Effects of nitrite and microplastic stress on immune, detoxification metabolism and osmoregulation-related indicators in gills of Litopenaeus vannamei
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摘要:
鳃是对虾重要的呼吸器官，是亚硝酸盐毒性效应的主要靶器官，也是微塑料主要富集的部位之一。鳃组织参与了对虾渗透调节、氮排泄、免疫功能等生理过程，对对虾维持机体健康具有重要意义。为研究亚硝酸盐和微塑料单因素及复合胁迫对凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 鳃组织生理功能的影响，将对虾分为对照组、20 mg·L−1亚硝酸盐胁迫组 (NIT)、10 µg·L−1微塑料胁迫组 (MP)、20 mg·L−1亚硝酸盐和10 µg·L−1微塑料复合胁迫组 (NM)，于第14天测定对虾鳃中相关指标变化。结果显示：1) 氧化应激指标丙二醛 (MDA)、过氧化氢 (H2O2) 浓度及抗氧化酶超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx) 活性在胁迫后发生不同程度的改变；2) 解毒代谢指标细胞色素P450基因 (CYP450) 和谷胱甘肽S-转移酶基因 (GST) 相对表达水平在胁迫后发生不同程度的紊乱；3) 渗透调节指标如离子转运酶液泡型ATP酶 (VATP)、Na+/H+交换体7 (NHE7)、Na+/K+-ATP酶亚基α (NKA-α)、Na+/K+-ATP酶亚基β (NKA-β)、碳酸酐酶 (CA) 和水通道蛋白TIP4-1 (TIP4)、钙通道蛋白1 (CCP)、氯通道蛋白2 (CLC)、水通道蛋白 (AQP) 基因的相对表达水平在胁迫后发生不同程度的紊乱；4) 细胞凋亡因子基因 (CASP-3) 相对表达水平在3个胁迫组均显著降低 (P<0.05)。由此推断，亚硝酸盐和微塑料胁迫会诱导凡纳滨对虾鳃中免疫、解毒代谢和渗透调节相关指标变化，进而影响其正常的生理功能。
Abstract:Gill is an important respiratory organ of prawns, the main target organ of nitrite toxicity effect, and also one of the main enrichment sites of microplastics. The gill tissue participates in the physiological processes of prawns such as osmoregulation, nitrogen excretion, immune function, etc., which is important for maintaining the prawns' health. In order to investigate the effects of single and combined stress of nitrite and microplastics on the physiological functions of gill tissues of Litopenaeus vannamei, we designed the control group, 20 mg·L−1 nitrite stress group (NIT), 10 μg·L−1 microplastic stress group (MP), 20 mg·L−1 nitrite and 10 μg·L−1 microplastic composite stress group (NM), and then measured the changes of immune and osmotic regulation in gills of shrimps on the 14th day. The results show that: 1) The oxidative stress indicators such as the contents of malondialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H2O2), and the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) changed at different degrees after the stress. 2) The detoxification metabolic indicators such as the relative expression levels of cytochrome P450 (CYP450), glutathione S-transferase (GST) and apoptosis factor (CASP-3) were disturbed at different degrees after the stress. 3) The relative gene expression levels of the osmoregulation indexes such as ion transporters (VATP, NHE7, NKA-α, NKA-β and CA) and channel proteins (TIP4, CCP, CLC and AQP) occurred at different degrees of disorder after the stress. 4) The apoptosis index sucha as the relative expression level of apoptosis factor (CASP-3) gene decreased significantly in the three groups (P<0.05). Thus, it is inferred that nitrite and microplastic stress can induce the changes of immunity, detoxification metabolism and osmotic regulation in the gills of L. vannamei, affecting its normal physiological functions.
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Keywords:
- Litopenaeus vannamei /
- Gill /
- Nitrite /
- Microplastics /
- Detoxification metabolism /
- Osmotic regulation
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工业化发展以来，人类活动对海洋的影响日益加剧，排放到水环境中的重金属最终汇集到海洋中，不仅会对海洋生物造成危害，还可通过食物链的富集和放大效应间接影响人类健康[1-3]。改革开放40年来，中国经济快速发展，城市化和工业化已对我国沿海和河口地区产生不同程度的重金属污染[1,4-5]。因此，对重金属污染水域的修复工作势在必行。传统的修复方法均存在一定的缺点，如化学沉淀法容易产生二次污染、活性炭吸附法成本高等。因此，越来越多的学者研究运用生物材料通过新陈代谢转移水体重金属的方法[6-8]。
重金属镉 (Cd)是一种环境中无处不在的非必需元素，即使有时水体Cd浓度低，也可在藻类和底泥中累积，被水体中鱼、贝和虾蟹类吸收，通过食物链富集，最终可能进入人体造成公害[9]。相关研究表明，我国沿海海洋环境和贝类已受到不同程度的Cd污染和危害[10]。海南新村港近海海水和表层沉积物重金属污染与生态风险评价中海水中ρ(Cd2+)为0~0.58 μg·L−1，表层沉积物w(Cd2+)年均水平为0.175 mg·kg−1，对该海域生态系统的潜在生态风险属于中等水平[11]。广西茅尾海水体中ρ(Cd2+)为0.03~0.34 μg·L−1[12]；南中国海表层海水ρ(Cd2+)为0.047~0.324 mg·L−1[13]，已超过我国海水水质三类水标准。已有研究表明，Cd2+胁迫下铜藻 (Sargassum horneri) 岩藻黄素和褐藻多酚的含量明显下降，且活性成分随Cd2+胁迫浓度的增加而减少，而褐藻胶在ρ(Cd2+)为0.1 mg·L−1和0.5 mg·L−1胁迫组与对照组无明显差异[14]。尹文珂等[15]研究显示，四尾栅藻 (S. quadricauda) 色素含量随Cd2+质量浓度增加而降低，可溶性蛋白含量在ρ(Cd2+)为1.0 mg·L−1时达到最大值，之后随ρ(Cd2+)上升而减小，四尾栅藻对低浓度Cd2+具有良好的耐受性，可耐受ρ(Cd2+)为1.0 mg·L−1。
半叶马尾藻(Sargassum hemiphyllum)隶属于褐藻门、马尾藻科、马尾藻属，生长在低潮带或潮下带，广泛分布于中国广东、福建、台湾、浙江沿岸，不仅可用于提取褐藻胶等原料，还可以吸收海水中的氮、磷等营养元素，对海水的净化和修复起重要作用，是人工修复或重建海藻场的重要物种之一。韩婷婷等[16-17]研究了3种氮源加富和充气培养对半叶马尾藻生长及生化组成的影响，付贵权等[18]研究发现半叶马尾藻可作为低质量浓度铜离子[ρ(Cu2+)≤0.05 mg·L−1] 污染海域的生物修复物种，目前尚未见有运用半叶马尾藻修复海洋Cd2+污染的研究报道。
本文以大亚湾海域优势种半叶马尾藻为研究对象，探讨Cd2+胁迫对半叶马尾藻的光合色素、可溶性糖、可溶性蛋白和抗氧化酶活性等生理生化指标的影响，为广泛运用半叶马尾藻修复中国东南沿海重金属污染海域提供依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
于广东大亚湾杨梅坑的岩礁潮间带采集半叶马尾藻，并于中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地筛选健康藻体，人工清洗去除表面附着物，并放置于砂滤自然海水[ 水温 (20±2) ℃，盐度33，pH 8.0]的水族箱中暂养，自然光照，周期为12 L∶12 D，24 h换一次水，24 h不间断充气。
实验海水为砂滤自然海水，经0.45 μm滤膜过滤后进行高压灭菌处理，并制备f/2 培养基做备用，测得海水盐度33，pH 8.0，ρ(Cd2+)采用火焰原子吸收分光光度法测定，低于检出限(0.001 μg·mL−1)，参照GB 17378. 6—2007。
1.2 实验设置
选取相同部位的半叶马尾藻藻体[ 鲜质量(1.50±0.01) g]放入每个锥形瓶中，实验组添加适量的氯化镉得到Cd2+胁迫所需的质量浓度，分别为0.1 mg·L−1、0.5 mg·L−1、2.5 mg·L−1和12.5 mg·L−1，未添加氯化镉的为对照组，每组设置3个平行，置于20 ℃、光强100 μmol·m−2·s−1、光照周期12 L∶12 D的GXZ智能型光照培养箱中培养，光照期间每隔2 h人工摇晃培养液使其混合均匀。实验选择0.1 mg·L−1、0.5 mg·L−1、2.5 mg·L−1、12.5 mg·L−14个浓度梯度，分别验证轻度污染、中度污染 、重度污染和最大耐受条件的抗逆情况。
分别于实验第第0、第4、第8、第12、第24和第48小时取藻体–80 ℃冷冻保存，用于测定其生理生化指标。
1.3 研究方法
1.3.1 光合色素[ 叶绿素a (Chl a)和类胡萝卜素 (Car)]的测定
参照韩婷婷等[19]和Wellburn[20]的方法，称量0.10 g新鲜半叶马尾藻藻体加入少许石英砂和碳酸镁，并吸取80%的丙酮10 mL研磨，研磨破碎后置于4 ℃冷藏萃取24 h，在4 000 r·min−1 下离心15 min，吸取上清液，测定其在波长665 nm、652 nm、510 nm和480 nm处的吸光值，根据公式计算Chl a 和Car的质量分数 (mg·g−1)：
$$ {\large{w_{{\rm Ch} 1\;a}}}=\left(16.29 \times A_{665}-8.54 \times A_{652}\right) \times V / W \times 1\;000 $$ (1) $$ {\large{w_{\rm{Car}}}}=7.6 \times\left(A_{480}-1.49 \times A_{510}\right) \times V / W \times 1\;000 $$ (2) 式中A 为吸光值，V为浸提丙酮的体积 (mL)，W为藻体鲜质量 (g)。
1.3.2 可溶性蛋白 (SP) 测定
采用南京建成试剂盒考马斯亮蓝法测定。
1.3.3 可溶性糖 (SS) 测定
参照Koehert[21]的苯酚-硫酸法，称量0.30 g新鲜半叶马尾藻藻体，加入适量蒸馏水 (少于20 mL) 研磨均匀，80 ℃恒温水浴30 min，待冷却后过滤定容至20 mL为待测溶液。吸取适量待测液，并加入1 mL苯酚试剂和5 mL浓硫酸，在485 nm波长下测其吸光值(mg·g−1)，计算公式为：
$$ {\large{w_{\mathrm{SS}}}}=C \times V / W \times 1\;000 \times \mathrm{a} $$ (3) 式中C为葡萄糖标准曲线中查得的值 (mg)；V为样品提取液体积 (mL)；a为显色时取样量 (mL)；W为样品鲜质量 (g)。
1.3.4 抗氧化酶 (SOD和CAT) 活性和丙二醛 (MDA) 的测定
采用南京建成试剂盒羟胺法测定超氧化物歧化酶 (SOD) 活性 (A001-1-1)，用南京建成试剂盒可见光法测定过氧化氢酶 (CAT) 活性 (A007-1-1)，丙二醛 (MDA) 用南京建成试剂盒硫代巴比妥酸 (TBA) 法测定。
1.4 数据处理
采用SPSS 16.0软件对数据进行单因素方差分析，并用最小显著差异法(LSD) 比较各处理组间的显著性差异 (P≤0.05)；处理数据后用Origin 9.0软件绘图。
2. 结果
2.1 Cd2+胁迫对半叶马尾藻的光合色素的影响
Cd2+胁迫对半叶马尾藻的光合色素合成有一定促进作用 (图1)，在ρ(Cd2+)为0.1 mg·L−1胁迫组中，w(Chl a)和w(Car)与对照组无显著差异 (P>0.05)；在ρ(Cd2+)为0.5 mg·L−1和2.5 mg·L−1胁迫组中，实验结束时w(Chl a)和w(Car)显著高于对照组 (P<0.05)，w(Chl a)分别增加9.9%和15.8%，w(Car)分别增加15.4%和27.9%；ρ(Cd2+)为12.5 mg·L−1的胁迫组，在4~12 h实验期间w(Chl a)和w(Car)显著低于对照组 (P<0.05)，12 h后出现明显上升趋势，在实验第48 小时w (Chl a)和w (Car)显著高于对照组 (P<0.05)，分别增加了10.2%和12.1%。
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图 1 重金属镉离子对半叶马尾藻叶绿素a和类胡萝卜素的影响不同字母表示同一胁迫时间内不同处理组间有显著性差异 (P<0.05)，后图同此Figure 1. Effects of Cd2+ on Chl a and Car of S. hemiphyllumDifferent letters represent significant difference among different treatments at the same time (P<0.05). The same case in the following figures.2.2 Cd2+胁迫对半叶马尾藻的SS和SP的影响
Cd2+胁迫对半叶马尾藻的SS和SP合成有一定促进作用 (图2)，在ρ(Cd2+)为0.1 mg·L−1的胁迫组中，w(SP)与对照组无显著差异 (P>0.05)， w(SS)在第4~第24小时均显著高于对照组 (P<0.05)，第48小时恢复到对照组水平 (P>0.05)；而在ρ(Cd2+)为0.5 mg·L−1、2.5 mg·L−1和12.5 mg·L−1的胁迫组中，w(SP)和w(SS)均显著高于对照组 (P<0.05)，第48小时w(SS)分别比对照组增加了20.2%、60.8%和17.5%，w(SP)分别比对照组增加了38.7%、19.3%和2.4%，其中ρ(Cd2+)为2.5 mg·L−1的胁迫组对SS合成促进最大，ρ(Cd2+)为0.5 mg·L−1的胁迫组对SP合成促进最大。
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图 2 重金属镉离子对半叶马尾藻可溶性糖和可溶性蛋白的影响Figure 2. Effects of Cd2+ on soluble sugar and soluble protein of S. hemiphyllum2.3 Cd2+胁迫对半叶马尾藻抗氧化酶系统的影响
Cd2+胁迫对半叶马尾藻抗氧化酶系统的影响显著(图3)，对照组藻体的抗氧化酶各项指标保持不变，说明藻体没有产生抗逆反应。
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图 3 重金属镉离子对半叶马尾藻超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性和丙二醛水平的影响Figure 3. Effects of Cd2+ on SOD and CAT activities, MDA content of S. hemiphyllumSOD活性在ρ(Cd2+)为0.1 mg·L−1的胁迫组中，除在第12小时明显高于对照组(P<0.05)，其余与对照组无显著差异 (P>0.05)；在ρ(Cd2+)为0.5 mg·L−1、2.5 mg·L−1和12.5 mg·L−1的胁迫组中，SOD活性显著高于对照组 (P<0.05)，至第48小时，分别比对照组升高16.9%、45.2%和41.6%，其中ρ(Cd2+)为2.5 mg·L−1对SOD活性影响最大。
CAT活性 (U·mg−1prot)在ρ(Cd2+)为0.1 mg·L−1的胁迫组中，除在第8和第12小时明显高于对照组(P<0.05)，其余与对照组无显著差异(P>0.05)；在ρ(Cd2+)为0.5 mg·L−1、2.5 mg·L−1和12.5 mg·L−1的胁迫组中，第48小时显著高于对照组(P<0.05)，分别比对照组升高47.4%、63.9%和57.3%，其中ρ(Cd2+)为2.5 mg·L−1的胁迫组对CAT活性影响最大。
MDA摩尔质量浓度 (nmol·mg−1) 在ρ(Cd2+)为0.1 mg·L−1和0.5 mg·L−1的胁迫组在第4~第12小时比对照组显著增加 (P<0.05)，第48小时0.1 mg·L−1与0.5 mg·L−1胁迫组无显著差异 (P>0.05)；而ρ(Cd2+)为2.5 mg·L−1和12.5 mg·L−1胁迫组中，MDA水平均显著高于对照组 (P<0.05)，结束时分别比对照组增加17.5%、22.8%、92.0%和67.0%，其中ρ(Cd2+)为2.5 mg·L−1胁迫组对MDA水平影响最大。
3. 讨论
大型海藻的生长状况受多种环境因子的影响，如温度、pH、营养盐等[22-23]，而且还受重金属铜、镉等影响[24]。研究发现，真江蓠 (Gracilaria verrucose)、孔石莼 (Ulva pertusa)[25]、龙须菜 (Gracilaria lemaneiformis)[26]等大型海藻对Cd都有很强的吸附和耐受性，在ρ(Cd2+)大于10 mg·L−1胁迫下才会破坏龙须菜藻体中过氧化物酶的活性，出现生长抑制[27]。
本研究表明，半叶马尾藻在ρ(Cd2+)为12.5 mg·L−1胁迫组中第4~第12小时Chl a和Car质量浓度出现明显下降，随后逐渐升高显著高于对照组 (P<0.05)。朱喜锋等[28]研究表明，Cd2+通过损害光合作用器官、结合生物大分子的活性位点(如Cd2+取代叶绿素分子中心的Mg2+从而破坏叶绿素结构)影响光合作用；同时，藻类自身也会形成植物络合素、金属硫蛋白等与重金属结合从而增加藻类对重金属的耐受性[29]。Chl a和Car是大型海藻光合作用的主要色素，Chl a含量的变化是衡量藻体衰老状况的重要指标，第48小时实验结束时，ρ(Cd2+)≤0.1 mg·L−1胁迫下半叶马尾藻Chl a和Car含量与对照组没有显著性差异，说明低浓度的Cd2+对半叶马尾藻的光合作用影响不大；0.1 mg·L−1<ρ(Cd2+)≤12.5 mg·L−1胁迫下半叶马尾藻Chl a和Car含量均高于对照组，说明半叶马尾藻对高浓度Cd2+胁迫有较强的抗逆性。
SP和SS是衡量植物代谢水平的重要指标，Cd胁迫下植物膜蛋白会明显增加[30]，实验第4~第24小时SP和SS含量均明显上升，只有ρ(Cd2+)为0.1mg·L−1胁迫组在48 h后恢复到对照组水平，ρ(Cd2+)为0.5 mg·L−1、2.5 mg·L−1和12.5 mg·L−1下胁迫处理48 h后SP和SS含量明显高于对照组。本研究结果表明，ρ(Cd2+)不高于12.5 mg·L−1胁迫浓度下可诱导SP和SS合成，从而降低Cd2+对藻体的毒性，这可能是半叶马尾藻对环境中过量Cd2+毒害自我保护机制的响应，但高浓度的Cd2+会对藻体蛋白质合成与代谢起破坏作用[31]。
在重金属胁迫下，藻体会产生大量的活性氧自由基 (ROS)从而对藻体蛋白和核酸等产生损害，破坏代谢平衡。与此同时，藻体会产生大量的抗氧化酶 (如SOD、CAT等)适应胁迫环境，SOD主要清除活性氧自由基，CAT则主要清除SOD产生的H2O2，从而保护细胞。当重金属浓度过高破坏抗氧化酶保护系统则会引发活性氧积累，进而引起膜组分不饱和脂肪酸的过氧化，MDA水平增加。因此，MDA水平可以显示细胞质膜过氧化程度和对逆境条件反应的强弱[32]。本研究中，ρ(Cd2+)为0.1 mg·L−1胁迫组中，藻体Chl a、Car和SP在48 h内与对照组均无显著性差异，在该浓度胁迫下藻体的光合色素和SP含量保持稳定，说明藻体的光合作用产能以及蛋白代谢正常运作，而SS、SOD和CAT出现波动，在第48小时结束时与对照组无显著差异，说明在0.1 mg·L−1胁迫组中藻体通过加强糖代谢和增加抗氧化酶含量进行抗逆，并在48 h内适应该胁迫环境，同时MDA水平显著高于对照组，说明在该浓度Cd2+胁迫下藻体出现抗逆现象，以此维持正常的代谢平衡；在ρ(Cd2+)为0.5 mg·L−1胁迫组中，实验结束时光合色素、SS、SP、SOD和CAT含量显著性高于对照组，说明在该浓度胁迫下藻体除了通过加强糖代谢和增加抗氧化酶含量方式进行抗逆外，同时需要加强光合作用，增加能量和加强蛋白代谢进行共同抗逆，其MDA水平与0.1 mg·L−1胁迫组没有显著差异，说明在ρ(Cd2+)为0.5 mg·L−1胁迫下，半叶马尾藻通过增强抗逆系统，藻体依然能保持正常的代谢平衡；而在ρ(Cd2+)为2.5 mg·L−1的胁迫组中，光合色素含量持续增加，抗逆反应依然需要大量的能量消耗，SS含量在24 h后出现大幅增加，SP则在第24小时上升至最高，48 h后出现下降，但依然显著高于对照组，该浓度下48 h后SS含量最高说明藻体内糖代谢旺盛有利于对Cd2+的吸附，同时SOD和CAT活性以及MDA含量在第48小时时远高于对照组抗氧化酶系统平衡失常，产生大量活性氧，该浓度的Cd2+胁迫已对藻体的正常代谢造成了破坏，但尚未达到破坏MDA水平的程度，还处于藻膜脂质过氧化加剧状态；在ρ(Cd2+)为12.5 mg·L−1的胁迫组中，光合色素、SS、SP和抗氧化酶以及MDA含量均低于2.5 mg·L−1胁迫组，说明藻体不能继续加强光合作用产能维持抗逆，同时也无法继续利用糖代谢和蛋白代谢进一步吸附重金属镉，抗氧化酶系统已经受到破坏，所以继续增加Cd2+并不会使藻体产生更强的抗逆性。
综上，轻度的Cd2+污染对半叶马尾藻的生理指标无显著影响；中度Cd2+污染下藻体通过加强光合作用、蛋白代谢、糖代谢和抗氧化物系统运作4种方式增强抗逆性，藻体产生较强的耐受性；而重度Cd2+污染下，各项生理指标出现异常增高，藻体内积累大量活性氧，抗氧化酶系统失衡，无法正常代谢；最大耐受条件下，藻体各项生理指标相较于重度污染降低，活性氧大量累积，抗氧化酶系统受到破坏。因此，半叶马尾藻对Cd2+胁迫具有一定的适应性和耐受性，本研究可为运用半叶马尾藻修复中国东南沿海中度重金属Cd2+ (≤0.5 mg·L−1) 污染海域提供依据。
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图 1 亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中氧化损伤指标的影响
注：数据上标不同字母表示组间差异显著 (P<0.05)；后图同此。
Figure 1. Effects of nitrite and microplastics stress on oxidative damage index in gills of L. vannamei
Note: Different letters on the bar indicate significant differences among the groups (P<0.05). The same case in the following figures.
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图 2 亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中抗氧化酶活性的影响
Figure 2. Effects of nitrite and microplastics stress on antioxidant enzymes activity in gills of L. vannamei
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图 3 亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃组织免疫基因表达的影响
Figure 3. Effects of nitrite and microplastics stress on immune gene expression in gills of L. vannamei
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图 4 亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃组织渗透调节基因表达的影响
Figure 4. Effects of nitrite and microplastics stress on osmotic regulation gene expression in gills of L. vannamei
表 1 本研究所用引物序列
Table 1 Primer sequences used in this study
基因名称
Gene name正向引物 (5'—3')
Forward primer (5'–3')反向引物 (5'—3')
Reverse primer (5'–3')CASP-3 ATTATAGAGTGCCTGCGTTGCTACC TGCGATATCATGCCTAGATGCTTGG CYP450 CGCCGCCAAGGAAGTGAAGG TGGGAGGCGATGGTGGTGTC GST ACGAACACTACGAACAGAAGGATGC GCCAGGAAGTCGATGTAGGTTAGC VATP GCCAAGTATGAGCACCTAGCAGAC TCGTCCACCACCTTACTGAAGAGAG TIP4 GTCTCTCTGAACCCTTGCCAAACTC GTTGCCTATGATTACCTGCGTCCTC CCP CCCTGAGACCTCTGTTTGCTGTG TGGCAGTGTTCTTCGCATGTTCC NHE7 CACCGCCATCCTCACCAAGTTC ACAGAAGAGCACAGCCACAATACC CLC GCCGATAGGAGGTGTGTTGTTCAG CGAAGAAGCCACGCCAGTAGTTC NKA-α TGAAATCGTGTTTGCCCGTACCTC ACCATCACCAGTTACAGCCACAATG NKA-β GAACCCAGCCGACGAAGAATACG CAGCAACAATAGGTGGCAGGTAGC AQP GCAGCCATCTTGAAGGGAGTGAC ACGAGGACGAAGGTGATGAGGAG CA CCTATTCTGGCTCCCTCACTACCC GTTCATCCTCTGGGCAACACTCG β-actin AGCTCATTGTAGAAGGTGTGATGCC TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG 
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