罗非鱼皮胶原肽的酪氨酸酶抑制活性与铜离子结合活性研究

宋玉琼, 胡晓, 相欢, 陈胜军, 李来好, 杨贤庆, 吴燕燕, 马海霞

宋玉琼, 胡晓, 相欢, 陈胜军, 李来好, 杨贤庆, 吴燕燕, 马海霞. 罗非鱼皮胶原肽的酪氨酸酶抑制活性与铜离子结合活性研究[J]. 南方水产科学, 2023, 19(1): 155-164. DOI: 10.12131/20220097
引用本文: 宋玉琼, 胡晓, 相欢, 陈胜军, 李来好, 杨贤庆, 吴燕燕, 马海霞. 罗非鱼皮胶原肽的酪氨酸酶抑制活性与铜离子结合活性研究[J]. 南方水产科学, 2023, 19(1): 155-164. DOI: 10.12131/20220097
SONG Yuqiong, HU Xiao, XIANG Huan, CHEN Shengjun, LI Laihao, YANG Xianqing, WU Yanyan, MA Haixia. Study on tyrosinase inhibitory activity and Cu2+ binding activity of tilapia skin peptides[J]. South China Fisheries Science, 2023, 19(1): 155-164. DOI: 10.12131/20220097
Citation: SONG Yuqiong, HU Xiao, XIANG Huan, CHEN Shengjun, LI Laihao, YANG Xianqing, WU Yanyan, MA Haixia. Study on tyrosinase inhibitory activity and Cu2+ binding activity of tilapia skin peptides[J]. South China Fisheries Science, 2023, 19(1): 155-164. DOI: 10.12131/20220097

罗非鱼皮胶原肽的酪氨酸酶抑制活性与铜离子结合活性研究

基金项目: 广东省重点领域研发计划资助项目(2020B020226005);国家特色淡水鱼产业技术体系 (CARS-46);广东省基础与应用基础研究基金 (2019A1515011588);茂名市引进创新创业团队项目 (200201095834980); 广东省企业科技特派员专项 (GDKTP2021035300);中国水产科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助 (2020TD69);中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助 (2021SD06)
详细信息
    作者简介:

    宋玉琼 (1997—),女,硕士研究生,研究方向为水产品加工与质量安全、食品生物技术。E-mail: SYQ1010730529@163.com

    通讯作者:

    胡 晓 (1981—),男,研究员,博士,研究方向为水产品加工与质量安全、食品生物技术。E-mail: hnhuxiao@163.com

  • 中图分类号: TS 254.1

Study on tyrosinase inhibitory activity and Cu2+ binding activity of tilapia skin peptides

  • 摘要: 为探明罗非鱼 (Oreochromis) 鱼皮胶原蛋白肽能否有效抑制黑色素的生成,采用酶解法制备出罗非鱼皮酪氨酸酶抑制肽 (Tilapia skin tyrosinase inhibitory peptides, TSTIP),并开展其酪氨酸酶 (Tyrosinase, TYR) 抑制活性与铜离子 (Cu2+) 结合活性的相关性研究。结果显示,罗非鱼皮经碱性蛋白酶酶解4 h后的产物具有最高的TYR抑制活性和Cu2+结合活性,且两者呈极显著正相关 (R=0.856)。荧光光谱分析显示,TSTIP与TYR或Cu2+结合后其内源荧光吸收强度的下降趋势一致,同时紫外吸收增强,且最大吸收波长发生红移。傅里叶变换红外光谱分析显示,TYR与Cu2+主要通过羰基及氨基与TSTIP结合。圆二色谱分析显示,两种结合物中β-转角及无规则卷曲含量相对减少,β-折叠含量相对增多,该现象在TSTIP-Cu2+结合物中更加明显。结果表明,TSTIP结合TYR产生的结构变化与结合Cu2+相似,TSTIP可通过螯合TYR的活性中心Cu2+来抑制其活性。
    Abstract: To find out whether the tilapia (Oreochromis) skin collagen peptides can effectively inhibit melanin production, we used enzymatic method to prepare the tilapia skin tyrosinase (TYR) inhibitory peptides (TSTIP) and studied the relevance between TYR inhibitory activity and Cu2+ binding activity. The results show that the product of tilapia skin hydrolyzed by alcalase for 4 h exhibited both the highest TYR inhibitory activity and Cu2+ binding activity, which were significantly positively correlated (R=0.856). When TSTIP was bound to Cu2+ or tyrosinase, the intrinsic fluorescence absorption had a consistent decreasing trend, but the UV absorption increased and the maximum absorption wavelength had a red shift. For FTIR results, TYR and Cu2+ bound to TSTIP mainly by carbonyl and amino groups. Circular dichroism shows that the β-turn and random curl contents of the two conjugates decreased relatively, while the β-fold content increased relatively, which was more obvious for TSTIP-Cu2+ conjugate. In conclusion, the structural change of TSTIP-TYR is similar with that of TSTIP-Cu2+ conjugate, which indicates that TSTIP can inhibit TYR's activity by binding to its Cu2+ active site.
  • 近年来,广西海水养殖业得到了长足发展,海水养殖业的快速发展不仅改善了人们的食物结构,丰富了城乡居民的菜篮子,而且对发展渔区经济,增加渔农民收入发挥了巨大的作用,已成为农业经济增长的一个新亮点。

    广西海岸线长1 595 km,沿岸岛屿约700个,岛屿岸线长600余km。潮间带滩涂面积10万hm2,适宜水产养殖的面积约6.7万hm2。20 m等深线以内浅海面积65万hm2,适宜水产养殖的面积约57万hm2。水域滩涂生物资源丰富,盛产对虾Penaeus、锯缘青蟹Scylla serrata、马氏珠母贝Pinctada martensii、近江牡蛎Crassostrea rivularis、文蛤Meretrix meretrix及赤点石斑鱼Epinephelus akaara、真鲷Pagrosomus major、二长棘鲷Parargyrops edita、银鲳Pampus argenteus等主要经济种类,发展海水养殖业条件十分优越。从20世纪90年代开始,在“以养为主”的方针指导下,实施包括旨在发展海水养殖在内的“种子工程”和“万水工程”等经济战略下,坚持面积、产量、质量和效益并重,海水养殖业得到快速、稳步发展。

    2004年,全区海水养殖面积达6万多hm2,是1994年的3.6倍。其中陆基池塘养殖约2万hm2,滩涂养殖3万多hm2,占近期可开发滩涂总面积的45%;浅海开发约1万hm2,占适宜开发利用面积的3%。充分发挥资源优势,潮上带、潮间带和浅海开发同步发展,养殖热潮有增无减。大批养殖户通过发展养殖生产走上了致富之路。

    为适应市场需要,在稳定常规品种养殖的同时,扩大名优品种养殖。养殖品种发展到30多个,主要有对虾(长毛对虾Penaeus penicillatus、斑节对虾P.monodon、日本对虾P.japonicus、南美白对虾P.vannamei)、文蛤、近江牡蛎、马氏珠母贝、泥蚶Tegillarca granosa、海湾扇贝Argopecten irradians、栉江珧Pinna pectinata Linnaeus、大獭蛤Lutria maxima、中华乌塘鳢Bostrichthys sinensis、大弹涂鱼Boleophthalmus pectinirostris、真鲷、美国红鱼Sciaemops ocellatus、赤点石斑鱼、红鳍笛鲷Lutjanus erythropterus、真鲷、黄鳍鲷Sparus lctus、黑鲷S.macrocephalus、鲈鱼Lateolabrax japonicus、军曹鱼Rachycentron canadum、鲻鱼Mugil cephalus等。养殖品种的多样化和优质化丰富了消费市场,满足了人们生活需求。

    养殖模式主要推广混养、轮养、立体吊养、网箱养殖、深水礁体养殖以及对虾高位池养殖、珍珠深水育珠技术、贝类增养殖等养殖模式。海水养殖由岸边、滩涂养殖向浅海养殖推进,由单一养殖向立体养殖的深度和广度发展,逐渐形成鱼、虾、蟹贝全面发展的格局。

    形成了以对虾、珍珠、近江牡蛎、文蛤、泥蚶、名贵鱼类6大主导产品的海水养殖基地。1.3 hm2以上的规模养殖户达712户,面积6 200 hm2,占养殖总面积的10%;其中6.7 hm2以上的规模养殖户有75户。北海工厂化养殖基地面积已达30万m2,10 m等深线内深水养殖大獭蛤、栉江珧等面积达4 000 hm2;钦州建成了广西最大的近江牡蛎养殖基地,其中七十二泾近江牡蛎浮筏串式高密度养殖近1 500 hm2,形成集观光、生产于一体的海洋牧场。

    2004年育出各种鱼、虾110亿尾,比1994年增长了9倍。对虾育苗场近100家,育苗水体达10万m3,年育苗量109亿尾,完全能满足广西对虾养殖生产的需要。近江牡蛎自然采苗2.5亿只,不但满足广西养殖需要而且部分苗种运销区外。

    随着沿海地区经济的迅速发展,城市毗连的海域、港口、海湾、河流入海口,岸线海域的水质已受到不同程度的污染,并有继续发展的趋势。工业废水、城市生活污水和大量富含有机质、无机氮和磷及有机农药的农业污水随泾流进入近海水域,致使养殖水质恶化,严重地影响养殖种类的生存和生长。另一方面是养殖自身水环境的污染,养殖过程中的残饵、化肥、消毒药品等,特别是残饵中的蛋白质、氮和磷未经科学处理就直接排放到海区水环境中,易引起海水的富营养化,滋生病原;大量新增加的养殖设施使养殖区及其毗邻水域场发生改变,养殖设施的屏障效应使流速降低,影响了营养物质的输入和污物的输出,使陆源污染物得不到及时的稀释扩散,滞留在养殖水域。

    渔业管理虽然推行了养殖证制度,但养殖开发利用仍然处于无序状态。养殖水域滩涂规划滞后,养殖规模的盲目扩大与海区养殖容量相对有限的问题仍严重。目前海水养殖规模大小大都是人为盲目决定,或由市场单一引导,缺乏有科学依据的政策性宏观调控,养殖生产往住一哄而上。近江牡蛎、马氏珠母贝养殖近年来连续发生死亡,2005年早造的对虾养殖发病率超过五成。海上近江牡蛎筏吊养殖过密,也将直接危害到一些名贵物种的繁衍生长,发展无序化的弊病,已显端倪。

    近年来,水产种苗培育偏重数量、不讲质量;不重视选育,由于近亲繁殖,种质退化严重,导致养殖性能严重衰退,生长减缓,个体小型化,抗逆性减弱。缺少高产抗逆的优良品种和高产值养殖对象,优质种总量比例小,产量、质量提高缓慢。

    在不同生态类型海区养殖中,普遍存在养殖种类结构不合理现象,池塘对虾、滩涂贝类养殖中,养殖种类或类群单一问题由来已久。养殖生物量严重超过环境负荷,进行掠夺式养殖。结构单一的密集养殖,使生态系统能量和物质由于超支而贫乏,造成循环过程紊乱和生态失衡,致使某些污损、赤潮和病原生物异常发生,极易引发病害的发生和流行。

    虾病流行,贝类发病减产,形势严峻。暴发性、流行性疾病频繁发生,病毒性疾病类型愈来愈多,非病原性疾病愈来愈突出,病原耐药性越来越强,水产养殖病害不断发生、蔓延。养殖生态、疾病与环境和营养的关系研究不够,短期内难以提出普遍有效的技术措施,使生产难以持续增长。

    从业者养殖技术参差不齐,科技应用水平偏低。科研手段落后,科技不能满足生产快速发展的要求,许多领域滞后于生产。在水产养殖发展前途的重大关键技术方面,科技的先导作用不能充分发挥。良种引进更新换代步伐不快,科研所必需的仪器设备不能及时配置,致使试验手段无法更新,长期处于落后状态等等,影响了科学研究的深度和精度。

    国际、国内消费市场对水产品的质量安全性都有了很高的认识和要求,而目前的养殖生产环境、产品质量标准、投入品及药残监控等方面与国际市场的要求尚有一定差距,提高养殖产品的食用安全性、使产品更好地进入国内外市场显得格为迫切。

    由于科研经费的缺乏,制约了渔业资源和渔业生态环境的基础性调查。缺乏常规性、基础性的调查和监测数据,渔业统计资料不规范、不完整,严重影响了渔业决策的科学依据和理论基础,致使生产带有一定的盲目性,难以科学、合理、有效地利用海洋渔业资源。

    加强海洋环境的保护,要用法律手段来控制和治理养殖水域污染,处理好养殖发展与保护资源和生态环境的关系,保证养殖资源的合理和永续利用。对于陆源污染的治理,要重点放在污染形成的前端,增加污水和废渣的处理能力,控制污染物入海量。要用法律手段对重点排污河流、临海城市和直接排污入海的大、中企业进行重点管理,规定其污水处理率和排放达标率,以控制工业废水、生活污水等的排放,要改变人们长期以来形成的,只知开发利用、不知保护海洋的观念。调整优化养殖结构,改进养殖技术,提高饲料质量,科学养殖,养殖污水经过净化处理后再排放等措施,把水产养殖自身污染降低到最低程度。

    加强对养殖容量研究,科学地确定各养殖品种的养殖负荷量,制订科学的养殖规划、养殖布局,确定适宜合理的养殖规模。调整现有的区域结构、品种结构和养殖方式等。调整养殖布局,将过度密集的近岸养殖转移到外海,大力发展深水抗风浪网箱及深水养鱼。把以前在潮间带及水面上进行的养殖转移到水面以下,发展海珍品底播养殖及沉箱养殖。合理搭配养殖品种,实施立体生态养殖,提高水域利用率。营造海底森林,大力发展海洋牧场、增殖渔业、人工鱼礁、围海养殖,形成深海海洋牧场产业带、外海抗风浪网箱养殖产业带、近海筏式养殖产业带、潮间带海珍品养殖产业带、滩涂池塘养殖产业带、观光及休闲渔业产业带、陆上工厂化养殖产业带等优势产业带,拓展新的发展空间,增加新的发展活力。

    加快水产原良种繁育基地建设,完善水产苗种供应体系。做好种苗提纯复壮,培养性状好、抗病力强的品种,实现养殖良种化。通过引进、繁育、提纯、复壮,开发一大批生产性状优良、经济价值较高的名优新品种。增加名特优新品种比重,从而调整、优化养殖品种结构。抓好苗种生产许可证的年审和新证换发工作,并加大水产苗种生产及流通的监管和执法检查力度,促使苗种生产和销售健康、有序地进行。

    随着水产养殖向高密度、高产方向发展,防治病害将越来越重要,要重视和加强病害防治工作。贯彻以防为主的原则,科学养殖,减少病害发生。应从长远来规划水产养殖的发展基地,制定相应的环保措施。组织科研力量,对重大流行病实行多单位联合攻关,提高科技应变能力,满足生产需要。健全基层水产科技推广网络,发挥基层科技人员的作用,尤其要强化镇级技术干部的培训,发挥其骨干作用。做好种苗的检疫及渔用药物的监检工作,严格把关;积极研究和探索生态防治技术,从水质调控人手,防治水产动物的疾病。

    利用国内外现有科研成果,迅速转化为生产力,提高水产养殖的科技含量。依靠科技进步,推广优良品种和先进养殖技术。加强技术培训,开展多种形式的养殖技术培训班、现场调查会、交流会,提高养殖业从业人员的养殖技术。

    加强对苗种、饲料、渔药等生产投入品的监督管理,确保投入品的质量。推广健康养殖技术,推进无公害水产养殖基地建设。建立健全渔业质量标准体系,积极推行HACCP、欧盟等国际通行的水产品质量标准。抓好无公害养殖技术推广,全面推行无公害生产。逐步推行养殖场注册、养殖生产日志、渔药使用记录、产品标识、苗种检疫、环境监测、药残抽捡等制度。

    加强渔业资源调查和监测及渔业环境监测,制订科学的渔业规划、渔业布局,确定适宜合理的渔业规模,走科技兴渔和科技管理结合的道路,做到渔业资源与海区水交换能力、渔业作业模式和技术与品种结构间的平衡协调发展,实现海洋渔业资源的可持续开发利用。

    加大渔业法制建设,认真贯彻《渔业法》及涉渔法律法规,大力推行养殖许可证制度、苗种生产许可证制度,《水产品质量管理条例》等法规及标准。组织编制“水产养殖发展规划”、“养殖区划布局规划”,对养殖生产进行宏观调控和指导。水产养殖的立项上马建立严格的审批制度,养殖项目要进行“生态成本”的核算,做到未雨绸缪,达到经济发展、资源节约与环境保护的和谐和统一。同时加强对从业人员的岗位技术培训,制订水产养殖的准入制度、持证生产制度和苗种检疫制度等,走绿色养殖之路,走法制化的水产养殖之路。

  • 图  1   不同酶解物的TYR抑制率与Cu2+结合率和相关性分析

    注:a. 酶解物的单酚酶抑制活性;b. 酶解物的二酚酶抑制活性;c. 酶解物的Cu2+结合率;d. TSTIP二酚酶抑制活性与Cu2+结合率和相关性分析;不同小写字母表示同种蛋白酶在不同酶解时间所得酶解物的抑制率差异显著 (P<0.05);不同大写字母表示不同蛋白酶在同一酶解时间所得酶解物的抑制率差异显著 (P<0.05)。

    Figure  1.   Tyrosinase inhibition rate and Cu2+ binding rate of different hydrolysates and correlation analysis

    Note: a. Monophenolase inhibitory activity of hydrolysates; b. Diphenolase inhibitory activity of hydrolysates; c. Cu2+ binding rate of hydrolysates; d. Correlation analysis between tyrosinase inhibitory activity and Cu2+ binding rate. Different lowercase letters indicate that the same protease at different hydrolysis time had significant difference (P<0.05), while different uppercase letters indicate that different proteases at the same hydrolysis time had significant difference (P<0.05).

    图  2   碱性蛋白酶酶解物分子量分布及其占比

    注:a. 酪氨酸酶抑制肽的分子量分布;b. 碱性蛋白酶酶解物不同组分的占比。

    Figure  2.   Molecular weight distribution and proportion of alcalase hydrolysate

    Note: a. Molecular weight distribution of TSTIP; b. Proportion of alcalase hydrolysate with different components.

    图  3   TSTIP-TYR及TSTIP-Cu2+的荧光光谱

    注:a、b分别为TSTIP与不同浓度的TYR或Cu2+结合后的荧光强度变化;c、d分别为TSTIP与TYR或Cu2+结合后荧光强度随时间的变化。

    Figure  3.   Fluorescence intensity of TSTIP-TYR and TSTIP-Cu2+

    Note: The a and b represent the changes in fluorescence intensity of TSTIP combining with TYR or Cu2+ at different concentrations, respectively; the c and d represent the changes in fluorescence intensity of TSTIP combining with TYR or Cu2+ at different time, respectively.

    图  4   TSTIP-TYR和TSTIP-Cu2+的紫外与红外光谱分析

    注:a. TSTIP-TYR及TSTIP-Cu2+的紫外吸收光谱;b. TSTIP-TYR及TSTIP-Cu2+的红外吸收光谱。

    Figure  4.   UV and FTIR spectrum of TSTIP-TYR and TSTIP-Cu2+

    Note: a. UV spectrums of TSTIP-TYR and TSTIP-Cu2+; b. FTIR spectrums of TSTIP-TYR and TSTIP-Cu2+.

    图  5   TSTIP-TYR及TSTIP-Cu2+的圆二色谱

    注:a. TSTIP-TYR和TSTIP-Cu2+的圆二色谱图;b. TSTIP-TYR和TSTIP-Cu2+的二级结构;不同小写字母表示同一样品在不同二级结构的质量比例有显著性差异 (P<0.05);不同大写字母表示不同样品在同种二级结构的质量比例有显著性差异 (P<0.05)。

    Figure  5.   CD analysis of TSTIP-TYR and TSTIP-Cu2+

    Note: a. Circular dichroism spectrum of TSTIP-TYR and TSTIP-Cu2+; b. Proportions of secondary structures of TSTIP-TYR and TSTIP-Cu2+. Different lowercase letters indicate that the mass proportion of the same sample in different secondary structures had significant difference (P<0.05). Different uppercaseletters indicate that the mass proportion of different samples in the same secondary structure had significant difference (P<0.05).

    表  1   不同蛋白酶的酶解条件

    Table  1   Enzymatic conditions for different proteases

    蛋白酶Protease酶解条件 Hydrolysis condition
    酶活力Enzymatic activity/ (U·mg−1)pH温度Temperature/ ℃加酶量Enzyme content/%酶解时间Hydrolysis time/h
    碱性蛋白酶 Alcalase 200 9.0 50 2 1、2、4、6、8 
    木瓜蛋白酶 Papain 1 500 6.5 50 2 1、2、4、6、8 
    胰蛋白酶 Trypsin 250 8.0 37 2 1、2、4、6、8 
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    表  2   罗非鱼皮和酪氨酸酶抑制肽中氨基酸成分和质量分数

    Table  2   Amino acids composition and mass fraction of        tilapia skin and TSTIP      %

    氨基酸Amino acids罗非鱼皮Tilapia skin罗非鱼皮酪氨酸酶抑制肽 TSTIP
    天冬氨酸 Asp 6.20±0.23f 6.00±0.28f
    谷氨酸 Glu 10.78±0.14d 10.65±0.21d
    赖氨酸 Lys 3.69±0.23g 3.62±0.26g
    组氨酸 His 0.90±0.10jk 0.87±0.25kl
    精氨酸 Arg 9.45±0.18e 9.20±0.23e
    色氨酸 Trp 0.15±0.20l 1.80±0.22i
    酪氨酸 Tyr 0.65±0.23k 0.61±0.18l
    苯丙氨酸 Phe 2.21±0.25i 2.11±0.15i
    甘氨酸 Gly 26.28±0.21a 27.70±0.21a
    丙氨酸 Ala 11.22±0.17c 11.16±0.23c
    缬氨酸 Val 2.21±0.21i 2.19±0.26i
    蛋氨酸 Met 1.18±0.17k 1.47±0.34ij
    异亮氨酸 Ile 1.17±0.24j 1.10±0.40jk
    脯氨酸 Pro 14.32±0.15b 13.68±0.23b
    亮氨酸 Leu 2.95±0.09h 2.92±0.22h
    苏氨酸 Thr 2.95±0.04h 2.94±0.17h
    丝氨酸 Ser 3.84±0.14g 3.72±0.32g
    胱氨酸 Cys 0.01±0.12l 0.04±0.13m
    注:不同小写字母表示同种原料在不同氨基酸种类的相对质量分数差异显著 (P<0.05)。 Note: Different lowercase letters indicate that there are significant differences in the relative mass fraction of the same material in different amino acids (P<0.05).
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-04-06
  • 修回日期:  2022-06-05
  • 录用日期:  2022-07-18
  • 网络出版日期:  2022-07-25
  • 刊出日期:  2023-02-04

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