Anesthetic effect and tissue oxidative injury for Litopenaeus vannamei by two anesthetics
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摘要: 为明确丁香酚和MS-222对凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 的麻醉效果及相同效果下造成的二次应激，为两种麻醉剂在凡纳滨对虾中的应用提供参考数据与实验依据。研究了不同质量浓度丁香酚 (20、30、40、60、80、100、120、140和160 mg·L−1) 和MS-222 (800、900、1 000、1 100、1 200、1 300、1 400、1 500和1 600 mg·L−1) 对体质量为 (14±3) g凡纳滨对虾的麻醉效果，以及相同效果下对其机体生理和组织形态的影响。结果表明：1) 丁香酚和MS-222的质量浓度分别为80和1 400 mg·L−1时，对虾在3 min内进入深度麻醉阶段，5 min内恢复正常；2) 使用这两种麻醉剂均会造成对虾的鳃和肝胰腺组织损伤，其中丁香酚组的鳃组织各项抗氧化指标早于MS-222组达到峰值；丁香酚组Caspase-3活性在麻醉复苏后6 h显著降低，而MS-222组则显著升高 (P<0.05)；丁香酚组和MS-222组的Na+/K+-ATP酶活性显著降低 (P<0.05)；组织形态分析显示两种麻醉剂均会引起对虾鳃和肝胰腺产生不同程度的变形或裂解损伤，而在麻醉复苏后6 h丁香酚组恢复正常。综上，丁香酚和MS-222对凡纳滨对虾均有麻醉效果，但MS-222所需浓度更高，且对机体造成的二次应激损伤更为严重。Abstract: To provide references for the application of two anesthetics in Litopenaeus vannamei, we studied the anesthetic effects of eugenol (20, 30, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160 mg·L−1) and MS-222 (800, 900, 1 000, 1 100, 1 200, 1 300, 1 400, 1 500, 1 600 mg·L−1) on L. vannamei with body mass of (14±3) g. Besides, we tested the secondary stress injury on the physiological functions and pathomorphologic changes by the two anesthetics. The results show that: 1) Eugenol of 80 mg·L−1and MS-222 of 1 400 mg·L−1 induced L. vannamei to enter the stage of deep anesthetic within 3 min, and return to the normal stage within 5 min. 2) The gills and hepatopancreas of L. vannamei were injured by the two anesthetics, and the antioxidant indexes of gills in the eugenol group reached the maximum value earlier than the MS-222 group. The Caspase-3 activity in the eugenol group decreased significantly after anesthesia recovery of 6 h, while that in the MS-222 group increased significantly (P<0.05). The Na+/K+-ATPase activity in both the groups decreased significantly (P<0.05). Pathomorphologic analysis shows that the two anesthetics could cause deformation or lysis of gills and hepatopancreas, and the eugenol group could recover after anesthesia recovery of 6 h. In conclusion, eugenol and MS-222 have anesthetic effects on L. vannamei, but the concentration of MS-222 is higher and the secondary stress damage to the body is more serious.
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Keywords:
- Litopenaeus vannamei /
- Eugenol /
- MS-222 /
- Anesthetic effect /
- Stress injury
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斑节对虾(Penaeus monodon) 是养殖对虾中体形最大、经济价值较高的一种，也是我国南方传统养殖对虾种类之一，在半咸淡水或海水、淡水资源丰富的对虾养殖区都适合养殖，特别适合大规格虾养殖[1-2]。在“十一五”、“十二五”期间，中国水产科学研究院南海水产研究所在国家和省部级项目资助下，已开展了斑节对虾育种研究，培育出了生长快的斑节对虾新品种“南海1号”和生长快、成活率高的杂交新品种“南海2号”，此外还培育了多个具有不同遗传性状差异的育种材料。但是，仅仅改善生长性状、瞄准产量目标是远远不够的，对抗逆性状以及与养殖生态环境相适应的性状的选育，成为当前斑节对虾产业可持续发展亟待解决的重要问题。盐度和氨氮含量是斑节对虾养殖过程中非常重要的环境因子，对其生长、呼吸代谢、免疫防御、存活都有着非常重要的影响[3-5]。培育抗逆性状得到明显改良的斑节对虾品种(耐氨氮品系和低盐品系)是其产业的迫切需要。
估计遗传参数是开展育种工作的重要依据，对选择育种方案的制定具有非常重要的指导意义[6]。目前，水产动物遗传参数的研究主要集中在数量性状遗传力的估计，如草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[7]、鳜(Siniperca chuatsi)[8]、日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)[9]、斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus)[10]、文蛤(Meretrix meretrix)[11]、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannmei)[12]、脊尾白虾(Exopalaemon carincauda)[13]、缢蛏(Sinonovacula constricta)[14]、中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)[15]等生长性状的遗传力估计，以及长牡蛎(Crassostrea gigas)肉质和壳色性状的遗传力分析[16]等。目前，关于水产动物抗逆性状的遗传参数估计研究不多。已报道的有虹鳟(Oncorhynchus mykiss)耐低溶解氧等性状[17-18]，凡纳滨对虾存活和耐低氧性状[19-20]，大黄鱼(Larimichthys crocea)耐低氧、低盐、低pH等抗逆性状[21]，三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)耐低盐性状[22]，以及中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)耐高氨氮、高pH遗传力[23]等。
目前，有关斑节对虾遗传参数的估计主要集中在生长和存活性状方面。Sun等[24]估计了6月龄斑节对虾体长、体质量等生长性状的遗传力。Macbeth等[25]对斑节对虾繁殖性状的遗传力进行了估计。Kenway等[26]对池塘养殖斑节对虾生长性状的遗传力和遗传相关进行了估计。Benzie等[27]对斑节对虾幼虾生长性状的遗传力进行了估计。Krishna等[28]对斑节对虾生长和存活性状的遗传力进行了估计。有关斑节对虾抗逆性状遗传参数的研究尚未见报道。
本研究利用定向交尾技术建立斑节对虾全同胞(半同胞)家系，分别以高氨氮和淡水胁迫致死时间为衡量指标，采用方差分析法估计了斑节对虾氨氮耐受性和淡水应激性状的遗传参数，首次对斑节对虾抗逆性状进行了遗传评估，为其抗逆良种选育提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
以保存在斑节对虾遗传育种中心(中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地)的斑节对虾“南海1号”和非洲品系亲虾构建家系，用于氨氮和淡水应激性状的遗传参数估计。雌性和雄性亲虾分池暂养并用眼柄数字环对其标记。已经自然交配成熟的雌虾，单独对其进行产卵和苗种培育，构建家系。未自然交配的雌虾蜕壳后，参照杨其彬等[29]方法，用挤压或解剖法将雄虾精荚取出，并移植到雌虾纳精囊中，完成定向交尾，构建家系。
2014年4月，成功建立了全同胞家系27个，其中包括5个父系半同胞家系。27个家系虾苗培育到P15后，随机取1 000尾移入标粗车间水泥池，分别单独培育30 d后用于耐氨氮和淡水应激实验。
1.2 实验方法
1.2.1 氨氮胁迫
实验在斑节对虾遗传育种中心进行。在正式氨氮胁迫实验前，需进行预实验，确定氨氮胁迫浓度。预实验共设计了5个氨氮浓度梯度(50 mg·L–1、90 mg·L–1、110 mg·L–1、130 mg·L–1和150 mg·L–1)，氨氮浓度用氯化铵(分析纯)来调节。实验结果表明，氨氮质量浓度为90 mg·L–1时实验虾96 h全部死亡，因此确定本次实验用此浓度进行耐氨氮性状遗传参数估计。
从标粗池中每个家系挑选100尾大小均匀的幼虾[(3.46±0.10) g]进行荧光标记，并暂养24 h，然后将100尾个体随机分成2组，每组50尾，分别混养于2个6 m3水体的水泥池中，采用高浓度氨氮(90 mg·L–1)进行胁迫实验。实验期间不充气，每12 h换1次实验用水，每次全部换掉。每隔2 h统计1次每个水泥池的对虾死亡数据，捞取死虾，并记录死亡对虾对应的家系，直至全部对虾死亡，实验结束。
1.2.2 淡水应激胁迫
从标粗池中每个家系挑选100尾大小均匀的幼虾(3.5±0.10) g进行荧光标记，并暂养24 h，然后每个家系分成2份，每份50尾，混养于2个6 m3水体的水泥池中，进行淡水应激胁迫实验。实验期间，每隔10 min统计1次每个水泥池的对虾死亡数据，捞取死虾，并记录死亡对虾对应的家系，直至全部对虾死亡，实验结束。
1.3 统计分析
采用SPSS 19.0 软件一般线性模型(general linear model，GLM)，检验家系间在耐氨氮和淡水应激性状上是否存在显著性差异。
统计模型为单性状动物模型和ASReml软件进行方差组分估计，具体模型形式：
$$ y = \mu + {t_{i} + {\alpha _{{j}}} + {e_{{{ij}}}}} $$ 式中y为高氨氮或淡水应激胁迫中的个体存活时间，μ为总体均值，ti为池子固定效应，αj为个体加性遗传效应，eij为随机残差。
家系全同胞效应包括环境效应、非加性遗传效应和母本效应。已有的研究表明，应用动物模型分析方差组分时，加入和未加入家系全同胞效应，遗传力估计值差异较大[30-32]。当模型加入和未加入家系全同胞效应时，似然比率检验(likelihood ratio test，LRT)差异不显著，则模型中不应加入家系全同胞效应，遗传力估值更为准确[10, 32]。本研究在收获高氨氮或淡水应激性状方差组分估计时，模型加入和未加入家系全同胞效应，似然比率检验差异不显著，因此在模型中剔除了家系全同胞效应。
收获高氨氮或淡水应激的遗传力(h2)计算公式为：
$$ {{{h}}^2} = \frac{{{\rm{\sigma }}_{\rm{\alpha }}^2}}{{{\rm{\sigma }}_{\rm{\alpha }}^2 + {\rm{\sigma }}_{{e}}^2}} $$ 式中
${\rm{\sigma }}_{\rm{\alpha }}^2 $ 为加性遗传方差组分，$ \sigma _e^2$ 为残差方差组分。因为高氨氮或淡水应激胁迫实验是分开进行的，故无法在个体水平上估计性状间的表型相关，因此，本研究进行了性状间家系表型值和育种值的相关分析。通过ASReml V4.1软件的单性状动物模型，估计出收获高氨氮和淡水应激性状间的表型相关系数和育种值相关系数。
2. 结果
2.1 氨氮耐受性和淡水应激性状的描述性统计量
27个家系幼虾阶段的耐氨氮存活平均时间为35.66 h，变异系数达到68.26%；27个家系耐淡水应激存活平均时间为122.56 min，变异系数达到43.63% (表1)。图1以箱线图的形式给出了斑节对虾27个家系耐氨氮和淡水应激存活时间的平均值、最小值、最大值、异常值、中位数、第一四分位数以及第三四分位数。家系间耐氨氮和淡水应激存活时间的中位数存在较大差异，且一般线性模型分析表明家系间耐氨氮和淡水应激性状差异极显著(P<0.01)。
表 1 斑节对虾27个家系耐氨氮耐和淡水应激存活时间的表型参数Table 1. Phenotypic parameters of ammonia nitrogen tolerance and freshwater tolerance for 27 families of P. monodon性状
trait平均值
mean标准差
standard deviation变异系数/%
coefficient of variation最大值
maximum最小值
minimum耐氨氮存活/h
survival for ammonia nitrogen tolerance35.66 24.34 68.26 98 2 耐淡水应激存活/min
survival for freshwater tolerance122.56 53 43.63 330 15 ![]()
图 1 斑节对虾家系耐氨氮 (a) 和淡水应激 (b) 存活时间的箱线图盒子包含了中位数、第一四分位数和第三四分位数；×、−、△和○依次表示平均值、最小值、最大值和异常值Figure 1. Box plots of ammonia nitrogen tolerance (a) and freshwater tolerance (b) survival time for P. monodon familiesThe boxes contain median, 25th and 75th percentiles; ×, −, △ and ○ represent mean, minimum, maximum and outliers, respectively.2.2 氨氮耐受性和淡水应激性状的方差组分、遗传力和遗传相关
斑节对虾耐氨氮性状的遗传力为0.11±0.04，属于低遗传力(表2)。耐淡水应激的遗传力为0.29±0.08，属于中等遗传力。通过LRT检验分析表明，耐氨氮性状和耐淡水应激性状的遗传力达到显著水平。
表 2 斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的方差组分和遗传力Table 2. Variance components, heritabilities of ammonia nitrogen tolerance and freshwater tolerance for P. monodon性状
trait方差 variance 表型方差 (σp 2)
phenotypic variance加性方差 (σα 2)
additive genetic variance残差方差 (σe 2)
residual variance遗传力 (h2)
heritability遗传力显著性
significantly different heritability耐氨氮/h
ammonia nitrogen tolerance588.27 66.30 521.97 0.11±0.04 * (P<0.05) 耐淡水应激/min
freshwater tolerance2 663.50 783.48 1 880.00 0.29±0.08 * (P<0.05) 斑节对虾耐氨氮和淡水应激家系表型值相关系数为0.15，遗传相关系数为0.57。统计检验分析表明，家系表型相关系数不显著(P>0.05)，家系遗传相关系数达到了极显著水平(P<0.01)。根据本研究构建的散点图(图2)，各个家系的耐氨氮和淡水应激性状育种值的数据点分布分散，但有明显的直线关系。各个家系的耐氨氮和淡水应激性状表型值的数据点分布分散，且无明显的直线关系。
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图 2 斑节对虾家系耐氨氮性状和耐淡水应激性状表型值 (a) 与育种值 (b) 散点图Figure 2. Scatter plot of phenotype value (a) and breeding value (b) of ammonia nitrogen tolerance and freshwater tolerance for P. monodon3. 讨论
本研究显示，利用斑节对虾“南海1号”和非洲品系群体构建的27个家系耐氨氮性状和耐淡水应激性状变异系数较大，分别为68.26%和43.63%(表1)，且一般线性模型分析表明家系间耐氨氮和淡水应激性状差异极显著(P<0.01)，因此，本研究认为斑节对虾“南海1号”和非洲品系群体耐氨氮性状和耐淡水应激性状具有较大的选育潜力。
在进行抗逆性状遗传力分析时，成活率或存活时间常被作为动物抗性大小的指标[33-35]，成活率为阈性状，其遗传参数估计有多种，在水产动物中应用的有线性动物模型[22, 36-37]和公母畜阈模型[10, 21, 38]等方法。有学者认为采用常规性线性模型估计阈性状的遗传参数，结果不是很理想[39]，而利用广义线性混合模型(GLMM)方法或公母畜阈模型对阈性状的遗传参数进行估计更为合适[40]。当把存活时间作为动物抗性大小的指标时，抗逆性状为连续性状，对其遗传参数进行估计时，应用常规线性模型分析能得到理想的结果[35]。本研究在进行氨氮耐受性和淡水应激性状遗传力分析时，存活时间被作为斑节对虾抗性大小的指标。因此，本研究采用一般线性动物模型估计了斑节对虾氨氮耐受性和淡水应激性状遗传力。有关水产动物抗逆性状遗传力的报道较少，且都属于中低遗传力，如九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)养殖群体耐低盐性状遗传力估计值为0.056±0.022[38]；大黄鱼耐低盐、低溶解氧和低pH值遗传力估计值分别为0.23、0.10和0.23[21]；大菱鲆(Scophthalmus maximus)耐高温性状遗传力为0.026[32]；三疣梭子蟹Ⅱ期幼蟹和80日龄稚蟹耐低盐性状的遗传力为0.18~0.20[22]等。本研究与上述结果类似，斑节对虾耐氨氮性状的遗传力为低遗传力(0.11±0.04)，耐淡水应激性状的遗传力为中遗传力(0.29±0.08)。性状遗传力水平是选择育种的重要依据，一般认为高遗传力性状，通过个体选育或群体选育的方法能够达到较好的选育效果，对于中低遗传力的性状，采用家系选育或家系内选育效果会更好[41]。因此，在开展斑节对虾耐氨氮或淡水应激性状选育时，家系选育更为合适。
育种工作中，性状间的相关参数是制定目标性状的重要依据。有的性状可通过与其他相关性较高性状的选育达到间接选育的目的[42]。研究发现，生长与抗逆性状的相关性较小或不相关，如斑节对虾收获体质量与成活率的育种值相关系数为0.05 (P>0.05)[28]，大菱鲆生长和耐高温性状的相关系数仅为0.04 (P>0.05)[32]，斑点叉尾鮰基础群体家系收获体质量和存活性状育种值相关系数为0.065 (P>0.05)[10]，九孔鲍生长性状与耐低盐性状无显著相关[38]。因此，在开展斑节对虾等上述物种的良种选育时，育种目标只考虑生长性状，育种核心群体经过多代选育后，其抗逆性状(存活、耐高温或耐低盐性状)不会得到有效改良，甚至可能会衰退。因此，在育种规划时有必要采用经济加权系数或百分比赋值方式，对抗逆性状进行一定的加权。目前有关抗逆性状之间的相关性分析很少，栾生等[35]研究表明中国对虾抗WSSV存活时间与成活率之间为负相关。本研究中斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的家系表型值相关系数较小，表现为低度线性正相关(R=0.15，P>0.05)。斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的家系育种值相关系数表现为中高度线性正相关(R=0.57，P<0.01)。因此在进行耐氨氮选育时，核心育种群体多代选育后，其耐淡水应激性状也能得到一定的改良。
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图 1 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾鳃组织抗氧化酶活性影响
注：大写字母不同表示相同时间点上不同组间差异显著 (P<0.05)；小写字母不同表示同组间不同时间点间差异显著 (P<0.05)； 图2—图4同此。
Figure 1. Antioxidant capacity in gill tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-222
Note: Different uppercase letters indicate significant difference among different groups at the same time (P<0.05); different lowercase letters indicate significant difference among different time within the same group (P<0.05). The same case in Fig. 2–Fig. 4.
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图 2 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性影响
Figure 2. Antioxidant capacity in hepatopancreas tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-222
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图 3 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾肝胰腺细胞凋亡相关指标影响
Figure 3. Apoptosis in hepatopancreas tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-222
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图 4 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾渗透调节指标影响
Figure 4. Osmoregulation in tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-222
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图 5 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾鳃部组织形态影响 (10×20倍)
注：a. 3 h对照组；b. 6 h对照组；c. 3 h丁香酚组；d. 6 h丁香酚组；e. 3 h MS-222组；f. 6 h MS-222组；图6同此。
Figure 5. Gill tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-222 (10×20 times)
Note: a. Control group at 3rd hour; b. Control group at 6th hour; c. Eugenol group at 3rd hour; d. Eugenol group at 6th hour; e. MS-222 group at 3rd hour; f. MS-222 group at 6th hour. The same case in Fig. 6.
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图 6 丁香酚和MS-222麻醉对凡纳滨对虾肝胰腺组织形态影响 (10×20倍)
Figure 6. Hepatopancreas tissue of L. vannamei exposed to combined stress of eugenol and MS-222 (10×20 times)
表 1 麻醉与复苏阶段虾类行为特征
Table 1 Behavioral characteristics of shrimps at anaesthesia and recovery stages
状态 State 行为特征Behavioral characteristics 麻醉阶段Anaesthesia stage A0 正常 正常游动，对外界刺激反应迅速 A1 镇静 游动缓慢，对外界刺激反应迟钝 A2 轻度麻醉 游泳足缓慢摆动，对外界刺激反应微弱 A3 中度麻醉 游泳足轻微摆动，失去平衡，水底侧游 A4 深度麻醉 游泳足停止摆动，水底侧躺，无反应 A5 死亡 颚舟片摆动停止 复苏阶段 Recovery stage R1 轻度恢复 游泳足开始无规则摆动，对外界刺激无反应 R2 中度恢复 游泳足有规律摆动，外界刺激后有逃跑意识 R3 平衡恢复 恢复平衡，游动无规律 R4 正常 游动正常，对外界刺激反应灵敏 
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表 2 不同浓度丁香酚和MS-222对凡纳滨对虾的麻醉效果
Table 2 Anaesthesia and recovery effects of eugenol and MS-222 of different concentrations on L. vannamei
麻醉剂质量浓度Anesthetic mass concentration/ (mg·L−1) 进入不同麻醉阶段程度的时间Average time for reaching different anaesthesia stages/s 进入不同恢复阶段程度的时间Average time for reaching different recovery stages/s 复苏率Recovery rate/% 48 h后成活率Survival rate after 48 h/% A1 A2 A3 A4 A5 R1 R2 R3 R4 丁香酚Eugenol 20 87.6±24.3 182.1±20.7 — — — — — — — 100 100 30 86.8±15.6 156.2±33.9 — — — — — — — 100 100 40 55.7±4.6 126.8±33.8 132.7±4.1 — — 58.6±5.6 98.3±32.2 186.3±38.7 272.2±6.3 100 100 60 45.9±3.8 93.7±8.0 124.6±16.3 338.8±35.2 — 122.7±34 187.8±6.9 265.1±6.9 294.7±17.1 100 100 80 40.7±6.1 74.5±2.6 116.1±17.0 195.9±12.4 — 123.9±22.7 186.8±31.3 266.8±22.7 324.6±32.4 100 100 100 31.8±5.2 53.1±0.8 107.7±6.1 164.9±8.4 — 170.7±51.5 228.6±26.2 293.6±42.8 392.6±50.5 100 100 120 19.6±3.1 89.9±17.8 107.4±10.9 160.8±26.5 — 238.6±84.6 346.4±16.2 404.2±24.6 438.2±26.3 100 100 140 34.4±0.8 81.7±21.3 103.0±9.0 145.5±7.4 — 218.9±3.68 280.9±5.6 343.9±13.6 440.5±32.9 83.3 66.7 160 27.6±2.1 50.2±2.6 87.0±26.2 121.0±32.4 — 367.1±26.4 438.6±22.4 528.8±38.9 652.9±82.0 50 33.3 MS-222 800 74.9±3.5 237.5±24.9 — — — — — — — 100 100 900 78.3±21.1 200.5±22.8 632.4±68.4 — — — — 26.7±11.9 99.6±20.1 100 100 1 000 84.5±12.9 187.4±17.2 289.3±29.7 454.0±38.6 — 27.7±6.3 55.6±7.1 156.9±13.7 193.0±10.4 100 100 1 100 55.0±5.8 165.5±18.7 269.7±25.8 391.1±17.7 — 41.7±6.9 104.0±13.7 195.7±13.6 269.0±42.2 100 100 1 200 69.2±6.8 140.4±27.8 213.1±24.8 307.7±23.2 — 39.1±7.3 99.3±17.5 195.6±25.8 256.5±21.1 100 100 1 300 60.0±7.0 117.9±30.2 189.4±26.5 292.3±13.6 — 52.1±9.8 94.6±10.2 202.5±20.6 311.5±24.1 100 100 1 400 35.0±4.3 77.6±11.7 122.8±29.5 171.3±16.5 — 52.6±9.5 91.5±14.2 175.5±18.2 312.7±16.0 100 100 1 500 33.8±10.1 66.4±9.8 106.3±22.5 155.6±22.1 — 46.5±3.8 108.7±20.6 187.4±27.6 331.1±39.0 100 100 1 600 — 61.5±6.1 118.8±8.7 143.3±9.7 — 89.9±13.2 172.0±20.3 333.6±16.2 499.9±16.5 83.3 66.7 注：—. 未观察到相应的状态。 Note: —. No corresponding state was observed.
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