细菌24门，前9位的门类相对丰度占比达99.5% (变幅介于0.3%~43.4%)，排在前9位的门类中除没有Parcubacteria，而出现Candidatus Saccharibacteria (占比0.3%)外，其余门类同池塘A (图1-b)；池塘C调查期间共鉴出浮游细菌25门，前9门相对丰度占比达99.5% (变幅介于0.2%~44.3%)，前9位出现的浮游细菌门类在池塘A和B中均有发现 (图1-c)。

    表  2  各样本有效序列数据统计
    Table  2.  Valid sequences of each sample
    样品
    Sample    		条形码
    Barcode    		有效序列
    Valid sequence/条    		碱基数
    Base number    		平均长度
    Mean length/bp    		最短序列长度
    Min. length/bp    		最长序列长度
    Max. length/bp
    S1GTAACA82 73634 604 966418.26363469
    S2CCAGAC81 90534 619 470422.68361476
    S3GGTGAA56 85923 683 959416.54367475
    S4TGCATC85 21235 667 198418.57353469
    S5TCGACC83 24634 547 936415.01365470
    S6GTCGCG73 82930 547 465413.76362453
    S7CGGATG83 66234 668 763414.39356465
    S8GTGAAA84 38434 811 366412.54350466
    S9ATCTTG100 94541 590 813412.01350452
    S10TATGCA73 80130 659 241415.43352459
    S11GTAACA86 47135 924 249415.45354471
    S12GCGAGG90 43237 722 526417.14351465
    S13CACGAT54 43922 735 194417.63373465
    S14GCGGTA44 22718 478 585417.81352471
    S15TATCGA61 43125 638 627417.36359473
    S16ATCACG52 38421 792 829416.02376471
    S17CGGATG99 21141 215 038415.43360473
    S18CGCATA100 00141 427 908414.27372476
    S19TGCATC65 71227 246 907414.64359476
    S20TCAGTA76 02931 690 841416.83362471
    S21CGGCAC75 20231 405 455417.61364469
    S22ATCACG71 60530 328 221423.55352470
    S23CGGATG63 35826 635 233420.39367470
    S24GTGAAA56 42923 698 925419.98350471
    S25TCAGTA92 40038 487 742416.53355435
    S26GAAGTG87 30537 043 958424.31368448
    S27TCGACC94 07539 472 386419.58360464
    S28CTTGTA52 27322 054 548421.91373472
    S29GTTTCG44 69718 684 447418.02360462
    S30ATCTTG59 73725 072 871419.72365465
    S32GCCATC78 46232 993 239420.5357474
    S33TGTGTT69 61329 167 734419.00351474
    S34CTTGTA56 08323 551 548419.94356471
    S35GTTTCG45 70118 993 334415.60359464
    S36TTCGTA46 33719 212 573414.63356468
    S37CCAGAC51 97821 598 326415.53372436
    S38AGCAGT77 23331 835 991412.21350470
    S39GAGGAA75 22631 060 291412.89370468
    S40AAGGTA46 92019 633 227418.44352450
    S41ATCACG43 98318 242 559414.76352469
    S42TAGGAC66 63927 702 230415.71356470
    S43TGGACG49 20620 369 621413.97357472
    S44AGAACA50 32220 765 128412.65356469
    S45GGTGTG41 16917 011 770413.22350471
    S46AACTAT67 69128 070 176414.68357468
    S47ACTGCG60 22025 559 117424.43359474
    S48TGTGTT94 26139 467 506418.7355474
    S49TAGGAC86 90436 530 365420.35353467
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    图  1  凡纳滨对虾养殖池塘门水平的浮游细菌组成
    Figure  1.  Composition of bacteriaoplankon at phylum level in L. vannamei ponds
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    2.2.2   各池塘优势菌群及相对丰度

    利用优势度指数筛选各池塘优势菌群，本文将Y值大于0.01的浮游细菌列为优势菌群。3口池塘共筛选出优势菌群23属，其中池塘A有优势菌群18属，池塘B 15属，池塘C 15属。各池塘优势菌群相对丰度变动情况如图2所示[为更加清晰地展示优势菌群的变动情况，相对丰度数据进行了log2(x+0.01)转换]。根据层级聚类分析，池塘A优势菌群变动情况可提取3类 (图2-a)：I类中Gplla和微酸菌属在淡化期 (S2—S4) 含量较低 (0.003~2.928)，池塘养殖初期相对丰度较高 (最大值为38.508)，之后逐渐降低；II类在淡化期和池塘养殖中、后期相对丰度较高；III类优势菌群相对丰度多在池塘养殖初期和后期 (S19—S25) 较高 (最高可达49.9%)。池塘B (图2-b) 中I类优势菌群在养殖期不同阶段均可达到较高的相对丰度 (最高值分别可达41.3%和39.5%)；II类在养殖中后期 (S36—S48) 可占据一定相对丰度  (3.8%~21.1%)；III类多在养殖前期呈现较高的相对丰度 (最高值可达18.2%)。池塘C (图2-c)中I类优势菌群多在养殖中期 (S33—S41) 出现较高相对丰度 (最高可达19.3%)；II类优势菌群则在养殖初期 (最高值为38.2%) 和后期 (38.5%) 相对丰度较高；III类优势菌群在养殖前期相对丰度较高 (最高值为7.5%)。

    图  2  各池塘优势菌群组成及变动
    Figure  2.  Composition and changes of dominant flora in each pond
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    2.3   浮游细菌群落Alpha多样性

    利用PD值、H'值和物种丰富度对不同池塘alpha多样性的变动情况进行了计算 (图3)。池塘A、B和C的PD指数均值分别为82.81 (61.94~111.65)、74.65 (35.55~106.19) 和59.56 (24.45~78.14)，方差分析表明池塘A和C间差异极显著 (P<0.01)，其他各池塘间差异不显著 (P>0.05)。H'值各池塘均值分别为4.28 (3.04~4.96)、4.01 (2.64~5.06) 和3.71  (2.48~4.59)，池塘A与C之间差异均极显著 (P<0.01)。各池塘物种丰富度均值分别为843 (变幅介于597~1054)、656 (变幅介于334~942)和620 (变幅介于243~743)，池塘A与B和C之间差异均极显著 (P<0.01)，池塘B和C之间差异不显著 (P>0.05)。

    图  3  3口池塘的α多样性系数分析
    注：箱体上中下线分别为75、50 (中位数) 和25分位数，轴须线最长不超过1.5倍箱体范围，黑色空心圆表示平均数；差异显著性用* (P<0.05)、** (P<0.01)以及*** (P<0.001) 表示；图中的样本量：A：n=22、B：n=12、C：n=12。
    Figure  3.  α diversity index analysis of bacterioplankton in three ponds
    Note: The upper, middle and lower lines of the box are 75, 50 (Median) and 25 quantiles, respectively. The maximum length of whiskers shall not exceed 1.5 times of the box range. The black hollow circles represent the average values. The significant differences were represented by * (P<0.05), ** (P<0.01) and *** (P<0.001). The numbers of replicated samples in this figure are: A: n=22; B: n=12; C: n=12.
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    2.4   浮游细菌群落Beta多样性

    利用rankindex函数筛选出最优的manhattan差异系数进行NMDS分析，如图4所示，各池浮游细菌样方95%置信区间 (不同颜色椭圆所示) 有较多重叠，且这些样方多为养殖的中、后期，边缘分布的诸多样方多为养殖初期，表明各池塘浮游细菌群落在对虾养殖初期差异较大，至中、后期差异减小。ANOSIM分析结果显示，各池塘浮游细菌群落结构总体上差异不显著 (P>0.05)。

    图  4  凡纳滨对虾养殖池塘浮游细菌群落NMDS分析
    Figure  4.  NMDS analysis of bacterioplankton community in L. vannamei pond
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    3口池塘调查期间共鉴出浮游细菌433属，其中3口池塘共有属414个，池塘A特有属88个，池塘B特有属7个，池塘C特有属4个 (图5)。利用LEfSe分析法，对各池塘浮游细菌群落相对丰度在各分类水平上的差异进行了分析，LDA得分阈值设为4时 (P=0.05)，共筛选出18个分类单元，其中属于池塘A的差异分类单元4个，属于池塘B和C的差异分类单元均为7个。如图6所示，差异分析结果包含各分类水平的差异菌群信息，其中池塘A的差异菌群为Lacibacter sp.、鞘脂杆菌纲、成对杆菌属和微杆菌科；池塘B的差异菌群为暖绳菌纲、暖绳菌目、SAR11、动球菌科、鞘脂单胞菌科、远洋杆属和α-变形菌纲；池塘C的差异菌群为类芽孢八叠球菌、嗜甲基菌科、嗜甲基菌目、黄杆菌纲、浮霉菌门、分枝杆菌属和分支杆菌科。

    图  5  各池浮游细菌属水平上共有和特有属的数量
    Figure  5.  Number of common and endemic genera of bacterioplankton at genus level in each pond
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    图  6  各池浮游细菌群落的线性判别分析 (菌群LDA>4)
    Figure  6.  Linear discriminant analysis of bacterioplankton community in each pond (Bacterial flora with LDA>4)
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    2.5   优势菌群分布与主要理化因子的关系

    对14个环境变量与优势菌群 (Y>0.02) 进行冗余分析 (RDA)。前两轴累计解释总变异的37.8%。经P值校正，全模型前2约束轴显著 (P<0.05)。经ordiR2step函数向前选择，最终保留4个环境变量，其中PO4-P与第一主成分轴 (RDA1) 相关性最大 (R=0.775)，其次是ALK (R=−0.604) 和DO (R=0.568)，Sul与第二主成分轴相关性最大 (R=0.737)。

    如图7所示，GpIIa、芽殖杆菌属、湖栖菌属和红杆菌属与ALK呈正相关，与DO和PO4-P呈负相关；不动杆菌属和黄杆菌属与PO4-P呈高度正相关，与ALK呈高度负相关；气单胞菌属和鞘脂菌属与Sul和DO均呈正相关，Spartobacteria genera incertae sedis和多核杆菌与Sul呈负相关。池塘A养殖前、中期的样方主要集中在排序图左部，显示优势菌群主要在ALK浓度较高的样方分布，其中GpIIa是主导的优势菌群，池塘A后期的样方PO4-P浓度高。池塘B和C在养殖初期和后期的样方多数PO4-P浓度较高，且H'较低 (H'均值分别为3.08和3.50)；养殖中期的样方，H'较高 (H'均值为4.30，P<0.01)。

    图  7  优势菌群分布和群落多样性 (H') 与主要理化因子之间的关系 (II型标尺)
    注：Aci. 不动杆菌属；Aer. 气单胞菌属；Fla. 黄杆菌属；Gem. 芽殖杆菌属；GpI. GpIIa；Ilu. 微酸菌属；Lim. 湖栖菌属；Pol. 多核杆菌；Rho. 红杆菌属；Sed. 沉积物杆状菌属；Spa. 发光细菌属；Sph. 鞘脂菌属。
    Figure  7.  Species associations of dominan flora and diversity (H') with environmental factors (Scaling II)
    Note: Aci. Acinetobacter sp.; Aer. Aeromonas sp.; Fla. Flavobacterium sp.; Gem. Gemmobacter sp.; GpI. GpIIa; Ilu. Ilumatobacter sp.; Lim. Limnohabitans sp.; Pol. Polynucleobacter sp.; Rho. Rhodobacter sp.; Sed. Sediminibacterium sp.; Spa. Spartobacteria genera incertae sedis; Sph. Sphingomonas sp..
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    3.   讨论

    3.1   凡纳滨对虾淡化养殖池塘浮游细菌群落结构特征及其对理化因子的响应

    本次调查的新疆凡纳滨对虾淡化养殖池塘共鉴出浮游细菌30门，各池塘相对丰度占比前7的门类 (相对丰度占比>1%) 组成相同，分别为变形菌门、放线菌门、蓝细菌门、拟杆菌门、疣微菌门、浮霉菌门和厚壁菌门。这与已有报道的不同凡纳滨对虾养殖水体中优势浮游细菌组成在门分类水平上较为相似[13-15,23]。

    群落中优势种群的存在对于生态系统结构与功能的稳定至关重要，包含系统代谢所需的主要生物结构与功能信息，并影响生态系统的演替[23]。如本次调查发现，Lacibacters sp. 既是池塘A的优势菌群也是LEfSe分析识别到的一个生物标记，Lacibacters sp. 经常发现于富营养化水体中[24]，其不能进行反硝化和硝酸盐还原，但能水解复杂的有机物，使降解的有机物能够被微生物群落充分吸收利用[25]。表明池塘A水生态系统在有机物循环利用转化中具有优势，更有利于形成良好的养殖环境。

    研究表明水生态系统中浮游细菌群落对水环境变化极其敏感并可迅速做出响应[26-27]，这种响应主要涉及到现有群落相对丰度的变化[28]。众多相关研究均显示不同的结果，认为水温、pH、DO、硅酸盐、氮、磷和COD或这些因子的不同组合等是影响浮游细菌分布的主要环境因素[29-31]。研究结果的差异除了与环境因子变化幅度不同有关，还可能是不同水体浮游细菌群落由于受到固有的种间关系影响，而形成了复杂群落的结构异质性[32]。本研究中各池塘优势菌群在组成上有较高的相似性，但优势菌群在分布和相对丰度变动上有较大差异 (图2)。而张皓[15]的调查却发现不同水样间优势菌在组成及丰度上均存在明显差异。这可能与采样频次、养殖密度和水环境状况等不同有关。调查发现在养殖前期、中期，优势菌群主要由营光合自养的GpIIa、红杆菌属及化能异养的芽殖杆菌属、微小杆菌属等有益菌株组成。后期条件致病菌不动杆菌属、黄杆菌属、假单胞菌属和气单胞菌属含量增加 (相对丰度最高值分别达18.2%、6.2%、11.2%和39.5%)，从RDA分析结果可以看出，这些菌群主要与PO4-P和Sul呈正相关，与GpIIa、红杆菌属和芽殖杆菌属这些益生菌呈负相关，表明后期由于水体营养盐含量增加、水质恶化导致条件致病菌大量繁殖，有益菌生长严重受限。张皓[15]的研究也表明高氨氮、高有机物条件下，假单胞菌和黄杆菌属条件致病菌丰度增加。可见，当水环境状况变差，条件致病菌的发生率会增加，极易引发病害。另外，本研究发现随着ALK的增加，有益菌含量增加。ALK可缓存水体酸碱度，其变动改变了微生物酶的活性和膜的通透性，从而影响其生长状况。郭远涛[33]研究也表明随着ALK的消耗，细菌硝化作用减弱，氨氮去除率不再升高。本次调查各池塘ALK变动范围介于54.2~186.2 mg·L−1，此范围内ALK的增加可促进有益菌的生长。

    3.2   凡纳滨对虾养殖池塘浮游细菌群落多样性特征

    本次调查H'指数变动范围介于2.48~5.06，各池塘间H'指数差异不显著，这与杨淑芳[14]的调查结果近似。根据物种生态位保守假说[34]，即物种在进化过程中生态位是保守的，亲缘关系越相近的物种其生态位越相似。不同物种会通过占有资源生态位的分化实现共存[35]，PD值越小亲缘关系越相近，更趋向相似的生态位，池塘A浮游细菌物种丰富度、H'值和PD值均大于池塘C (P<0.05或P<0.01)，因此相较池塘A和C的浮游细菌群落呈现更低的物种共存和系统发育多样性特征。

    根据NMDS分析，各池浮游细菌群落在凡纳滨对虾养殖初期差异较大，至中、后期差异减小，在统计学上各池塘浮游细菌群落结构的变动差异并不显著。Fan等[36]对不同养殖品种的池塘浮游细菌群落的研究发现，池塘中养殖品种的不同是形成不同浮游细菌群落的主要因素，本研究是同一养殖场的凡纳滨对虾养殖池塘，未呈现显著的群落结构变动。虽然各池塘浮游细菌群落整体上差异不显著，但LEfSe分析仍识别到18个生物标记，这些类群显示出各池塘浮游细菌在各分类单元的差异菌群。如远洋杆属仅在后期出现，Sphingomonadaceae则仅在前期出现，这些菌群的分布可能受到水体营养及有机质状况的影响。

    稳定的微生物环境对维持对虾的健康生长至关重要，一般认为多样性是反映群落稳定性的重要指标[37]，高多样性指数一般表征更加稳定的群落特征[38]。本研究H'多样性与环境因子RDA分析表明，养殖初期和后期的样方，H'值较低 (均值分别为3.08和3.50，P<0.01)；养殖中期的样方，H'值较高 (均值为4.30，P<0.01，图7)，这与胡晓娟等[39]的研究结果近似。养殖初期，由于水体浮游细菌群落刚刚构建，H'值较低，随着营养元素的注入，H'值升高，至后期水体呈严重富营养化状态，有机物升高，H'值降低，条件致病菌增多，群落稳定性降低。Yang等[16]的研究也表明，水体富营养化会破坏浮游细菌群落的稳定性。根据中度干扰假说[40]，中等程度的干扰使多样性维持在较高水平，可以容纳更多的物种迁入和定居；本研究符合中度干扰假说这一现象。由此可见，凡纳滨对虾养殖后期是水质调控的关键节点，此时应加强人为干预，对水质进行合理调控，如抗应激、杀灭有害菌藻、底质改良、培育有益微生物群落，重新构建生态系统。

  • 图  1   凡纳滨对虾养殖池塘门水平的浮游细菌组成

    Figure  1.   Composition of bacteriaoplankon at phylum level in L. vannamei ponds

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    图  2   各池塘优势菌群组成及变动

    Figure  2.   Composition and changes of dominant flora in each pond

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    图  3   3口池塘的α多样性系数分析

    注：箱体上中下线分别为75、50 (中位数) 和25分位数，轴须线最长不超过1.5倍箱体范围，黑色空心圆表示平均数；差异显著性用* (P<0.05)、** (P<0.01)以及*** (P<0.001) 表示；图中的样本量：A：n=22、B：n=12、C：n=12。

    Figure  3.   α diversity index analysis of bacterioplankton in three ponds

    Note: The upper, middle and lower lines of the box are 75, 50 (Median) and 25 quantiles, respectively. The maximum length of whiskers shall not exceed 1.5 times of the box range. The black hollow circles represent the average values. The significant differences were represented by * (P<0.05), ** (P<0.01) and *** (P<0.001). The numbers of replicated samples in this figure are: A: n=22; B: n=12; C: n=12.

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    图  4   凡纳滨对虾养殖池塘浮游细菌群落NMDS分析

    Figure  4.   NMDS analysis of bacterioplankton community in L. vannamei pond

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    图  5   各池浮游细菌属水平上共有和特有属的数量

    Figure  5.   Number of common and endemic genera of bacterioplankton at genus level in each pond

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    图  6   各池浮游细菌群落的线性判别分析 (菌群LDA>4)

    Figure  6.   Linear discriminant analysis of bacterioplankton community in each pond (Bacterial flora with LDA>4)

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    图  7   优势菌群分布和群落多样性 (H') 与主要理化因子之间的关系 (II型标尺)

    注：Aci. 不动杆菌属；Aer. 气单胞菌属；Fla. 黄杆菌属；Gem. 芽殖杆菌属；GpI. GpIIa；Ilu. 微酸菌属；Lim. 湖栖菌属；Pol. 多核杆菌；Rho. 红杆菌属；Sed. 沉积物杆状菌属；Spa. 发光细菌属；Sph. 鞘脂菌属。

    Figure  7.   Species associations of dominan flora and diversity (H') with environmental factors (Scaling II)

    Note: Aci. Acinetobacter sp.; Aer. Aeromonas sp.; Fla. Flavobacterium sp.; Gem. Gemmobacter sp.; GpI. GpIIa; Ilu. Ilumatobacter sp.; Lim. Limnohabitans sp.; Pol. Polynucleobacter sp.; Rho. Rhodobacter sp.; Sed. Sediminibacterium sp.; Spa. Spartobacteria genera incertae sedis; Sph. Sphingomonas sp..

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    表  1   凡纳滨对虾养殖池塘水体主要理化因子

    Table  1   Environmental factors in L. vannamei ponds

    环境因子
    Environmental factor    		池塘A
    Pond A    		池塘B
    Pond B    		池塘C
    Pond C
    水温 Temperature/℃ 26.19±2.01 26.15±1.57 26.37±2.00
    pH 8.10±0.50 8.29±0.37 8.30±0.38
    溶解氧质量浓度 DO/(mg·L−1) 8.00±0.68 8.45±1.17 8.11±1.15
    铵态氮质量浓度 NH4-N/(mg·L−1) 0.45±0.73 0.44±0.39 0.33±0.27
    亚硝酸氮质量浓度 NO2-N/(mg·L−1) 0.01±0.01 0.01±0.01 0.01±0.01
    硝酸态氮质量浓度 NO3-N/(mg·L−1) 0.34±0.44 0.41±0.42 0.48±0.53
    活性磷质量浓度 PO4-P/(mg·L−1) 0.12±0.14 0.37±0.24 0.22±0.28
    活性硅酸盐质量浓度 SiO3-Si/(mg·L−1) 11.2±3.55 12.38±7.38 4.03±2.98
    高锰酸盐指数 CODMn/(mg·L−1) 8.34±7.19 6.12±3.18 5.34±2.91
    叶绿素 a 质量浓度 Chl-a/(mg·L−1) 75.78±131.01 56.13±42.81 58.36±61.48
    硫化物质量浓度 Sul/(mg·L−1) 0.03±0.04 0.02±0.01 0.02±0.01
    矿化度质量浓度 Mineralization degree/(mg·L−1) 1209.44±2445.58 813.39±171.69 814.35±41.91
    碱度 ALK/(mg·L−1) 138.18±12.06 115.32±33.82 84.46±14.73
    总硬度 Total hardness/(mg·L−1) 362.76±395.28 476.5±227.34 349.36±60.18
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    表  2   各样本有效序列数据统计

    Table  2   Valid sequences of each sample

    样品
    Sample    		条形码
    Barcode    		有效序列
    Valid sequence/条    		碱基数
    Base number    		平均长度
    Mean length/bp    		最短序列长度
    Min. length/bp    		最长序列长度
    Max. length/bp
    S1GTAACA82 73634 604 966418.26363469
    S2CCAGAC81 90534 619 470422.68361476
    S3GGTGAA56 85923 683 959416.54367475
    S4TGCATC85 21235 667 198418.57353469
    S5TCGACC83 24634 547 936415.01365470
    S6GTCGCG73 82930 547 465413.76362453
    S7CGGATG83 66234 668 763414.39356465
    S8GTGAAA84 38434 811 366412.54350466
    S9ATCTTG100 94541 590 813412.01350452
    S10TATGCA73 80130 659 241415.43352459
    S11GTAACA86 47135 924 249415.45354471
    S12GCGAGG90 43237 722 526417.14351465
    S13CACGAT54 43922 735 194417.63373465
    S14GCGGTA44 22718 478 585417.81352471
    S15TATCGA61 43125 638 627417.36359473
    S16ATCACG52 38421 792 829416.02376471
    S17CGGATG99 21141 215 038415.43360473
    S18CGCATA100 00141 427 908414.27372476
    S19TGCATC65 71227 246 907414.64359476
    S20TCAGTA76 02931 690 841416.83362471
    S21CGGCAC75 20231 405 455417.61364469
    S22ATCACG71 60530 328 221423.55352470
    S23CGGATG63 35826 635 233420.39367470
    S24GTGAAA56 42923 698 925419.98350471
    S25TCAGTA92 40038 487 742416.53355435
    S26GAAGTG87 30537 043 958424.31368448
    S27TCGACC94 07539 472 386419.58360464
    S28CTTGTA52 27322 054 548421.91373472
    S29GTTTCG44 69718 684 447418.02360462
    S30ATCTTG59 73725 072 871419.72365465
    S32GCCATC78 46232 993 239420.5357474
    S33TGTGTT69 61329 167 734419.00351474
    S34CTTGTA56 08323 551 548419.94356471
    S35GTTTCG45 70118 993 334415.60359464
    S36TTCGTA46 33719 212 573414.63356468
    S37CCAGAC51 97821 598 326415.53372436
    S38AGCAGT77 23331 835 991412.21350470
    S39GAGGAA75 22631 060 291412.89370468
    S40AAGGTA46 92019 633 227418.44352450
    S41ATCACG43 98318 242 559414.76352469
    S42TAGGAC66 63927 702 230415.71356470
    S43TGGACG49 20620 369 621413.97357472
    S44AGAACA50 32220 765 128412.65356469
    S45GGTGTG41 16917 011 770413.22350471
    S46AACTAT67 69128 070 176414.68357468
    S47ACTGCG60 22025 559 117424.43359474
    S48TGTGTT94 26139 467 506418.7355474
    S49TAGGAC86 90436 530 365420.35353467
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    • 参考文献(40)
  • [1]

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出版历程
  • 收稿日期:  2022-07-10
  • 修回日期:  2022-09-27
  • 录用日期:  2022-10-23
  • 网络出版日期:  2022-10-26
  • 刊出日期:  2023-04-04

目录

摘要
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  • 1.   材料与方法

  • 1.1   池塘条件及样品采集

  • 1.2   DNA提取与测序

  • 1.3   数据分析

  • 2.   结果

  • 2.1   主要理化因子状况

  • 2.2   浮游细菌群落结构及变动

  • 2.2.1   各池塘浮游细菌门水平群落组成
  • 2.2.2   各池塘优势菌群及相对丰度

  • 2.3   浮游细菌群落Alpha多样性

  • 2.4   浮游细菌群落Beta多样性

  • 2.5   优势菌群分布与主要理化因子的关系

  • 3.   讨论

  • 3.1   凡纳滨对虾淡化养殖池塘浮游细菌群落结构特征及其对理化因子的响应

  • 3.2   凡纳滨对虾养殖池塘浮游细菌群落多样性特征

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