Effects of nanometer selenium on immune protection and antioxidant ability of Eriocheir sinensis under hypoxia stress
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摘要: 低氧胁迫会减弱中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 的免疫机能和抗氧化能力。为揭示纳米硒 (nano-Se) 对低氧胁迫下中华绒螯蟹的免疫保护作用及抗氧化调控机制，在基础饲料中添加不同水平 (0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 mg·kg−1) 的纳米硒饲喂中华绒螯蟹90 d。饲喂实验结束后，进行低氧胁迫实验并注射嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)。结果表明：1) 低氧胁迫24 h和低氧胁迫下感染嗜水气单胞菌24 h的蟹死亡率分别可达62.45%和100%，低氧胁迫12 h使血淋巴中血蓝蛋白浓度、血细胞数量、组织中超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性显著升高 (P<0.05)，胁迫至第24小时有下降趋势；乳酸 (LD) 和丙二醛 (MDA) 浓度在低氧胁迫12~24 h持续上升。2) 饲料中添加适量 (0.1~0.4 mg·kg−1) 纳米硒可显著降低低氧胁迫下蟹死亡率和低氧胁迫下嗜水气单胞菌的致死率 (P<0.05)，显著提高低氧胁迫下血蓝蛋白浓度和血细胞数量以及抗氧化酶 (SOD、CAT、GSH-Px) 活性，降低LD和MDA浓度 (P<0.05)；添加0.8~1.6 mg·kg−1纳米硒加剧了低氧胁迫损伤。结果表明饲料中添加适量纳米硒可改善低氧胁迫下中华绒螯蟹的免疫功能和抗氧化能力，且添加水平以0.2 mg·kg−1为宜。Abstract: Hypoxia stress will weaken the immune function and antioxidant capacity of Eriocheir sinensis. In order to reveal the immune protection and anti-oxidation regulation mechanism of nanometer selenium (nano-Se) on E. sinensis under hypoxia stress, we had fed E. sinensis with different doses of nano-Se (0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 and 1.6 mg·kg−1) in basic diets for 90 d. After the feeding, we conducted a hypoxia stress test and injected Aeromonas hydrophila under hypoxia stress. The results show that: 1) The mortality of E. sinensis under hypoxia stress for 24 h and that infected with A. hydrophila under hypoxia stress reached 62.45% and 100%, respectively. The levels of hemocyanin and the hemocyte count in crab hemolymph, and the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GSH-Px) in crab tissues increased significantly under hypoxia stress for 12 h (P<0.05), as well as there was a decreasing trend under stress to 24 h. The contents of lactic acid (LD) and malondialdehyde (MDA) continued to rise from 12 to 24 h under hypoxia stress. 2) Appropriate addition amount (0.1−0.4 mg·kg−1) of nano-Se reduced the mortality of E. sinensis significantly and the lethality of A. hydrophila under hypoxia stress (P<0.05), increasing the levels of hemocyanin, the hemocyte count and the activities of antioxidant enzymes (SOD, CAT, GSH-Px) under hypoxia stress significantly, but decreasing the contents of LD and MDA (P<0.05). The addition of 0.8−1.6 mg·kg−1 nano-Se had aggravated hypoxia stress injury. These results indicate that appropriate addition of nano-Se to the diets can improve the decrease of immune response and antioxidant ability of E. sinensis under hypoxia stress, and the optimal dose of nano-Se in basal diets is 0.2 mg·kg−1.
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Keywords:
- Eriocheir sinensis /
- Nanometer selenium /
- Hypoxia stress /
- Immunity /
- Antioxidant
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壳聚糖是由甲壳素经过部分脱乙酰作用得到的具有独特功能特性的天然阳离子聚合物，由D-氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成[1]。作为自然界中唯一的碱性阳离子多糖，壳聚糖具有很好的吸附性和黏性，可以应用于食品、材料等领域，但由于其相对分子量较大，不易溶于水，只能溶于某些酸性溶液中，限制了壳聚糖的有效利用[2]。壳寡糖是壳聚糖进一步水解产生的聚合度介于2~20的低分子氨基寡糖[3]，由于其链长较短和游离的氨基而易溶于水。壳寡糖具有多种生物活性，如抗氧化[4-5]、抗肿瘤[6-7]和抗菌[8-9]等，广泛应用于食品、农业和生物医药等领域[4,10-12]。壳寡糖可通过化学法、物理法和酶法制备获得[13]。与高污染的化学法和高成本的物理法相比，通过酶法制备壳寡糖对环境友好、产率高且产物聚合度可控，已被广泛应用于工业生产[14]。
壳聚糖酶 (EC 3.2.1.132) 是一类特异性水解壳聚糖中的β-1,4糖苷键，形成不同聚合度壳寡糖的水解酶，广泛分布于细菌、真菌、病毒以及植物等生物群中，在降解壳聚糖、制备壳寡糖中发挥着重要作用[15-20]。酶制剂是工业生物技术快速发展的基石，设计高效稳定的酶制剂是工业生物技术时代需要攻克的关键科学问题[21]。但目前开发的壳聚糖酶常常具有稳定性差、效率低、成本高等缺陷，仅依靠天然酶分子势必无法满足工业发展的迫切需求；此外工业生产中的高温、偏酸等环境对壳聚糖酶的稳定性提出了更加严格的要求。因此通过鉴定并改造影响壳聚糖酶稳定性的关键氨基酸位点，获得高效稳定的新型壳聚糖酶对我国壳寡糖工业生产技术的升级具有重要意义。
根据蛋白质中氨基酸序列的相似性，将不同物种来源的壳聚糖酶分成不同的蛋白质家族。目前发现的壳聚糖酶归属于6个糖苷水解酶 (Glycoside hydrolase, GH) 家族，包括GH5、GH7、GH8、GH46、GH75和GH80[16]。其中GH46家族的壳聚糖酶受到的关注最多，已有大量壳聚糖酶在真核或原核系统中实现重组表达，对该家族中壳聚糖酶的基本性质、催化特点及酶解产物分析的研究均有所涉及[2,17-20,22-24]。目前已报道的大多数GH46家族的壳聚糖酶，其最适温度为30~50 ℃，最适pH为5~7[16]。也有少数具有良好的热稳定性或酸碱耐受性等特殊性质，如来自芽孢杆菌 (Bacillus sp.) CK4的壳聚糖酶在80 ℃的半衰期为90 min[25]；来自芽孢杆菌DAU101的壳聚糖酶其最适pH为7.5[26]，说明这些酶中可能存在某些特殊的氨基酸位点使其与大多数已报道的壳聚糖酶不同。本研究选取了来自芽孢杆菌DAU101的壳聚糖酶为模板，以实验室已报道的来源于芽孢杆菌MD-5的壳聚糖酶Csn-BAC[2]为研究对象，综合同源建模和序列比对的方法，选取了可能影响该家族壳聚糖酶酸碱耐受性的氨基酸位点进行鉴定，以期为该家族壳聚糖酶稳定性的改造提供依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株和质粒
感受态细胞大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3) [天根生化科技 (北京) 有限公司]；质粒pET-28a (+) 由本实验室保藏。
1.1.2 主要试剂
引物合成 (青岛派森诺基因生物技术有限公司)；PCR产物纯化及质粒提取试剂盒 [天根生化科技 (北京) 有限公司]；卡那霉素 (Kanamycin, Kan)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG) (Solarbio公司)；标准分子量蛋白Marker、DNA聚合酶KOD-Plus-Neo [东洋纺 (上海) 生物科技有限公司]；T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHІ、HindIII、DpnI (ThermoFisher Scientific公司)；壳聚糖 [脱乙酰度 (Degree of deacetylation, DDA), 95%, Macklin公司]；壳寡糖标准品 (聚合度1~6，青岛博智汇力生物科技有限公司)。
1.1.3 培养基
Luria-Bertani (LB) 培养基：蛋白胨10 g·L−1、酵母提取物5 g·L−1、氯化钠 (NaCl) 10 g·L−1、琼脂粉15 g·L−1 (固体培养基时加入)，121 ℃灭菌20 min。
1.1.4 仪器与设备
低温高速离心机、PCR仪 (Eppendorf公司)；DYY-6C型电泳仪 (北京市六一仪器厂)；JY92-IIN超声波细胞破碎仪 (宁波新芝生物科技公司)；恒温培养箱 (上海喆图科学仪器公司)；Haier生物冰箱 (青岛海尔)；DW-86L386立式超低温保存箱 (青岛海尔特种电器)。
1.2 序列分析
从美国国家生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 下载壳聚糖酶Csn-BAC (GenBank: CP021911.1) 的序列，同时下载GH46家族中已详细报道酶学性质的壳聚糖酶序列，其中包括来源于芽孢杆菌DAU101的壳聚糖酶 (GenBank: ABC66094) 序列，然后使用Clustal X算法对Csn-BAC及所选序列进行多序列比对[27]。并选择蛋白质数据库 (Protein Data Bank, PDB) 中同源性较高的壳聚糖酶为模板，在SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/) 在线网址上进行同源建模，并将输出的模型在PyMOL软件上进行分析。
1.3 定点突变
Csn-BAC作为野生型酶[2]，使用基于聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR)的方法进行定点突变。用于突变的引物序列见表1。经限制性内切酶DpnI酶切后，转化至大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞中，利用LB-Kan平板进行筛选，挑取转化子进行测序以验证突变情况。
表 1 定点突变引物Table 1. Primers for directed evolution引物
Primer name序列 (5'—3')
Sequence (5'—3')P68A上游引物
Fw P68AGCCCGTCACCCAATGCCTCGACATATCCATA P68A下游引物
Rv P68ATATGGATATGTCGAGGCATTGGGTGACGGGC A137G上游引物
Fw A137GCGAAATTCCTTATCATTTCCAAGCGACTTCCAGGCA A137G下游引物
Rv A137GTGCCTGGAAGTCGCTTGGAAATGATAAGGAATTTCG A203M上游引物
Fw A203MTTGGTGACCCGCCCATTTTTTTGTTCGTACGTTTAATCAAGGC A203M下游引物
Rv A203MGCCTTGATTAAACGTACGAACAAAAAAATGGGCGGGTCACCAA H234E上游引物
Fw H234EGTCACGGGTGTCCTCATTTGCCGGATTCATCAGATCG H234E下游引物
Rv H234ECGATCTGATGAATCCGGCAAATGAGGACACCCGTGAC 1.4 蛋白表达及纯化
将重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞后，接种至添加了Kan (50 μg·mL−1) 的LB培养基中，于37 ℃培养箱中培养至光密度 (OD600) 为0.6~0.8，用IPTG (0.1 mmol·L−1) 进行诱导表达，并于30 ℃继续培养15 h。将所得菌液超声破碎后，使用ProteinIso®Ni-NTA Resin色谱柱 (北京全式金生物技术有限公司) 纯化His标签标记的蛋白，并以NPI-200缓冲液 [200 mmol·L−1咪唑、50 mmol·L−1磷酸二氢钠 (NaH2PO4)、300 mmol·L−1NaCl，pH 8] 洗脱目标蛋白，然后在4 ℃下用10 kD截止膜超滤除盐，得到的蛋白质用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 进行分析。蛋白质浓度用Bradford法测定[28]。
1.5 活性测定
以胶体壳聚糖 (10 g·L−1, 95% DDA) 为底物，加适量的酶液和磷酸盐缓冲液 (pH 7)，在37 ℃下反应10 min，于100 ℃水浴10 min终止反应后，用改良的3,5-二硝基水杨酸试剂法 (DNS) [17]测定还原糖的量，并于520 nm处测定吸光值。1个单位的酶活 (U) 定义为每分钟每生成1 μmol的还原糖所需要的酶量。
1.6 酶学性质分析
1.6.1 最适温度和pH
利用pH 7的磷酸盐缓冲溶液，将所得突变体分别在30~70 ℃进行酶促反应，确定酶的最适反应温度。将胶体壳聚糖置于不同pH (3~10) 的缓冲液中，所用缓冲体系分别为：柠檬酸盐缓冲溶液 (pH 3~6)、磷酸盐缓冲溶液 (pH 6~8)、Tri-HCl缓冲溶液 (pH 8~9) 和甘氨酸缓冲溶液 (pH 9~10)，在最适温度下测定突变体酶活，确定pH对其酶活的影响。
1.6.2 温度和pH稳定性
利用pH 7的磷酸盐缓冲溶液，分别在30~70 ℃孵育1 h后，在最适反应温度下测定突变体酶活，确定温度对其稳定性的影响。将胶体壳聚糖置于不同pH (3~10) 的缓冲液中，所用缓冲体系同1.6.1，于室温孵育1 h后，在最适温度下测定突变体酶活，确定pH对其稳定性的影响。
1.7 动力学分析
在标准条件下，用纯化的酶 (100 µL) 和不同浓度的壳聚糖 (500 µL) 在37 ℃下反应5 min，然后加入375 µL DNS溶液终止反应，进行动力学分析。使用Lineweaver-Burk双倒数作图法在底物质量浓度介于1~10 mg·mL−1内测定了包括米氏常数 (Km)、催化常数 (Kcat) 和催化效率(Kcat/Km) 在内的动力学参数。
2. 结果与分析
2.1 Csn-BAC突变位点的选择
由于壳聚糖酶Csn-BAC的蛋白结构尚未解析，因此采用同源建模的方法预测其蛋白结构。基于序列比对的结果，选取了来源于枯草芽孢杆菌 (B. subtilis) MY002的壳聚糖酶CsnMY002 ( PDB ID: 7C6C) [29]为模板 (与Csn-BAC的序列相似性为96.28%)，利用SWISS-MODEL在线网址 (https://swissmodel.expasy.org/) 对Csn-BAC进行同源建模，并在PyMOL软件上进行可视化分析，结果见图1。将从NCBI下载的壳聚糖酶序列与Csn-BAC的序列进行比对，结果见图1-c。结合模拟的结构与序列比对，最终选取了4个点 (其中P68和H234靠近底物结合口袋，A137和A203则远离结合口袋，位于表面)，并按照来自芽孢杆菌DAU101壳聚糖酶的序列进行了定点突变 [V1 (P68A)、V2 (A137G)、V3 (A203M)和V4 (H234E)]。
2.2 突变体表达及纯化
对突变体进行诱导表达，菌液离心后取上清液为粗酶液。将粗酶液利用镍离子亲和层析进行纯化，在NPI-200溶液中将目标产物洗脱下来，并进行SDS-PAGE分析，结果见图2。在35 kD附近有与野生型Csn-BAC大小相符的单一蛋白条带，证明突变体成功表达，经超滤浓缩后，可进行后续分析和研究。
2.3 突变体酶活测定
突变体比酶活测定结果见图3。在37 ℃、pH 7条件下，Csn-BAC及其突变体V1、V2、V3和V4的比酶活分别为258.32、241.08、270.44、291.22和291.65 U·mg−1。各突变体的水解活性与野生型Csn-BAC相比无较大差异。其中突变体V3、V4的活性为Csn-BAC的113%左右。突变体的比酶活高于来自曲霉 (Aspergillus sp.) W-2菌株的壳聚糖酶CsnW2 (34 U·mg−1)[30]、树状拟芽孢杆菌 (Paenibacillus dendritiformis) 的壳聚糖酶Csn-PD (76.4 U·mg−1)[16] 和丁核弧菌 (Butyribrio sp.) MC2013的壳聚糖酶BUT (146 U·mg−1)[31]，与根际细菌 (Gynuella sunshinyii) 中的壳聚糖酶GsCsn46A相似 (260.39 U·mg−1)[32]，低于枯草芽孢杆菌 (B. subtilis) CH2菌株在毕赤酵母系统中表达的壳聚糖酶 (338.08 U·mg−1)[33]、肾杆菌属 (Renibacterium sp.) QD1壳聚糖酶Csn-A (1 575 U·mg−1) [34]和解淀粉芽孢杆菌 (B. amyloliquefaciens) ECU08的壳聚糖酶BaCsn46A (1 031.2 U·mg−1)[35]。
2.4 突变体酶学性质
2.4.1 最适温度
突变体的最适温度见图4-a。突变体V1和V2的最适温度与Csn-BAC相同，均在40 ℃时表现出最大活性，而V3、V4则升高至50 ℃。此外，Csn-BAC在70 ℃时已失活，而突变体在70 ℃时相对酶活仍有初始酶活的20%左右。与微生物的生长相适应，大多数壳聚糖酶都是嗜温酶，其最适温度通常介于30~60 ℃。但仍有部分壳聚糖酶是冷适应性酶，如来自鱼腥藻 (Anabaena fertilissima) RPAN1菌株的壳聚糖酶最适反应温度为27 ℃[36]。
2.4.2 温度稳定性
突变体的温度稳定性见图4-b。Csn-BAC在50 ℃孵育1 h后，其相对酶活保持在87.53%，突变体V1—V4则分别为58.74%、60.73%、58.16%和52.08%。相较于Csn-BAC，突变体整体而言对热更为敏感。但在较高温度下，如70 ℃时，V3和V4的热稳定性稍有提升。本结果表明，203和234两个位点突变后可能对其在较高温度下保持稳定性有益。耐高温的酶在工业生产中具有独特优势，但除极端环境微生物和部分真菌来源的壳聚糖酶较为耐热外[29,37]，多数野生型GH46家族是热敏性的壳聚糖酶。Zhou等[38]研究发现来源于海洋细菌假交替单胞菌属 (Pseudoalteromonas sp.) 的壳聚糖酶CsnM在30 ℃孵育1 h后，残余酶活仅为25.4%；Ma等[39]发现源自海洋芽孢杆菌属的壳聚糖酶CsnQ同样在30 ℃之后稳定性急剧下降。
2.4.3 最适pH
突变体的最适pH见图4-c—图4-f。突变体V1和V2的最适pH与Csn-BAC相同，均在pH 7的磷酸盐缓冲溶液中表现出最大活性，而V3、V4则更适应pH 9的甘氨酸缓冲溶液。与许多壳聚糖酶相同，弱酸性溶液对Csn-BAC及其突变体活力均有抑制作用[17,20,40]。目前已报道的所有家族的壳聚糖酶其最适pH介于4~8[41]，且多数壳聚糖酶在偏酸性条件下表现出最优的水解活性，最适pH为9的酶很少见。Gupta等[36]报道了来自鱼腥藻RPAN1菌株的壳聚糖酶在pH 7.5时显示出最大活性；Guo等[20]研究了来自白色链霉菌 (Streptomyces albolongus) ATCC27414的壳聚糖酶Csn21c，其最适反应pH为8；Liang等[42]则报道过壳聚糖酶CS038分别在pH 6和10时显示出最大活性。此外，突变体V1在pH 5的相对活性由Csn-BAC的约20%提至约50%，结合壳聚糖溶液的弱酸性特质，这可能有助于该酶在工业生产上的应用。
2.4.4 pH稳定性
突变体的pH稳定性见图4-g—图4-j。突变体V1、V2对pH的变化较为敏感，在Tris-HCl缓冲液中，突变体V1、V2在pH 8孵育1 h后仍可保持83%以上的活性，在pH 9时却仅剩余5%~10%，这些突变体对不同pH的同一缓冲液的活性差异与Csn-BAC类似[2]。而V3和V4在pH 6~10孵育1 h后仍能保持60%以上的相对酶活，其pH稳定性优于野生型Csn-BAC (Csn-BAC在pH 9~10时失活)。与之相似的是壳聚糖酶Csn21c[20]，其同样在pH 6~10较为稳定 (残余酶活>60%)；马帅等[43]报道的壳聚糖酶BsCsn46在pH 4.5~10的缓冲液中孵育30 min后仍能保持90%以上残余酶活；此外，另外一个来自曲霉TCCC45017的壳聚糖酶在pH 8孵育1 h后，残余酶活仍能保持70%[44]。
2.5 反应动力学参数
突变体的动力学参数见表2。Csn-BAC和突变体V3的Km分别为7.25和7.27 mg·mL−1，与壳聚糖酶Csn21c (7.43 mg·mL−1) [20]相似。而突变体V1、V2、V4的Km分别为3.68、3.13和3.16 mg·mL−1，与壳聚糖酶CvCsn46 (3.06 mg·mL−1) 较为接近[45]，与Csn-BAC相比下降明显，表明酶与底物的亲和力增强，其中突变体V2和V4的Kcat/Km约为Csn-BAC的1.7倍左右，催化效率有所增加。
表 2 Csn-BAC及其突变体反应动力学参数Table 2. Reaction kinetic parameters of chitosanase Csn-BAC and its mutants酶
Enzyme米氏常数
Km/(mg·mL−1)周转率
Kcat/s−1催化效率
Kcat/Km/[mL·(mg·s) −1]野生型 Csn-BAC 7.25 556.00 76.65 突变体 V1 3.68 307.22 83.37 突变体 V2 3.13 409.49 130.66 突变体 V3 7.27 540.88 74.39 突变体 V4 3.16 322.68 102.19 3. 结论
本研究选取了GH46家族中来源于芽孢杆菌的壳聚糖酶Csn-BAC为研究对象，以来自芽孢杆菌DAU101的壳聚糖酶为模板，根据同源建模和序列比对的结果，筛选了4个可能影响其酸碱耐受性的位点进行鉴定，其中P68和H234两个位点靠近底物结合口袋，而另外两个位点则位于蛋白表面。结果显示，所得的突变体中其热稳定性均出现了不同程度的降低，但203和234两个位点突变后对其在较高温度下保持稳定性有益；而突变体的酸碱耐受性有了明显提升，突变体V3和V4的最适pH由最初的7升至9，且在pH 6~10时表现出更好的稳定性。因此，本研究鉴定了4个影响GH46家族壳聚糖酶酸碱耐受性的关键氨基酸，其可能分布在蛋白空间结构的结合口袋附近或表面，同时获得了2个酸碱耐受性明显提高的突变体，且本研究验证了该策略在鉴定并改造影响壳聚糖酶稳定性的关键氨基酸方面是一种有效的方法。
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图 1 纳米硒对低氧胁迫下中华绒螯蟹血淋巴耐低氧指标的影响 (N=6)
注：柱上不同英文字母表示相同低氧胁迫时间下显著差异 (P<0.05)；*. 与对照组差异显著 (P<0.05)；后图同此。
Figure 1. Effects of nano-Se on hemolymph hypoxia tolerance indexes of E. sinensis under hypoxia stress (N=6)
Note: Different lowercase letters on the bar indicate significant difference at the same hypoxia stress time (P<0.05); *. Significant difference compared with the control group (P<0.05); the same case in the following figures.
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图 2 纳米硒对低氧胁迫下中华绒螯蟹血淋巴血细胞数量的影响 (N=6)
Figure 2. Effects of nano-Se on hemolymph hemocyte count of E. sinensis under hypoxia stress (N=6)
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图 3 纳米硒对低氧胁迫下中华绒螯蟹不同组织中超氧化物歧化酶活性的影响 (N=6)
Figure 3. Effects of nano-Se on SOD activity in different tissues of E. sinensis under hypoxia stress (N=6)
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图 4 纳米硒对低氧胁迫下中华绒螯蟹不同组织中过氧化氢酶活性的影响 (N=6)
Figure 4. Effects of nano-Se on CAT activity in different tissues of E. sinensis under hypoxia stress (N=6)
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图 5 纳米硒对低氧胁迫下中华绒螯蟹不同组织中谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响 (N=6)
Figure 5. Effects of nano-Se on GSH-Px activity in different tissues of E. sinensis under hypoxia stress (N=6)
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图 6 纳米硒对低氧胁迫下中华绒螯蟹不同组织中丙二醛浓度的影响 (N=6)
Figure 6. Effects of nano-Se on MDA concentration in different tissues of E. sinensis under hypoxia stress (N=6)
表 1 基础饲料配方组成
Table 1 Ingredients of composition of basal diets
原料
Ingredient质量分数
Mass fraction/%鱼粉 Fish meal 17 棉粕 Cotton seed meal 17 菜粕 Rape seed meal 16 次粉 Wheat flour 10.5 豆粕 Soybean meal 10 玉米 Corn 9 米糠 Rice bran 5 黏合剂 Adhesive 1 血粉 Blood meal 3 虾壳粉 Shrimp shell meal 3 豆油+菜油 (1∶1) Soybean oil+ Rapeseed oil 2 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 1.5 沸石粉 Zeolite powder 2 河蟹饲料添加剂 Crab feed additive 1 蟹用多维① Crab vit premix 1 蟹用多矿② Crab min premix 1 注：①. 每100 g蟹用多维预混料中含：维生素E 2.0 g、维生素C 3.0 g、维生素A 0.6 g、维生素D3 0.08 g、维生素B1 0.07 g、维生素B2 0.14 g、维生素B3 0.28 g、维生素B5 0.01 g、维生素B6 0.08 g、维生素B7 0.05 g、维生素B11 0.02 g、维生素H 0.04 g、烟酸0.3 g、叶酸0.05 g、氯化胆碱0.5 g、泛酸钙0.25 g、生物素0.05 g、肌醇0.7 g；②. 每100 g蟹用多矿预混料中含：磷酸二氢钠3.5 g、磷酸二氢钾6.0 g、碳酸钙3.5 g、氯化钾0.6 g、七水合硫酸镁3.2 g、六水合氯化铝0.55 g、七水合硫酸锌0.157 g、柠檬酸铁0.019 g、四水合硫酸锰0.043 g、碘化钾0.016 g、氯化铜0.014 g、六水合氯化钴0.055 g、乳酸钙5.15 g。 Note: ①. Per 100 g of crab multi vitamin premix contains: ${\rm{V}}_{\rm{E}} $ 2.0 g , ${\rm{V}}_{\rm{C}} $ 3.0 g, ${\rm{V}}_{\rm{A}} $ 0.6 g, ${\rm{V}}_{{\rm{D}}_3}$ 0.08 g, ${\rm{V}}_{{\rm{B}}_1}$ 0.07 g, ${\rm{V}}_{{\rm{B}}_2}$ 0.14 g, ${\rm{V}}_{{\rm{B}}_3}$ 0.28 g, ${\rm{V}}_{{\rm{B}}_5}$ 0.01 g, ${\rm{V}}_{{\rm{B}}_6}$ 0.08 g, ${\rm{V}}_{{\rm{B}}_7}$ 0.05 g, ${\rm{V}}_{{\rm{B}}_{11}}$ 0.02 g, VH 0.04 g, niacin 0.3 g, folic acid 0.05 g, choline chloride 0.5 g, calcium pantothenate 0.25 g, biotin 0.05 g, inositol 0.7 g; ②. Per 100 g of crab multi mineral premix contains: NaH2PO4 3.5 g, KH2PO4 6.0 g, CaCO3 3.5 g, KCl 0.6 g, MgSO4·7H2O 3.2 g, AlCl3·6H2O 0.55 g, ZnSO4·7H2O 0.157 g, FeC6H5O7 0.019 g, MnSO4·4H2O 0.043 g, KI 0.016 g, CuCl2 0.014 g, CoCl2·6H2O 0.055 g, C6H10CaO6 5.15 g. 
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表 2 纳米硒对低氧胁迫下中华绒螯蟹死亡率的影响 (N=10)
Table 2 Effects of nano-Se on mortality rate of E. sinensis under hypoxia stress (N=10)
纳米硒添加水平
Level of nano-Se/(mg·kg−1)死亡率
Mortality rate/%免疫保护率
Immune protection rate/%0 h 12 h 24 h 12 h 24 h 0 0 12.66±3.33c 62.45±8.57c* — — 0.1 0 6.25±1.50b 44.39±4.88b 50.63 28.92 0.2 0 2.50±0.30a 25.62±3.33a 80.25 58.98 0.4 0 12.34±2.05c 31.55±3.29b 2.53 49.48 0.8 0 19.36±2.67d 62.66±6.32c −52.92 −0.34 1.6 0 20.25±5.55d 87.73±10.34d −59.95 −40.48 注：同列不同上标字母表示差异显著 (P<0.05)；*. 与对照组 (0 mg·kg−1纳米硒低氧胁迫0 h组) 差异显著 (P<0.05)；—. 无数据；后表同此。 Note: Different superscript letters within the same column indicate significant difference (P<0.05); *. Significant difference compared with the control group (0 mg·kg−1 nano-Se group under hypoxia stress for 0 h) (P<0.05); —. No data. The same case in the following tables.
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表 3 纳米硒对低氧胁迫下嗜水气单胞菌致死率的影响 (N=10)
Table 3 Effects of nano-Se on lethality of A. hydrophila under hypoxia stress (N=10)
纳米硒添加水平
Level of nano-Se/(mg·kg−1)嗜水气单胞菌致死率
Lethality of A. hydrophila/%免疫保护率
Immune protection rate/%0 h 12 h 24 h 12 h 24 h 0 0 50.36±6.72c* 100±0c* — — 0.1 0 25.22±3.51b 87.47±5.95b 49.92 12.53 0.2 0 12.48±2.39a 56.82±7.31a 75.22 43.18 0.4 0 25.78±3.64b 81.43±2.5b 48.81 18.57 0.8 0 50.33±4.52c 100±0c 0.06 0 1.6 0 75.29±6.15d 100±0c −49.5 0
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-
[1] 农业农村部渔业渔政管理局, 全国水产技术推广总站, 中国水产学会. 2021中国渔业统计年鉴[M]. 北京: 中国农业出版社, 2021: 27-46. [2] BAO J, LI X D, XING Y N, et al. Effects of hypoxia on immune responses and carbohydrate metabolism in the Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis[J]. Aquac Res, 2020, 51(7): 2735-2744. doi: 10.1111/are.14612
[3] GUO K, ZHAO Z G, LUO L, et al. Immune and intestinal microbiota responses to aerial exposure stress in Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis)[J]. Aquaculture, 2021, 541: 736833. doi: 10.1016/j.aquaculture.2021.736833
[4] GRAVINESE P M. The tolerance of juvenile stone crabs to hypoxia: size matters[J]. J Exp Mar Biol Ecol, 2020, 523: 151269. doi: 10.1016/j.jembe.2019.151269
[5] 阮雯, 纪炜炜, 郑亮, 等. 鱼类低氧胁迫及营养调控和应对研究进展[J]. 海洋渔业, 2020, 42(6): 751. doi: 10.3969/j.issn.1004-2490.2020.06.011 [6] ADENIRAN S O, ZHENG P, FENG R, et al. The antioxidant role of selenium via GPx1 and GPx4 in LPS-induced oxidative stress in bovine endometrial cells[J]. Biol Trace Elem Res, 2022, 200(3): 1140-1155. doi: 10.1007/s12011-021-02731-0
[7] NKENGFACK G. Selenium and immunity[M]//MAHMOUDI M. Nutrition and immunity. Cham: Springer, 2019: 159-165.
[8] YUAN L X, ZHANG R, MA X Z, et al. Selenium accumulation, antioxidant enzyme levels, and amino acids composition in Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) fed selenium-biofortified corn[J]. Nutrients, 2018, 10(3): 318. doi: 10.3390/nu10030318
[9] WANG X D, SHEN Z H, WANG C L, et al. Dietary supplementation of selenium yeast enhances the antioxidant capacity and immune response of juvenile Eriocheir sinensis under nitrite stress[J]. Fish Shellfish Immunol, 2019, 87: 22-31. doi: 10.1016/j.fsi.2018.12.076
[10] NEAMAT-ALLAH A N F, MAHMOUD E A, ABD EL HAKIM Y. Efficacy of dietary nano-selenium on growth, immune response, antioxidant, transcriptomic profile and resistance of Nile tilapia, Oreochromis niloticus against Streptococcus iniae infection[J]. Fish Shellfish Immunol, 2019, 94: 280-287. doi: 10.1016/j.fsi.2019.09.019
[11] 侍苗苗, 秦粉菊, 袁林喜, 等. 纳米硒对中华绒螯蟹生长性能、硒含量和营养组成的影响[J]. 饲料工业, 2015, 36(10): 21-25. doi: 10.13302/j.cnki.fi.2015.10.006 [12] 王璀红. 碘量法测定溶解氧[J]. 辽宁化工, 2012, 41(1): 107-108. doi: 10.3969/j.issn.1004-0935.2012.01.032 [13] NICKERSON K W, van HOLDE K E. A comparison of molluscan and arthropod hemocyanin-I. Circular dichroism and absorption spectra[J]. Comp Biochem Phys B, 1971, 39(4): 855-872. doi: 10.1016/0305-0491(71)90109-X
[14] 杨明, 孙盛明, 傅洪拓, 等. 低氧和复氧对日本沼虾抗氧化酶活力及组织结构的影响[J]. 中国水产科学, 2019, 26(3): 493-503. [15] 张静, 陈红莲, 鲍俊杰, 等. 水产养殖中嗜水气单胞菌拮抗菌的研究进展[J]. 江苏农业科学, 2020, 48(17): 21-33. [16] STRATEV D, ODEYEMI O A. An overview of motile Aeromonas septicaemia management[J]. Aquac Int, 2017, 25(3): 1095-1105. doi: 10.1007/s10499-016-0100-3
[17] 谢丽玲, 赵水灵, 余飞, 等. 黄连素对3种水产动物致病菌的抑制作用研究[J]. 南方水产科学, 2013, 9(4): 45-49. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2013.04.008 [18] 程超, 肖敏, 李菁, 等. 嗜水气单胞菌刺激对中华绒螯蟹免疫的影响[J]. 水产科学, 2020, 39(4): 465-475. [19] KONG Y Q, DING Z L, ZHANG Y X, et al. Dietary selenium requirement of juvenile oriental river prawn Macrobrachium nipponense[J]. Aquaculture, 2017, 476: 72-78. doi: 10.1016/j.aquaculture.2017.04.010
[20] HAUTON C. The scope of the crustacean immune system for disease control[J]. J Invertebr Pathol, 2012, 110(2): 251-260. doi: 10.1016/j.jip.2012.03.005
[21] LIU S, ZHENG S C, LI Y L, et al. Hemocyte-mediated phagocytosis in crustaceans[J]. Front Immunol, 2020, 11: 268. doi: 10.3389/fimmu.2020.00268
[22] MITTA G, VANDENBULCKE F, ROCH P. Original involvement of antimicrobial peptides in mussel innate immunity[J]. FEBS Lett, 2000, 486(3): 185-190. doi: 10.1016/S0014-5793(00)02192-X
[23] 洪宇航, 杨筱珍, 成永旭, 等. 中华绒螯蟹的血细胞组成、分类及免疫学功能[J]. 水产学报, 2017, 41(8): 1213-1222. [24] SIVAKUMAR M R, DENIS M, SIVAKUMAR S, et al. Agglutination of plasma, hemocyanin, and separated hemocyanin from the hemolymph of the freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii (de Man, 1879) (Decapoda: Caridea: Palaemonidae)[J]. J Crust Biol, 2020, 40(3): 309-315. doi: 10.1093/jcbiol/ruaa016
[25] XU Z N, LIU A, LI S K, et al. Hepatopancreas immune response during molt cycle in the mud crab, Scylla paramamosain[J]. Sci Rep, 2020, 10(1): 1-14. doi: 10.1038/s41598-019-56847-4
[26] le MOULLAC G, SOYEZ C, SAULNIER D, et al. Effect of hypoxic stress on the immune response and the resistance to vibriosis of the shrimp Penaeus stylirostris[J]. Fish Shellfish Immunol, 1998, 8(8): 621-629. doi: 10.1006/fsim.1998.0166
[27] SONG Y M, WU M Y, PANG Y Y, et al. Effects of melatonin feed on the changes of hemolymph immune parameters, antioxidant capacity, and mitochondrial functions in Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) caused by acute hypoxia[J]. Aquaculture, 2021, 535: 736374. doi: 10.1016/j.aquaculture.2021.736374
[28] WANG J, XU Z, HE J P. The role of HIF-1α in the energy metabolism and immune responses of hypoxic Scylla paramamosain[J]. Aquac Rep, 2021, 20: 100740. doi: 10.1016/j.aqrep.2021.100740
[29] 李彦红, 张飞飞, 黄丽娟, 等. 纳米硒对齐口裂腹鱼生长、肌肉成分、血清生化及抗氧化指标的影响[J]. 中国水产科学, 2020, 27(6): 682-691. [30] LI Y H, WEI L, CAO J R, et al. Oxidative stress, DNA damage and antioxidant enzyme activities in the Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) when exposed to hypoxia and reoxygenation[J]. Chemosphere, 2016, 144: 234-240. doi: 10.1016/j.chemosphere.2015.08.051
[31] STOREY K B. Oxidative stress: animal adaptations in nature[J]. Braz J Med Biol Res, 1996, 29(12): 1715-1733.
[32] LESSER M P. Oxidative stress in tropical marine ecosystems[M]//ABELE D. Oxidative stress in aquatic ecosystems. Chichester: John Wiley & Sons Ltd. , 2011: 7-19.
[33] 虞为, 杨育凯, 林黑着, 等. 牛磺酸对花鲈生长性能、消化酶活性、抗氧化能力及免疫指标的影响[J]. 南方水产科学, 2021, 17(2): 78-86. doi: 10.12131/20200223 [34] 曾祥兵, 董宏标, 韦政坤, 等. 鸡内金多糖对尖吻鲈幼鱼生长、消化、肠道抗氧化能力和血清生化指标的影响[J]. 南方水产科学, 2021, 17(4): 49-57. doi: 10.12131/20210028 [35] NUGROHO R A, FOTEDAR R. Comparing the effects of dietary selenium and mannan oligosaccharide supplementation on the growth, immune function, and antioxidant enzyme activity in the cultured marron Cherax cainii (Austin, 2002)[J]. Aquac Int, 2014, 22(2): 585-596. doi: 10.1007/s10499-013-9682-1
[36] LIU Z M, ZHU X L, LU J, et al. Effect of high temperature stress on heat shock protein expression and antioxidant enzyme activity of two morphs of the mud crab Scylla paramamosain[J]. Comp Biochem Phys A, 2018, 223: 10-17. doi: 10.1016/j.cbpa.2018.04.016
[37] HONG Y H, HUANG Y, YAN G W, et al. Antioxidative status, immunological responses, and heat shock protein expression in hepatopancreas of Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis under the exposure of glyphosate[J]. Fish Shellfish Immunol, 2019, 86: 840-845. doi: 10.1016/j.fsi.2018.12.020
[38] 管敏, 张德志, 唐大明. 慢性氨氮胁迫对史氏鲟幼鱼生长及其肝脏抗氧化、免疫指标的影响[J]. 南方水产科学, 2020, 16(2): 36-42. doi: 10.12131/20190191 [39] 谭连杰, 林黑着, 黄忠, 等. 当归多糖对卵形鲳鲹生长性能、抗氧化能力、血清免疫和血清生化指标的影响[J]. 南方水产科学, 2018, 14(4): 72-79. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.04.009 [40] de OLIVEIRA U O, da ROSA ARAÚJO A S, BELLÓ-KLEIN A, et al. Effects of environmental anoxia and different periods of reoxygenation on oxidative balance in gills of the estuarine crab Chasmagnathus granulata[J]. Comp Biochem Phys B, 2005, 140(1): 51-57. doi: 10.1016/j.cbpc.2004.09.026
[41] 管越强, 李利, 王慧春, 等. 低氧胁迫对日本沼虾呼吸代谢和抗氧化能力的影响[J]. 河北大学学报(自然科学版), 2010, 30(3): 301-306. [42] NAM S E, HAQUE M N, LEE J S, et al. Prolonged exposure to hypoxia inhibits the growth of Pacific abalone by modulating innate immunity and oxidative status[J]. Aquat Toxicol, 2020, 227: 105596. doi: 10.1016/j.aquatox.2020.105596
[43] BUNDGAARD A, RUHR I M, FAGO A, et al. Metabolic adaptations to anoxia and reoxygenation: new lessons from freshwater turtles and crucian carp[J]. Curr Opin Endocr Metab Res, 2020, 11: 55-64. doi: 10.1016/j.coemr.2020.01.002
[44] WANG H L, ZHANG J S, YU H Q. Elemental selenium at nano size possesses lower toxicity without compromising the fundamental effect on selenoenzymes: comparison with selenomethionine in mice[J]. Free Radic Biol Med, 2007, 42(10): 1524-1533. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2007.02.013
[45] 徐铭, 朱丹丹. 硒与动物免疫功能的关系[J]. 畜牧兽医科技信息, 2013(3): 16-17. [46] 赵亚伟, 汤加勇, 贾勇, 等. 不同硒源对肉鸡生长性能、血清和肌肉硒含量、抗氧化能力及肉品质的影响[J]. 动物营养学报, 2021, 33(4): 2024-2032. doi: 10.3969/j.issn.1006-267x.2021.04.022 [47] BAI K K, HONG B H, HUANG W W, et al. Selenium-nanoparticles-loaded chitosan/chitooligosaccharide microparticles and their antioxidant potential: a chemical and in vivo investigation[J]. Pharmaceutics, 2020, 12(1): 43. doi: 10.3390/pharmaceutics12010043
[48] 黄小红, 曹岩, 江俊勇, 等. 饲料中添加纳米硒对草鱼生长性能、免疫器官指数和抗氧化性能的影响[J]. 中国饲料, 2017(16): 30-34. -
期刊类型引用(3)
1. 孙佳鑫，石连玉，姜晓娜，李池陶，葛彦龙，胡雪松，张晓峰，贾智英. 镜鲤抗疱疹病毒(CyHV-3)F_4抗病品系病毒表达量评估. 上海海洋大学学报. 2021(02): 258-265 . 
百度学术
2. 刘枝华，况文明，王伦，高富铭，陈松，董然然. 鲤鱼肠道中4种细菌的分离与生化鉴定. 贵州畜牧兽医. 2020(01): 45-49 . 百度学术
3. 翁宏飚，沈卫锋，牛宝龙. 水产口服DNA疫苗研究进展. 浙江农业科学. 2020(10): 2125-2131+2135 . 百度学术
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