Effects of different crosslinking agents on properties of agar/sodium alginate composite films
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摘要: 琼胶和海藻酸钠是从海藻中提取的亲水性胶体,具有良好的成膜性和生物降解性。为提高琼胶/海藻酸钠复合膜的应用性能,以琼胶、海藻酸钠为成膜基料,甘油为增塑剂,阿魏酸、单宁酸、柠檬酸和丁二酸为交联剂,采用溶液浇筑法制备了琼胶/海藻酸钠复合膜,通过测定复合膜的机械性能、耐水性、阻湿性、不透明度、傅里叶变换红外光谱 (FT-IR) 和微观结构,研究了4种交联剂对复合膜性能的影响。结果表明,4种交联剂均显著提高了复合膜的拉伸强度、耐水性和阻湿性 (P<0.05),但显著降低了膜的透明度 (P<0.05),且当阿魏酸和单宁酸添加量为5%、柠檬酸和丁二酸为10%时,交联剂对复合膜的改善作用最好。4种交联剂中,柠檬酸交联膜的性能最好,当添加量为10%时,其拉伸强度为46.98 MPa,断裂伸长率为17.87%,水溶性为24.17%,溶胀率为38%,水蒸气透过率为0.51 g·mm·(m2·h·kPa)−1。FT-IR分析显示,柠檬酸和丁二酸通过与琼胶和海藻酸钠分子中的羟基 (−OH) 发生酯化反应,改善复合膜的性能,阿魏酸和单宁酸通过与琼胶和海藻酸钠形成分子间氢键实现交联。扫描电镜分析结果表明,琼胶和海藻酸钠的相容性良好,交联剂可使复合膜截面更加致密、光滑。因此,适量添加4种交联剂可不同程度地改善琼胶/海藻酸钠复合膜的理化性能,为包装薄膜的制备及应用提供科学参考。Abstract: Agar and sodium alginate are hydrophilic colloids extracted from algae, with good film-forming and biodegradability. In order to improve the application performance of agar/sodium alginate composite membrane, we used agar and sodium alginate as film-forming base material, glycerol as plasticizer, ferulic acid, tannin acid, citric acid and succinic acid as crosslinking agents to prepare the agar/sodium alginate composite films by solution casting method. Then we studied the effects of four crosslinking agents on the properties of the composite films based on the mechanical properties, water resistance, moisture resistance, opacity, fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and microstructure of the composite films. The results show that the four crosslinking agents improved the tensile strength, water resistance and moisture resistance of the composite films significantly (P<0.05), but reduced the transparency significantly (P<0.05). The crosslinking agents had the best improvement effect on the composite films with additions of ferulic acid and tannin acid of 5%, citric acid and succinic acid of 10%. Among the four crosslinking agents, citric acid cross-linked film had the best performance, and when the addition of citric acid was 10%, each index reached the optimal value [The tensile strength was 46.98 MPa; the elongation at break was 17.87%; the water solubility was 24.17%; the swelling ratio was 38%; the water vapor permeability (WVP) was 0.51 g·mm·(m2·h·kPa)−1]. FT-IR analysis shows that citric acid and succinic acid improved the properties of the composite films by esterifying with −OH of agar and sodium alginate, and ferulic acid or tannin acid achieved crosslinking by forming intermolecular hydrogen bonds with agar and sodium alginate. Scanning electron microscopy (SEM) analysis shows that agar and sodium alginate had good compatibility, and the cross section of composite film became denser and smoother with the addition of crosslinking agents. Therefore, moderate addition of crosslinking agent to agar/sodium alginate composite films can improve the physical and chemical properties of composite films at different degrees, which provides scientific references for the preparation and application of packaging films.
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Keywords:
- Agar /
- Sodium alginate /
- Crosslinking agent /
- Edible film
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三角帆蚌 (Hyriopsis cumingii) 是中国南方一种重要的经济淡水蚌类。根据《2024中国渔业统计年鉴》,2023年中国淡水珍珠养殖产量为754 920 kg[1],而三角帆蚌珍珠产量在人工养殖淡水育珠蚌中占据重要地位。此外,三角帆蚌可通过高强度的滤食增加水体透明度,直接或间接地改变浮游植物和沉水植物的群落结构。因此,养殖三角帆蚌具有重要的经济价值和生态意义[2-4]。然而,近年来细菌和病毒感染导致贝类大规模死亡的现象时有发生,给珍珠养殖产业造成重大损失[5]。此外,养殖环境的恶化导致水生动物的发病率不断上升,污染物通过诱导免疫抑制,严重破坏了宿主先天免疫对病原体的防御[6]。因此,在集约化养殖条件下如何有效地防治贝类病害已成为产业发展面临的新一轮挑战。了解贝类先天性免疫机制和抗菌作用将有助于制定贝类病害治理方法,有利于推动贝类健康养殖和珍珠产业的可持续发展。
先天免疫系统是脊椎动物和无脊椎动物抵抗微生物入侵的第一道防线[7]。其中,Toll样受体 (Toll-like receptors, TLR) 作为先天免疫中的关键组分,在识别和应对多种病原体中发挥着至关重要的作用[8]。TLR1通过直接招募并结合髓样分化因子88 (Myeloid differentiation factor 88, MyD88) 蛋白,引发自身活化并募集下游信号转导相关蛋白白细胞介素-1受体相关激酶 (Interleukin-1 receptor-associated kinases, IRAKs),活化的IRAKs驱动自体磷酸化并募集肿瘤坏死因子受体相关因子6 (Tumour-necrosis factor receptor-associated factor 6, TRAF6)[9-11],TRAF6进而激活转化生长因子-β激活激酶1 (Transforming growth factor-β-activated kinase 1, TAK1),TAK1进一步刺激IkB激酶 (Inhibitor of kappa B kinase, IKK) 介导的核因子κB (Nuclear factor kappa-B, NF-κB) 和丝裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinase, MAPK) 介导的激活蛋白1 (Activating protein-1, AP-1) 的转录反应,从而诱导炎性细胞因子的活化和表达[12-13]。目前已在三角帆蚌中鉴定了11个TLRs。在病原菌刺激下,三角帆蚌肝胰腺中Toll1基因的表达量升高,且过表达可以激活S2细胞中的Toll信号通路,从而上调抗真菌肽 (Drosomycin, DRS) 的表达[14]。然而并无研究证明在受到病原菌刺激时,TLR1是否直接激活MyD88信号通路,并调节下游相关免疫基因发挥抗菌应答作用。HcToll2参与诱导抗真菌肽表达以进行抗菌免疫[15];HcToll3介导调节乳清酸蛋白 (Whey acidic protein, WAP) 和溶菌酶 (Lysozyme, Lys) 的表达,参与了三角帆蚌对弧菌的防御[16];HcToll4和HcToll5则能够识别金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus)、副溶血弧菌 (Vibrio parahemolyticus)、白斑综合征病毒 (White Spot Syndrome Virus) 和聚肌胞苷酸 (Polyinosinic acid-polycytidylic acid, poly I:C),并参与调节三角帆蚌抗菌肽 (Theromacin, Ther) 和乳清酸蛋白的表达[17];此外,HcToll6和HcToll7介导鳃中溶菌酶和防御素 (Defensins, Def) 的表达,参与了副溶血弧菌刺激后机体的抗菌应答过程[18];HcTLRn[19]、HcToll9和HcToll10可通过NF-κB信号通路参与三角帆蚌的抗菌免疫应答[20]。由此可见,在三角帆蚌体内存在多种不同功能的TLRs,它们在对抗不同病原微生物感染中发挥着重要作用。
为探讨三角帆蚌HcTLR1基因在先天性免疫中的作用机制,本研究从感染维氏气单胞菌 (Aeromonas veronii)的三角帆蚌肝胰腺转录组数据库[21]中筛选并克隆了三角帆蚌HcTLR1基因的全长cDNA。采用实时荧光定量分析技术和dsRNA干扰技术研究了HcTLR1基因在不同组织中的表达情况,以及HcTLR1-MyD88信号通路对不同免疫刺激物和维氏气单胞菌的免疫响应情况。为进一步了解TLRs在软体动物先天免疫防御和抗菌应答中的作用奠定了基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
选用2龄三角帆蚌250只,体质量约为 (75±10) g。实验前,将蚌置于含过滤淡水和空气泵的15 L水循环系统中养殖1周左右,养殖水温 (23.0±1.0) ℃。每天喂食1次小球藻液 (5.6×105 个·mL−1)。暂养期间剔除不健康个体,选取健康个体用于后续实验。
1.2 HcTLR1基因克隆
从构建的三角帆蚌肝胰腺转录组文库中,筛选出TLR1基因片段 (数据未发表)[22]。使用SMARTer® RACE 5'/3' Kit试剂盒 (TaKaRa,日本),结合特异性和通用引物 (表1),以肝胰腺为模板,进行cDNA末端快速克隆 (RACE),扩增两端序列。PCR反应体系为:12 μL LA taq (TaKaRa,日本),1 μL 特异性引物 (Gene specific primer, GSP, 10 μmol·L−1),1 μL 通用引物 (Universal primer, UPM, 10 μmol·L−1),3 μL cDNA,8 μL ddH2O。PCR扩增程序为:98 ℃ 10 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,30个循环。将回收的PCR扩增产物连接到pMD19T质粒 (TaKaRa,日本) 载体中,并转化至大肠杆菌感受态DH5α细胞 (擎科生物,中国) 中进行菌液PCR和测序。最后,通过拼接HcTLR1的两端序列,获得基因全长序列。
表 1 引物序列Table 1 Sequences of primers引物名称
Primer name引物序列 (5'—3')
Primers sequence (5'−3')用途
Application来源
SourceHcTLR1-3'race-F TGCCATGCTGTACAGACTTGCTACCGAA 基因克隆 本研究 HcTLR1-5'race-R CGTGCACTTCTCGGGACATCTGTGT 本研究 UPM Long CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 本研究 UPM Short CTAATACGACTCACTATAGGGC 本研究 TLR1-iF+T7 TAATACGACTCACTATAGGGTAAAGTTCGGATGGCGAATC RNA干扰 本研究 TLR1-iR TTTTCCCAAAACCAAGCATC 本研究 GFP-iF+T7 TAATACGACTCACTATAGGGAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG 本研究 GFP-iR CAGCAGGACCATGTGATCGCGC 本研究 HcTLR1-qPCR-F TGCCATGCTGTACAGACTTGCT qPCR 本研究 HcTLR1-qPCR-R CGTGCACTTCTCGGGACATCTGT 本研究 MyD88-qPCR-F GAACGCCACCCTTGGGAAAC 本研究 MyD88-qPCR-R TCCACGACAGCACCCTCAAG 本研究 TRAF6-qPCR-F CGCAGTGTGGTCATCGCTTC 本研究 TRAF6-qPCR-R TGGCACACGAGTTAGGGCAT 本研究 IRAK4-qPCR-F TCGCAAGTGGTACAGGCCAT 本研究 IRAK4-qPCR-R TGACGTGCCAATTACGAGCG 本研究 WAP-qPCR-F TGTAATGTTGACGGGAGTG [22] WAP-qPCR-R CTGTTTTGTTTTGATGGCT LBP/BPI1-qPCR-F TGGAGAACAGAGTCAGAAAGA [23] LBP/BPI1-qPCR-R CGATAGTCAAGCAGGAAATG LBP/BPI2-qPCR-F TATCAGTGTCAGCGGTAGTG [23] LBP/BPI2-qPCR-R CATCAGCGTAAAGAGGGA p65-qPCR-F TGGCAAGGACTGTAAGAAAGG [23] p65-qPCR-R CTTGTGCTTAAATCCAGTCTGA P105-qPCR-F TGTTGTATCCACTCCCATCT [23] P105-qPCR-R TCTTGCTCAACGAACTTCAC Lys-qPCR-F CACAGTTGGTGGTTCAGTAA 本研究 Lys-qPCR-R CGAATCCTTCAGTAGATGGT 本研究 IL17-qPCR-F CCATCCACGATCCTCAACG 本研究 IL17-qPCR-R CGCAAGTGTATCCAACAGCAA 本研究 Def-qPCR-F GGTGTCGTCTATCTTGCTTC [19] Def-qPCR-R AGGTTATTTGGTCATCTATTTTG Ther-qPCR-F CACAGTTGGTGGTTCAGTAA [18] Ther-qPCR-R CGAATCCTTCAGTAGATGGT EF1α-qPCR-F GGAACTTCCCAGGCAGACTGTGC [3] EF1α-qPCR-R TCAAAACGGGCCGCAGAGAAT 注:下划线部分引物序列为T7启动子序列。 Note: The underlined primer sequence is T7 promoter sequence. 1.3 生物信息学分析
使用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中ORF Finder对基因序列开放阅读框 (Open reading frame, ORF) 与编码氨基酸序列进行预测;用Smart Blast对氨基酸序列进行同源性分析;通过Simple Modular Architecture Research Tool SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) 预测氨基酸所包含的结构域;利用Protparam (http://www.expasy.org/tools/protparam.html) 线上工具获取氨基酸序列组成、分子质量大小、等电点等物理参数信息;利用MEGA 11的邻接法 (Neighbor-Joining, NJ) 构建系统进化树,Bootstrap分析其可靠性,重复1 000次。
1.4 HcTLR1基因的组织表达
分别取三角帆蚌的肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜、鳃、性腺、血细胞、肾脏和肠组织,并采用心脏取血的方式收集血淋巴,1 000×g离心5 min,收集血细胞。共9只蚌,每3只的组织混合作为1个样品,根据RNAiso plus提取试剂盒 (TaKaRa,日本) 说明书提取组织RNA。参照Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (Yeasen,中国) 说明书合成cDNA。以EF-1α基因为内参,以不同组织的cDNA为模板,结合特定的荧光定量引物 (表1),通过BIORAD CFX ConnectTM荧光定量仪 (Bio-Rad Laboratories,美国),检测了2龄三角帆蚌不同组织中HcTLR1基因的相对表达量。反应体系为:10 μL SYBR Green Mix (Yeasen,中国)、0.4 μL q-F (10 μmol·L−1)、0.4 μL q-R (10 μmol·L−1)、2 μL cDNA和7.2 μL ddH2O。反应程序为:95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 10 s,39个循环。使用2−ΔΔCt法计算基因的相对表达量,每组3个重复,计算平均值。
1.5 免疫刺激
脂多糖 (Lipopolysaccharides, LPS)、肽聚糖 (Peptidoglycan, PGN) 和poly I:C 3种刺激物代表不同的病原体相关分子模式 (Pathogen-associated molecular pattern, PAMP),均购自麦克林公司;维氏气单胞菌GL1由本实验室前期从患病三角帆蚌中分离[23]。将健康三角帆蚌随机分为5组,其中4组向闭壳肌中分别注射200 μL维氏气单胞菌GL1 (107 CFU·mL−1)、LPS、PGN和poly I:C (0.5 mg·mL−1,溶于pH 7.4的PBS),另一组注射相同体积的磷酸盐缓冲溶液 (PBS, pH 7.4) 作为阴性对照。未经处理的三角帆蚌作为空白对照组。在注射后的第6、第12、第24、第48小时,分别收集9只三角帆蚌的血细胞、肝胰腺和鳃组织。每3只蚌的组织混合作为1个样品,用于RNA提取。
1.6 血细胞内RNA干扰实验
使用Primer 5.0软件设计1对含有T7启动子的基因特异性引物:TLR1-iF+T7、TLR1-iR (表1)。以血细胞cDNA为模板,采用rTaq DNA聚合酶 (TaKaRa,日本) 进行特异性DNA片段的扩增。同时,绿色荧光蛋白 (Green fluorescent protein, GFP) 片段用于阴性对照dsRNA的合成。根据T7 High Yield RNA Transcription Kit (Beyotime Biotechnology,中国) 试剂盒操作,合成并纯化相应的dsRNA。
挑选健康的三角帆蚌个体暂养后收集血细胞。血细胞培养于含10% (φ) FBS (Gibico,美国)、2% (φ) 青链霉素 (Beyotime Biotechnology,中国) 的DMEM培养基 (Gibico,美国) 中,培养条件为27 ℃、5% (φ) CO2,并定期观察细胞状态。按照每毫升106个细胞的密度,向细胞中同时加入40 μg的dsRNA及灭活后的维氏气单胞菌GL1。每个时间点的不同处理组各设置3个重复。将上述处理的细胞置于27 ℃、5% (φ) CO2培养箱中静置培养。在培养后的第6、第12和第24小时,分别收集不同处理组的血细胞,以便进行后续的RNA提取和qPCR分析。
1.7 数据分析
所有数据均以“平均值±标准差 ($ \overline x \pm s $)”表示。采用SPSS 26.0软件进行单因素方差 (One-Way ANOVA) 分析及Tukey氏多重检验,显著性水平α为0.05 (n=3)。
2. 结果
2.1 三角帆蚌HcTLR1基因的克隆与序列分析
通过测序、拼接获得HcTLR1基因全长序列 (GenBank登录号:PP051478) 3 969 bp,包含45 bp的5'非翻译区 (Untranslated region, UTR)、237 bp的3'UTR和3 687 bp的ORF,共编码1 228个氨基酸 (图1),预测分子质量为139 kD,理论等电点为5.54。SMART结构域分析预测HcTLR1蛋白包含14个LRR结构域、3个LRR亚家族结构域、2个C端LRR结构域、1个LRR-NT结构域、1个跨膜结构域和1个胞内TIR结构域 (图2)。
图 1 HcTLR1核苷酸序列和预测的氨基酸序列注:红色碱基代表起始密码子 (ATG) 和终止密码子 (TAA);富含亮氨酸的重复序列 (LRR) 结构域用下划线标出;富含亮氨酸的重复序列典型的亚家族 (LRR TYP) 用双下划线标出;富含亮氨酸重复C-末端结构域 (LRR CT) 用波浪线标出;富含亮氨酸重复N-末端结构域 (LRR NT) 用虚线标出;跨膜结构域 (TM) 用灰色标出;白细胞介素-1受体 (TIR) 结构域用蓝色标出。Fig. 1 Nucleotide sequences and predicted amino acid sequences of HcTLR1Note: Red bases represent the initiation codon (ATG) and stop codon (TAA); the Leucine-rich repeats (LRR) domains were underlined; the Leucine-rich repeats typical subfamily (LRR TYP) was double underlined; the Leucine rich repeat C-terminal domain (LRR CT) was marked with wavy lines; the Leucine rich repeat N-terminal domain (LRR NT) was marked with dotted line; the transmembrane domain (TM) was marked with gray and the Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain was marked with blue.将三角帆蚌HcTLR1蛋白的功能结构域序列与其他物种功能结构域序列进行多重序列比对,发现不同物种 (包括脊椎动物和无脊椎动物) 的TIR结构域序列具有较高的同源性 (图3)。基于三角帆蚌氨基酸全长序列的系统进化树分析显示,HcTLR1与三角帆蚌Toll 1及栉孔扇贝 (Azumapecten farreri) Toll、长牡蛎 (Crassostrea gigas) TLR1聚为一支,其中与三角帆蚌Toll 1的亲缘关系最近 (图4)。
图 3 三角帆蚌与其他物种TIR结构域的氨基酸多序列比对注:黑色阴影表示氨基酸相同,其他阴影表示氨基酸部分相同;用于多重序列比对的其他物种的氨基酸序列分别是智人 (CAG38593.1),小鼠 (AAG35062.1),大鼠 (XP_038947854.1),原鸡 (BAD67422.1),斑马鱼 (NP_001124065.1),三角帆蚌 (Toll 2: AIA66467.1, Toll 4: AVR52705.1, Toll 5: AVR52704.1, Toll 6: QCR63936.1, Toll 7: QCR63937.1),紫贻贝 (AFU48614.1),虾夷扇贝 (XP_021346851.1),海湾扇贝 (AVP74315.1),巨海扇蛤 (XP_033755286.1)。Fig. 3 Multiple sequence alignment of TIR domain between H. cumingii and other speciesNote: Black shading represents amino acid identity, and other shading represents partial amino acid identity. The amino acid sequences used for multiple alignment include Homo sapians (CAG38593.1), Mus musculus (AAG35062.1), Rattus norvegicus (XP_038947854.1), Gallus gallus (BAD67422.1), Danio rerio (NP_001124065.1), Hyriopsis cumingii (Toll 2: AIA66467.1, Toll 4: AVR52705.1, Toll 5: AVR52704.1, Toll 6: QCR63936.1, Toll 7: QCR63937.1), Mytilus galloprovincialis (AFU48614.1), Mizuhopecten yessoensis (XP_021346851.1), Argopecten irradians (AVP74315.1) and Pecten maximus (XP_033755286.1).2.2 HcTLR1基因组织特异性表达分析
实时荧光定量PCR结果显示,HcTLR1基因在所有检测的组织中均有表达,且表达程度各异 (图5)。其中,血细胞中HcTLR1的表达量最高,并显著高于其他组织 (p<0.05)。其在血细胞中的表达量分别为肝胰腺的13.67倍、斧足的23.27倍、闭壳肌的19.06倍、外套膜的7.1倍、鳃的11.45倍、性腺的18.63倍、肾脏的2.5倍和肠的2.07倍。
图 5 HcTLR1 mRNA在三角帆蚌组织中的相对表达量注:1. 肝胰腺;2. 斧足;3. 闭壳肌;4. 外套膜;5. 鳃;6. 性腺;7. 血细胞;8. 肾脏;9. 肠;所标字母不同表示差异显著 (p<0.05)。Fig. 5 Relative mRNA expression of HcTLR1 in different tissues from H. cumingiiNote: 1. Hepatopancreas; 2. Foot; 3. Adductor; 4. Mantle; 5. Gill; 6. Gonad; 7. Hemocyte; 8. Kidney; 9. Intestine. Different letters represent significant differences (p<0.05).2.3 免疫刺激后不同组织中HcTLR1的表达
在2 龄三角帆蚌受到维氏气单胞菌和不同PAMPs刺激后,采用qPCR技术检测了不同时间点三角帆蚌各组织中HcTLR1基因的相对表达量。结果显示,在鳃组织中,经维氏气单胞菌GL1和poly I:C刺激后,HcTLR1基因表达量呈先上升后下降的趋势。刺激后第12 和第24小时,其表达量显著增加 (p<0.05),分别为PBS组的5.2和4.5倍。而LPS、PNG刺激后,其表达量呈下降趋势,但在刺激后第6小时,与PBS组相比,其表达量显著增加 (p<0.05),分别为4.2和5.4倍 (图6-a)。在肝胰腺中,经维氏气单胞菌GL1、LPS、PNG、poly I:C刺激后,HcTLR1基因的表达量也呈先上升后下降的趋势,且在刺激后第24小时表达量显著上调 (p<0.05),分别为PBS组的14、5.8、8和4.9倍 (图6-b)。在血细胞中,维氏气单胞菌GL1刺激后第6、第12和第24小时,HcTLR1基因的表达量显著上调 (p<0.05),分别为PBS组的2.1、2和2.4倍 (图6-c)。然而,在LPS、PNG、poly I:C刺激后,其表达量先下降后上升,但无显著性差异 (p>0.05)。由此可见,当三角帆蚌经过维氏气单胞菌GL1、LPS、PNG和poly I:C刺激后,HcTLR1基因在不同组织和时间点的表达水平存在显著差异。
图 6 免疫刺激后三角帆蚌鳃 (a)、肝胰腺 (b) 和血细胞 (c) 中HcTLR1 mRNA在不同时间点的相对表达量注:同一处理时间下不同字母表示差异显著 (p<0.05),相同字母表示差异不显著 (p>0.05)。Fig. 6 Relative mRNA expression of HcTLR1 after immune challenges in gill (a), hepatopancreas (b) and hemocyte (c) of H. cumingii at different time pointNote: Different letters at the same treatment time represent significant differences (p<0.05), while the same letters represent insignificant differences (p>0.05).2.4 HcTLR1基因干扰后MyD88依懒性通路及免疫相关基因的表达
为了探究三角帆蚌HcTLR1基因对TLR信号通路的激活作用,采用dsRNA干扰方法来抑制血细胞中HcTLR1基因的表达。通过qPCR检测HcTLR1及其介导的MyD88依赖性信号通路中多个关键基因的表达变化,包括MyD88、IRAK4、TRAF6、核因子-κB/Rel转录因子p65 (NF-κB/RELA p65, p65)、核因子-κB/Rel 蛋白1 p105 (NF-κB/RELA 1 p105, p105) 和下游免疫相关基因Ther、Lys、Def、Wap、脂多糖结合蛋白/杀菌通透性增加蛋白 (LPS binding protein/bactericidal permeability increasing protein, LBP/BPI) 1、2和白细胞介素17 (Interleukin-17, IL-17)。结果显示,与未处理组和阴性对照dsGFP组相比,dsTLR1组在干扰后的第6、第12和第24小时,HcTLR1 基因的表达量显著下降,干扰效果显著 (p<0.05,图7-a)。在此基础上,进一步在干扰后使用维氏气单胞菌GL1刺激血细胞发现,dsTLR1组的HcTLR1基因表达量在第6、第12和第24小时均显著降低 (p<0.05,图7-b)。此外,与未处理组相比,维氏气单胞菌GL1刺激血细胞12 h后检测发现,dsTLR1组中MyD88依赖性通路相关基因MyD88、IRAK4、TRAF6、p65和p105的表达量分别下降87.8%、97.7%、94.6%、93%和96.3% (p<0.05,图8-a—e)。同时,通路下游抗菌免疫相关基因Ther、Def、Lys、WAP、LBP/BPI 2和IL-17的表达量分别下降97.4%、98.3%、99.7%、91.7%、91.2%和94.4% (p<0.05,图8-f—i,8-k—l)。然而,LBP/BPI 1基因的表达量与对照组相比无显著性差异 (p>0.05,图8-j)。上述结果表明,HcTLR1基因参与三角帆蚌TLR1-MyD88-NF-κB信号通路的激活,并通过激活下游免疫相关基因发挥抗菌应答作用。
图 7 HcTLR1干扰及免疫刺激后血细胞中HcTLR1 mRNA的相对表达量注:a. dsRNA干扰后血细胞中HcTLR1 mRNA的表达水平;b. dsRNA干扰后并经维氏气单胞菌GL1刺激血细胞中HcTLR1 mRNA的表达水平。同一处理时间下不同字母表示差异显著 (p<0.05),相同字母表示差异不显著 (p>0.05)。Fig. 7 mRNA expression levels in hemocytes of H. cumingii after HcTLR1 interference and immune challengesNote: a. HcTLR1 mRNA expression levels in hemocytes after dsRNA interference; b. HcTLR1 mRNA expression levels in hemocytes after dsRNA interference in A. veronii GL1 stimulation. Different letters at the same treatment time represent significant differences (p<0.05), while the same letters represent insignificant differences (p>0.05).图 8 HcTLR1 基因干扰及免疫刺激后血细胞中TLR1-MyD88-NF-κB信号通路及下游抗菌相关基因的相对表达量注:不同字母表示差异显著 (p<0.05),相同字母表示差异不显著 (p>0.05)。Fig. 8 Relative expression of TLR1-MyD88-NF-κB signaling pathway and downstream antimicrobial-associated gene in hemocytes after HcTLR1 gene interference and immune challengesNote: Different letters represent significant differences (p<0.05), while the same letters represent insignificant differences (p>0.05).3. 讨论
本研究克隆了三角帆蚌HcTLR1基因的cDNA序列,编码一个长为3 687 bp的ORF。蛋白质结构预测分析显示,HcTLR1蛋白中含有多个LRR结构域、1个跨膜结构域和1个胞内Toll/白细胞介素-1受体 (TIR),表现出典型的Toll样受体结构。其中,Toll样受体胞外结构域由LRR组成,每个LRR被疏水性的氨基酸间隔开,在识别多种病原体相关的分子模式中发挥重要作用[24-25];而胞内结构域由TIR构成,具有3个保守的氨基酸序列框,负责C端信号传导,并能与含有TIR结构域的接头蛋白MyD88发生相互作用以激活下游信号通路[26-28]。这表明HcTLR1能够识别多种病原体相关分子模式并启动天然免疫反应,参与三角帆蚌的抗菌应答过程。在维氏气单胞菌GL1、LPS、PNG和poly I:C刺激下,三角帆蚌鳃、肝胰腺和血细胞中HcTLR1基因的表达量在不同时间点呈现显著性差异。同时,不同刺激诱导下,免疫持续时效也存在差异。这一发现与已报道的贝类研究结果相符。例如,在副溶血弧菌刺激后,香港牡蛎 (C. hongkongensis) 鳃和血细胞中TLR4基因表达量显著性升高[29];在溶藻弧菌 (V. alginolyticus)、LPS、PGN和poly I:C刺激后,合浦珠母贝 (Pinctada fucata) 肝胰腺中PfTLR3和PfTLR13基因的表达量在不同时间点出现显著性差异[30-31];在LPS、PGN和poly I:C刺激后,三角帆蚌肝胰腺和鳃中TLRn基因的表达水平在不同时间点均显著性升高[20]。以上研究结果均证实了贝类TLRs在应对病原体和PAMPs的刺激时扮演着重要的免疫识别作用[32]。因此,推测HcTLR1分子具有广泛的识别谱,能够识别多种病原体及不同类型的PAMPs,并可能引起一系列级联反应,参与生物体防御功能。
三角帆蚌各组织HcTLR1基因定量结果显示,其在肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜、鳃、性腺、血细胞、肾脏和肠等9种组织中均有不同程度的表达,特别是在血细胞中的表达量显著高于其他组织。而在贝类抵御外来病原微生物的过程中,血细胞起到了至关重要的作用,既是细胞免疫的主体,又是体液免疫的提供者[33]。已有研究发现,长牡蛎的TLR2和TLR3基因[34-35]及厚壳贻贝 (Mytilus coruscus) 的TLR-like1基因[36]均在血细胞中高表达,并在贝类的免疫应答中发挥关键作用。这与本研究的结果相似,提示HcTLR1在三角帆蚌抗菌应答中同样扮演着重要角色。
鉴于血细胞在贝类免疫系统中的中心地位[37-38],本研究在血细胞内进行RNA干扰实验。结果显示,HcTLR1的干扰导致多个基因 (如MyD88、IRAK4、TRAF6、p65、p105等) 的表达量明显下调,同时下游抗菌免疫基因 (如Ther、Lys、Def、WAP、LBP/BPI 2和IL-17) 的表达量也显著降低。这一结果与厚壳贻贝中干扰McTLRw导致McMyD88、McIRAK4和McTRAF6基因的表达受到显著抑制[39],青蛤 (Cyclina sinensis) 中干扰CsTLR13导致CsMyD88、CsIRAK4、CsTRAF6、CsIKKa、CsIkB、CsNF-kB、CsC-LYZ和CsAMP基因[40]表达显著下调,以及三角帆蚌中干扰HcTLRn导致NF-κB (p65、p105) 及Lys、Ther、WAP、LBP/BPI 1和LBP/BPI 2的表达显著下降[20]等研究结果相一致,这提示HcTLR1可能参与TLR信号通路的激活,且TLR1-MyD88-NF-κB信号通路在三角帆蚌先天免疫应答中起重要作用。Toll信号通路是宿主抗菌应答重要的信号转导通路之一[17],TLR1属于跨膜蛋白,位于信号通路最上游,当受到病原体刺激时,其胞内TIR结构域与包含TIR结构域的接头蛋白MyD88直接相互作用,并经过刺激将IRAK4吸引到TLRs,进而活化IKK复合体、MAPKs和NF-κB等级联反应,最终调节免疫相关基因的表达以发挥多种生物学功能[41]。因此,在三角帆蚌血细胞中,干扰HcTLR1 基因从而导致MyD88依赖性信号通路基因的表达受到抑制,表明HcTLR1可能通过激活MyD88-NF-κB依赖性信号通路来调节下游免疫相关基因的表达,从而发挥抗菌应答作用,但下游MAPK信号通路是否参与三角帆蚌的抗菌应答仍未可知。本研究结果对于深入了解Toll信号通路及HcTLR1在生物体内的抗菌应答机制具有积极意义。
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图 1 不同交联剂对复合膜拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过率水溶性和溶胀率的影响
注:图1-d和1-e中同种交联剂不同小写字母间存在显著性差异 (P<0.05)。
Figure 1. Effects of different crosslinking agents on tensile strength, elongation at break, water vapor permeability, water solubility, and swelling ratio of composite films
Note: For the same crosslinking agent, different letters indicate significant differences (P<0.05).
表 1 不同交联剂对复合膜不透明度的影响
Table 1 Effect of different crosslinking agents on opacity of composite films
交联剂添加量Crosslinking agent
addition/%复合膜不透明度Opacity of composite films 阿魏酸FA 单宁酸TA 柠檬酸CA 丁二酸SA 0 1.18±0.01f 1.18±0.01f 1.18±0.01d 1.18±0.01e 3 1.22±0.01e 1.84±0.02e 1.20±0.02d 1.20±0.01de 5 1.30±0.02d 2.64±0.03d 1.27±0.03c 1.23±0.01cd 7 1.39±0.01c 2.93±0.06c 1.31±0.02b 1.24±0.02bc 10 1.46±0.01b 3.14±0.02b 1.34±0.02b 1.27±0.03ab 15 1.59±0.01a 3.65±0.10a 1.41±0.03a 1.29±0.01a 注:同列不同字母表示差异显著 (P<0.05)。 Note: Different letters within the same column indicate significant differences (P<0.05). -
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