Anesthetic effect and tissue oxidative injury for Litopenaeus vannamei by two anesthetics
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摘要: 为明确丁香酚和MS-222对凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 的麻醉效果及相同效果下造成的二次应激，为两种麻醉剂在凡纳滨对虾中的应用提供参考数据与实验依据。研究了不同质量浓度丁香酚 (20、30、40、60、80、100、120、140和160 mg·L−1) 和MS-222 (800、900、1 000、1 100、1 200、1 300、1 400、1 500和1 600 mg·L−1) 对体质量为 (14±3) g凡纳滨对虾的麻醉效果，以及相同效果下对其机体生理和组织形态的影响。结果表明：1) 丁香酚和MS-222的质量浓度分别为80和1 400 mg·L−1时，对虾在3 min内进入深度麻醉阶段，5 min内恢复正常；2) 使用这两种麻醉剂均会造成对虾的鳃和肝胰腺组织损伤，其中丁香酚组的鳃组织各项抗氧化指标早于MS-222组达到峰值；丁香酚组Caspase-3活性在麻醉复苏后6 h显著降低，而MS-222组则显著升高 (P<0.05)；丁香酚组和MS-222组的Na+/K+-ATP酶活性显著降低 (P<0.05)；组织形态分析显示两种麻醉剂均会引起对虾鳃和肝胰腺产生不同程度的变形或裂解损伤，而在麻醉复苏后6 h丁香酚组恢复正常。综上，丁香酚和MS-222对凡纳滨对虾均有麻醉效果，但MS-222所需浓度更高，且对机体造成的二次应激损伤更为严重。Abstract: To provide references for the application of two anesthetics in Litopenaeus vannamei, we studied the anesthetic effects of eugenol (20, 30, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160 mg·L−1) and MS-222 (800, 900, 1 000, 1 100, 1 200, 1 300, 1 400, 1 500, 1 600 mg·L−1) on L. vannamei with body mass of (14±3) g. Besides, we tested the secondary stress injury on the physiological functions and pathomorphologic changes by the two anesthetics. The results show that: 1) Eugenol of 80 mg·L−1and MS-222 of 1 400 mg·L−1 induced L. vannamei to enter the stage of deep anesthetic within 3 min, and return to the normal stage within 5 min. 2) The gills and hepatopancreas of L. vannamei were injured by the two anesthetics, and the antioxidant indexes of gills in the eugenol group reached the maximum value earlier than the MS-222 group. The Caspase-3 activity in the eugenol group decreased significantly after anesthesia recovery of 6 h, while that in the MS-222 group increased significantly (P<0.05). The Na+/K+-ATPase activity in both the groups decreased significantly (P<0.05). Pathomorphologic analysis shows that the two anesthetics could cause deformation or lysis of gills and hepatopancreas, and the eugenol group could recover after anesthesia recovery of 6 h. In conclusion, eugenol and MS-222 have anesthetic effects on L. vannamei, but the concentration of MS-222 is higher and the secondary stress damage to the body is more serious.
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Keywords:
- Litopenaeus vannamei /
- Eugenol /
- MS-222 /
- Anesthetic effect /
- Stress injury
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凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 因具有口感佳、广盐性、抗病力强、生长快等特性，深受消费者和养殖户喜爱。自20世纪90年代引入中国以来，养殖范围不断扩大，已然是我国最主要的养殖对虾品种，2020年中国凡纳滨对虾养殖产量达186万吨[1]，占全国对虾养殖总产量的87.8%。
在水产养殖操作和流通过程中，捕捞、运输和离水操作等均会对虾类造成不同程度的应激和损伤，进而影响其生长、存活和动物福利。麻醉是降低水产动物人为操作应激损伤的有效手段之一，能诱导机体意识休眠、舒缓镇定，抑制中枢神经从而减轻对外界刺激的反应，有效降低活动量和新陈代谢[2-3]。MS-222 (间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐) 和丁香酚作为常见渔用麻醉剂[4]，MS-222是美国食品和药物管理局 (Food and drug administration, FDA) 唯一批准的食用鱼麻醉剂，需要21 d的休药期[5]；丁香酚是天然植物提取物，中国许可其用于食用香精调配[6]，而且日本批准FA-100 (含10%的丁香酚) 可作为鱼用麻醉剂，需7 d左右的休药期[7]。这两种麻醉剂已见报道于大口黑鲈 (Micropterus salmoides)[8]、美洲鲥 (Alosa sapidissima)[9]、暗纹东方鲀 (Takifugu obscurus)[10]和大黄鱼 (Larimichthys crocea)[11]等鱼类的麻醉与麻醉生理生化相关研究。研究发现，麻醉剂虽可降低操作带来的应激损伤，但麻醉反应自身也会对机体造成二次应激，国内外关于丁香酚和MS-222对虾类的麻醉研究主要集中在麻醉效应[12-13]和呼吸频率[14-15]等生理与行为学相关领域，有关麻醉剂使用带来的二次应激损伤等副作用分析尚未见报道。本实验通过研究丁香酚和MS-222对凡纳滨对虾的麻醉效果，及相同麻醉效果下这两种麻醉剂对其鳃和肝胰腺组织抗氧化能力、细胞凋亡指标、渗透调节和组织形态的影响，为麻醉剂科学应用于凡纳滨对虾提供参考数据与实验依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
凡纳滨对虾的获取、暂养和实验均在广东南湾水产有限公司开展。实验虾平均体质量为 (14±3) g，共200尾，暂养于300 L玻璃纤维桶中7 d。期间，日投喂对虾配合饲料 (阳江卜蜂水产有限公司) 3次，日投喂量为对虾体质量的3%~5%，投喂后2 h吸底1次，日换水量50%，水温 (30±0.5) ℃、盐度25‰、pH 8.5±0.2，溶解氧质量浓度≥6 mg·L−1，自然光周期。实验用丁香酚 (纯度≥99.9%) 购自吉安华硕香料油有限公司，与无水乙醇按体积比1∶9制成母液[16]。MS-222购自青岛文鼎商贸有限公司，与碳酸氢钠按质量比1∶1混溶于纯水[17] 制成母液。以上麻醉剂母液在使用当天制备。
1.2 实验方法:
1.2.1 麻醉效果实验
麻醉实验于塑料圆桶 (直径：28 cm，高：34 cm，容积：21 L) 中进行，实验水体12 L。丁香酚和MS-222分别按终质量浓度20、30、40、60、80、100、120、140、160 mg·L−1和800、900、1 000、1 100、1 200、1 300、1 400、1 500、1 600 mg·L−1，各设置9个梯度组。
实验虾经停食24 h后用于麻醉实验，每个梯度组设置6尾，每尾虾单独观察记录并只使用1次；每重复3尾虾更换新配溶液。参照平洪领等[18]的分类标准，根据对虾对外界刺激的反应程度、游泳足摆动状态和身体平衡状况综合判断麻醉程度，将麻醉诱导分为6个阶段，复苏过程分为4个阶段 (表1)。麻醉后置于圆桶中进行清水复苏，气石充气，溶解氧质量浓度≥6 mg·L−1，1 h内未苏醒且观察颚舟片摆动停止则判定为死亡，麻醉后能复苏的尾数占总数的比例为复苏率，继续饲养观察48 h，计算成活率。
表 1 麻醉与复苏阶段虾类行为特征Table 1. Behavioral characteristics of shrimps at anaesthesia and recovery stages状态 State 行为特征Behavioral characteristics 麻醉阶段Anaesthesia stage A0 正常 正常游动，对外界刺激反应迅速 A1 镇静 游动缓慢，对外界刺激反应迟钝 A2 轻度麻醉 游泳足缓慢摆动，对外界刺激反应微弱 A3 中度麻醉 游泳足轻微摆动，失去平衡，水底侧游 A4 深度麻醉 游泳足停止摆动，水底侧躺，无反应 A5 死亡 颚舟片摆动停止 复苏阶段 Recovery stage R1 轻度恢复 游泳足开始无规则摆动，对外界刺激无反应 R2 中度恢复 游泳足有规律摆动，外界刺激后有逃跑意识 R3 平衡恢复 恢复平衡，游动无规律 R4 正常 游动正常，对外界刺激反应灵敏 参照Marking和Meyer[4]的麻醉浓度确定标准，结合对虾实际情况，建立本实验有效麻醉浓度设定标准为：3 min内进入A4麻醉阶段，5 min内到达R4复苏阶段，复苏率和成活率均为100%。
1.2.2 样品的采集与处理
按照麻醉效果实验获得的麻醉剂质量浓度，设置丁香酚麻醉组、MS-222麻醉组和对照组，每组4个重复，每个重复5尾对虾，共20尾置于12 L相同圆桶中，水温30 ℃，气石充气。分别在麻醉复苏后第3 和第6小时取样，每个重复组取2尾，经体积分数为75%的乙醇体表消毒后，冰盘上剖取鳃和肝胰腺组织，取其中5份样品分别置于1.5 mL离心管中，液氮速冻后−80 ℃保存，用于酶学分析；其余3份分别置于5 mL离心管中，4% (体积分数) 多聚甲醛保存，用于组织学分析。
1.2.3 抗氧化相关指标测定
样品用预冷生理盐水漂洗去除组织液，滤纸拭干，称质量后加入9倍体积的生理盐水，经均质机低温研磨制成10%组织匀浆液，再在4 ℃下2 000 r·min−1离心15 min，取上清液用于总蛋白 (TP)、超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、丙二醛 (MDA)、谷胱甘肽S-转移酶 (GST)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、总抗氧化能力 (T-AOC) 和蛋白羰基指标的测定，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，按照说明书方法进行操作。
1.2.4 细胞凋亡相关指标测定
组织样品经裂解后，采用ELISA检测方法，Spark酶标仪 (广东市深华生物技术有限公司) 测定Caspase-3、热休克蛋白70 (HSP70) 和细胞色素C (Cyt-C) 的含量，试剂盒来源同上。
1.2.5 渗透调节相关指标测定
组织中Na+/K+-ATP酶的测定是通过组织蛋白中分解ATP产生无机磷的量，判断Na+/K+-ATP酶活力，试剂盒来源同上。
1.2.6 组织形态观察
组织样品于4% (体积分数) 多聚甲醛中固定24 h后，分别经流水冲洗、梯度乙醇 (体积分数：70%、80%、90%和100%) 脱水、二甲苯透明和石蜡包埋后用切片机制成4 μm的组织切片，以苏木精和伊红染料染色，于光学显微镜下观察并拍照。
1.2.7 统计分析
所有数据均以“平均值±标准差 (
$\overline { X}\pm { \rm {SD}} $ )”表示。采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析 (One-way ANOVA) 和Duncan's多重比较。显著性水平设定为P<0.05。2. 结果
2.1 麻醉效果分析
两种麻醉剂对凡纳滨对虾的麻醉效果如表2所示。丁香酚和MS-222质量浓度分别为60和 1 000 mg·L−1时，对虾进入A4麻醉阶段。丁香酚和MS-222质量浓度分别超过120和900 mg·L−1时，对虾进入A1、A2麻醉阶段和R1、R2复苏阶段的时间发生无规律的延长和缩短。MS-222质量浓度为1 200 mg·L−1时，对虾进入R4复苏阶段的时间短于1 100 mg·L−1，此外随着麻醉剂质量浓度的增加，进入A4麻醉阶段的时间缩短，进入R4复苏阶段的时间延长。复苏率和成活率随着麻醉剂质量浓度的增加而降低，当丁香酚和MS-222质量浓度分别达140和1 600 mg·L−1时，对虾开始出现死亡。本实验选取丁香酚和MS-222最适麻醉质量浓度分别为80和1 400 mg·L−1。
表 2 不同浓度丁香酚和MS-222对凡纳滨对虾的麻醉效果Table 2. Anaesthesia and recovery effects of eugenol and MS-222 of different concentrations on L. vannamei麻醉剂质量浓度Anesthetic mass concentration/ (mg·L−1) 进入不同麻醉阶段程度的时间Average time for reaching different anaesthesia stages/s 进入不同恢复阶段程度的时间Average time for reaching different recovery stages/s 复苏率Recovery rate/% 48 h后成活率Survival rate after 48 h/% A1 A2 A3 A4 A5 R1 R2 R3 R4 丁香酚Eugenol 20 87.6±24.3 182.1±20.7 — — — — — — — 100 100 30 86.8±15.6 156.2±33.9 — — — — — — — 100 100 40 55.7±4.6 126.8±33.8 132.7±4.1 — — 58.6±5.6 98.3±32.2 186.3±38.7 272.2±6.3 100 100 60 45.9±3.8 93.7±8.0 124.6±16.3 338.8±35.2 — 122.7±34 187.8±6.9 265.1±6.9 294.7±17.1 100 100 80 40.7±6.1 74.5±2.6 116.1±17.0 195.9±12.4 — 123.9±22.7 186.8±31.3 266.8±22.7 324.6±32.4 100 100 100 31.8±5.2 53.1±0.8 107.7±6.1 164.9±8.4 — 170.7±51.5 228.6±26.2 293.6±42.8 392.6±50.5 100 100 120 19.6±3.1 89.9±17.8 107.4±10.9 160.8±26.5 — 238.6±84.6 346.4±16.2 404.2±24.6 438.2±26.3 100 100 140 34.4±0.8 81.7±21.3 103.0±9.0 145.5±7.4 — 218.9±3.68 280.9±5.6 343.9±13.6 440.5±32.9 83.3 66.7 160 27.6±2.1 50.2±2.6 87.0±26.2 121.0±32.4 — 367.1±26.4 438.6±22.4 528.8±38.9 652.9±82.0 50 33.3 MS-222 800 74.9±3.5 237.5±24.9 — — — — — — — 100 100 900 78.3±21.1 200.5±22.8 632.4±68.4 — — — — 26.7±11.9 99.6±20.1 100 100 1 000 84.5±12.9 187.4±17.2 289.3±29.7 454.0±38.6 — 27.7±6.3 55.6±7.1 156.9±13.7 193.0±10.4 100 100 1 100 55.0±5.8 165.5±18.7 269.7±25.8 391.1±17.7 — 41.7±6.9 104.0±13.7 195.7±13.6 269.0±42.2 100 100 1 200 69.2±6.8 140.4±27.8 213.1±24.8 307.7±23.2 — 39.1±7.3 99.3±17.5 195.6±25.8 256.5±21.1 100 100 1 300 60.0±7.0 117.9±30.2 189.4±26.5 292.3±13.6 — 52.1±9.8 94.6±10.2 202.5±20.6 311.5±24.1 100 100 1 400 35.0±4.3 77.6±11.7 122.8±29.5 171.3±16.5 — 52.6±9.5 91.5±14.2 175.5±18.2 312.7±16.0 100 100 1 500 33.8±10.1 66.4±9.8 106.3±22.5 155.6±22.1 — 46.5±3.8 108.7±20.6 187.4±27.6 331.1±39.0 100 100 1 600 — 61.5±6.1 118.8±8.7 143.3±9.7 — 89.9±13.2 172.0±20.3 333.6±16.2 499.9±16.5 83.3 66.7 注：—. 未观察到相应的状态。 Note: —. No corresponding state was observed. 2.2 抗氧化能力分析
2.2.1 鳃组织抗氧化指标分析
与对照组相比，麻醉复苏后3 h，丁香酚组SOD、CAT、MDA、GSH-Px和蛋白质羰基浓度均显著升高 (图1)，且在第3小时达到峰值；MS-222组SOD、GSH-Px和T-AOC显著升高，而GST和蛋白质羰基浓度则显著降低 (P<0.05)。复苏后6 h丁香酚组CAT显著升高，MDA、GST、GSH-Px和蛋白质羰基浓度均显著降低；MS-222组CAT、GSH-Px、T-AOC和蛋白质羰基浓度均显著升高，MDA显著降低 (P<0.05)。
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图 1 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾鳃组织抗氧化酶活性影响Figure 1. Antioxidant capacity in gill tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-2222.2.2 肝胰腺组织抗氧化指标分析
与对照组相比，麻醉复苏后3 h丁香酚组GST、GSH-Px、T-AOC和蛋白质羰基浓度显著降低，MDA显著升高 (图2)；MS-222组SOD、MDA、GST、GSH-Px和T-AOC显著降低 (P<0.05)。复苏6 h后丁香酚组SOD、GSH-Px、T-AOC和蛋白质羰基浓度显著降低，MDA显著升高；MS-222组SOD、GST、GSH-Px和蛋白质羰基浓度显著降低，MDA和T-AOC显著升高 (P<0.05)。
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图 2 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性影响Figure 2. Antioxidant capacity in hepatopancreas tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-2222.3 细胞凋亡相关指标分析
与对照组相比，麻醉复苏后3 h两麻醉组对虾肝胰腺组织Caspase-3活性显著降低 (P<0.05，图3)，其中丁香酚组最低；复苏后6 h丁香酚组显著降低，MS-222组显著升高 (P<0.05)。两麻醉组HSP 70和Cyt-C活性与对照组无显著差异 (P>0.05)。
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图 3 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾肝胰腺细胞凋亡相关指标影响Figure 3. Apoptosis in hepatopancreas tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-2222.4 渗透调节相关指标分析
与对照组相比，麻醉复苏后3 h，两麻醉组对虾鳃和肝胰腺组织Na+/K+-ATP 酶活性均显著降低，以MS-222组最低 (P<0.05，图4)。复苏后6 h丁香酚组鳃组织Na+/K+-ATP 酶活性显著降低，而MS-222组与对照组无显著性差异 (P>0.05)；肝胰腺组织Na+/K+-ATP 酶活性均显著降低，其中MS-222组最低 (P<0.05)。
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图 4 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾渗透调节指标影响Figure 4. Osmoregulation in tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-2222.5 组织学分析
2.5.1 鳃组织形态分析
两种麻醉剂对凡纳滨对虾鳃组织形态学影响如图5所示。与对照组 (图5-a) 相比，麻醉复苏后3 h，丁香酚组 (图5-c) 和MS-222组 (图5-e) 血细胞数量增加，隔膜变窄，入鳃和出鳃血管变形或裂解，液泡数量增加，鳃丝排列紊乱；复苏后6 h，丁香酚组 (图5-d) 和MS-222组 (图5-f) 的鳃组织中液泡数量较多。
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图 5 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾鳃部组织形态影响 (10×20倍)注：a. 3 h对照组；b. 6 h对照组；c. 3 h丁香酚组；d. 6 h丁香酚组；e. 3 h MS-222组；f. 6 h MS-222组；图6同此。Figure 5. Gill tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-222 (10×20 times)Note: a. Control group at 3rd hour; b. Control group at 6th hour; c. Eugenol group at 3rd hour; d. Eugenol group at 6th hour; e. MS-222 group at 3rd hour; f. MS-222 group at 6th hour. The same case in Fig. 6.2.5.2 肝胰腺组织形态分析
与对照组 (图6-a) 相比，麻醉复苏后3 h丁香酚组 (图6-c) 和MS-222组 (图6-e) 的肝小管萎缩变形，转运泡数量增加，部分基膜破损；复苏后6 h，丁香酚组 (图6-d) 和MS-222组 (图6-f) 的B细胞数量增加且体积变小，其中MS-222组部分管腔仍存在裂解现象，肝小管形态恢复情况低于丁香酚组。
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图 6 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾肝胰腺组织形态影响 (10×20倍)Figure 6. Hepatopancreas tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-222 (10×20 times)3. 讨论
3.1 两种麻醉剂对凡纳滨对虾的麻醉效果
麻醉剂是一种能抑制水产生物神经系统的制剂，可使其暂时性失去痛觉和反射能力，从而达到缓解惊吓，降低代谢强度，提高成活率等效果。丁香酚与MS-222作为水产动物中最常用的麻醉剂，前者可以通过改变中枢神经系统的单胺类神经递质进而影响中枢神经系统信号通路的传导过程[19-20]，MS-222则是通过抑制神经细胞的Na+通道来抑制神经细胞的兴奋性[21]。研究发现，MS-222能够抑制脊椎动物下丘脑-垂体-肾间轴 (HPI) 的激活[22]，而虾类只存在X-器官窦腺复合体、Y-器官和大颚器等内分泌器官，不具有HPI相关的神经传导系统[23]。亦有研究报道，MS-222对罗氏沼虾 (Macrobrachiurn rosenbergii)[12]和日本沼虾 (M. nipponense)[24]无麻醉作用，而用于日本对虾 (Marsupenaeus japonicus)[18]麻醉效果明显。本研究发现，凡纳滨对虾在使用MS-222麻醉过程中出现剧烈的应激反应，表现为虾背弯弓、惊跃、肌肉轻微白浊等，这与徐德峰等[13]的实验情况相似，而丁香酚麻醉的对虾表现出更为温和的状态，且进入同等麻醉程度MS-222所需作用浓度远高于丁香酚。徐子涵和茅林春[2]发现，过高剂量的麻醉剂会引起呼吸中枢刺激与血管舒缩，蔡诤等[14]研究也表明高剂量的麻醉剂会引起呼吸中枢短暂兴奋刺激。本研究中，丁香酚和MS-222质量浓度分别超过120和900 mg·L−1时，对虾进入A1、A2麻醉阶段的时间有不同程度的延长，R1、R2复苏阶段的时间缩短，推测高剂量麻醉剂造成对虾短时间内的呼吸中枢兴奋性刺激，从而引起A1、A2麻醉阶段时间延长，又因对虾浸泡在麻醉剂的时间逐渐缩短，体内麻醉剂的积累量少，致使R1、R2复苏阶段时间缩短。综上所述，比较两种麻醉剂作用下凡纳滨对虾的反应状态与作用剂量，得出丁香酚在经济性和适用性上优于MS-222。
3.2 两种麻醉剂对凡纳滨对虾抗氧化能力的影响
SOD和CAT能清除机体的超氧阴离子自由基，以保护细胞免受氧化损伤[25]。MDA可以间接反映出细胞脂质的氧化损伤程度[26]。Wang等[27]发现经丁香酚和MS-222麻醉后，均能造成花鲈 (Lateolabrax maculatus) 鳃组织SOD、CAT和MDA等抗氧化酶活性先升高后降低，与本研究结果相似。GST具有消除体内过氧化物及解毒的双重功能，在肝细胞中大量存在，当肝细胞受损时释放到其他组织中；GSH-Px可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用[28]。T-AOC是评价机体抗氧化功能的综合性指标，可以反映机体抗氧化防御系统的状态[29]；蛋白羰基是蛋白质氧化损伤的主要检测指标[30]。本研究发现，两种麻醉剂均造成对虾抗氧化相关指标不同程度的变化，表明两种麻醉剂均会对凡纳滨对虾造成一定程度的氧化应激，且丁香酚组鳃组织各项抗氧化相关指标在麻醉复苏后3 h即达到峰值，早于MS-222组。已有研究发现，丁香酚可以保护细胞膜脂质不被氧化，抑制羟基自由基的形成[31]，由此推测丁香酚在对虾麻醉过程中产生了保护机能，相较于MS-222更早地激发了组织细胞的氧化防御能力，从而快速抵御麻醉剂带来的氧化损伤。
3.3 两种麻醉剂对凡纳滨对虾细胞凋亡的影响
Caspase-3是细胞凋亡过程中最重要的活性酶之一，是机体细胞凋亡反应的重要标记物[32]。HSP 70表达与机体应激反应程度有关[33]。Cyt-C是重要的凋亡起始因子，Cyt-C的释放介导线粒体凋亡途径的发生[34]。本研究中，Cyt-C和HSP 70在本次实验中各组均无显著性差异，MS-222组肝胰腺组织在麻醉复苏6 h后Caspase-3活性显著升高，丁香酚组则显著降低。结果同样表明，MS-222对凡纳滨对虾肝胰腺细胞损伤凋亡程度强于丁香酚。
3.4 两种麻醉剂对凡纳滨对虾渗透调节的影响
Na+/K+-ATP酶可作为评估细胞渗透调节能力的相关指标[35]。王文豪[36]研究发现，丁香酚和MS-222能降低花鲈鳃组织中的Na+/K+-ATP酶活性。本实验中，MS-222组鳃和肝胰腺组织中的Na+/K+-ATP酶活性在麻醉复苏后第3小时达到最低值，而丁香酚组在第6 小时达到最低值。根据MS-222可抑制细胞Na+通道的麻醉机制，推测MS-222较丁香酚对组织细胞渗透平衡和渗透调节能力的影响更大。
3.5 两种麻醉剂对凡纳滨对虾组织形态的影响
麻醉剂首先通过鳃和皮肤吸收，然后通过血液循环作用于全身，最后未代谢的麻醉剂聚集在肝胰腺中[37]。相关研究发现，丁香酚易对鳃和肝脏组织造成损伤和低氧血症[36]。MS-222会引起水生动物血细胞肿胀，降低鳃小片的摄氧能力，进而导致缺氧症状[38]，且对脾脏和肝脏造成影响[11]。本研究结果显示，两种麻醉剂均会对凡纳滨对虾的鳃和肝胰腺组织造成变形或裂解等损伤现象，MS-222组对虾肝小管恢复程度慢于丁香酚组[39-41]，表现出更为严重的组织形态损伤。
4. 结论
丁香酚和MS-222对凡纳滨对虾均具备麻醉镇静、降低代谢和减少应激行为的作用，但均会对机体造成一定程度的二次应激损伤，且MS-222表现更为严重。本实验条件下，丁香酚和MS-222的最适麻醉质量浓度分别为80和1 400 mg·L−1，MS-222不仅作用剂量更大，且伴随着不良刺激反应，对凡纳滨对虾的氧化应激和组织损伤更大。
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图 1 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾鳃组织抗氧化酶活性影响
注：大写字母不同表示相同时间点上不同组间差异显著 (P<0.05)；小写字母不同表示同组间不同时间点间差异显著 (P<0.05)； 图2—图4同此。
Figure 1. Antioxidant capacity in gill tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-222
Note: Different uppercase letters indicate significant difference among different groups at the same time (P<0.05); different lowercase letters indicate significant difference among different time within the same group (P<0.05). The same case in Fig. 2–Fig. 4.
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图 2 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性影响
Figure 2. Antioxidant capacity in hepatopancreas tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-222
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图 3 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾肝胰腺细胞凋亡相关指标影响
Figure 3. Apoptosis in hepatopancreas tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-222
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图 4 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾渗透调节指标影响
Figure 4. Osmoregulation in tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-222
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图 5 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾鳃部组织形态影响 (10×20倍)
注：a. 3 h对照组；b. 6 h对照组；c. 3 h丁香酚组；d. 6 h丁香酚组；e. 3 h MS-222组；f. 6 h MS-222组；图6同此。
Figure 5. Gill tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-222 (10×20 times)
Note: a. Control group at 3rd hour; b. Control group at 6th hour; c. Eugenol group at 3rd hour; d. Eugenol group at 6th hour; e. MS-222 group at 3rd hour; f. MS-222 group at 6th hour. The same case in Fig. 6.
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图 6 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾肝胰腺组织形态影响 (10×20倍)
Figure 6. Hepatopancreas tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-222 (10×20 times)
表 1 麻醉与复苏阶段虾类行为特征
Table 1 Behavioral characteristics of shrimps at anaesthesia and recovery stages
状态 State 行为特征Behavioral characteristics 麻醉阶段Anaesthesia stage A0 正常 正常游动，对外界刺激反应迅速 A1 镇静 游动缓慢，对外界刺激反应迟钝 A2 轻度麻醉 游泳足缓慢摆动，对外界刺激反应微弱 A3 中度麻醉 游泳足轻微摆动，失去平衡，水底侧游 A4 深度麻醉 游泳足停止摆动，水底侧躺，无反应 A5 死亡 颚舟片摆动停止 复苏阶段 Recovery stage R1 轻度恢复 游泳足开始无规则摆动，对外界刺激无反应 R2 中度恢复 游泳足有规律摆动，外界刺激后有逃跑意识 R3 平衡恢复 恢复平衡，游动无规律 R4 正常 游动正常，对外界刺激反应灵敏 
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表 2 不同浓度丁香酚和MS-222对凡纳滨对虾的麻醉效果
Table 2 Anaesthesia and recovery effects of eugenol and MS-222 of different concentrations on L. vannamei
麻醉剂质量浓度Anesthetic mass concentration/ (mg·L−1) 进入不同麻醉阶段程度的时间Average time for reaching different anaesthesia stages/s 进入不同恢复阶段程度的时间Average time for reaching different recovery stages/s 复苏率Recovery rate/% 48 h后成活率Survival rate after 48 h/% A1 A2 A3 A4 A5 R1 R2 R3 R4 丁香酚Eugenol 20 87.6±24.3 182.1±20.7 — — — — — — — 100 100 30 86.8±15.6 156.2±33.9 — — — — — — — 100 100 40 55.7±4.6 126.8±33.8 132.7±4.1 — — 58.6±5.6 98.3±32.2 186.3±38.7 272.2±6.3 100 100 60 45.9±3.8 93.7±8.0 124.6±16.3 338.8±35.2 — 122.7±34 187.8±6.9 265.1±6.9 294.7±17.1 100 100 80 40.7±6.1 74.5±2.6 116.1±17.0 195.9±12.4 — 123.9±22.7 186.8±31.3 266.8±22.7 324.6±32.4 100 100 100 31.8±5.2 53.1±0.8 107.7±6.1 164.9±8.4 — 170.7±51.5 228.6±26.2 293.6±42.8 392.6±50.5 100 100 120 19.6±3.1 89.9±17.8 107.4±10.9 160.8±26.5 — 238.6±84.6 346.4±16.2 404.2±24.6 438.2±26.3 100 100 140 34.4±0.8 81.7±21.3 103.0±9.0 145.5±7.4 — 218.9±3.68 280.9±5.6 343.9±13.6 440.5±32.9 83.3 66.7 160 27.6±2.1 50.2±2.6 87.0±26.2 121.0±32.4 — 367.1±26.4 438.6±22.4 528.8±38.9 652.9±82.0 50 33.3 MS-222 800 74.9±3.5 237.5±24.9 — — — — — — — 100 100 900 78.3±21.1 200.5±22.8 632.4±68.4 — — — — 26.7±11.9 99.6±20.1 100 100 1 000 84.5±12.9 187.4±17.2 289.3±29.7 454.0±38.6 — 27.7±6.3 55.6±7.1 156.9±13.7 193.0±10.4 100 100 1 100 55.0±5.8 165.5±18.7 269.7±25.8 391.1±17.7 — 41.7±6.9 104.0±13.7 195.7±13.6 269.0±42.2 100 100 1 200 69.2±6.8 140.4±27.8 213.1±24.8 307.7±23.2 — 39.1±7.3 99.3±17.5 195.6±25.8 256.5±21.1 100 100 1 300 60.0±7.0 117.9±30.2 189.4±26.5 292.3±13.6 — 52.1±9.8 94.6±10.2 202.5±20.6 311.5±24.1 100 100 1 400 35.0±4.3 77.6±11.7 122.8±29.5 171.3±16.5 — 52.6±9.5 91.5±14.2 175.5±18.2 312.7±16.0 100 100 1 500 33.8±10.1 66.4±9.8 106.3±22.5 155.6±22.1 — 46.5±3.8 108.7±20.6 187.4±27.6 331.1±39.0 100 100 1 600 — 61.5±6.1 118.8±8.7 143.3±9.7 — 89.9±13.2 172.0±20.3 333.6±16.2 499.9±16.5 83.3 66.7 注：—. 未观察到相应的状态。 Note: —. No corresponding state was observed.
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