细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)酶系是一类普遍存在于动、植物体内的重要混合功能氧化酶^[1]。它参与多种亲脂外源和内源物质(包括脂肪酸、甾类化合物、药物、芳香烃类有机污染物等)在生物体内的转化与代谢过程，是主要的Ⅰ相代谢反应(phaseⅠreaction)酶类，在解毒和激活食物链中的卤代、非卤代烃方面发挥重要作用^[2]。细胞色素P450氧化酶系具有较强的可诱导性，成为P450研究中的一个热点，也是生物体P450诱导与环境胁迫影响关系的重要研究内容。

随着科学进步与工业发展，大量有毒化学物质和人工合成化学物质被释放到环境中，尤其是有机化合物如烷烃、芳烃、多氯联苯、有机氯、杂环等造成环境污染日益严重。环境中的亲脂性化合物，如多环芳烃、多氯联苯及含有这些化合物的工业废水都可以诱导生物体内CYP450的合成和活性变化^[3]。细胞色素P450第四亚族(CYP4)基因是控制细胞色素P450酶系功能的超基因家族中的一个重要亚族，目前国内外已有许多研究表明CYP4基因与多种生物的解毒机制以及抗药性相关^[3-4]，一般可从信使RNA(mRNA)水平、蛋白质水平以及细胞色素酶的催化活性等方面进行监测。CYP4基因表达能受环境中污染物的诱导可作为生物体对不良生存环境的一种响应表现^[5-6]，是多种昆虫的解毒机制^[7]，并参与哺乳动物的内源物质代谢过程^[8]。目前，对于海洋环境指示生物——翡翠贻贝(Perna viridis)的环境污染效应和有机物代谢机制研究主要集中于抗氧化酶系活性变化等方面，而对基因调控与表达影响的研究报道则少见，文章从分子生物学角度，采用实时荧光定量PCR技术，对翡翠贻贝内脏团和外套膜CYP4基因相对表达水平进行检测，探讨适合海洋石油亚致死浓度污染诊断的大分子生物标记物，为海洋环境监测提供新的手段，进而为解释翡翠贻贝有机物代谢的生理机制提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   试验溶液的制备

用低速电动磁力搅拌器不间断搅拌0^#柴油(国深Ⅲ号)与沙滤海水(V∶ V=1∶ 9)混合液，搅拌24 h，静置4 h，下层水相为0^#柴油水溶液(WSF)母液，吸取母液4 ℃避光保存。采用荧光分光光度法测定WSF石油烃质量浓度，根据《海洋监测规范》(GB 17378.1-2007)中的海水石油烃检测方法^[9]测定其WSF母液中石油烃质量浓度，荧光测定波长Ex为231 nm，Em为332 nm。

1.2   试验材料及预处理

翡翠贻贝购买于深圳市龙岗区东山社区水产码头，平均体长、体宽、体厚和体质量分别为(75.95±2.88)mm、(33.10±1.89)mm、(21.03±1.47)mm和(28.99±4.03)g。沙滤海水中驯养翡翠贻贝7 d，选取反应灵敏、固着丝产生正常、代谢正常的个体进行曝毒。

设置4个浓度组(WSF中石油烃质量浓度为5 μg · L^-1、10 μg · L^-1、50 μg · L^-1和100 μg · L^-1)，对照组为0 μg · L^-1，每浓度组设置2个平行，每平行组设置试验水体40 L，试验翡翠贻贝60只，维持水体环境温度、盐度和pH分别为20~25 ℃、25~30和7.7~8.5；24 h持续给氧，12 h更换一次试验海水，每天定时给食。整个WSF胁迫试验周期为22 d，前15 d进行WSF正常曝毒，后7 d停止曝毒进行清水释放。

1.3   翡翠贻贝CYP4基因表达水平定量测定

1.3.1   总RNA提取

分别于第1、第3、第7、第15、第18和第22天取样，液氮研磨后称取每浓度组内脏团和外套膜各50 mg，分别滴加1 mL TRIzol试剂(Invitrogen公司出品)用于提取总RNA，适量无RNase水(Sigma)溶解絮状RNA后于-80 ℃保存。紫外分光光度法测定全部RNA样品的质量浓度和纯度，选取1.8＜OD_260nm/OD_280nm＜2.0的RNA样品应用于实时荧光定量PCR中。

1.3.2   模板cDNA合成

1) 总RNA纯化。分别取翡翠贻贝内脏团和外套膜总RNA 1 μL，用DNase Ⅰ(1 U · μL^-1)1 μL(Fermentas公司出品)、10×Buffer 1 μL、DEPC水8 μL，37 ℃水浴30 min，加入25 mmol · L^-1 EDTA溶液1 μL，65 ℃反应10 min。2)cDNA模板合成。cDNA模板合成体系总体积为20 μL，依次加入2 μL RNA (1 μg ·μL^-1)、2 μL Oligo dT(50 μmol · L^-1)、10 μL DEPC H₂O，72 ℃反应5 min后转入-80 ℃冷冻2 min，离心5 s；再加入4 μL 5×M-MLV buffer(Promega)、1 μL dNTP(10 mmol · L^-1)、0.5 μL M-MLV(Promega)反转录酶、0.5 μL RNase Inhibitor(TaKaRa)，PCR仪42 ℃反应1 h再70 ℃保温15 min后冰上冷却，可作实时荧光定量PCR反应模板使用，-20 ℃保存。3)实时荧光定量PCR。Eppendorf-Mastercycler ep realplex²实时荧光定量PCR仪检测分析翡翠贻贝内脏团和外套膜CYP4基因相对表达情况，以cDNA为模板，SYBR Premlx Ex Taq II (2X)(TaKaRa)配置反应体系20 μL，针对翡翠贻贝内脏团和外套膜CYP4基因设计定量正向引物QCYP4-F1：5′-GGCGTTGTAAAGTGGGATA-3′和反向引物QCYP4-R1：5′-GTTTTCGCTGGGAATGTTA-3′；针对beta-action内参基因设计定量正向引物QMB-F1：5′-TTTACGACGACAGCAGAA-3′和反向引物QMB-R1：5′-TGACGAAGATGATGAAGC-3′^[10]，反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸35 s，共40个循环。反应结束后需进行PCR产物单一条带检测，确保PCR扩增反应产物准确性；用引物QCYP4-F1和QCYP4-R1对cDNA模板进行CYP4基因拷贝检测，用引物QMB-F1和QMB-R1对beta-actin进行内参基因拷贝检测，每个检测反应均做3个平行对照，以纠正系统误差，每个cDNA模板样品实时荧光定量PCR反应重复3次，以便进行统计学分析。

1.4   数据统计与分析

应用2^-△△Ct法^[11]对数据进行处理，结果表示各处理组样本基因表达量相对对照样本基因表达量的倍数^[12]。SPSS 18.0统计分析，多组间数据差异显著性比较采用单因素方差分析和t-检验法，其中*表示组间差异显著(0.01≤P<0.05)；* *表示组间差异极显著(P < 0.01)。

2.   结果

2.1   内脏团CYP4基因相对表达水平

WSF处理的第1天，各浓度组翡翠贻贝内脏团CYP4基因均被诱导表达，第3和第7天CYP4基因表达水平随WSF处理浓度的变化呈现出不同的变化趋势(图 1-a)，并于第7天出现诱导饱和现象。WSF处理第15天时4个处理浓度组CYP4基因表达水平都明显增高，从低浓度到高浓度组相对空白组的诱导率分别达到499%、566%、709%和420%。单因素分析结果表明，WSF对内脏团CYP4基因的表达水平为极显著诱导(P < 0.01)，且表达水平随着WSF处理浓度的增加而升高。WSF处理浓度增加至100 μg · L^-1时翡翠贻贝内脏团中CYP4基因表达水平相对于50 μg · L^-1浓度组有明显降低，但仍高于空白对照组。清水释放第3天即第18天，CYP4基因表达水平较处理第15天迅速下降，5 μg · L^-1和50 μg · L^-1浓度组依旧明显高于空白对照组(P < 0.01)，10 μg · L^-1和100 μg · L^-1浓度组则快速恢复到空白对照水平。清水释放第22天时各浓度组内脏团CYP4基因表达水平与空白对照组无明显差异。

图  1  CYP4在翡翠贻贝内脏团和外套膜中的相对表达水平测定(以beta-actin为内参)

*、* *. 分别与空白组比较(0.01≤P < 0.05、P < 0.01)

Figure  1.  Relative level of CYP4 gene expression in visceral mass and mantle of P.viridis (use beta-actin as internal control gene)

*, * *. compared with the control, respectively (0.01≤P < 0.05, P < 0.01)

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2.2   外套膜CYP4基因相对表达水平

WSF处理第1天，各浓度组翡翠贻贝外套膜CYP4基因的表达水平较空白对照组均有所增加；WSF处理第3天时，各浓度组CYP4基因表达水平为空白对照组的1.74、1.93、1.82和1.70倍，差异极显著(P < 0.01)；第7天降低到第1天水平以下，表现出强烈的抑制表达作用(图 1-b)。随着WSF处理时间的延长，整体呈现出先诱导后抑制再诱导的波动变化趋势(图 2)；WSF处理第15天相对第7天各浓度组CYP4基因表达水平迅速增加，诱导作用极显著(P < 0.01)，其诱导率分别达到112%、139%、64%和152%，存在一定的时间效应关系；停止WSF处理后10 μg · L^-1和50 μg ·L^-1浓度组CYP4基因表达水平于第18天并没有迅速恢复到空白对照组水平，差异显著(0.01≤P < 0.05)；第22天各浓度组则进一步回落，最终恢复到空白对照水平。

图  2  0^#柴油水溶液对翡翠贻贝外套膜CYP4基因相对表达水平的时间-效应曲线(以beta-actin为内参)

Figure  2.  Time-effect curve for effect of No.0 diesel oil water-soluble fraction on relative level of CYP4 gene expression in mantle of P.viridis (use beta-actin as internal control gene)

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第3、第7和第15天CYP4基因相对表达水平的回归方程如下：

第3天CYP4 y=20 284x³-3 217.9x² + 125.38x + 1.057 2，R²=0.949 0

第7天CYP4 y=3 259.9x³-704.86x²+ 39.092x + 1.009 5，R²=0.996 4

第15天CYP4 y=49 426x³ - 7 680x²+ 291.34x + 1.089 6，R²=0.976 1

3.   讨论

通过机体解毒酶催化并完成自身解毒、恢复机体正常功能的解毒作用，是生物体最常见的一种适应机制，而众多解毒酶中单加氧酶的作用最为重要。单加氧酶是一种多酶复合体，包括细胞色素P450、黄素蛋白-NADPH-P450还原酶、细胞色素b5等。在生物体中各自发挥功能并组成电子信号传递系统。其中细胞色素P450负责活化氧分子，是整个酶系中的末端氧化酶，与底物结合后传送给下一个氧化酶进行氧化分解^[13]。目前已有大量研究发现生物体细胞色素P450的存在，并且通过其控制基因组的选择性表达来反映浸染物对机体的损害程度。污染物对生物机体发挥毒害作用可以通过诱导或者抑制细胞色素P450控制基因组的表达使相应的细胞色素P450酶系活性和表达量发生变化，促使对应的效应因子代谢发生改变从而间接地损害生物体的正常功能表现，使其呈现出机能的钝化或者丧失^[14]。

该研究结果显示，WSF处理的第1天各浓度处理组翡翠贻贝外套膜和内脏团CYP4基因的表达被诱导，与苯并(a)芘对小鼠肺组织细胞色素P4501A表达表现相似^[15]，说明翡翠贻贝CYP4基因表达对WSF刺激具有强烈的敏感性，多环芳烃类化合物(PAHs)可诱导CYP4基因表达；第7天内脏团和外套膜CYP4基因的表达水平明显低于第1天，基因被抑制表达，出现一种当诱导物到达一定浓度时基因表达水平不升反降的诱导饱和现象，这一现象在摇蚊幼虫(Chironomus riparius)CYP4诱导作用中也存在^[16]，说明翡翠贻贝内脏团和外套膜CYP4基因能被WSF诱导但存在诱导限制因子，此因子在短时间内控制CYP4基因表达效率，影响生物体对外源污染物的清除能力；WSF处理后期CYP4基因的相对表达再次被强烈诱导，于第15天出现基因表达峰值，随着处理时间延长，内脏团和外套膜CYP4基因表达水平整体呈现出先诱导后抑制再诱导的波动变化趋势。由于多环芳烃类物质对CYP家族基因的诱导机制第一步都是与芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)结合^[17]，芳香烃类物质的诱导作用与AHR总量特别是AHR受体结合位点的数量有关，并且芳香烃物质与AHR结合的紧密程度也是关键，通常与两者的结合表现为竞争性抑制^[18]。因此，同一浓度WSF诱导翡翠贻贝内脏团和外套膜CYP4基因表达会存在诱导率的差异，表现出时间效应关系。

内脏团各时期的CYP4基因表达均比外套膜强烈，STEGEMAN等^[19]研究证明金眼门齿鲷(Stenotomus chrysops)肝脏中P450的质量浓度明显高于心肌，表示消化组织CYP4基因较肌肉组织更容易被诱导表达；同时CYP4系列基因所调控表达的细胞色素P450酶系是生物体内的第一阶段代谢酶^[20]，该阶段酶催化外源有机化合物将氧分子拆分氧原子，促使反应底物羟基化或者环氧化，为第二阶段的谷胱甘肽转移酶(GST)提供基础作用物质^[21]。肖雅元等^[22]对翡翠贻贝内脏团和外套膜GST活性的比较得出，贻贝内脏团GST活性明显高于外套膜，与该研究中结果相吻合。整个WSF处理过程中，50 μg · L^-1浓度组影响下的翡翠贻贝CYP4基因表达最为显著，由此可推测此浓度影响下翡翠贻贝细胞色素P450酶系作用强烈，协助机体抗氧化酶系清除氧自由基，帮助生物体减轻由氧自由基带来的损伤作用最强，生物体对此浓度WSF的生理响应最为显著。

清水释放阶段翡翠贻贝内脏团和外套膜CYP4基因表达明显下降，逐步恢复到空白对照水平，说明翡翠贻贝内脏团和外套膜CYP4基因表达受外源污染物的直接影响，在无污染的稳定环境中表达水平则相对稳定。但机体抗氧化系统是个更为复杂的系统，CYP4基因被诱导表达，刺激机体产生更多细胞色素P450参与机体抗氧化反应，细胞色素P450的诱导具有剂量和时间效应，只有当诱导剂达到一定浓度和一定作用时间才发生诱导作用^[23]，由此推断出只有当外源污染物达到一定浓度和一定作用时间时，翡翠贻贝内脏团和外套膜CYP4基因表达才能呈现出显著而稳定的剂量和时间效应，从而将其应用于海洋石油亚致死浓度污染诊断的大分子生物标记。

4.   结论

该研究确定了翡翠贻贝内脏团和外套膜CYP4基因可受WSF诱导表达，存在诱导饱和现象；CYP4基因诱导表达能有效地控制机体氧化损伤程度，为揭示海水双壳贝类体内CYP4基因功能和参与机体抗氧化代谢过程研究提供了有益线索。目前该研究只发现外套膜CYP4基因表达具有一定的时间效应关系，发展翡翠贻贝CYP4基因表达作为大分子生物标记物用于海洋环境监测仍需进一步研究探讨。