Effects of cbpD gene on virulence and related biological characteristics of Vibrio alginolyticus
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摘要: 为研究几丁质结合蛋白 (Chitin-binding protein D, CbpD) 对溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus) 毒力和相关生物学特性的影响，通过同源重组技术构建溶藻弧菌ZJ-T的cbpD基因缺失突变株ZJ-T-ΔcbpD，比较突变株与野生株对斑马鱼 (Danio rerio) 的毒性，以及毒力相关生理过程，包括生长能力、运动性、胞外蛋白酶分泌活性、溶血活性、抗生素敏感性、生物膜形成、过氧化氢 (H2O2) 和铜离子 (Cu2+) 抗性以及铁离子 (Fe3+) 吸收能力的差异。研究发现，cbpD缺失后，溶藻弧菌对斑马鱼的毒力显著减弱，且细菌游动能力、涌动能力和胞外蛋白酶活性均降低，突变株对 Cu2+的抗性提高；cbpD的突变不影响溶藻弧菌在富营养培养基中的生长、生物膜的形成、溶血活性、对大部分抗生素敏感性、对H2O2的抗性和Fe3+的获取能力。结果表明，cbpD可能通过正调控溶藻弧菌的运动能力和胞外蛋白酶分泌活性，而促进溶藻弧菌的毒力。Abstract: In order to study the effect of the chitin binding protein D (CbpD) on the virulence and related biological characteristics of Vibrio alginolyticus, we constructed the cbpD gene deletion mutant strain of V. alginolyticus ZJ-T by homologous recombination technique. Then we compared the virulence to Danio rerio and other related physiological processes between the wild type strain and the cbpD gene mutant strain, including the growth ability, motility, extracellular protease secretion activity, hemolytic activity and antibiotic sensitivity, biofilm formation, hydrogen peroxide and copper ion resistance as well as ion absorption capacity. The results show that due to the absence of cbpD gene, the swimming motility, swarming motility and extracellular protease activity all reduced, while the resistance to copper ion of the mutant strain strengthened, and its virulence toD. rerio was weakened. However, the deletion of cbpD gene did not affect the growth of the strain in nutrient-rich medium, biofilm formation, hemolytic activity, stress response to H2O2, uptake and utilization of iron and sensitivity to most antibiotics. In conclusion, the results indicate that cbpD may promote the virulence by positively regulating the motility, extracellular protease secretion activity of V. alginolyticus.
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Keywords:
- Vibrio alginolyticus /
- cbpD gene /
- Gene knockout /
- Virulence regulation /
- Biological characteristics
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蜈蚣藻属(Grateloupia)隶属于红藻门、隐丝藻目、海膜科，广泛分布于世界各地沿海地区[1]。蜈蚣藻属种类多(全世界报道91种，中国报道42种[2])，用途广泛，可食用、药用(具有清热解毒、驱虫、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化等作用)，并可作为提取卡拉胶的工业原料，是有待于养殖和加工开发的重要海藻[3-4]。综合了解蜈蚣藻属的研究现状，对促进该属藻类的研究、开发和利用具有重要意义。目前对其药用研究进展[5]、应用和人工养殖前景[6]已有报道，而有关其生物学和海区养殖方面的研究进展尚未见报道。
蜈蚣藻属种类多，种类形态鉴定存在一定困难[7-8]，借助分子生物学方法进行种类鉴定后，该属一些种名一直在改动。如若不关注其分类学方面的变动，可能会给养殖或加工等研究工作带来一定影响。本文综合概述了国内外关于蜈蚣藻属分类的变动、繁殖生物学、生理生态和养殖的研究现状及存在的问题，以期为蜈蚣藻属增养殖和加工开发利用提供参考。
1. 蜈蚣藻属分类
蜈蚣藻属传统的鉴别方法是依据藻体形态、大小、颜色、质地、分支、固着器、藻体内部结构以及生殖器官等进行种类鉴别[1, 9]。因该属种类外部形态多样，同一种类的形态会因生态环境、地域等不同而差异巨大，仅依靠传统的方法鉴定该属种类显得不足[7-8]。随着分子生物学技术的发展，藻类分类学家借助DNA条形码与传统鉴定相结合的方法进行蜈蚣藻属的种类鉴定[9-14]，修正一些种名[7,15]并发布新种类[8,16-18]，因此使蜈蚣藻属的分类系统处于变动、不统一状态。蜈蚣藻属分类变动中需要关注的主要是属模式种蜈蚣藻(Grateloupia filicina)和入侵物种鲂生蜈蚣藻(G. doryphora)名称的修订、蜈蚣藻属的重新划分以及中国蜈蚣藻属种类的变化。2001年，Kawaguchi等[19]对分布在亚洲东部和意大利的属模蜈蚣藻进行了形态学观察和rbcL基因序列的对比分析, 将亚洲产的蜈蚣藻定为新种亚洲蜈蚣藻(G. asiatica)，此后有的学者采用亚洲蜈蚣藻来替代蜈蚣藻[20-21]，有的学者仍沿用原有名称[22]。由亚洲东部被带入大西洋的入侵物种鲂生蜈蚣藻，在2002年被重新鉴定为带形蜈蚣藻(G. turuturu)[23]，此后大部分文献对这一入侵物种均采用带形蜈蚣藻的名称[13-14]。1997年，Kawaguchi[24]根据形态鉴定结果建议将Pachymeniopsis并入到蜈蚣藻属，而2013年Gargiulo等[25]根据生殖器官结构以及rbcL分析，建议把蜈蚣藻属分为5个属(Grateloupia, Dermocorynus, Pachymeniopsis, Phyllymenia 和Prionitis)。韩国学者Kim等[26]按照Gargiulo的建议将披针形蜈蚣藻 (G. lanceolata)改为Pachymeniopsis lanceolata，西班牙学者Montes等[13]也按照Gargiulo等的建议恢复了Pachymeniopsis属，而中国的分类学家仍沿用原来的分类系统，2015年丁兰平等[2]仍将披针形蜈蚣藻归到蜈蚣藻属[2]。《中国海藻志》记载蜈蚣藻属31种[1]，随着黄海蜈蚣藻(G. huanghaiensis)等新增种类的不断发现及一些种名的修订，丁兰平等[2]报道了42种，Cao等[17-18]发现新增种类多枝蜈蚣藻(G. angusta)和异枝蜈蚣藻(G. variata)，修订帚状蜈蚣藻(G. fastigiata)为亚洲蜈蚣藻[7]、修订对枝蜈蚣藻(G. didymecladia)为亚栉状蜈蚣藻(G. subpectinata) [15]。
2. 繁殖生物学
2.1 蜈蚣藻的生活史
蜈蚣藻属不同种类的生活史相同，均由双倍体的果孢子体、四分孢子体和单倍体的配子体世代交替出现，四分孢子体和配子体同型[20,27]。
2.2 孢子萌发
蜈蚣藻属藻类的四分孢子和果孢子的萌发过程相同。不同种类孢子的萌发过程基本相同，孢子在放散附着后萌发成为基本细胞，由基本细胞分裂形成的盘状体生长萌发出直立体(幼苗)。不同种类孢子萌发过程略有不同的是从基本细胞萌发到盘状体阶段，大部分种类如大连蜈蚣藻(G. dalianensis) [27]和披针形蜈蚣藻[28]基本细胞都是原地分裂形成盘状体，但也有一些种类如亚洲蜈蚣藻[20]的基本细胞首先分裂形成丝状体再形成盘状体。细弱蜈蚣藻(G. tenuis)基本细胞的分裂则两种情况都存在[29]。带形蜈蚣藻(G. turuturu)正常萌发形成盘状体阶段没有出现丝状体，但在强光刺激下会产生丝状体 [30]。
2.3 繁殖与生长季节
蜈蚣藻属的种类繁多，分布广泛，因此其繁殖及生长季节也略有差异。迄今为止已报道亚栉状蜈蚣藻、椭圆蜈蚣藻(G. elliptica)、两叉蜈蚣藻(G. dichotoma)和亚洲蜈蚣藻的繁殖和生长季节[31-33]。生长在韩国东海岸的亚栉状蜈蚣藻四分孢子体生长旺季为10月和11月，而果孢子体则为9月到翌年3月，6—7月其藻体消失，8月开始形成新的直立体[31]。辽宁大连的椭圆蜈蚣藻和两叉蜈蚣藻生长盛期为6—7月，成熟期为5—8月[32]；亚洲蜈蚣藻3月出现幼体，10月生物量达到最大，繁殖季节为每年的8—11月[33]。汕头南澳的舌状蜈蚣藻(G. livida)每年3—4月生物量达到最大，5—6月藻体成熟[34]。
3. 影响生长、发育和生理的因素
3.1 温度、光照和盐度的影响
温度和光照对蜈蚣藻属藻类生长、发育具有重要的作用，目前已报道了蜈蚣藻(按重新鉴定命名为亚洲蜈蚣藻)藻体[35]和丝状体[22]生长、带形蜈蚣藻丝状体发育成为盘状体和盘状体萌发出直立体[36]、舌状蜈蚣藻附着孢子萌发和幼苗生长[34,37]、披针形蜈蚣藻盘状体生长[28]以及大连蜈蚣藻[27]、细弱蜈蚣藻[29]和亚洲蜈蚣藻[20-21]附着孢子萌发的最适温度和光照条件(表1)。另外，也报道了带形蜈蚣藻成为外来入侵物种的优势：生长快且对温度的适应范围广，30 ℃仍可存活[38]。
表 1 蜈蚣藻属一些种类生长发育的适宜温度和光照条件Table 1. Optimum temperature and light for growth and development of some species of Grateloupia种类
species生长发育阶段
developmental stage温度/℃
temperature光照强度/μmol·(m2·s) −1
light intensity参考文献
Reference亚洲蜈蚣藻 G. asiatica 藻体 23 100 [35] 亚洲蜈蚣藻 G. asiatica 丝状体 20 31.25 [22] 带形蜈蚣 G. turuturu 丝状体到盘状体 25 60 [36] 带形蜈蚣藻 G. turuturu 盘状体到直立体 20 60 [36] 大连蜈蚣藻 G. dalianensis 附着孢子到直立体 16 93.75~125 [27] 细弱蜈蚣藻 G. tenuis 附着孢子到直立体 24 120 [29] 亚洲蜈蚣藻 G. asiatica 附着孢子到直立体 20~25 42~80 [20-21] 舌状蜈蚣藻 G. livida 附着孢子到直立体 25 62.5 [34] 舌状蜈蚣藻 G. livida 附着孢子到幼苗 18 35 [37] 披针形蜈蚣藻 G. lanceolata 盘状体到直立体 15 80 [28] 注：文献中光照强度单位为lx的, 根据公式1 000 lx=12.5 μmol· (m2·s) −1换算; 文献[22]和[35]中蜈蚣藻根据新的命名改为亚洲蜈蚣藻 Note: It was changed to μmol·(m2·s)−1 according to the formula 1 000 lx=12.5 μmol·(m2·s)−1 for the unit of light intensity of Reference [22], [27] and [34]. G. filicina of Reference [22] and [35] was changed to G. asiatica according to revision. 在研究光照对蜈蚣藻属藻类的影响时，大部分实验都将光照周期设置为12 L∶12 D，而实际上，不同种类不同生长阶段对光照周期的要求有差异，如舌状蜈蚣藻盘状体和幼苗生长最适光照周期为8~10 h[37]，而蜈蚣藻(亚洲蜈蚣藻)丝状体生长最适光照周期为24 h[22]。
盐度对蜈蚣藻属的生长、发育和生理也有影响。已报道舌状蜈蚣藻果孢子放散附着的合适盐度范围为24~40[39]；亚洲蜈蚣藻丝状体生长最适盐度为32[22]；亚洲蜈蚣藻藻体生长和光合作用速率在盐度20时达到最大[35]。
3.2 其他因素的影响
Jiang等[40]研究了不同二氧化碳(CO2)浓度对舌状蜈蚣藻生长、光合作用和氮吸收的作用，结果表明舌状蜈蚣藻用
${\rm HCO}^-_3$ 作为光合作用的无机碳源，过高或过低的CO2浓度均不利于生长和光合作用。Yokoya和Handro[41]的研究表明植物生长素2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)或吲哚-3-乙酸和细胞分裂素6-苄氨基嘌呤混合(1∶5 mg·L–1)对两叉蜈蚣藻直立体生长具有促进作用。Garcia-Jimenez等[42]研究报道了茉莉酮酸甲酯诱导复瓦蜈蚣藻(G. imbricata)果孢子形成的分子机制。
4. 人工繁殖与养殖
从20世纪80年代至今，对蜈蚣藻属一些种类的人工繁殖和养殖实验从未间断。采集孢子进行苗种培育[43]、切碎盘状体和直立体产生丝状体再由丝状体培育出苗种[44-45]、采用原生质体和愈伤组织进行苗种培育[46-47]和藻体切段作为苗种[48]的繁殖方法，在蜈蚣藻属一些种类的应用已证明可行。一些种类的养殖实验随着苗种培育的进行而开展。如右田清治[49]将蜈蚣藻(亚洲蜈蚣藻)孢子萌发成的盘状体切碎后泼洒于紫菜网和牡蛎壳上，在室内培养1个月后放于海区养殖，2个月后藻体可达15 cm；林江崑[50]把室内培养到1 cm (约2个月)的蜈蚣藻(亚洲蜈蚣藻)苗夹到绳子里吊养于海区，2个月后藻体达到上市规格(25 cm)。Iima等[44]采用同样方法进行顶状蜈蚣藻的养殖，2个月后在牡蛎壳上的藻体长度达12 cm；Huang等[47]把带形蜈蚣藻的愈伤组织切碎泼洒在紫菜网上进行苗种培养(42~56 d)后吊养于海区，5个月后藻体长度达110 cm；白凯强等[51]进行了披针形蜈蚣藻与紫贻贝的混养实验。
从蜈蚣藻属存在的多种人工繁殖方式及一些养殖实验结果可以看出，该属藻类具有较强的繁殖生长能力，具备进行养殖的优势，但是到目前为止，中国尚未有进行规模化苗种生产与养殖的蜈蚣藻属种类。
5. 存在的问题与展望
随着DNA条形码的应用，蜈蚣藻属的分类取得了较大进展，但由此带来了分类系统的变动，如未引起从事藻类培养、加工研究人员关注的话，则可能会影响相关文献的查询或研究成果的报道。如亚洲东部属模式种蜈蚣藻修订为亚洲蜈蚣藻，若查阅资料时仍按蜈蚣藻种名检索，则会忽略或遗漏以亚洲蜈蚣藻种名发表的相关文献，且在发表自己的研究成果时仍按蜈蚣藻这个学名而未能及时更新。另外，如不清楚在近几年发表的外国文献中已将披针形蜈蚣藻从蜈蚣藻属中移出，也可能会查漏相关的研究信息。总之，对蜈蚣藻属进行研究时应关注其多变的分类系统。
蜈蚣藻属种类多，有些种类繁殖生长能力强且藻体大(可达1 m以上)，容易形成优势种类，如带形蜈蚣藻、复瓦蜈蚣藻和披针形蜈蚣藻在南非、欧洲、北美等地被作为来自于亚洲东部的入侵物种进行研究报道[13-14,38,52]。每年2—4月，在广东汕头南澳、福建东山的养殖筏架或浮绠上附着生长大量蜈蚣藻属的种类(调查结果另文发表)。这些蜈蚣藻属种类目前未能被充分利用而造成资源浪费。蜈蚣藻属的一些种类作为食用海藻(海藻沙拉)在日本和韩国深受欢迎，但中国大部分沿海居民只把其当成药物，没有大量食用。这是其资源未被充分利用的因素之一，也是其未被规模化养殖的原因。另外，虽然对蜈蚣藻属的药用、营养成分以及提取方法已有较多的研究报道[3-4,53-54]，对该属藻类加工业的发展已引起人们的关注，但因蜈蚣藻的养殖没能形成规模，仅仅依靠自然海区的资源量难以维持和促进其加工业的发展。这也是蜈蚣藻属养殖和加工开发中存在的问题。
中国居民食用海藻以煮汤为主，但蜈蚣藻属做汤没有紫菜鲜甜，这是其未能作为食用海藻的原因之一。然而，蜈蚣藻属的舌状蜈蚣藻、披针形蜈蚣藻等制作成凉拌菜或炒菜有海带等藻类无法比拟的爽滑口感，使其在日本和韩国市场深受青睐。长茎葡萄蕨藻(海葡萄，Caulerpa lentillifera) 仅适于制作凉拌菜，20世纪70年代在日本开始养殖并广受欢迎 (中国于2006年从日本引进养殖[55])。在中国海南省有海葡萄的自然分布，却未被利用。近年在兴起海葡萄养殖热潮后，才有采集海南分布的海葡萄进行养殖实验的报道[56]。从海葡萄的事例可得到启发，蜈蚣藻属种类食用市场的拓展，应像海葡萄一样宣传推广，将蜈蚣藻属中食用口感好的种类加工成海洋蔬菜，让更多的人品尝并宣传其食用方法，拓展其消费市场，从而促进其养殖业的发展。在倡导绿色食品、发展海洋药物以及中国素食者逐年增加的新形势下，开发利用多种海藻是一种必然趋势。蜈蚣藻属种类多且用途广泛，随着该属藻类活性物质提取和食品加工研究的深入开展，对该属藻类的食用以及加工利用会逐渐增加，从而将带动该属藻类养殖和加工业的发展。
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图 1 缺失株ZJ-T-ΔcbpD的构建
注：a. 质粒 pSW7848 线性化条带；b. cbpD 上下游片段，泳道 2 为 cbpD 上游同源臂，泳道 3 为 cbpD 下游同源臂；c. 重组自杀质粒 PCR 鉴定扩增片段；d. cbpD 缺失株的鉴定，泳道 5 为野生株扩增结果，泳道 6 为潜在突变株扩增结果。
Figure 1. Construction of deletion strain ZJ-T-ΔcbpD
Note: a. Plasmid pSW7848 linearization band; b. cbpD upstream and downstream fragments, and Lane 2 is the upstream, while Lane 3 is the downstream; c. PCR to identify segment of recombinant suicide plasmid; d. Identification of cbpD deletion strain, Lane 5 is the amplification result of the wild strain, and Lane 6 is the amplification result of the potential mutant strain.
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图 3 溶藻弧菌ZJ-T和突变株ZJ-T-ΔcbpD的运动性
Figure 3. Mobility of V. alginolyticus ZJ-T and mutant strain ZJ-T-ΔcbpD
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图 4 运动性统计分析
注：*. P<0.05；**. P<0.01；图5-a、8-b同此。
Figure 4. Motility statistical analysis
Note: *. P<0.05; **. P<0.01; The same case in Fig. 5-a and 8-b.
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图 5 蛋白酶分泌能力
注： a. 蛋白质透明分解圈直径与菌落直径的比值；b. 脱脂牛奶平板图。
Figure 5. Secretion of extracellular protease capacity
Note: a. The ratio of protein transparent decomposition circle diameter to colony diameter; b. Picture of skim milk plate.
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图 6 溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-ΔcbpD的溶血性
Figure 6. Hemolytic activity of V. alginolyticus ZJ-T and ZJ-T-ΔcbpD
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图 7 溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-ΔcbpD对过氧化氢、硫酸铜以及铁离子螯合剂2-2'-联吡啶的敏感性
注：a. LBS 琼脂平板；b. 0.003% H2O2-LBS 平板；c. 4.5 mmol·L−1 CuSO4-LBS 平板；d. 150 μmol·L−1 DIP-LBS 平板。
Figure 7. Sensitivity to H2O2, CuSO4 and DIP of wild type and cbpD mutant on LBS plate
Note: a. LBS agar plate; b. 0.003% H2O2-LBS agar plate; c. 4.5 mmol·L−1 CuSO4-LBS agar plate; d. 150 μmol·L−1 DIP-LBS agar plate.
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图 9 溶藻弧菌ZJ-T和突变株ZJ-T-ΔcbpD感染斑马鱼后成活率
Figure 9. Survival rate of V. alginolyticus ZJ-T and mutant strain ZJ-T-ΔcbpD after infection of D. rerio
表 1 本研究所用菌株及质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株或质粒
Strain or plasmid相关特征
Relevant characteristics来源
Source菌株 Strain Vibrio alginolyticus ZJ-T 氨苄抗性；野生菌株ZJ-51半透明/光滑变体；分离自中国南部沿海患病石斑鱼 [15] ZJ-T-ΔcbpD 缺失cbpD基因的ZJ-T突变株 本文构建 E. coliⅡ3813 lacIQ，thi1，supE44，endA1，recA1，hsdR17，gyrA462，zei298::Tn10[Tc]，ΔthyA::erm-pir116；自杀质粒pSW7848的中间宿主 [16] E. coli GEB883 大肠杆菌野生株K12 ΔdapA::ermpir RP4-2 ΔrecAgyrA462，zei298::Tn10；接合作用供体菌 [17] 质粒 Plasmid pSW7848 氯霉素抗性；具有R6K起点的自杀质粒，需要pir蛋白进行复制，带ccdB毒性基因 [18] pSW7848-cbpDup-cbpD down 氯霉素抗性；包括cbpD上下游同源臂的pSW7848质粒 本文构建 
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表 2 本研究所用引物
Table 2 Primers used in this study
引物
Primer引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')用途
ApplicationpSW7848_fwd GTCTGATTCGTTACCAATTATGACAAC 扩增pSW7848片段 pSW7848_rev GAATTCGATATCAAGCTTATCGATAC cbpD-U-F ataagcttgatatcgaattcCAACATATGTGGGATAGTGCGT 扩增cbpD上游同源臂 cbpD-U-R ggtccattctttaccCTGAAACACAAGCGGTTTAAGC cbpD-D-F aaccgcttgtgtttcagGGTAAAGAATGGACCGCTC 扩增cbpD下游同源臂 cbpD-D-R taattggtaacgaatcagacGTCTTGGTTCTTAAAGGAGCTG Del-check-pSW7848-F TCACTGTCCCTTATTCGCACC 验证cbpD上下游片段是否与
质粒pSW7848重组成功Del-check-pSW7848-R CTGCTTTTGAGCACTACCCG Del-cbpD-check-F GTCACAACATTACGGGATCTAAC 检验cbpD基因是否成功敲除 Del-cbpD-check-R GCGAATAACGATATGTGCTCTG
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表 3 药敏试验结果
Table 3 Drug sensitivity tests results of ZJ-T and ZJ-T-ΔcbpD
药物
Drug每片含量
Content of each tablet/(μg·片−1)ZJ-T ZJ-T-ΔcbpD 抑菌圈直径
Size of inhibition zone/mm敏感性
Sensitivity抑菌圈直径
Size of inhibition zone/mm敏感性
Sensitivity克拉霉素 Claricid 15 18.24±1.10 S 15.59±0.81 I 利福平 Rifampin 5 15.35±0.35 R 13.66±0.33 R 阿莫西林 Amoxicillin 20 7.67±0.45 R 0 R 多西环素 Doxycycline 30 12.79±0.32 I 13.08±0.19 I 磺胺异噁唑 Sulfafurazole 300 0 R 0 R 麦迪霉素 Medimycin 30 9.63±0.64 R 8.52±0.12 R 头孢氨苄 Cephalexin 30 8.06±0.62 R 7.40±0.24 R 氟苯尼考 Florfenicol 30 22.15±1.31 S 20.96±0.78 S 妥布霉素 Tobramycin 10 15.07±1.32 S 15.25±2.01 S 环丙沙星 Ciprofloxacin 5 16.37±1.07 I 16.98±1.56 I 恩诺沙星 Enrofloxacin 10 15.04±0.87 R 14.91±0.44 R 呋喃唑酮 Furazolidone 100 11.77±1.08 R 10.81±0.43 R 复方新诺明 SMZ/TMP 23.75/1.25 0 R 0 R 庆大霉素 Gentamicin 10 13.43±0.47 I 12.38±0.17 I 链霉素 Streptomycin 10 8.12±0.16 R 8.08±0.12 R 头孢唑啉 Cefazolin 30 10.01±0.78 R 9.73±0.04 R 四环素 Tetracycline 30 12.89±0.73 R 12.90±1.15 R 红霉素 Erythromycin 15 16.86±0.91 I 15.04±0.68 I 氯霉素 Chloramphenicol 30 20.93±1.08 S 21.19±0.45 S 氨苄西林 Ampicillin 10 0 R 0 R 氧氟沙星 Ofloxacin 5 15.72±0.73 I 15.88±0.28 I 诺氟沙星 Norfloxacin 10 14.24±0.62 I 14.75±0.84 I 万古霉素 Vancomycin 30 0 R 0 R 注：R. 耐药；I. 中度敏感；S. 高度敏感。 Note: R. Resistance; I. Moderately sensitivity; S. Highly sensitivity.
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