cbpD基因对溶藻弧菌毒力及相关生物学特性的影响

苏雯晓, 邓益琴, 臧树军, 王茜, 林梓阳, 冯娟

苏雯晓, 邓益琴, 臧树军, 王茜, 林梓阳, 冯娟. cbpD基因对溶藻弧菌毒力及相关生物学特性的影响[J]. 南方水产科学, 2022, 18(5): 81-90. DOI: 10.12131/20220025
引用本文: 苏雯晓, 邓益琴, 臧树军, 王茜, 林梓阳, 冯娟. cbpD基因对溶藻弧菌毒力及相关生物学特性的影响[J]. 南方水产科学, 2022, 18(5): 81-90. DOI: 10.12131/20220025
SU Wenxiao, DENG Yiqin, ZANG Shujun, WANG Qian, LIN Ziyang, FENG Juan. Effects of cbpD gene on virulence and related biological characteristics of Vibrio alginolyticus[J]. South China Fisheries Science, 2022, 18(5): 81-90. DOI: 10.12131/20220025
Citation: SU Wenxiao, DENG Yiqin, ZANG Shujun, WANG Qian, LIN Ziyang, FENG Juan. Effects of cbpD gene on virulence and related biological characteristics of Vibrio alginolyticus[J]. South China Fisheries Science, 2022, 18(5): 81-90. DOI: 10.12131/20220025

cbpD基因对溶藻弧菌毒力及相关生物学特性的影响

基金项目: 中国水产科学研究院基本科研业务费资助 (2022GH03);国家自然科学基金项目 (31902415);广东省自然科学基金项目 (2019A1515011833);中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助 (2021SD15);广州市科技计划资助项目 (202201010162)
详细信息
    作者简介:

    苏雯晓 (1996—),女,硕士研究生,研究方向为水产动物病原学。E-mail: sosmcx1989@qq.com

    通讯作者:

    邓益琴 (1990—),女,副研究员,博士,从事鱼类细菌病及防治技术研究。E-mail: yiqindd@126.com

    冯 娟 (1973—),女,研究员,博士,从事水产动物免疫与防治技术研究。E-mail: jannyfeng@163.com

  • 中图分类号: R 917.1

Effects of cbpD gene on virulence and related biological characteristics of Vibrio alginolyticus

  • 摘要: 为研究几丁质结合蛋白 (Chitin-binding protein D, CbpD) 对溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus) 毒力和相关生物学特性的影响,通过同源重组技术构建溶藻弧菌ZJ-T的cbpD基因缺失突变株ZJ-T-ΔcbpD,比较突变株与野生株对斑马鱼 (Danio rerio) 的毒性,以及毒力相关生理过程,包括生长能力、运动性、胞外蛋白酶分泌活性、溶血活性、抗生素敏感性、生物膜形成、过氧化氢 (H2O2) 和铜离子 (Cu2+) 抗性以及铁离子 (Fe3+) 吸收能力的差异。研究发现,cbpD缺失后,溶藻弧菌对斑马鱼的毒力显著减弱,且细菌游动能力、涌动能力和胞外蛋白酶活性均降低,突变株对 Cu2+的抗性提高;cbpD的突变不影响溶藻弧菌在富营养培养基中的生长、生物膜的形成、溶血活性、对大部分抗生素敏感性、对H2O2的抗性和Fe3+的获取能力。结果表明,cbpD可能通过正调控溶藻弧菌的运动能力和胞外蛋白酶分泌活性,而促进溶藻弧菌的毒力。
    Abstract: In order to study the effect of the chitin binding protein D (CbpD) on the virulence and related biological characteristics of Vibrio alginolyticus, we constructed the cbpD gene deletion mutant strain of V. alginolyticus ZJ-T by homologous recombination technique. Then we compared the virulence to Danio rerio and other related physiological processes between the wild type strain and the cbpD gene mutant strain, including the growth ability, motility, extracellular protease secretion activity, hemolytic activity and antibiotic sensitivity, biofilm formation, hydrogen peroxide and copper ion resistance as well as ion absorption capacity. The results show that due to the absence of cbpD gene, the swimming motility, swarming motility and extracellular protease activity all reduced, while the resistance to copper ion of the mutant strain strengthened, and its virulence toD. rerio was weakened. However, the deletion of cbpD gene did not affect the growth of the strain in nutrient-rich medium, biofilm formation, hemolytic activity, stress response to H2O2, uptake and utilization of iron and sensitivity to most antibiotics. In conclusion, the results indicate that cbpD may promote the virulence by positively regulating the motility, extracellular protease secretion activity of V. alginolyticus.
  • 近年来,水产养殖过程中各种细菌、霉菌性流行病普遍发生,消毒剂也因此在水产养殖过程中被频繁使用[1-3]。消毒剂除了可杀灭和抑制病原外,还具有改良水质、为水生动物提供良好的生长和生活环境、提高经济效益的作用。高锰酸钾、聚维酮碘、二溴海因是养殖过程中的3种常见消毒剂。研究发现,聚维酮碘可以抑制养殖水体沉积物中氨氧化菌属的丰度[4],高锰酸钾可杀灭水体中的细菌[5],二溴海因和聚维酮碘对鱼类柱状黄杆菌 (Flavobacterium columnare) 有一定的抑菌效果[6],聚维酮碘对养殖水体中的细菌具有杀菌效果[7]。但用量超过药物安全浓度 (Safe concentration, SC) 会导致水生动物出现中毒甚至死亡,有研究显示在使用消毒剂对水体消毒时,会对褶皱臂尾轮虫 (Brachionus plicatilis)[8]、卤虫 (Artemia salina)[9]产生不利影响。

    原生动物纤毛虫是海洋生态系统的重要组成部分,参与营养物质的转化并维持生态系统的稳定性,对生态系统的物质循环和能量流动发挥着至关重要的作用[10-13]。纤毛虫分布范围广、易培养,通常被应用于生态学研究中,如分类学、微生物生态学、生态毒理学等,是一种重要的模式生物[14-17]。盐蚕豆虫 (Fabrea salina) 隶属于纤毛虫门、多膜纲、异毛目、蚕豆虫属,其生长周期短、繁殖速度快,能够在短时间内大量培养,且适应性强,在多种生境下均可生长繁殖,可作为海水经济动物的开口饵料。盐蚕豆虫细胞内的蛋白质和脂肪含量丰富 (质量分数分别为56.66%和36.66%),且其体内含有油酸、亚油酸和亚麻酸等脂肪酸。研究发现,使用盐蚕豆虫投喂红鲷鱼 (Lutjanus campechanus) 能明显提高其成活率 (提高了2.11%)[18]。目前消毒药物对盐蚕豆虫毒性效应的研究尚少,因此,本研究以开口饵料盐蚕豆虫为受试生物,探究了高锰酸钾、二溴海因、聚维酮碘3种常见消毒药物对其产生的毒性效应和种群动力学影响,以及对盐蚕豆虫进行水体消毒时适宜的药物及剂量。

    本研究选用的盐蚕豆虫来自天津农学院鱼类生理学实验室,试验前将盐蚕豆虫置于经0.22 μm孔径滤膜抽滤的盐度为55‰ 的人工海水中进行培养,在恒温光照培养箱中进行扩大培养,温度为28 ℃,光照强度为25 μmol·m−2·s−1,光暗周期为14 h∶10 h,使用杜氏盐藻 (Dunaliella salina) 进行投喂,当其密度达到4×104 个∙L−1时开展试验。

    采用水生生物毒性试验方法[19]。根据预试验结果,按照等对数间距法设置6个处理组,包括空白对照组和5个药物浓度梯度组 (表1)。每个药物浓度组设置3个重复,药物均为现配现用,配置时使用超声波振荡10 min加速溶解。试验在6孔细胞培养板中进行,最终试验体积为3 mL,用毛细玻璃管吸取盐蚕豆虫加入配好药物的6孔细胞培养板中,接种密度为10 个∙mL−1,急性毒性试验期间不喂食,每隔 24 h在解剖镜下观察计数盐蚕豆虫的成活数目,每个浓度组3 次重复,计数重复 2 次,计数误差不超过15%。分析结果通过概率单位法[20]计算确定半数致死浓度 (Lethal concentration 50, LC50)。

    表  1  3种消毒药物急性毒性试验质量浓度
    Table  1  Mass concentration of three disinfectant drugs in acute toxicity test
    药物名称
    Drug name
    质量浓度
    Mass concentration/(mg∙L−1)
    二溴海因
    Dibromo hydantoin
    0 0.50 0.71 1.00 1.41 2.00
    聚维酮碘
    Povidone iodine
    0 14.45 16.60 19.05 21.90 25.00
    高锰酸钾
    Potassium permanganate
    0 0.52 0.63 0.76 0.90 1.10
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    在6孔培养板中研究盐蚕豆虫的种群生长动态,培养基和培养条件与 LC50 测定相同。根据急性毒性试验结果,每种药物的质量浓度设置见表2。每天定时投喂杜氏盐藻 (6×109 个∙L−1) 作为食物。每个试验组设 3 个平行,每隔 24 h测定盐蚕豆虫的种群密度1次,取盐蚕豆虫培养液0.1 mL用浮游动物计数框 (0.1 mL) 计数,使用 2% (w) 的戊二醛固定液对盐蚕豆虫进行固定,每孔重复计数2次,2次计数误差不得超过15%[21-22]。由于二溴海因和聚维酮碘易挥发,故试验过程中每 24 h 用管口细度小于虫子体积的吸管,从6孔板每孔吸出一半测试液[23-25],并重新配置二溴海因溶液与聚维酮碘溶液和海水加至原测试液量,以保证二溴海因和聚维酮碘的有效性。

    表  2  3种消毒药物慢性毒性试验质量浓度
    Table  2  Mass concentration of three disinfectant drugs in chronic toxicity test
    药物名称
    Drug name
    质量浓度
    Mass concentration/(mg∙L−1)
    二溴海因
    Dibromo
    hydantoin
    0 0.015 0 0.018 7 0.024 9 0.037 4 0.074 8
    聚维酮碘
    Povidone iodine
    0 0.392 0 0.490 5 0.654 0 0.981 0 1.962 0
    高锰酸钾
    Potassium permanganate
    0 0.018 5 0.023 1 0.030 8 0.046 25 0.092 5
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    急性毒性试验的LC50采用概率单位法[20],通过作图后分析计数得出。药物对盐蚕豆虫的 SC [8] 、种群生长率(r)[26]、世代时间(G)与种群生长率之间的关系[27]计算公式为:

    $$ \mathrm{S}\mathrm{C}{\mathrm{=}}L_{48}\times 0.3/{\left(\frac{L_{24}}{L_{48}}\right)}^{2} $$ (1)
    $$ r{\mathrm{=}}\frac{\mathrm{l}\mathrm{n}\left({C}_{t}\right){\text{−}}\mathrm{l}\mathrm{n}\left({C}_{0}\right)}{t} $$ (2)
    $$ G{\mathrm{=}}\frac{\mathrm{l}\mathrm{n}2}{r} $$ (3)

    式中:L48L24分别为48和24 h的LC50C0Ct (个∙L−1) 分别为初始和t (d) 时纤毛虫的丰度。

    所有数据均使用Origin 2021 软件作图,使用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析 (One-way ANOVA)。

    聚维酮碘对盐蚕豆虫的急性毒性试验结果如图1-a所示。根据概率单位分析法求出聚维酮碘对盐蚕豆虫的死亡率概率单位与所加药物质量浓度对数的线性回归方程为y=5.147 3x−10.32 ($r^2 $=0.937 4)。根据方程计算得出聚维酮碘对盐蚕豆虫的48 h LC50为19.620 mg∙L−1

    图  1  3 种药物浓度对数与概率单位回归分析
    Fig. 1  Regression analysis of logarithmic and probit for three drugs

    高锰酸钾对盐蚕豆虫的急性毒性试验结果如图1-b所示。根据概率单位分析法求出高锰酸钾对盐蚕豆虫的死亡率概率单位与所加药物质量浓度对数的线性回归方程为y=2.608 1x−2.660 6 ($r^2 $=0.996)。根据方程计算得出高锰酸钾对盐蚕豆虫的48 h LC50为0.925 mg∙L−1

    二溴海因对盐蚕豆虫的急性毒性试验结果如图1-c所示。根据概率单位分析法求出二溴海因对盐蚕豆虫的死亡率概率单位与所加药物质量浓度对数的线性回归方程为y=1.620 7x−5.724 3 ($r^2 $=0.986 9)。根据方程计算得出二溴海因对盐蚕豆虫的48 h LC50为0.748 mg∙L−1

    不同二溴海因质量浓度组的盐蚕豆虫在经过24 h的停滞期后,均进入指数生长期,各处理组在第120小时达到最大种群密度 (图2)。随着二溴海因浓度升高,盐蚕豆虫的最大种群密度逐渐降低。One-way ANOVA检验结果表明 (图3),0.015 mg∙L−1组与对照组的最大种群密度差异不显著(p>0.05),其余处理组的最大种群生长率与对照组相比均存在极显著性差异 (p<0.01)。说明二溴海因对盐蚕豆虫种群生长起到了明显的抑制作用,并且随着浓度升高抑制作用越明显,其中0.074 8 mg∙L−1组的抑制作用最明显,最大种群密度为 (1.69±0.077)×105 个∙L−1,与对照组 [(2.19±0.056)×105 个∙L−1] 相比降低了23%。

    图  2  二溴海因对盐蚕豆虫种群生长曲线的影响
    Fig. 2  Effect of dibromo hydantoin on growth curve of F. salina population
    图  3  二溴海因对盐蚕豆虫最大种群密度的影响
    注: **. 与对照组相比差异极显著(p<0.01)。
    Fig. 3  Effect of dibromo hydantoin on maximum population density of F. salina
    Note: **. There are very significant differences compared with the control group (p<0.01).

    图4所示,随着二溴海因质量浓度升高,种群生长率呈下降趋势。One-way ANOVA检验结果表明,0.015 0 mg∙L−1组与对照组的种群生长率差异不显著 (p>0.05),其余处理组的种群生长率与对照组相比均存在显著性差异 (p<0.05)。其中0.074 8 mg∙L−1组下降最明显,种群生长率为 (0.57±0.009) d−1,比对照组下降了8%。

    图  4  二溴海因对盐蚕豆虫的种群生长率和世代时间的影响
    注:相同字母为组间无显著性差异 (p>0.05),不同字母为组间有显著性差异 (p<0.05),生长率用小写字母表示,世代时间用大写字母表示。
    Fig. 4  Effect of dibromo hydantoin on population growth rate and generation time of F. salina
    Note: The same letters represent insignificant differences among the groups (p>0.05), while different letters represent significant differences among the groups (p<0.05). Growth rates are represented by lowercase letters, while generation time are represented by uppercase letters.

    随着二溴海因质量浓度的升高,世代时间逐渐变长,One-way ANOVA检验结果表明,0.015 0 mg∙L−1组与对照组的世代时间差异不显著 (p>0.05),其余处理组的世代时间与对照组相比均存在显著性差异 (p<0.05)。其中0.074 8 mg∙L−1处理组的世代时间延长最为明显,世代时间为 (1.23±0.2) d,比对照组 [(1.11±0.024) d] 延长了11%。

    不同聚维酮碘质量浓度试验组的盐蚕豆虫,在经过24 h的停滞期后,均进入指数生长期。对照组、0.392 mg∙L−1、0.490 5 mg∙L−1和0.654 mg∙L−1组的种群密度在第120小时达到峰值,0.981 mg∙L−1和1.962 mg∙L−1组在第144 小时达到峰值。与对照组相比,聚维酮碘质量浓度为0.392 mg∙L−1试验组促进了纤毛虫的生长,最大种群密度增加,聚维酮碘质量浓度为0.981 mg∙L−1和1.962 mg∙L−1组,聚维酮碘对盐蚕豆虫的生长曲线产生了明显的抑制作用、指数生长期变长 (图5),其中1.962 mg∙L−1组抑制作用最明显,与对照组相比下降了25%。

    图  5  聚维酮碘对盐蚕豆虫种群生长曲线的影响
    Fig. 5  Effect of povidone iodine on growth curve of F. salina population

    One-way ANOVA检验结果表明 (图6),聚维酮碘质量浓度为0.654 mg∙L−1、0.981 mg∙L−1和1.962 mg∙L−1试验组与对照组盐蚕豆虫的最大种群密度均存在极显著性差异 (p<0.01),聚维酮碘质量浓度为0.392 mg∙L−1和0.490 5 mg∙L−1试验组与对照组盐蚕豆虫的最大种群密度均差异不显著 (p>0.05)。

    图  6  聚维酮碘对盐蚕豆虫最大种群密度的影响
    注: **. 与对照组相比差异极显著 (p<0.01)。
    Fig. 6  Effect of povidone iodine on maximum population density of F. salina
    Note: **. There are very significant differences compared with the control group (p<0.01).

    图7可见,聚维酮碘对盐蚕豆虫种群生长率呈低浓度促进,高浓度抑制作用。One-way ANOVA检验结果表明,聚维酮碘质量浓度高于0.654 mg∙L−1的试验组 (0.654、0.981和1.962 mg∙L−1) 和对照组盐蚕豆虫的种群生长率存在显著性差异 (p<0.05)。质量浓度低于0.654 mg∙L−1的试验组(0、0.392 0、0.490 5 mg∙L−1) 与对照组盐蚕豆虫的种群生长率差异均不显著 (p>0.05)。其中1.962 mg∙L−1组下降最明显,种群生长率为 (0.57±0.005) d−1,比对照组下降了9%。

    图  7  聚维酮碘对盐蚕豆虫的种群生长率和世代时间的影响
    注:相同字母为组间无显著性差异 (p>0.05),不同字母为组间有显著性差异 (p<0.05),生长率用小写字母表示,世代时间用大写字母表示。
    Fig. 7  Effect of povidone iodine on population growth rate and generation time of F. salina
    Note: The same letters represent insignificant differences among the groups (p>0.05), while different letters represent significant differences among the groups (p<0.05). Growth rates are represented by lowercase letters, while generation time are represented by uppercase letters.

    盐蚕豆虫世代时间随浓度变化先缩短后变长,聚维酮碘质量浓度高于0.654 mg∙L−1的试验组 (0.654、0.981和1.962 mg∙L−1) 和对照组盐蚕豆虫的世代时间存在显著性差异 (p<0.05)。其中1.962 mg∙L−1组的世代时间为 (1.22±0.011) d,延长最为明显,比对照组 [(1.10±0.003) d] 延长了10%。

    不同高锰酸钾浓度下盐蚕豆虫经过24 h的停滞期后,均进入指数生长期。各处理组在第120 小时均达到最大种群密度,其中0.02310 mg∙L−1组的抑制作用最明显,最大种群密度为 (1.13±0.22)×105 个∙L−1,与对照组相比下降了47.8%。对照组稳定期持续4 d,其他试验组均在第120 小时达到最大种群密度后就开始进入衰退期 (图8)。One-way ANOVA检验结果表明,对照组与其他试验组盐蚕豆虫的最大种群密度均存在极显著性差异 (p<0.01,图9)。

    图  8  高锰酸钾对盐蚕豆虫种群生长曲线的影响
    Fig. 8  Effect of potassium permanganate on growth curve of F. salina population
    图  9  高锰酸钾对盐蚕豆虫最大种群密度的影响
    Fig. 9  Effect of potassium permanganate on maximum population density of F. salina

    图10所示,随着高锰酸钾质量浓度的增加种群生长率呈先降后升的趋势,其中对种群生长率抑制作用最明显的是0.023 1 mg∙L−1组,种群生长率为 (0.47±0.007) d−1,比对照组降低了23%。One-way ANOVA检验结果表明,对照组与其他试验组的种群生长率均存在显著性差异 (p<0.05)。

    图  10  高锰酸钾对盐蚕豆虫的种群生长率和世代时间的影响
    注:相同字母为组间无显著性差异 (p>0.05),不同字母为组间有显著性差异 (p<0.05),生长率用小写字母表示,世代时间用大写字母表示。
    Fig. 10  Effect of potassium permanganate on population growth rate and generation time of F. salina
    Note: The same letters represent insignificant differences among the groups (p>0.05), while different letters represent significant differences among the groups (p<0.05). Growth rates are represented by lowercase letters, while generation time are represented by uppercase letters.

    浓度从低到高各试验组的世代时间呈先增后降的趋势,处理组的世代时间与对照组相比均存在显著性差异 (p<0.05)。其中0.023 1 mg∙L−1组的世代时间 [(1.30±0.078) d]延长最明显,比对照组延长了30%。

    高锰酸钾、二溴海因和聚维酮碘对盐蚕豆虫的24 h LC50分别为1.182、1.067和18.451 mg∙L−1,48 h LC50分别为0.925、0.748和19.620 mg∙L−1;SC分别为0.170、0.110 和6.655 mg∙L−1。盐蚕豆虫对3种消毒药物的敏感性依次为二溴海因>高锰酸钾>聚维酮碘,可能是因为二溴海因能水解成次溴酸,次溴酸可对盐蚕豆虫细胞内部结构产生不可逆的氧化和分解[28],使盐蚕豆虫对二溴海因的敏感性更高。二溴海因在生产上的常规施药剂量为0.3~0.4 mg∙L−1,在多种水产动物中的SC均高于其常规用量,如二溴海因对草鱼 (Ctenopharyngodon idellus) 的SC为14.1 mg∙L−1[29],对日本黄姑鱼 (Nibea japonica) 幼鱼的SC为0.79 mg∙L−1[30],对体长为3.5~5.0 cm太湖秀丽白虾 (Palaemon modestus) 的SC为21 mg∙L−1[31],本研究得出的二溴海因对盐蚕豆虫的 48 h LC50 (0.748 mg∙L−1) 也高于二溴海因的常规施药剂量,但其SC (0.110 mg∙L−1) 低于常规施药剂量,因此在研究二溴海因对盐蚕豆虫水体进行消毒时,可参考二溴海因SC不超过0.110 mg∙L−1的标准对水体进行消杀。

    高锰酸钾通常用于鱼类及其附属设施、设备的消毒,日常养殖过程中的一般使用剂量为2~5 mg∙L−1。本研究得出的高锰酸钾对盐蚕豆虫的24 h LC50为1.182 mg∙L−1,48 h LC50为0.925 mg∙L−1,SC为0.170 mg∙L−1,均低于日常养殖过程中的一般使用剂量。已有研究表明高锰酸钾对黄姑鱼 (Nibea albiflora Richardson) 幼鱼的24 h LC50为3.69 mg∙L−1,48 h LC50为3.23 mg∙L−1[32],对岩虫 (Marphysa sanguinea) 的24 h LC50为14.10 mg∙L−1,48 h LC50为9.59 mg∙L−1[33],对卤虫 (A. salina) 无节幼体的24 h LC50为21.333 mg∙L−1,48 h LC50为9.003 mg∙L−1[9],大于高锰酸钾对盐蚕豆虫的24 h和48 h LC50,说明盐蚕豆虫对高锰酸钾的敏感性略高于其他水生动物,因此在研究高锰酸钾对盐蚕豆虫水体进行消毒时,要在安全浓度范围内谨慎使用。

    聚维酮碘是聚乙烯吡咯烷酮与碘的络合物,对大部分细菌、真菌、霉菌孢子及部分病毒均有一定杀灭作用[34]。对水生生物来说,生命周期的不同阶段,种间甚至种内对聚维酮碘的耐受性存在差异。研究表明聚维酮碘对宽体金线蛭 (Whitmania pigra) 幼苗的24 h LC50为78.17 mg∙L−1,48 h LC50为70 mg∙L−1[35],聚维酮碘对暗纹东方鲀 (Takifugu obscurus) 稚鱼的24 h LC50为269.80 mg∙L−1,48 h LC50为200.00 mg∙L−1[36],本研究中聚维酮碘对盐蚕豆虫的24 h LC50为18.451 mg∙L−1,48 h LC50为19.620 mg∙L−1。由此可见,聚维酮碘对盐蚕豆虫的毒性远大于宽体金线蛭和暗纹东方鲀。刘青等[8]的研究表明聚维酮碘对褶皱臂尾轮虫 (B. plicatilis) 幼体的24 h LC50为2.25 mg∙L−1,48 h LC50为1.99 mg∙L−1,低于本研究中聚维酮碘对盐蚕豆虫的24 h和48 h LC50,表明盐蚕豆虫对聚维酮碘的耐受性比褶皱臂尾轮虫幼体高,本研究得出聚维酮碘SC为6.655 mg∙L−1,因此在盐蚕豆虫养殖水体中需要根据实际情况综合考虑水温、水质、虫体情况等各因素的影响来确定用量。

    纤毛虫种群生长均符合逻辑斯蒂增长曲线,即细胞在进行分裂前都有一段停滞期,随后进入指数生长期、稳定期及衰退期[37]。本研究显示,盐蚕豆虫在3种不同浓度消毒剂中的种群增长符合逻辑斯蒂增长曲线,对盐蚕豆虫种群生长的抑制作用随3种消毒剂浓度的增加越明显。对照组的盐蚕豆虫种群24 h后进入指数生长期,指数生长期持续96 h,在第120 小时达到最大种群密度,随后进入衰退期。本研究中,随着二溴海因浓度的增加,盐蚕豆虫的种群生长受到明显抑制,推测可能是由于过量的二溴海因会引起盐蚕豆虫的急性死亡,从而导致其种群密度下降。王兴强等[38]的研究也证实了随二溴海因浓度的升高,凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 的特定生长率、摄食量、饲料转换效率和吸收效率均呈下降趋势。

    高锰酸钾是水产养殖中传统的杀菌药剂,具有很强的氧化能力,可以快速氧化蛋白质等有机物,起到杀菌消毒的作用。本研究中,试验组高锰酸钾胁迫盐蚕豆虫的最大种群密度和生长率显著低于对照组,对盐蚕豆虫的种群生长产生了抑制作用。推测可能由于高锰酸钾通过与机体接触,快速氧化酶蛋白及其活性基团,高锰酸钾强的氧化能力损伤了虫体的抗氧化系统[9],导致其种群密度与对照组产生明显差异。谢钦铭和赵伟伟[39]研究发现使用高锰酸钾对褶皱臂尾轮虫的种群生长也会产生抑制作用,与本研究结果一致。本研究中投喂的杜氏盐藻中含有丰富的有机物[40],高锰酸钾的抗菌效力极易被有机物减弱[41],因此高浓度的高锰酸钾对盐蚕豆种群的生长率和世代时间未表现出明显的浓度依赖性。

    本研究中,盐蚕豆虫种群生长受到的抑制作用随着聚维酮碘浓度的增加而越发明显。盐蚕豆虫在质量浓度为0.392和0.490 5 mg·L−1 聚维酮碘中的种群生长率与对照组相比差异不显著,而高浓度组 (0.654、0.981、1.962 mg∙L−1) 生长率与对照组相比差异显著,推测可能是盐蚕豆虫对低浓度的聚维酮碘有一定的耐受性,高浓度的聚维酮碘破坏了盐蚕豆虫的细胞结构,抑制了盐蚕豆虫的生长,导致其种群密度下降。刘青等[8]研究褶皱臂尾轮虫的种群动态时发现,质量浓度为0.2 mg∙L−1 以上的聚维酮碘对褶皱臂尾轮虫的寿命、繁殖和种群增长有显著影响,高浓度的聚维碘酮抑制了褶皱臂尾轮虫的生长;张恺[42]的研究也发现高浓度的聚维酮碘对小球藻 (Chlorella pyrenidosa) 的生长会产生明显抑制作用,与本研究结果一致。

    本研究探究了二溴海因、高锰酸钾及聚维碘酮3种常见消毒药物对盐蚕豆虫的毒性效应,得出盐蚕豆虫对其的敏感性依次为二溴海因>高锰酸钾>聚维酮碘。这3种消毒药物在高浓度下对盐蚕豆虫的种群生长均起到了明显抑制作用,且盐蚕豆虫对这3种消毒药物的敏感性存在差异。目前,二溴海因、高锰酸钾及聚维碘酮对单细胞真核生物的作用机制报道尚少,后续研究应聚焦于3种消毒药物对盐蚕豆虫细胞发生机制的影响。

  • 图  1   缺失株ZJ-T-ΔcbpD的构建

    注:a. 质粒 pSW7848 线性化条带;b. cbpD 上下游片段,泳道 2 为 cbpD 上游同源臂,泳道 3 为 cbpD 下游同源臂;c. 重组自杀质粒 PCR 鉴定扩增片段;d. cbpD 缺失株的鉴定,泳道 5 为野生株扩增结果,泳道 6 为潜在突变株扩增结果。

    Figure  1.   Construction of deletion strain ZJ-T-ΔcbpD

    Note: a. Plasmid pSW7848 linearization band; b. cbpD upstream and downstream fragments, and Lane 2 is the upstream, while Lane 3 is the downstream; c. PCR to identify segment of recombinant suicide plasmid; d. Identification of cbpD deletion strain, Lane 5 is the amplification result of the wild strain, and Lane 6 is the amplification result of the potential mutant strain.

    图  2   LBS培养基中的生长曲线

    Figure  2.   Growth curves in LBS culture

    图  3   溶藻弧菌ZJ-T和突变株ZJ-T-ΔcbpD的运动性

    Figure  3.   Mobility of V. alginolyticus ZJ-T and mutant strain ZJ-T-ΔcbpD

    图  4   运动性统计分析

    注:*. P<0.05;**. P<0.01;图5-a、8-b同此。

    Figure  4.   Motility statistical analysis

    Note: *. P<0.05; **. P<0.01; The same case in Fig. 5-a and 8-b.

    图  5   蛋白酶分泌能力

    注: a. 蛋白质透明分解圈直径与菌落直径的比值;b. 脱脂牛奶平板图。

    Figure  5.   Secretion of extracellular protease capacity

    Note: a. The ratio of protein transparent decomposition circle diameter to colony diameter; b. Picture of skim milk plate.

    图  6   溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-ΔcbpD的溶血性

    Figure  6.   Hemolytic activity of V. alginolyticus ZJ-T and ZJ-T-ΔcbpD

    图  7   溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-ΔcbpD对过氧化氢、硫酸铜以及铁离子螯合剂2-2'-联吡啶的敏感性

    注:a. LBS 琼脂平板;b. 0.003% H2O2-LBS 平板;c. 4.5 mmol·L−1 CuSO4-LBS 平板;d. 150 μmol·L−1 DIP-LBS 平板。

    Figure  7.   Sensitivity to H2O2, CuSO4 and DIP of wild type and cbpD mutant on LBS plate

    Note: a. LBS agar plate; b. 0.003% H2O2-LBS agar plate; c. 4.5 mmol·L−1 CuSO4-LBS agar plate; d. 150 μmol·L−1 DIP-LBS agar plate.

    图  8   生物膜形成量

    Figure  8.   Biofilm formation

    图  9   溶藻弧菌ZJ-T和突变株ZJ-T-ΔcbpD感染斑马鱼后成活率

    Figure  9.   Survival rate of V. alginolyticus ZJ-T and mutant strain ZJ-T-ΔcbpD after infection of D. rerio

    表  1   本研究所用菌株及质粒

    Table  1   Strains and plasmids used in this study

    菌株或质粒
    Strain or plasmid
    相关特征
    Relevant characteristics
    来源
    Source
    菌株 Strain
     Vibrio alginolyticus ZJ-T 氨苄抗性;野生菌株ZJ-51半透明/光滑变体;分离自中国南部沿海患病石斑鱼 [15]
     ZJ-T-ΔcbpD 缺失cbpD基因的ZJ-T突变株 本文构建
     E. coliⅡ3813 lacIQ,thi1,supE44,endA1,recA1,hsdR17,gyrA462,zei298::Tn10[Tc],ΔthyA::erm-pir116;自杀质粒pSW7848的中间宿主 [16]
     E. coli GEB883 大肠杆菌野生株K12 ΔdapA::ermpir RP4-2 ΔrecAgyrA462,zei298::Tn10;接合作用供体菌 [17]
    质粒 Plasmid
     pSW7848 氯霉素抗性;具有R6K起点的自杀质粒,需要pir蛋白进行复制,带ccdB毒性基因 [18]
     pSW7848-cbpDup-cbpD down 氯霉素抗性;包括cbpD上下游同源臂的pSW7848质粒 本文构建
    下载: 导出CSV

    表  2   本研究所用引物

    Table  2   Primers used in this study

    引物      
    Primer      
    引物序列 (5'—3')      
    Primer sequence (5'–3')      
    用途   
    Application   
    pSW7848_fwd GTCTGATTCGTTACCAATTATGACAAC 扩增pSW7848片段
    pSW7848_rev GAATTCGATATCAAGCTTATCGATAC
    cbpD-U-F ataagcttgatatcgaattcCAACATATGTGGGATAGTGCGT 扩增cbpD上游同源臂
    cbpD-U-R ggtccattctttaccCTGAAACACAAGCGGTTTAAGC
    cbpD-D-F aaccgcttgtgtttcagGGTAAAGAATGGACCGCTC 扩增cbpD下游同源臂
    cbpD-D-R taattggtaacgaatcagacGTCTTGGTTCTTAAAGGAGCTG
    Del-check-pSW7848-F TCACTGTCCCTTATTCGCACC 验证cbpD上下游片段是否与
    质粒pSW7848重组成功
    Del-check-pSW7848-R CTGCTTTTGAGCACTACCCG
    Del-cbpD-check-F GTCACAACATTACGGGATCTAAC 检验cbpD基因是否成功敲除
    Del-cbpD-check-R GCGAATAACGATATGTGCTCTG
    下载: 导出CSV

    表  3   药敏试验结果

    Table  3   Drug sensitivity tests results of ZJ-T and ZJ-T-ΔcbpD

    药物   
    Drug   
    每片含量
    Content of each tablet/(μg·片−1)
    ZJ-TZJ-T-ΔcbpD
    抑菌圈直径
    Size of inhibition zone/mm
    敏感性
    Sensitivity
    抑菌圈直径
    Size of inhibition zone/mm
    敏感性
    Sensitivity
    克拉霉素 Claricid 15 18.24±1.10 S 15.59±0.81 I
    利福平 Rifampin 5 15.35±0.35 R 13.66±0.33 R
    阿莫西林 Amoxicillin 20 7.67±0.45 R 0 R
    多西环素 Doxycycline 30 12.79±0.32 I 13.08±0.19 I
    磺胺异噁唑 Sulfafurazole 300 0 R 0 R
    麦迪霉素 Medimycin 30 9.63±0.64 R 8.52±0.12 R
    头孢氨苄 Cephalexin 30 8.06±0.62 R 7.40±0.24 R
    氟苯尼考 Florfenicol 30 22.15±1.31 S 20.96±0.78 S
    妥布霉素 Tobramycin 10 15.07±1.32 S 15.25±2.01 S
    环丙沙星 Ciprofloxacin 5 16.37±1.07 I 16.98±1.56 I
    恩诺沙星 Enrofloxacin 10 15.04±0.87 R 14.91±0.44 R
    呋喃唑酮 Furazolidone 100 11.77±1.08 R 10.81±0.43 R
    复方新诺明 SMZ/TMP 23.75/1.25 0 R 0 R
    庆大霉素 Gentamicin 10 13.43±0.47 I 12.38±0.17 I
    链霉素 Streptomycin 10 8.12±0.16 R 8.08±0.12 R
    头孢唑啉 Cefazolin 30 10.01±0.78 R 9.73±0.04 R
    四环素 Tetracycline 30 12.89±0.73 R 12.90±1.15 R
    红霉素 Erythromycin 15 16.86±0.91 I 15.04±0.68 I
    氯霉素 Chloramphenicol 30 20.93±1.08 S 21.19±0.45 S
    氨苄西林 Ampicillin 10 0 R 0 R
    氧氟沙星 Ofloxacin 5 15.72±0.73 I 15.88±0.28 I
    诺氟沙星 Norfloxacin 10 14.24±0.62 I 14.75±0.84 I
    万古霉素 Vancomycin 30 0 R 0 R
    注:R. 耐药;I. 中度敏感;S. 高度敏感。 Note: R. Resistance; I. Moderately sensitivity; S. Highly sensitivity.
    下载: 导出CSV
  • [1]

    REN C, HU C, JIANG X, et al. Distribution and pathogenic relationship of virulence associated genes among Vibrio alginolyticus from the mariculture systems[J]. Mol Cell Probe, 2013, 27(3): 164-168.

    [2]

    LI X, ZHANG C, WEI F, et al. Bactericidal activity of a holin-endolysin system derived from Vibrio alginolyticus phage HH109[J]. Microb Pathogenesis, 2021, 159: 105135. doi: 10.1016/j.micpath.2021.105135

    [3]

    ZUO Y, ZHAO L, XU X, et al. Mechanisms underlying the virulence regulation of new Vibrio alginolyticus ncRNA Vvrr1 with a comparative proteomic analysis[J]. Emerg Microbes Infec, 2019, 8(1): 1604-1618. doi: 10.1080/22221751.2019.1687261

    [4]

    MOHAMAD N, ROSELI F A M, AZMAI M N A, et al. Natural concurrent infection of Vibrio harveyi and V. alginolyticus in cultured hybrid groupers in Malaysia[J]. J Aquat Anim Health, 2019, 31(1): 88-96. doi: 10.1002/aah.10055

    [5]

    YANG B, ZHAI S, LI X, et al. Identification of Vibrio alginolyticus as a causative pathogen associated with mass summer mortality of the Pacific oyster (Crassostrea gigas) in China[J]. Aquaculture, 2021, 535: 736363. doi: 10.1016/j.aquaculture.2021.736363

    [6]

    FAHMY N M, HAMED E sayed A E. Isolation and characterization of Vibrio alginolyticus strain HAT3 causing skin ulceration disease in cultured sea cucumber Holothuria atra (Jaeger, 1833)[J]. Egypt J Aquat Res, 2022, 48(1): 75-81.

    [7]

    ZHAO Z, LIU J, DENG Y, et al. The Vibrio alginolyticus T3SS effectors, Val1686 and Val1680, induce cell rounding, apoptosis and lysis of fish epithelial cells[J]. Virulence, 2018, 9(1): 318-330. doi: 10.1080/21505594.2017.1414134

    [8] 王俊霖, 招茵, 苏茵茵, 等. 溶藻弧菌T3SS exsD基因敲除突变株构建及其表型特征[J]. 广东海洋大学学报, 2021, 41(5): 35-43. doi: 10.3969/j.issn.1673-9159.2021.05.005
    [9]

    BUNPA S, CHAICHANA N, TENG J L L, et al. Outer membrane protein A (OmpA) is a potential virulence factor of Vibrio alginolyticus strains isolated from diseased fish[J]. J Fish Dis, 2020, 43(2): 275-284. doi: 10.1111/jfd.13120

    [10]

    CAI S, CHENG H, PANG H, et al. AcfA is an essential regulator for pathogenesis of fish pathogen Vibrio alginolyticus[J]. Vet Microbiol, 2018, 213: 35-41. doi: 10.1016/j.vetmic.2017.11.016

    [11]

    HUANG L, GUO L, XU X, et al. The role of RpoS in the regulation of Vibrio alginolyticus virulence and the response to diverse stresses[J]. J Fish Dis, 2019, 42(5): 703-712. doi: 10.1111/jfd.12972

    [12]

    GAVIARD C, COSETTE P, JOUENNE T, et al. LasB and CbpD virulence factors of Pseudomonas aeruginosa carry multiple post-translational modifications on their lysine residues[J]. J Proteome Res, 2019, 18(3): 923-933.

    [13] 王晓辉. 海洋细菌DL-6几丁质酶和几丁质结合蛋白的生化性质与功能研究[D]. 大连: 大连理工大学, 2016: 14.
    [14]

    ASKARIAN F, UCHIYAMA S, MASSON H, et al. The lytic polysaccharide monooxygenase CbpD promotes Pseudomonas aeruginosa virulence in systemic infection[J]. Nat Commun, 2021, 12(1): 1230. doi: 10.1038/s41467-021-21473-0

    [15]

    HUANG X, CHEN C, REN C, et al. Identification and characterization of a locus putatively involved in colanic acid biosynthesis in Vibrio alginolyticus ZJ-51[J]. Biofouling, 2018, 34(1): 1-14. doi: 10.1080/08927014.2017.1400020

    [16]

    le ROUX F, BINESSE J, SAULNIER D, et al. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector[J]. Appl Environ Microb, 2007, 73(3): 777-784. doi: 10.1128/AEM.02147-06

    [17]

    NGUYEN A N, DISCONZI E, CHARRIÈRE G M, et al. csrb gene duplication drives the evolution of redundant regulatory pathways controlling expression of the major toxic secreted metalloproteases in Vibrio tasmaniensis LGP32[J]. MSphere, 2018, 3(6): e00582-18.

    [18]

    VAL M E, SKOVGAARD O, DUCOS-GALAND M, et al. Genome engineering in Vibrio cholerae: a feasible approach to address biological issues[J]. PLOS Genet, 2012, 8(1): e1002472. doi: 10.1371/journal.pgen.1002472

    [19]

    DENG Y, CHEN C, ZHAO Z, et al. The RNA chaperone Hfq is involved in colony morphology, nutrient utilization and oxidative and envelope stress response in Vibrio alginolyticus[J]. PLOS ONE, 2016, 11(9): e0163689. doi: 10.1371/journal.pone.0163689

    [20]

    VAZQUEZ S, MERINO L, MACCORMACK W, et al. Protease-producing psychrotrophic bacteria isolated from Antarctica[J]. Polar Biol, 1995, 15(2): 131-135.

    [21] 邓益琴, 陈偿, 苏友禄, 等. 溶藻弧菌ZJ-T小RNA srvg23535基因突变株的构建及其功能初探[J]. 微生物学通报, 2019, 46(4): 829-841.
    [22]

    SPAN E A, MARIETTA M A. The framework of polysaccharide monooxygenase structure and chemistry[J]. Curr Opin Struc Biol, 2015, 35: 93-99. doi: 10.1016/j.sbi.2015.10.002

    [23]

    BHOWMICK R, GHOSAL A, DAS B, et al. Intestinal adherence of Vibrio cholerae involves a coordinated interaction between colonization factor GbpA and mucin[J]. Infect Immun, 2008, 76(11): 4968-4977. doi: 10.1128/IAI.01615-07

    [24]

    CHAUDHURI S, BRUNO J C, ALONZO F, et al. Contribution of chitinases to Listeria monocytogenes pathogenesis[J]. Appl Environ Microb, 2010, 76(21): 7302-7305. doi: 10.1128/AEM.01338-10

    [25]

    FREDERIKSEN R F, PASPALIARI D K, LARSEN T, et al. Bacterial chitinases and chitin-binding proteins as virulence factors[J]. Microbiology, 2013, 159(Pt5): 833-847.

    [26]

    JOSENHANS C, SUERBAUM S. The role of motility as a virulence factor in bacteria[J]. Int J Med Microbiol, 2002, 291(8): 605-614. doi: 10.1078/1438-4221-00173

    [27]

    ZHOU S, TU X, PANG H, et al. A T3SS regulator mutant of Vibrio alginolyticus affects antibiotic susceptibilities and provides significant protection to Danio rerio as a live attenuated vaccine[J]. Front Cell Infect Mi, 2020, 10: 183. doi: 10.3389/fcimb.2020.00183

    [28]

    CAO X, WANG Q, LIU Q, et al. Identification of a LuxO-regulated extracellular protein Pep and its roles in motility in Vibrio alginolyticus[J]. Microb Pathogenesis, 2011, 50(2): 123-131. doi: 10.1016/j.micpath.2010.12.003

    [29]

    ZHOU Z, PANG H, DING Y, et al. VscO, a putative T3SS chaperone escort of Vibrio alginolyticus, contributes to virulence in fish and is a target for vaccine development[J]. Fish Shellfish Immunol, 2013, 35(5): 1523-1531. doi: 10.1016/j.fsi.2013.08.017

    [30]

    WATNICK P I, LAURIANO C M, KLOSE K E, et al. The absence of a flagellum leads to altered colony morphology, biofilm development and virulence in Vibrio cholerae O139[J]. Mol Microbiol, 2001, 39(2): 223-235. doi: 10.1046/j.1365-2958.2001.02195.x

    [31] 李莹玉, 贺小贤, 蒋合阳, 等. 组氨酸激酶BaeS对溶藻弧菌毒力因子和环境应激的作用[J]. 陕西科技大学学报, 2022, 40(1): 57-64.
    [32]

    KIM I H, KIM S Y, PARK N Y, et al. Cyclo-(L-Phe-L-Pro), a quorum-sensing signal of Vibrio vulnificus, induces expression of hydroperoxidase through a ToxR-LeuO-HU-RpoS signaling pathway to confer resistance against oxidative stress[J]. Infect Immun, 2018, 86(9): e00932-17.

    [33]

    KARLIN K D. Metalloenzymes, structural motifs, and inorganic models[J]. Science, 1993, 261(5122): 701-708. doi: 10.1126/science.7688141

    [34]

    HODGKINSON V, PETRIS M J. Copper homeostasis at the host-pathogen interface[J]. J Biol Chem, 2012, 287(17): 13549-13555. doi: 10.1074/jbc.R111.316406

    [35]

    VANHOVE A S, RUBIO T P, NGUYEN A N, et al. Copper homeostasis at the host Vibrio interface: lessons from intracellular Vibrio transcriptomics[J]. Environ Microbiol, 2016, 18(3): 875-888. doi: 10.1111/1462-2920.13083

    [36]

    KONG W, HUANG L, SU Y, et al. Investigation of possible molecular mechanisms underlying the regulation of adhesion in Vibrio alginolyticus with comparative transcriptome analysis[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 2015, 107(5): 1197-1206. doi: 10.1007/s10482-015-0411-9

    [37]

    AFFANDI T, MCEVOY M M. Mechanism of metal ion-induced activation of a two-component sensor kinase[J]. Biochem J, 2019, 476(1): 115-135. doi: 10.1042/BCJ20180577

    [38]

    BURRIDGE L, WEIS J S, CABELLO F, et al. Chemical use in salmon aquaculture: a review of current practices and possible environmental effects[J]. Aquaculture, 2010, 306(1/2/3/4): 7-23.

    [39]

    RATTANAMA P, THOMPSON J R, KONGKERD N, et al. Sigma E regulators control hemolytic activity and virulence in a shrimp pathogenic Vibrio harveyi[J]. PLOS ONE, 2012, 7(2): e32523. doi: 10.1371/journal.pone.0032523

    [40]

    HALL-STOODLEY L, STOODLEY P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens[J]. Trends Microbiol, 2005, 13(1): 7-10. doi: 10.1016/j.tim.2004.11.004

推荐阅读
基于reca基因的qpcr与raa-lfd检测鳗败血假单胞菌方法的建立与应用
王一霖 et al., 南方水产科学, 2025
Hctlr1通过myd88-nf-κb信号通路参与三角帆蚌抗菌免疫应答
路俊怡 et al., 南方水产科学, 2024
尖翅燕鱼染色体水平基因组与特征分析
欧阳焱 et al., 南方水产科学, 2024
恩诺沙星及其代谢物环丙沙星在方斑东风螺体内药代动力学及残留消除规律研究
邓东 et al., 南方水产科学, 2024
鲤多拷贝基因mrc1的全基因组鉴定及表达分析
CHANG Songhuan et al., PROGRESS IN FISHERY SCIENCES, 2024
缢蛏abc转运蛋白基因家族成员全基因组鉴定及表达模式分析
YANG Fan et al., PROGRESS IN FISHERY SCIENCES, 2024
High-throughput rna isoform sequencing using programmed cdna concatenation
Al'Khafaji, Aziz M., NATURE BIOTECHNOLOGY, 2024
The chlamydomonas genome project, version 6: reference assemblies for mating-type plus and minus strains reveal extensive structural mutation in the laboratory
Craig, Rory J., PLANT CELL, 2023
Mechanism of lncrna gm2044 in germ cell development
FRONTIERS IN CELL AND DEVELOPMENTAL BIOLOGY, 2024
Tmem64 aggravates the malignant phenotype of glioma by activating the wnt/β-catenin signaling pathway
INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES, 2024
Powered by
图(9)  /  表(3)
计量
  • 文章访问数:  709
  • HTML全文浏览量:  223
  • PDF下载量:  59
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2022-01-23
  • 修回日期:  2022-02-28
  • 录用日期:  2022-03-10
  • 网络出版日期:  2022-03-25
  • 刊出日期:  2022-10-04

目录

/

返回文章
返回