Molecular cloning, expression profile and subcellular localization of nanos1 gene from Macrobrachium rosenbergii
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摘要: 为探究nanos1基因在罗氏沼虾 (Macrobrachium rosenbergii) 生殖发育中的功能，克隆了罗氏沼虾nanos1基因，其cDNA序列全长2 811 bp，编码243个氨基酸；系统进化分析结果表明其与中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 的同源性最高，与鱼类的nanos1同源性较高，与哺乳类同源性较低。半定量PCR检测发现，nanos1在卵巢中特异表达。通过实时荧光定量PCR检测该基因在不同胚胎发育时期及幼体中的表达水平，结果显示：nanso1 mRNA在 (卵) 未受精时期表达量最高，显著高于 (卵) 受精期及胚胎发育各期 (P<0.05)；在胚胎发育期间， (卵) 受精时期表达量最高，显著高于卵裂期且极显著高于胚胎发育后期 (P<0.01)；该基因在卵裂期的表达水平显著高于囊胚期至幼体期；而囊胚期至幼体期之间表达水平较低且无差异。原位杂交技术检测显示，nanos1 mRNA在卵原细胞及初级卵母细胞 (Oc1，Oc2，Oc3，Oc4) 的细胞质中表达。以上结果表明，nanos1与罗氏沼虾雌性生殖细胞发育有着密切的关系。Abstract: To investigate the function of the nanos1 gene in the reproductive development of Macrobrachium rosenbergii, we cloned its nanos1 gene. The cDNA sequence was 2 811 bp, encoding 243 amino acids. Phylogenetic analysis shows that it had the highest homology with Eriocheir sinensis, higher homology with nanos1 in fish but lower homology with mammals. We detected the expression level of the gene at different embryonic developmental stages and in larvae by real-time fluorescence quantitative PCR. The results show that the expression level of nanso1 mRNA was the highest at unfertilized stage, significantly higher than that at fertilized stage and the other embryonic developmental stages (P<0.05). During the embryonic development, the expression was the highest at fertilization stage, significantly higher than that at cleavage stage and very significantly higher than that at late embryonic development (P<0.01). The expression level of this gene at cleavage stage was significantly higher than that from blastocyst stage to larval stage. The expression level from blastocyst stage to larval stage was low and there was no difference.In situ hybridization shows that nanos1 mRNA was expressed in the cytoplasm of oocytes and primary oocytes (Oc1, Oc2, Oc3 and Oc4). The results show that nanos1 is closely related to the development of female germ cells of M. rosenbergii.
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Keywords:
- Macrobrachium rosenbergii /
- nanos1 /
- Expression profile /
- Subcellular localization
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Subfatin作为脂肪因子，是一类由脂肪细胞产生和分泌的具有生物活性的活性肽，在胰岛素敏感性、代谢稳态和免疫反应等多种生理过程中发挥着重要的调节作用[1-2]，其作为代谢性疾病的关键生物标志物而备受关注[3]。
Subfatin是2014年被发现的一种新型脂肪因子[4]，参与糖脂代谢、胰岛素抵抗、炎症反应和白色脂肪组织褐变等多种生物功能[5-7]。由于其序列与METRN蛋白相似，最初被命名为Meteorin-like[6]。但之后的研究发现，与Meteorin主要分布于大脑中不同，多个组织和器官中均能检测到Subfatin，且其在皮下脂肪中的水平最高[6]。由于在皮下脂肪组织中的高表达特性，将Meteorin-like更名为Subfatin[2,6]。另外，由于Subfatin在免疫等功能中发挥作用，因此也被称为IL-39[8]、IL-41[9]和Cometin[10]。Subfatin水平与长期高脂饮食、糖尿病等因素有关。妊娠期糖尿病患者血液中的Subfatin明显高于正常水平，且母乳中的Subfatin水平高于血液[11]。与健康人群相比，II型糖尿病和糖尿病前期患者血清中的Subfatin含量较低[12]；且与瘦型二型糖尿病 (T2DM) 患者相比，肥胖T2DM患者的Subfatin水平更低[13]。即Subfatin水平与肥胖[14]和胰岛素水平[15]呈负相关。研究表明，Subfatin可以通过过氧化物酶体增殖激活受体δ (PPAR-δ) 或AMP活化蛋白激酶(AMPK) 通路影响胰岛素敏感性[6]。在脂多糖 (LPS) 处理的脐静脉内皮细胞中，Subfatin可通过AMPK和PPAR-δ依赖途径改善炎症反应[9]。此外，Subfatin可上调过氧化物酶体增殖激活受体γ辅激活子1α (PGC-1α) 的水平，从而调控白色脂肪组织褐变[4,8]。提高脂肪细胞Subfatin水平后，可以通过减少脂肪生成及过氧化物酶体增殖激活受体γ (PPARγ) 水平抑制其分化[16]。此外，Subfatin水平与血清黏附分子呈负相关，这表明Subfatin可能在内皮功能障碍中也发挥作用[13]。
草鱼 (Ctenopharyngodon idellus) 是中国广泛养殖的淡水鱼类。随着水产养殖业的蓬勃发展，对饲料蛋白质的需求量正急剧攀升，而饲用蛋白质资源的稀缺，导致饲料价格不断上涨，严重影响了养殖效益。碳水化合物和脂质作为自然界中广泛存在的能源物质，不仅价格低廉，还具有节约蛋白质的作用。然而，鱼类对碳水化合物和脂质的利用有限，摄食过量的碳水化合物和脂质会造成鱼体能量过剩、脂质代谢紊乱及免疫力下降，从而导致鱼类脂肪肝等代谢疾病的发生。Subfatin在哺乳动物中葡萄糖和脂质代谢方面的作用已有报道，但其在鱼类中的功能研究尚少。目前Subfatin在草鱼中的研究主要集中在免疫及炎症方面[17-18]，在糖、脂代谢方面未见相关报道。本研究以草鱼为动物模型，通过葡萄糖灌喂、饥饿再投喂、诱导脂肪沉积及原代肝细胞实验探究了Subfatin在鱼类糖脂代谢过程中的生理功能。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
本研究于河南师范大学水产实验基地开展，实验用鱼均采购于河南省延津县渔场。在实验前，所有实验草鱼均于室内养殖循环系统暂养2周。具体条件如下：平均水温为(25±1) ℃，氨氮质量浓度 <0.01 mg·L−1，溶解氧质量浓度 >5 mg·L−1，亚硝酸盐质量浓度 ≤0.05 mg·L−1。每天于8:30、12:30、17:30对实验鱼进行饲喂，每天保持12 h∶12 h光暗循环 (8:00—20:00)。
1.2 草鱼subfatin基因分子鉴定、序列分析及组织表达分析
本研究采用反转录PCR (Reverse transcription PCR, RT-PCR)对草鱼subfatin基因进行分子克隆。用FreeZol Reagent (诺唯赞，中国)提取草鱼脑组织总RNA，根据反转录试剂盒 (艾科瑞，中国) 的操作方法，对草鱼脑组织总RNA进行反转录，合成cDNA。将NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)草鱼转录组数据库中序列与斑马鱼 (Danio rerio)的subfatin (KM655583.1) 序列进行比对，预测得到草鱼subfatin基因序列。根据预测草鱼subfatin基因序列设计克隆引物 (F: ATGCTCTCGCCGTTCTTG, R: TCAGTCTGTGTCCAAATG)。以草鱼脑组织cDNA为模板，通过基因克隆获得草鱼subfatin基因。经过测序后，对基因序列进行分析，信号肽序列分析：Signal-5.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；糖基化位点预测分析：YinOYang 1.2 Server (https://services.healthtech.dtu.dk/services/YinOYang)；蛋白三级结构预测分析：SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)；序列比对分析：ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)；进化树构建：MEGA X软件。
在组织表达分析实验中，随机选取3尾体质量为200~250 g的健康草鱼，用三卡因甲磺酸盐 (MS-222, 100 mg·L−1) 麻醉后断头处死，解剖后取端脑、中脑、后脑、下丘脑、垂体、鳃、头肾、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、前肠、中肠、后脑、脂肪、白肌、红肌各组织样品分别放入无菌、无酶的EP管中，迅速放入液氮速冷。取样结束后，样品放入−80 ℃冰箱中保存，以备总RNA提取。
1.3 灌喂葡萄糖对草鱼subfatin基因表达的影响
灌喂葡萄糖实验方法参考笔者课题组之前的研究[19]，选取72尾体质量为40~50 g的健康草鱼随机分为对照组和处理组。每组3个重复实验桶，每个实验桶12尾实验鱼。配置磷酸缓冲盐溶液 (PBS)：称取氯化钠 (NaCl) 8 g、氯化钾 (KCl) 0.2 g、磷酸二氢钾 (KH2PO4) 0.27 g、十二水磷酸氢二钠 (Na2HPO4·12H2O ) 3.58 g溶解于水中，随后定容至1 L。处理组每尾鱼灌喂葡萄糖溶液 (溶剂为PBS)，且葡萄糖剂量为1.67 mg·g−1鱼体质量，对照组按照每尾鱼体质量灌喂相应体积的PBS。灌喂后分别于第1、第3和第6小时，分批次将实验鱼用MS-222麻醉后处死，取实验鱼肝脏、前肠、肾脏和脑组织样品，液氮速冻后转入 −80 ℃冰箱，用于提取总RNA。
1.4 饥饿再投喂与诱导脂肪沉积对草鱼subfatin基因表达的影响
选取90尾体质量为80~100 g草鱼随机分为对照组、饥饿组和再投喂组，每组30尾。草鱼商品饲料购自通威 (质量分数，粗蛋白≥28%，粗纤维≤12%，粗脂肪≥5%，粗灰分≤15%)。对照组草鱼以3%的投喂率投喂商品饲料，每天分3次投喂(08:30、12:30和17:30)；饥饿组与再投喂组不进行饲料投喂。养殖14 d后对再投喂组进行投喂，投喂6 h后取样。实验结束后，每桶随机选取12尾实验鱼用MS-222麻醉后断头处死，取实验鱼脑、肝脏、前肠和脂肪样品置于无菌无酶EP管中，液氮速冻后转入 −80 ℃冰箱保存，用于提取总RNA。
为了评估过量营养水平对草鱼subfatin基因表达的影响，开展了食物诱导脂肪沉积实验。选取体质量40~50 g健康草鱼随机分为对照组和诱导组，每组3个重复，每个重复30尾。对照组以体质量的3%投喂率饲喂商品饲料，诱导组每天饱食饲喂3次 (08:30、12:30和17:30)以诱导脂肪沉积。每2周记录体质量，并根据体质量调整对照组投喂量。饲喂实验6周后，用MS-222对实验鱼进行麻醉，每桶随机选取12尾鱼，解剖后迅速取出脑、前肠、脂肪和肝脏样品，液氮速冻后转入 −80 ℃冰箱保存，用于提取总RNA。
1.5 葡萄糖、油酸、胰岛素和胰高血糖素对草鱼原代肝细胞subfatin基因表达的影响
采用胶原酶IV (Cls IV，Gibco，英国) 和脱氧核糖核酸酶 (DNase II，Gibco，英国) 消化法分离草鱼肝细胞，分离方法参照文献[19-20]。将分离的肝细胞以每孔8×105个细胞的密度种于聚乙烯亚胺 (PEI) 包被的24孔细胞培养板中，过夜培养后更换为无血清细胞培养基 (Gibco，英国)，参照笔者课题组之前的研究方法[20-21]对细胞分别进行以下处理：1) 草鱼原代肝细胞分别用含有葡萄糖 (终物质的量浓度为35 mmol·L−1) 的培养基和含有油酸 (终质量浓度为80 μg·mL−1) 的培养基分别培养12和24 h；2) 草鱼原代肝细胞分别用终物质的量浓度分别为10、100和
1000 nmol·L−1的胰岛素 (CYT-614，ProSpec-Tany TechnoGene Company，以色列) 和胰高血糖素 (HOR-237，ProSpecTany TechnoGene Company，以色列) 的培养基分别培养3和6 h。细胞培养结束后用RNAiso Plus提取细胞总RNA。1.6 RNA提取、cDNA合成和荧光定量PCR
用RNAiso Plus提取所有实验样品总RNA，测定总RNA浓度后，按照反转录试剂盒 (PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser, TaKaRa，日本) 的操作方法进行反转录。设计并合成subfatin定量引物 (F: GTGTATCTCCGCTGTGCC, R: CTGGACTCCTTAGAGGGTTT)。在荧光定量PCR仪(LightCycler 480 II)上进行荧光定量PCR反应，反应体系为：2×SYBR Green (GDSBio，中国) 5 μL，正反向引物各0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 3 μL。反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40个循环。以草鱼的18S rRNA (F: ATTTCCGACACGGAGAGG, R: CATGGGTTTAGGATACGCTC) 为内参基因，subfatin基因相对表达量用2−ΔΔCT方法进行计算。
1.7 数据处理与统计分析
实验数据用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析，结果用“平均值±标准误 ($\bar x \pm s_{\bar x}$)”表示，葡萄糖灌喂、诱导脂肪沉积、葡萄糖和油酸孵育实验结果用t检验进行显著性差异分析，饥饿再投喂、胰岛素和胰高血糖素孵育实验结果用ANOVA中的Duncan’s的统计方法进行显著性差异分析，p<0.05具有显著性差异。
2. 结果
2.1 草鱼subfatin基因序列分析及组织表达分析
通过分子克隆得到草鱼subfatin基因全长为861 bp，编码286个氨基酸，其中前21个氨基酸为信号肽序列。经过序列分析发现，草鱼Subfatin蛋白中存在3个O-连接的糖基化位点，分别为Ser160、Ser217和Thr226 (图1-a)。三维结构预测分析发现，本研究中的草鱼Subfatin与斑马鱼 (Danio rerio) METRL蛋白的三维结构 (Q7ZV46.1.A) 相似性为94.41% (图1-b)。序列比对结果发现，草鱼Subfatin蛋白与鱼类Subfatin蛋白的同源性超70% (表1)。进化树分析发现，草鱼subfatin基因与鱼类subfatin基因聚为一簇，与斑马鱼subfatin基因聚为一支 (图2)。组织表达分析结果表明，草鱼subfatin基因在各个组织中均有表达，但在肾脏、脑区、鳃及肠道组织中的表达量相对较高 (图3)。
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图 1 草鱼Subfatin cDNA和氨基酸序列 (a) 和草鱼Subfatin三维结构预测 (b)注：图中单下划线表示信号肽；方框为O-连接糖基化位点；星号表示终止密码子。Figure 1. cDNA and deduced amino acids (a) and predicted three-dimensional structure (b) of grass carp subfatinNote: The single underlines represent signal peptide; boxes represent the O-linked glycosylation sites; the asterisk represents the stop codon.表 1 草鱼Subfatin与其他物种的同源性分析Table 1. Identity analysis of grass carp Subfatin compared with other species物种 Species 同源性 Identity 草鱼
Ctenopharyngodon idella100% 银鲑
Oncorhynchus kisutch77.54%
XM_031822203.1剑尾鱼
Xiphophorus hellerii76.49%
XM_032587853.1大刺鳅
Mastacembelus armatus75.27%
XM_026325842.2大西洋鳕
Gadus morhua74.83%
XM_030350146.1橙喉镖鲈
Etheostoma spectabile74.48%
XM_032537892.1红鳍东方鲀
Akifugu rubripes72.63%
XM_003964696.3智人
Homo sapiens56.49%
NM_001004431.3大鼠
Rattus norvegicus54.74%
NM_001014104.1小鼠
Mus musculus54.04%
NM_144797.3 ![]()
图 2 草鱼与其他物种Subfatin氨基酸进化树分析Figure 2. Phylogenetic tree based on amino acid alignment for Subfatin in different species![]()
图 3 定量PCR检测subfatin在草鱼各组织中的表达水平注：1. 端脑；2. 中脑；3. 后脑；4. 下丘脑；5. 垂体；6. 鳃；7. 头肾；8. 心脏；9. 肝脏；10. 脾脏；11. 肾脏；12. 前肠；13. 中肠；14. 后肠；15. 脂肪；16. 白肌；17. 红肌。Figure 3. Analysis of expression levels of subfatin in different tissues of grass carp by real-time PCRNote: 1. Telencephalon; 2. Mesencephalon; 3. Cerebellum; 4. Hypothalamus; 5. Pituitary; 6. Gill; 7. Head kidney; 8. Heart; 9. Liver; 10. Spleen; 11. Kidney; 12. Foregut; 13. Midgut; 14. Hindgut; 15. Fat; 16. White muscle; 17. Red muscle.2.2 灌喂葡萄糖对草鱼subfatin基因表达的影响
如图4所示，葡萄糖处理1和3 h后，草鱼肝脏和前肠subfatin mRNA表达量与对照组相比显著增加 (p<0.05)；葡萄糖处理3 h后，脑和肾脏中subfatin mRNA表达量均显著增加 (p<0.05)；而葡萄糖处理6 h后，与对照组相比各组织中subfatin基因表达量无显著性变化 (p>0.05)。
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图 4 葡萄糖灌喂对草鱼肝脏、前肠、脑 和肾脏中subfatin基因表达的影响注：*. p<0.05；**. p<0.01；***. p<0.001。Figure 4. Effects of OGTT on mRNA expressions of subfatin in liver, foregut, brain and kidneyNote: *. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001.2.3 饥饿再投喂和诱导脂肪沉积对草鱼subfatin基因表达的影响
如图5所示，在饥饿再投喂实验中，草鱼饥饿处理14 d后，与对照组相比，脑、脂肪、前肠和肝脏组织subfatin基因表达量均显著降低 (p<0.05)；饥饿再投喂后，脑、脂肪和前肠组织subfatin mRNA表达量与饥饿组相比显著增加 (p<0.05)；而肝脏组织中subfatin mRNA表达量与饥饿组和对照组相比显著增加 (p<0.05)。如图6所示，诱导脂肪沉积实验表明，与对照组相比，诱导组草鱼脑、脂肪、前肠和肝脏组织中subfatin mRNA表达量均显著上调 (p<0.05)。
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图 5 饥饿再投喂对草鱼脑、脂肪、前肠和肝脏中subfatin基因表达的影响注：不同字母间代表有显著性差异。Figure 5. Effects of fast and refeeding on mRNA expressions of subfatin in brain, fat, foregut and liverNote: Different letters represent significant differences.![]()
图 6 脂肪沉积对草鱼脑、脂肪、前肠和肝脏中subfatin基因表达的影响注：*. p<0.05；**. p<0.01；***. p<0.001。Figure 6. Effects of lipid accumulation on mRNA expressions of subfatin in brain, fat, foregut and liverNote: *. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001.2.4 葡萄糖、油酸、胰岛素和胰高血糖素对草鱼原代肝细胞subfatin基因表达的影响
如图7所示，葡萄糖、油酸、胰岛素或胰高血糖素处理对草鱼原代肝细胞中subfatin基因表达结果显示，葡萄糖处理12和24 h后subfatin基因的表达量显著增加 (p<0.05)；油酸处理24 h可显著促进肝细胞中subfatin基因的表达 (p<0.05)；胰岛素处理3和6 h能显著降低肝细胞中subfatin基因的表达 (p<0.05)；胰高血糖素处理3和6 h可显著提高肝细胞中subfatin基因的表达 (p<0.05)。
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图 7 葡萄糖、油酸、胰岛素和胰高血糖素对草鱼原代肝细胞中subfatin基因表达的影响注：*. p<0.05；**. p<0.01；***. p<0.001。Figure 7. Effects of glucose, oleic acid, insulin and glucagon on subfatin expression in grass carp primary hepatocytesNote: *. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001.3. 讨论
草鱼对碳水化合物和脂质的利用能力差，且高碳水化合物或高脂饲料会导致其糖代谢紊乱、免疫力下降、疾病高发甚至死亡。因此，深入探讨草鱼的糖、脂代谢机制可为提高草鱼对糖脂代谢的利用提供一定参考。
3.1 草鱼subfatin序列分析及组织表达分析
Subfatin作为一种新型脂肪因子备受关注。本研究从草鱼中分离得到subfatin基因序列，分析发现草鱼Subfatin 蛋白包含信号肽和3个糖基化位点。同样，在哺乳动物的Subfatin蛋白中存在N端信号肽和糖基化位点[6]。在小鼠 (Mus musculus) Subfatin蛋白的第103位氨基酸处存在N-糖基化位点，并且通过糖苷酶降解实验验证了糖基化位点的存在[8,22]。然而，在人类Subfatin蛋白中却没有糖基化位点，以上结果推测糖基化位点在小鼠Subfatin的功能中不起主要作用[8,22]。糖基化在鱼类Subfatin中的功能还需深入探究。通过三维结构、序列比对和进化树分析发现，草鱼Subfatin与斑马鱼METRL蛋白的三维结构最为相似，与鱼类Subfatin蛋白有较高同源性，并且亲缘关系更近。最初发现Subfatin由脂肪组织和骨骼肌合成并分泌[23]。但后续研究发现，subfatin基因在人类和啮齿动物的多个组织 (如肝、脾、肌肉、心脏、胸腺、前脑、中脑、后脑等) 中均有表达[24]。在对小鼠的研究中发现，Subfatin在小鼠体内广泛存在，且在骨骼肌、心肌、脂肪组织、肾脏、脾脏等组织中水平较高[24]。本研究通过分子克隆成功得到草鱼subfatin基因序列。进一步研究发现subfatin基因在草鱼多个组织中均有表达，在肾脏、脑区、鳃及肠道组织中的表达量相对较高。
3.2 Subfatin与糖代谢的关系
Subfatin在哺乳动物中的相关研究较多，但在鱼类糖脂代谢中的功能研究还未见报道。在本研究的葡萄糖灌喂和葡萄糖孵育原代肝细胞实验中，葡萄糖处理后能够显著增加subfatin基因的表达。笔者课题组前期实验表明给草鱼灌喂葡萄糖后其血糖水平显著升高[19]。同样在对II型糖尿病人的研究中发现，病人血糖水平显著高于对照组，且血清中的Subfatin水平也显著高于对照组[25-27]；妊娠期糖尿病患者血清中的Subfatin水平也显著高于对照组[27]。在饥饿再投喂实验中，subfatin基因的表达量在再投喂后显著增加。笔者课题组前期实验表明，饥饿能显著降低血糖水平，再投喂后血糖水平显著增加[20]。上述结果表明，Subfatin的水平受营养物质摄入影响，并与血糖水平呈正相关。但也有研究发现，Subfatin水平与血糖水平呈负相关。例如，糖尿病患者血清Subfatin水平显著低于非糖尿病患者[23,28-29]，用Subfatin处理C2C12细胞系发现Subfatin可通过AMPKa2和P38 MAPK通路增加葡萄糖摄取，并调节组蛋白去乙酰化酶5 (HDAC5)与葡萄糖转运蛋白4 (GLUT4)的结合，使血糖水平降低[30]。但Subfatin与血糖水平的具体调控关系及机制仍有待深入探究。
3.3 Subfatin与脂代谢的关系
Subfatin不仅可以促进葡萄糖摄取，改善胰岛素抵抗，还能影响血脂成分及水平、减少脂肪堆积，在脂质代谢过程中也发挥着重要作用[16]。Subfatin可以抑制脂肪细胞分化，使脂肪生成数量减少[16]，还可作为肥胖和代谢性综合征的生物标志物[31]。在对小鼠的研究中也发现，高脂饮食可特异性升高其白色脂肪组织中的subfatin基因表达[31]。对肥胖人群的研究表明，肥胖者体内subfatin基因的表达显著高于非肥胖人群[32]；在分离的肥胖儿童脂肪细胞中subfatin基因的表达量显著高于体型较瘦的儿童，且其表达量与脂肪细胞直径呈正相关[16]。高脂饮食诱导的肥胖小鼠皮下脂肪组织中subfatin基因的表达量显著增加，而限制饮食组脂肪组织subfatin基因的表达量显著低于正常组[4]。本研究中，诱导脂肪沉积和油酸孵育原代肝细胞能显著增加subfatin基因的表达。笔者课题组的前期研究表明，油酸孵育和诱导脂肪沉积实验均可显著增加脂质蓄积引起的肥胖[21,33]。上述结果表明，Subfatin与细胞脂肪水平呈正相关。
3.4 Subfatin与胰岛素和胰高血糖素的关系
作为重要的内分泌激素，胰岛素和胰高血糖素在鱼的葡萄糖和脂质代谢中发挥着至关重要的作用。本研究表明，胰岛素处理原代肝细胞能显著抑制subfatin基因的表达。对小鼠的研究表明，脂肪细胞subfatin基因的特异性敲除加剧了高脂肪饮食 (High fat diet, HFD) 诱导的胰岛素抵抗，而脂肪细胞特异性转基因过表达subfatin防止了HFD或瘦素缺失诱导的胰岛素抵抗。脂肪细胞Subfatin与胰岛素敏感性的关系是通过PPARγ途径的局部自分泌或旁分泌作用来调控的[5]。subfatin基因的过表达抑制了人脂肪细胞分化，表现为PPARγ和脂肪生成标志物的水平降低[16]。同样，对人类的研究也发现，血清中胰岛素与subfatin基因表达量呈负相关[11,13,15,23]。上述结果表明，胰岛素和Subfatin间呈负调控关系，但具体调控机制有待深入探究。胰高血糖素与Subfatin的调控关系尚未见报道，但本研究发现，胰高血糖素处理原代肝细胞能显著促进subfatin基因表达，推测可能是因胰高血糖素引起细胞中的葡萄糖水平增加从而促进细胞subfatin基因表达，但其调控机制还需进一步探究。
综上，本研究以草鱼为待试动物，探究了Subfatin在调控草鱼葡萄糖和脂质代谢中的作用。实验结果表明，葡萄糖灌喂能显著增加subfatin基因表达；饥饿再投喂实验发现，饥饿后subfatin基因的表达量显著下调，再投喂后subfatin基因的表达量显著增加；诱导脂肪沉积实验中，subfatin基因的表达量在诱导组显著增加；葡萄糖、油酸和胰高血糖素孵育原代肝细胞均可显著增加细胞中subfatin基因的表达量，而胰岛素却会显著降低细胞中subfatin基因的表达。综上所述，Subfatin在草鱼糖脂代谢过程中起重要的调控作用。
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图 1 罗氏沼虾Mrnanos1 cDNA序列及氨基酸序列
Figure 1. Sequence and amino acid sequence ofMrnanos1 cDNA from M. rosenbergii
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图 2 MrNanos1氨基酸序列与其他物种Nanos家族蛋白的系统进化树分析
Figure 2. Phylogenetic tree analysis of MrNanos1 amino acid sequence with Nanos family proteins of other species
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图 3 罗氏沼虾MrNanos1与其他物种锌指区域结构的比较
Figure 3. Multiple alignments analysis of zinc finger domain of MrNanos1 in M. rosenbergii and other species
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图 4 Mrnanos1基因在罗氏沼虾不同组织中的表达分析
Figure 4. Expression analysis of Mrnanos1 gene in different tissues of M. rosenbergii
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图 5 罗氏沼虾nanos1在不同胚胎发育时期及早期幼体中的相对表达量
注：字母不同表示同一时间各实验组之间存在显著性差异 (P<0.05)。
Figure 5. Relative expression level ofnanos1 in different embryonic develomental stages and larvae of M. rosenbergii
Note: Different letters indicate significant difference among the experimental groups (P<0.05).
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图 6 Mrnanos1 mRNA 在罗氏沼虾卵巢中的亚细胞分布
注：a. 罗氏沼虾卵巢切片 (HE 染色) ；b. 罗氏沼虾卵巢切片 (反义探针结果)；c. 罗氏沼虾卵巢切片 (正义探针结果)；d、e、f 分别为 a、b、c 中红色方框内的放大视野图。
Figure 6. Subcellular localization of Mrnanos1 mRNA in ovary of M. rosenbergii
Note: a. Ovarian sections of M. rosenbergii (HE staining); b. Ovarian sections of M. rosenbergii (Antisense probe results); c. Ovarian sections of M. rosenbergii (Results of sense probe); d, e and f. The enlarged view in the red box of Fig. a, b and c, respectively.
表 1 本研究所用的全部引物
Table 1 All primers used in this study
引物
Primer序列 (5'—3')
Sequence (5'–3')长度
Length/bp温度
Temperature/℃应用
Applicationnanos1 F
nanos1 RAAAACAACTAACGGCGATGC
ACGAAGACCCGCTGATATTG747 57 RT-PCR、PCR、原位杂交 nanos1 QF
nanos1 QRGGCCTTAGGGCAAATAGCTC
ACGAAGACCCGCTGATATTG233 60 qPCR β-actinF
β-actinRGAAGCGTACATGGTGGGACT
GGTGACCTGCGAGATTCATT466 57 RT-PCR β-actinQF
β-actinQRCAGGGAAAAGATGACCCAGA
GGAAGTGCATACCCCTCGTA161 60 qPCR 
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