Effects of dietary supplementation with powder of Antarctic krill (Euphausia superba) on growth performance, body composition and color of Litopenaeus vannamei
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摘要: 为探讨南极磷虾粉在对虾养殖中的应用效果，在对虾全价配合饲料中分别添加5% (S5组)、10% (S10组)、15% (S15组) 和20% (S20组) 的南极磷虾粉，配制成4种实验饲料，以全价配合饲料为对照 (S0组)，饲养体质量为 (7.27±0.88) g 的凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 35 d，研究了其对凡纳滨对虾生长、体组分及体色的影响。结果显示，饲料中添加南极磷虾粉：1) 可显著提高对虾成活率 (P<0.05)，添加比例为15%时，终末体质量 (FBW)、体质量增长率 (WGR) 和特定生长率 (SGR) 均显著高于S0组 (P<0.05)；2) 逐渐提高粗脂肪含量，且S10、S15和S20组显著高于S0组 (P<0.05)，而头胸甲亮度值 (L*) 及身体处黄色值 (b*) 逐渐降低，均显著低于S0组 (P<0.05)；3) 显著提高肝胰腺和甲壳中虾青素的含量，且与体色相关的LVPBP75基因的表达水平与南极磷虾粉添加比例呈正相关。研究结果初步表明，饲料中添加南极磷虾粉能够促进对虾生长，提高其体内虾青素含量和肝胰腺中LVPBP75的表达水平，改善体色；其中，添加15%的南极磷虾粉效果更加明显。Abstract: To determine the application effect of Euphausia superba powder (PE) in shrimp culture, we designed five groups [S0 group (No PE supplementation), S5 group, S10 group, S15 group, and S20 group (5%, 10%, 15% and 20% PE supplemented to the feed, respectively)] for a 35-day experiment on Litopenaeus vannamei [Body mass of (7.27±0.88) g]. The effect of dietary supplementation with PE on the growth performance, body composition and color of L. vannamei were evaluated. The results show that: 1) PE supplementation improved the survival rate (SR) of L. vannamei significantly (P<0.05), and the final body mass (FBW), weight gain rate (WGR) and specific growth rate (SGR) of L. vannamei in S15 group were significantly higher compared with the other groups (P<0.05). 2) With the increase of PE supplementation, the crude fat content of L. vannamei increased gradually, and those in S10 group, S15 group and S20 group were significantly higher than that in S0 group (P<0.05). Additionally, the brightness (L*) of the cephalothorax and the yellowness (b*) of the carapace of L. vannamei decreased gradually, which were significantly lower than those in S0 group (P<0.05). 3) PE supplementation to the feed increased the astaxanthin content in the hepatopancreas and crustacean of L. vannamei significantly (P<0.05), and the effect was positively associated with PE supplementation. The expression level of the LVPBP75 related to body color was also positively correlated with PE supplementation. The results indicate that dietary supplementation with PE, especially with 15% PE, can improve the growth, astaxanthin content, body color as well as expression level of LVPBP75 of L. vannamei.
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Keywords:
- Litopenaeus vannamei /
- Euphausia superba powder /
- Body color /
- Astaxanthin /
- LVPBP75
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凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 原产于太平洋沿岸海域，是目前世界上产量最高的对虾养殖品种之一[1]。其体形与中国明对虾 (Fenneropenaeus chinensis) 相似，正常体色为青灰色，具有个体大、生长快、环境适应能力好、抗病力强、对饵料要求低等优点，可进行高密度、集约化养殖。2019年，中国凡纳滨对虾养殖产量达到181.6万吨，其中海水养殖产量达114.4万吨，占中国海水养殖虾类总产量的78.9%[2]。然而，随着对虾工厂化养殖的兴起，养殖对虾体色异常，体色变浅甚至发蓝的问题也随之暴露。由于消费者对于对虾颜色有一定的偏好，导致颜色正常的对虾价格高于颜色异常的，因此，如何改善工厂化养殖对虾的体色，提高其品质，亟须深入研究[3-4]。
虾青素是类胡萝卜素的一种，与甲壳类动物体色密切相关，约占对虾体内类胡萝卜素含量的65%~98%[5]。因为自身无法合成虾青素，必须从自然界中摄取虾青素或其前体物质，所以甲壳类动物体内的虾青素主要来源于食物[6-7]。已有研究表明，用缺乏虾青素的人工饲料喂养斑节对虾 (Penaeus monodon)，会造成其体色由绿褐色转为淡蓝色[8]。当为其补充适量角黄素与虾青素后，对虾体色变深，蓝色消失[9]。甲壳类动物从食物中摄入虾青素后，色素通过消化系统被运输到表皮，储存于表皮下的色素细胞内[5,10]。除了表皮色素细胞之外，甲壳类动物的外骨骼中也发现了虾青素的存在，并且体色很大程度上取决于外骨骼与表皮层中色素 (主要是虾青素) 的含量[4,11-12]。对虾工厂化养殖过程中，食物来源单一，颜色变浅或发蓝可能是由于缺少虾青素[13]。
南极磷虾(Euphausia superba)隶属于磷虾目、磷虾科、磷虾属，是磷虾科中体型较大的一种。据估计，南极磷虾的资源蕴藏量在 (6.5~100) 亿吨之间，年可捕量高达1亿吨[14]。南极磷虾不仅资源丰富，而且营养也较为均衡；由于含有10种必需氨基酸 (EAA) 和8种非必需氨基酸 (NEAA)，被公认为是可以与鱼粉媲美的优质蛋白质原料[15]。已有研究表明，饲料中添加南极磷虾粉能够提高大黄鱼 (Larimichthys crocea)[16]、三倍体虹鳟 (Oncorhynchus mykiss)[17]、圆斑星鲽 (Verasper variegatus)[18]的生长性能。此外，磷虾中含有丰富的虾青素，凡纳滨对虾饲料中添加磷虾粉能够提高其肝胰腺中虾青素的含量[19]。目前，关于凡纳滨对虾体色调控的研究较少，本实验在对虾配合饲料中添加南极磷虾粉，在探讨其对凡纳滨对虾生长、体组分影响的基础上，进一步研究饲喂南极磷虾粉对凡纳滨对虾体色的影响及其机制，以期为凡纳滨对虾的体色调控研究提供参考，并为改善工厂化养殖凡纳滨对虾的体色提供可行性方案。
1. 材料与方法
1.1 饲料制备
本实验所用南极磷虾购自中水集团远洋股份有限公司，体长为 (2.45±0.13) cm。磷虾解冻、沥干，用鱼肉采肉机进行脱壳处理，然后放入真空冷冻干燥机冻干后，用粉碎机粉碎成磷虾粉，其营养成分 (质量分数) 为粗蛋白 (65.41±0.28)%、粗脂肪 (13.27±0.00)%、灰分 (11.86±0.03)%。以对虾配合饲料 (正大集团南美白对虾配合饲料9061) 为基础，分别制成含有南极磷虾粉5%、10%、15%和20%的4种实验饲料。实验饲料配制方法如下：对虾配合饲料粉碎后，按照相应比例添加南极磷虾粉，然后加入水和海藻酸钠 (饲料质量的0.5%) 揉成面团，进制粒机压制成粒径约2 mm的颗粒饲料，55 ℃烘箱中烘干至水分低于10%后，将实验饲料封装，常温干燥保存。所配置的实验饲料营养成分分析见表1。
表 1 实验饲料营养水平分析 (风干质量)Table 1. Nutritional composition of experimental diets (Air-dry mass)项目Item 南极磷虾粉质量分数Mass fraction of E. superba powder/% 0 5 10 15 20 粗蛋白质量分数Crude protein mass fraction/% 44.68 44.17 45.32 45.36 45.37 粗脂肪质量分数Crude fat mass fraction/% 8.54 8.55 8.77 9.14 9.78 灰分质量分数Ash mass fraction/% 12.25 11.86 12.03 11.78 12.00 水分质量分数Moisture mass fraction/% 5.43 8.80 7.95 10.09 9.09 虾青素质量分数 Astaxanthin mass fraction/ (mg·kg−1) 1.19 1.68 2.05 2.66 2.96 1.2 实验设计与日常管理
实验于室内循环水养殖系统中完成，该系统由玻璃水缸 (50 cm×35 cm ×35 cm, 50 L)、沙滤罐、紫外灭菌装置和泡沫分离器组成。实验所用凡纳滨对虾体质量为 (7.27±0.88) g，运抵实验室后，先在系统中暂养7 d，挑选健康、规格相当的对虾450尾用于实验。设置5个实验组，分别投喂含南极磷虾粉0% (S0组)、5% (S5组)、10% (S10组)、15% (S15组) 和20% (S20组) 的配合饲料。每个实验组设置6个重复，每个重复15尾，每个玻璃水缸为1个实验重复，其中3个重复用于样品采集，另外3个用于计算对虾的生长和成活率。实验对虾每天于07:00、12:00、17:30、21:30投喂，根据残饵量相应调整下次的投喂量，每次投喂1 h后虹吸出水体中的粪便残饵。养殖实验持续 35 d，养殖期间系统内水温 26~28 ℃，盐度 (29±0.5)‰，氨氮质量浓度<0.3 mg·L−1，pH 7.7~7.9，溶解氧质量浓度＞6 mg·L−1。
1.3 对虾样品采集与分析
1.3.1 样品的采集
分别于实验第0、第7、第14、第21、第28和第35天随机从各组取6 尾对虾，取其肝胰腺、肌肉和甲壳，经液氮快速冷冻后放入–80 ℃ 超低温冰箱保存待测。测定指标包括肝胰腺及甲壳 (腹部) 虾青素含量，肝胰腺中LVPBP75基因表达水平。第35天，随机从各组取3尾对虾，测定全虾体成分，另取6尾测量体色。
1.3.2 虾青素的测定
根据Yi等[20]的方法，用分光光度计测定对虾肝胰腺、甲壳及饲料中虾青素含量。取0.2 g组织样品或0.8 g饲料样品于试管中，加入8 mL乙酸乙酯+乙醇混合液 (体积比1∶1) 匀浆，4 000×g离心5 min后移取上清液，将上述沉淀用4 mL乙酸乙酯和8 mL正己烷分别提取1次，最后将三者上清液集中后用高纯氮吹干。将吹干后的色素溶于4 mL色谱纯丙酮 (含质量分数为0.05% BHT) 中，混匀，10 000×g离心5 min。虾青素对应的吸收峰在474 nm处，其在丙酮中474 nm处消光系数为E(1%,1 cm)，1 cm=1 900。虾青素质量分数 (mg·kg−1)=10 000V×A/W/E(1%,1 cm)×1%，V为提取液的体积 (mL)；A为吸光度值；W为样品质量 (g)。
1.3.3 基因表达水平测定
LVPBP75基因表达水平测定使用的引物如表2 所示，β-ACTIN为内参基因。测定方法如下：肝胰腺总RNA的提取采用RNAiso-Plus (TaKaRa，日本) 试剂盒进行，根据说明书所示步骤进行操作。RNA浓度和纯度的检测使用 Nanodrop2000，完整性检测使用琼脂糖凝胶电泳完成。使用 Prime ScriptTM RT reagent Kit 试剂盒 (TaKaRa，日本) 处理以合成第一链 cDNA。参照 SYBR® Premix Ex Taq™ II (TaKaRa，日本) 的说明书，在 RT-PCR 扩增仪 (BIO-RAD CFX96，美国) 中进行实时PCR。扩增体系为20 μL：10 μL TB GreenPremix Ex Taq II (2×) (Tli RNaseH Plus)，Bulk，0.8 μL 正向引物 (10 μmol·L−1)，0.8 μL 反向引物 (10 μmol·L−1)，0.4 μL ROX Reference Dye (50×)，2 μL cDNA，6 μL ddH2O。其程序设定为：95 ℃预变性10 s，95 ℃运行10 s，60 ℃复性30 s，共40个循环，反应结束时进行熔解曲线分析，检测反应特异性。以各取样点的S0组作为标准，使用2−ΔΔCT方法计算相对基因表达水平。
表 2 本研究中使用的引物序列Table 2. Real-time PCR primer sequences used in present study引物Primer 引物序列 (5'—3') Primer sequence (5'–3') LVPBP75-F TGGGCATCCTTTGTCGGCAATG LVPBP75-R CATAGAGGGGAGGGAGCACCAC β-ACTIN-F ACCACCGCTGCTTCCTCCTC β-ACTIN-R CGGATGTCCACGTCGCACTTC 1.3.4 体组成测定
全虾样品在105 ℃烘干至恒质量测定水分，粗蛋白质采用全自动凯氏定氮仪测定，粗脂肪采用氯仿甲醇法测定，粗灰分采用550 ℃马弗炉灼烧法测定。
1.3.5 体色测定
将虾放入冰水桶中直至死亡，而后使用NR-200型色差仪 (三恩时，中国) 分别测量头胸甲和甲壳 (腹部2~3节) 处的体色。将测量完的虾放入100 ℃水中煮4 min后采用同样方法测量对虾体色。对虾体色采用国际发光照明委员会 (CIE) 的标准由L* (亮度值)、a* (红色值)、b* (黄色值) 表示[21-22]。
1.4 生长等相关指标的计算
对虾的成活率 (SR)、体质量增长率 (WGR) 和特定生长率 (SGR) 的计算公式如下：
$$ \mathrm{SR}=N_{{t}} / N_{0} \times 100 {\text{%}}$$ (1) $$ \mathrm{WGR}=\left[\left(W_{{t}}-W_{0}\right) / W_{0}\right] \times 100 {\text{%}}$$ (2) $$ \mathrm{SGR}=\left[\left(\ln W_{{{t}}}-\ln W_{0}\right) / t \right] \times 100 {\text{%}} $$ (3) 式中： N0表示凡纳滨对虾的放养数量；Nt表示凡纳滨对虾终末数量； W0表示凡纳滨对虾初始体质量 (g)；Wt表示凡纳滨对虾终末体质量 (g)；t表示实验时间 (d)。
1.5 数据分析
数据以“平均值±标准差 (
$ \overline { X}\pm { \rm {SD}} $ )”表示，所有数据分别采用Shapiro-Wilk测试和Levene测试检验其正态性和方差齐性，对不满足的数据进行lg转换并再次检验其正态性与方差齐性，若通过检测则采用单因素方差 (One-way ANOVA, LSD) 分析和Turkey's多重比较进行显著性分析，否则采用Kruskal-Wallis测试进行非参检验，以P<0.05作为差异显著水平。所有数据分析使用SPSS 25.0软件完成。2. 结果
2.1 对虾的生长和存活
饲料中添加南极磷虾粉对对虾生长和存活的影响见表3。添加南极磷虾粉的各组对虾终末体质量 (FBW)、WGR和SPR均高于S0组，且随着添加量的增加呈先升高后降低的趋势；其中，S15组的FBW、WGR、SGR显著高于S0组 (P<0.05)。饲料中添加南极磷虾粉能够提高对虾的成活率，各实验组较S0组提高了10%~20%，其中S10组对虾成活率显著高于S0组 (P<0.05)。
表 3 各组对虾生长性能和成活率Table 3. Growth performance and survival rate of shrimps in each group项目 Item 组别 Group S0 S5 S10 S15 S20 终末体质量 Final body mass/g 22.14±1.78b 23.62±3.02ab 25.10±3.76ab 26.35±2.56a 25.09±3.18ab 体质量增长率 Weight gain rate/% 204.41±24.53b 224.78±41.57ab 245.16±51.72ab 262.35±35.15a 245.03±43.78ab 特定生长率 Specific growth rate/(%·d−1) 3.17±0.24b 3.35±0.36ab 3.51±0.41ab 3.67±0.27a 3.52±0.35ab 成活率 Survival rate/% 46.67±0.00b 66.67±0.00ab 77.78±16.78a 66.67±0.00ab 57.78±10.18ab 注：同行数据不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)；下表同此。 Note: Values with different lowercase letters within the same row indicate significant difference (P<0.05). The same case in the following tables. 2.2 对虾肝胰腺和甲壳中虾青素含量
饲料中添加南极磷虾粉对对虾肝胰腺中虾青素含量的影响见图1。实验过程中，各组对虾肝胰腺中的虾青素含量呈上升趋势。S5组肝胰腺虾青素含量低于S0组，且在第7、第28天时达到显著水平 (P<0.05)。整体上，S10组肝胰腺中虾青素含量与S0组无显著性差异，而S15和S20组肝胰腺中虾青素含量高于S0组，且在第7、第14、第21、和第28天时具有显著性差异 (P<0.05)。
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图 1 各组对虾肝胰腺中虾青素质量分数的变化注：同组数据上标不同字母表示组间差异显著 (P<0.05)；后图同此。Figure 1. Variation of astaxanthin mass fraction in hepatopancreas of shrimps in each groupNote: Different letters within the same group indicate significantdifference among the groups (P<0.05). The same case inthe following figures.饲料中添加南极磷虾粉对对虾甲壳中虾青素含量的影响见图2。实验过程中，S15和S20组甲壳中虾青素的含量显著高于S0组 (P<0.05)。整体上，S10组甲壳中虾青素含量与S0组差异不显著，而S5组甲壳中虾青素含量低于S0组，且在一些时间点上具有显著性差异(P<0.05)。
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图 2 各组对虾甲壳虾青素质量分数的变化Figure 2. Variation of astaxanthin mass fraction in carapace of shrimps in each group2.3 对虾的体成分
饲料中添加南极磷虾粉对对虾体成分的影响见表4。各组的灰分、粗蛋白质、水分差异不显著(P>0.05)。饲料中添加南极磷虾粉的各组粗脂肪含量高于S0组，且随着添加量的增加呈现逐渐升高的趋势；其中，S10、S15和S20组的粗脂肪含量显著高于S0组 (P<0.05)。
表 4 各组对虾体组分Table 4. Body composition of shrimps in each group% 项目Item 组别 Group S0 S5 S10 S15 S20 粗蛋白质 Crude protein 74.49±0.81a 73.03±1.16a 73.51±1.30a 75.53±1.16a 74.66±1.63a 粗脂肪 Crude fat 10.42±0.73de 11.57±0.50cd 12.34±0.75bc 13.18±0.21ab 14.46±0.32a 粗灰分 Ash 11.10±0.07 10.50±0.17 11.53±0.38 11.16±0.18 10.39±0.99 水分 Moisture 74.16±0.10 75.69±2.02 73.44±0.69 74.53±1.69 74.63±0.92 注：除水分数据是湿质量测量外，其他成分均为干质量测量。 Note: The crude protein, crude fat and ash are dry mass measurement, while the moisture is wet mass measurement. 2.4 对虾肝胰腺中LVPBP75基因表达水平
饲料中添加南极磷虾粉对对虾肝胰腺中LVPBP75基因表达水平的影响见图3。前21 d，S5组LVPBP75基因表达水平低于S0组，且在第7和第21天时有显著性差异 (P<0.05)。21 d后，S5组LVPBP75基因表达水平高于S0组，但差异不显著。21 d后，S10组LVPBP75基因表达水平显著高于S0组 (P<0.05)。整个实验过程中，S15和S20组肝胰腺中LVPBP75基因表达水平显著高于S0组 (P<0.05)。
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图 3 各组对虾肝胰腺中LVPBP75表达水平Figure 3. Expression level of LVPBP75 in hepatopancreas of shrimps in each group2.5 对虾的体色
随着南极磷虾粉添加量的升高，对虾生虾头胸甲和腹部甲壳的L*值呈下降趋势，且显著低于S0组 (P<0.05)。各组对虾头胸甲和腹部甲壳a*无显著性差异。随着南极磷虾粉添加量的升高，对虾头胸甲和腹部甲壳的b*值呈下降趋势，S20组头胸甲b*值及S10、S15和S120组腹部甲壳b*值显著低于S0组 (P<0.05，表5)。随着饲料中南极磷虾粉添加量的不断提高，生虾青灰色呈逐渐变深的趋势，S15与S20组变深较明显 (图4-a)。
表 5 各组对虾甲壳亮度值、红色值和黄色值Table 5. L*, a*and b*of shrimp exoskeleton in each group头胸甲 Cephalothorax 腹部甲壳 Carapace 亮度值 L* 红色值 a* 黄色值 b* 亮度值 L* 红色值 a* 黄色值 b* 生虾 Raw shrimp S0 44.69±2.07a 0.16±0.88 5.57±0.28a 36.55±1.83a 0.20±1.01 5.52±0.63a S5 39.43±2.61b 0.53±1.53 5.18±0.63ab 33.28±1.71bc 0.70±0.79 4.65±0.71a S10 34.53±1.31c −0.17±1.36 4.24±0.78bc 34.19±1.77b −0.11±0.28 2.09±0.66b S15 32.14±1.12d 0.70±1.05 4.53±0.74ab 31.46±1.96c −0.89±0.70 −1.26±1.25c S20 31.80±1.06d −0.38±0.62 3.54±0.56c 32.71±0.92bc 0.27±0.47 1.31±0.38b 熟虾 Cooked shrimp S0 43.62±0.98d 9.39±0.60b 11.24±1.16c 76.45±0.22a 9.94±0.35bc 16.06±0.78b S5 61.19±0.82b 9.23±0.33b 18.85±0.33b 71.48±0.28b 9.45±0.35c 13.22±0.29c S10 66.63±2.31a 9.28±2.13b 24.25±0.23a 69.08±0.48c 11.21±0.36b 16.42±1.00ab S15 56.43±2.64c 10.36±0.16ab 18.71±1.11b 65.25±0.20d 18.44±1.30a 15.95±0.24b S20 61.06±0.66b 13.69±1.65a 23.13±0.80a 62.88±0.73e 20.36±0.89a 17.71±0.35a ![]()
图 4 实验结束时各组对虾生虾 (a) 和熟虾 (b) 的体色Figure 4. Color of raw shrimps (a) and cooked shrimps (b) in each group at end of experiment随着南极磷虾粉添加量的不断升高，对虾熟虾头胸甲L*值呈升高趋势，且显著高于S0组 (P<0.05)，而腹部甲壳的L*值则呈相反的变化趋势。整体上，随着南极磷虾粉添加量的不断升高，对虾头胸甲和腹部甲壳a*和b*值呈升高趋势 (表5)。随着饲料中南极磷虾粉添加量的不断提高，熟虾橙红色呈逐渐变深的趋势，S15与S20组变深较明显 (图4-b)。
3. 讨论
3.1 饲料中添加南极磷虾粉对对虾生长及存活的影响
本实验中，饲料中添加南极磷虾粉促进了对虾生长并提高了成活率。Nunes等[23]研究发现，使用南极磷虾粉替代凡纳滨对虾饲料中的鱼粉可以提高对虾的生长性能与成活率。此外，Shan等[19]研究发现饲料中添加南极磷虾粉可以提高对虾的体质量增长率与特定生长率。南极磷虾营养丰富，含有丰富的磷虾油，磷虾油具有促进对虾摄食与生长的作用[15,24]。饲料中添加南极磷虾粉能够促进对虾的生长可能与引入的磷虾油有关。另一方面，对虾的生长受饲料粗脂肪水平影响[25]，向饲料中添加南极磷虾粉显著提高了饲料中的粗脂肪含量，对对虾的生长可能起到促进作用。
对虾的成活率受到多种因素影响，其中，增加饲料中虾青素的含量可以提高凡纳滨对虾的成活率[26]。温为庚等[27]发现斑节对虾的成活率同样受饲料中虾青素含量的影响。本实验通过向饲料中添加南极磷虾粉显著提高了饲料中的虾青素含量，这可能是对虾成活率提高的主要原因；但由于全价配合饲料中含有一定量的虾青素，使得实验效果不显著，可以通过调整饲料配方，使用不含虾青素的饲料为对照组，探明通过向饲料中添加南极磷虾粉提高饲料中虾青素含量对对虾成活率的影响。
3.2 饲料中添加南极磷虾粉对对虾体成分的影响
本研究发现，饲料中添加南极磷虾粉可显著提高对虾体内的粗脂肪含量。已有研究表明，随着饲料中粗脂肪含量的提高，凡纳滨对虾体内的粗脂肪含量也随之增加[28-29]。本研究中，随着南极磷虾粉添加比例的不断提高，实验饲料中粗脂肪含量也不断增加，这可能是对虾体内粗脂肪含量提高的主要原因。王猛强等[25]发现，虾体中粗脂肪的含量会随饲料粗脂肪水平的上升而增加，与本研究结果一致。此外，南极磷虾油中二十碳五烯酸 (EPA) 和二十二碳六烯酸 (DHA) 等n-3长链多不饱和脂肪酸多以磷脂的形式存在，具有更好的生物利用度和生理活性，南极磷虾油还具有调节动物肝脏脂质代谢相关基因表达的作用[30-31]。对虾体内粗脂肪含量的提高可能与饲料中添加磷虾粉从而提高了饲料中的南极磷虾油含量有关。然而，一些研究表明饲料中添加南极磷虾粉对养殖生物的某些体成分不会产生影响，将其添加到珍珠龙胆石斑鱼 (Epinephelus fuscoguttatus ♀×E. lanceolatus ♂) 饲料中不会对幼鱼粗蛋白、粗灰分产生显著影响[32]；不同水平南极磷虾粉的添加对大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 水分、粗蛋白、粗灰分含量无显著影响[33]。本实验中，饲料中添加南极磷虾粉并未对对虾全虾水分、灰分、粗蛋白质含量产生显著影响，可能与南极磷虾粉添加之后并未对饲料中粗蛋白含量产生显著影响有关。
3.3 饲料中添加南极磷虾粉对对虾组织中虾青素含量的影响
本研究发现，当饲料中南极磷虾粉添加比例高于10%时，对虾组织中虾青素的含量显著提高。对虾自身无法直接合成虾青素，从食物中摄取的虾青素通过消化系统运输到体内[5,7,10]。南极磷虾粉中含有丰富的虾青素[34]，因此向饲料中添加南极磷虾粉是提高对虾体内虾青素含量的有效措施。有研究表明，饲料中添加含虾青素物质能够提高对虾甲壳及肝胰腺中虾青素的含量[35-36]，与本研究结果一致。当饲料中南极磷虾粉添加比例为5%时，对虾肝胰腺中虾青素含量显著下降；这意味着，饲料中虾青素的含量与其在对虾体内的沉积量并非直接的线性关系，摄入更多的虾青素可能不利于其积累，在对中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 与红罗非鱼 (Oreochromis mossambicus × O. niloticus) 的研究中也发现了此现象[37-38]。此外，崔广同等[39]发现饲料中磷脂含量能够影响甲壳动物外源虾青素的积累和内源虾青素的调用。本研究中，南极磷虾粉的添加不仅改变了饲料中粗脂肪的含量，还可能会改变饲料中的脂类组成，进而影响虾青素在对虾体内的积累与调用。综上，饲料中添加适量的南极磷虾粉不仅可以通过提高虾青素的摄入来促进凡纳滨对虾体内虾青素的沉积，还可通过改变饲料中脂类组成来影响其对虾青素的积累与调用。
3.4 饲料中添加南极磷虾粉对对虾体色的影响
研究表明，饲料缺乏虾青素会导致斑节对虾体色呈浅蓝色，当向饲料中添加虾青素，对虾体色又可恢复为健康的棕绿色[8]；饲料中添加虾青素也可增强中华绒螯蟹体色[37,40]。由此可见，虾青素是影响甲壳动物体色的重要因素。本研究中，随着南极磷虾粉添加比例的不断提高，饲料中虾青素的含量也逐渐升高。对虾体色的增强正是南极磷虾粉的添加使饲料中虾青素含量提升的结果。L*a*b*颜色体系中，L*越小，颜色越深；a*越大，颜色越倾向于红色；b*越小，颜色越倾向于蓝色。从生虾的体色来看，随着南极磷虾粉添加比例的提高，其L*逐渐降低，体色变深；从熟对虾的体色来看，随着南极磷虾粉添加比例的不断提高，a*逐渐增大，对虾体色越红。有研究表明，向凡纳滨对虾饲料中添加虾青素能够显著提高熟对虾的a*[41]，与本结果一致。综上，饲料中添加南极磷虾粉是增强对虾体色的有效方法。
3.5 饲料中添加南极磷虾粉对对虾体内LVPBP75表达水平的影响
本实验中，随着饲料中南极磷虾粉添加比例的不断提高，对虾肝胰腺中LVPBP75基因表达水平逐渐增强。LVPBP75是凡纳滨对虾体内一种调控基因，在肝胰腺中表达最高，其表达的色素结合蛋白可与虾青素结合[42]。常温状态下，该色素结合蛋白与虾青素结合呈青色，其含量越高，对虾体色越深；加热后与其结合的虾青素释放出来，LVPBP75基因表达越强，释放出来的虾青素越多，对虾体色越红。因而，LVPBP75基因的表达量与体色有直接关系。目前，关于LVPBP75基因的调控机制尚不明确。本实验中，随着对虾体内虾青素含量的不断提高，肝胰腺中LVPBP75基因表达逐渐增强，表明在凡纳滨对虾体内，LVPBP75基因的表达受体内虾青素含量的影响，且与虾青素的含量呈正相关。
4. 结论
向凡纳滨对虾饲料中添加南极磷虾粉能够提高其终末体质量、体质量增长率和特定生长率，当添加比例为15%时效果显著。随着南极磷虾粉添加比例的不断提高，凡纳滨对虾体成分中粗脂肪与虾青素含量呈逐渐上升的趋势，与体色相关的LVPBP75基因的表达呈逐渐增强的趋势，对虾体色变深。因此，饲料中添加南极磷虾粉能够促进对虾生长，提高其体内虾青素的含量和LVPBP75基因的表达水平，改善体色。
致谢：感谢卢丹、陈通、司健男三位同学在投喂及取样过程中提供的帮助。
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图 1 各组对虾肝胰腺中虾青素质量分数的变化
注：同组数据上标不同字母表示组间差异显著 (P<0.05)；后图同此。
Figure 1. Variation of astaxanthin mass fraction in hepatopancreas of shrimps in each group
Note: Different letters within the same group indicate significantdifference among the groups (P<0.05). The same case inthe following figures.
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图 2 各组对虾甲壳虾青素质量分数的变化
Figure 2. Variation of astaxanthin mass fraction in carapace of shrimps in each group
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图 3 各组对虾肝胰腺中LVPBP75表达水平
Figure 3. Expression level of LVPBP75 in hepatopancreas of shrimps in each group
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图 4 实验结束时各组对虾生虾 (a) 和熟虾 (b) 的体色
Figure 4. Color of raw shrimps (a) and cooked shrimps (b) in each group at end of experiment
表 1 实验饲料营养水平分析 (风干质量)
Table 1 Nutritional composition of experimental diets (Air-dry mass)
项目Item 南极磷虾粉质量分数Mass fraction of E. superba powder/% 0 5 10 15 20 粗蛋白质量分数Crude protein mass fraction/% 44.68 44.17 45.32 45.36 45.37 粗脂肪质量分数Crude fat mass fraction/% 8.54 8.55 8.77 9.14 9.78 灰分质量分数Ash mass fraction/% 12.25 11.86 12.03 11.78 12.00 水分质量分数Moisture mass fraction/% 5.43 8.80 7.95 10.09 9.09 虾青素质量分数 Astaxanthin mass fraction/ (mg·kg−1) 1.19 1.68 2.05 2.66 2.96 
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表 2 本研究中使用的引物序列
Table 2 Real-time PCR primer sequences used in present study
引物Primer 引物序列 (5'—3') Primer sequence (5'–3') LVPBP75-F TGGGCATCCTTTGTCGGCAATG LVPBP75-R CATAGAGGGGAGGGAGCACCAC β-ACTIN-F ACCACCGCTGCTTCCTCCTC β-ACTIN-R CGGATGTCCACGTCGCACTTC
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表 3 各组对虾生长性能和成活率
Table 3 Growth performance and survival rate of shrimps in each group
项目 Item 组别 Group S0 S5 S10 S15 S20 终末体质量 Final body mass/g 22.14±1.78b 23.62±3.02ab 25.10±3.76ab 26.35±2.56a 25.09±3.18ab 体质量增长率 Weight gain rate/% 204.41±24.53b 224.78±41.57ab 245.16±51.72ab 262.35±35.15a 245.03±43.78ab 特定生长率 Specific growth rate/(%·d−1) 3.17±0.24b 3.35±0.36ab 3.51±0.41ab 3.67±0.27a 3.52±0.35ab 成活率 Survival rate/% 46.67±0.00b 66.67±0.00ab 77.78±16.78a 66.67±0.00ab 57.78±10.18ab 注：同行数据不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)；下表同此。 Note: Values with different lowercase letters within the same row indicate significant difference (P<0.05). The same case in the following tables.
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表 4 各组对虾体组分
Table 4 Body composition of shrimps in each group
% 项目Item 组别 Group S0 S5 S10 S15 S20 粗蛋白质 Crude protein 74.49±0.81a 73.03±1.16a 73.51±1.30a 75.53±1.16a 74.66±1.63a 粗脂肪 Crude fat 10.42±0.73de 11.57±0.50cd 12.34±0.75bc 13.18±0.21ab 14.46±0.32a 粗灰分 Ash 11.10±0.07 10.50±0.17 11.53±0.38 11.16±0.18 10.39±0.99 水分 Moisture 74.16±0.10 75.69±2.02 73.44±0.69 74.53±1.69 74.63±0.92 注：除水分数据是湿质量测量外，其他成分均为干质量测量。 Note: The crude protein, crude fat and ash are dry mass measurement, while the moisture is wet mass measurement.
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表 5 各组对虾甲壳亮度值、红色值和黄色值
Table 5 L*, a*and b*of shrimp exoskeleton in each group
头胸甲 Cephalothorax 腹部甲壳 Carapace 亮度值 L* 红色值 a* 黄色值 b* 亮度值 L* 红色值 a* 黄色值 b* 生虾 Raw shrimp S0 44.69±2.07a 0.16±0.88 5.57±0.28a 36.55±1.83a 0.20±1.01 5.52±0.63a S5 39.43±2.61b 0.53±1.53 5.18±0.63ab 33.28±1.71bc 0.70±0.79 4.65±0.71a S10 34.53±1.31c −0.17±1.36 4.24±0.78bc 34.19±1.77b −0.11±0.28 2.09±0.66b S15 32.14±1.12d 0.70±1.05 4.53±0.74ab 31.46±1.96c −0.89±0.70 −1.26±1.25c S20 31.80±1.06d −0.38±0.62 3.54±0.56c 32.71±0.92bc 0.27±0.47 1.31±0.38b 熟虾 Cooked shrimp S0 43.62±0.98d 9.39±0.60b 11.24±1.16c 76.45±0.22a 9.94±0.35bc 16.06±0.78b S5 61.19±0.82b 9.23±0.33b 18.85±0.33b 71.48±0.28b 9.45±0.35c 13.22±0.29c S10 66.63±2.31a 9.28±2.13b 24.25±0.23a 69.08±0.48c 11.21±0.36b 16.42±1.00ab S15 56.43±2.64c 10.36±0.16ab 18.71±1.11b 65.25±0.20d 18.44±1.30a 15.95±0.24b S20 61.06±0.66b 13.69±1.65a 23.13±0.80a 62.88±0.73e 20.36±0.89a 17.71±0.35a
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