Effects of cold stress on black porgy tissue injury and apoptosis gene expression
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摘要: 为探究黑鲷 (Acanthopagrus schlegelii) 在低温下的生理适应机制，设计了3个温度梯度 (15、10和5 ℃)，以15 ℃为对照，低温胁迫24 h，分别研究了冷应激前后黑鲷的组织结构变化、生理生化反应及凋亡基因的表达。结果显示，随着温度的降低，黑鲷呈现出肝脏空泡化、腮小片收缩、肌纤维断裂等组织损伤现象；肝脏中的甘油三酯 (TG) 含量显著降低 (P<0.05)，谷草转氨酶 (AST)、谷丙转氨酶 (ALT) 活性和总胆固醇 (T-CHO) 含量显著升高 (P<0.05)，表明黑鲷遭受冷应激，肝脏功能紊乱、结构遭到破坏。q-PCR结果显示，10 ℃时黑鲷通过降低apaf-1、bax、caspase-1基因表达量，促进caspase-3、diablo基因表达，从而减少肝脏细胞丢失来降低冷应激的损伤；胁迫至5 ℃时，温度超过黑鲷自身生理调节阈值，肝脏细胞受损程度加重，黑鲷促进apaf-1、bcl-2和diablo基因表达，抑制caspase-3基因表达，最大限度维持了肝脏细胞的稳态。结果表明，随着温度的降低，黑鲷的肝脏、腮、肌肉损伤加重，其中肝脏通过调节AST、ALT、T-CHO、TG以及凋亡基因表达，以减少组织损伤带来的危害。Abstract: In order to explore the physiological adaptation mechanism of black porgy (Acanthopagrus schlegelii) under low temperature stress, we designed three temperature gradient groups (15, 10 and 5 ℃). Taking 15 ℃ as the control group and with a low temperature stress for 24 h, we studied the tissue structure changes, physiological, biochemical reactions and the expression of apoptosis genes before and after the cold stress. The results show that with the intensification of low temperature stress, the tissue damage such as liver vacuolation, gill lamellae contraction and breakage and muscle fiber breakage were aggravated. The content of triglyceride (TG) in the liver decreased significantly, while the activities of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) as well as the content of total cholesterol (T-CHO) increased significantly, indicating that A. schlegelii had suffered from liver dysfunction and structural damage under cold stress condition. At 10 ℃, the liver reduced the damage of cold stress by decreasing expression levels of apaf-1, bax and caspase-1 genes, increasing expression of caspase-3 and diablo genes so as to reduce the loss of liver cells. When the temperature reached 5 ℃, the temperature exceeded A. schlegelii's physiological regulation threshold, so the degree of liver cell damage was aggravated. The expression of apaf-1, bcl-2 and diablo genes were promoted, while the caspase-3 gene expression was inhibited in order to maintain the homeostasis of liver cells to the greatest extent. It is showed that as the temperature decreased, the liver, gills and muscle damages of A. schlegelii increased. The liver regulated the expression of AST, ALT, T-CHO, TG and apoptotic pathway related genes to reduce the damage caused by tissue damage.
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Keywords:
- Acanthopagrus schlegelii /
- Cold stress /
- Tissue section /
- Apoptosis
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卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)属于鲈形目、鲳鲹属，肉质细嫩鲜美，营养价值丰富，是深受大众喜爱的海水食用鱼[1]。近年来，中国和东南亚的一些国家对卵形鲳鲹的商业化养殖不断增加[2]。卵形鲳鲹是大量使用配合饲料养殖的海水鱼之一，鱼粉因蛋白质和必需氨基酸含量高、富含n-3多不饱和脂肪酸和维生素等优点[3]，一直是卵形鲳鲹配合饲料中使用最多的蛋白源。但由于近年来鱼粉价格上涨且供应量不稳定，寻求合适的蛋白源成为水产行业迫切需要解决的问题。在目前研究的植物蛋白中，豆粕因其消化吸收率高、产量丰富、成本低等优点[4]，被认为是可替代鱼粉的蛋白源之一。然而，豆粕存在抗营养因子、适口性差等缺点，这限制了其在饲料中的广泛应用[5]。发酵豆粕是豆粕的加工产物，通过发酵将抗营养因子、蛋白质、纤维等降解来提高大豆蛋白的营养价值和适口性[6-7]。许多研究已证实发酵豆粕在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[8]、黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)[9]、杂交罗非鱼(Oreochromis mossambicus×O. niloticus)[10]中部分替代鱼粉，可以获得较好的生长性能和免疫状态。发酵豆粕原料丰富，加工方式绿色环保，营养价值高，可以减少水产行业对鱼粉的依赖，缓解蛋白源相对紧缺的情况。与鱼粉相比，植物蛋白源氨基酸含量非常不平衡，目前已证实赖氨酸和蛋氨酸是内源代谢的2种限制性氨基酸[11]，限制性氨基酸含量不平衡会导致鱼体生长性能下降、饲料利用率下降、免疫状态下降等[12]。发酵豆粕替代鱼粉在卵形鲳鲹中也有相关研究，刘兴旺等[13]发现发酵豆粕替代鱼粉水平不超过60.8%对卵形鲳鲹的生长和饲料利用率无不利影响，但未探讨在添加限制性氨基酸条件下发酵豆粕替代鱼粉对卵形鲳鲹的影响。本研究在各发酵豆粕组中添加适量赖氨酸和蛋氨酸，探讨发酵豆粕替代鱼粉对卵形鲳鲹生长和血清生化的影响，以期为卵形鲳鲹合理使用发酵豆粕、优化饲料配方提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 实验饲料
本实验共配制了5种等氮等脂的饲料，以鱼油为主要脂肪源，鱼粉为基础蛋白源。各实验饲料分别添加0% (FM)，25% (FSM25)，50% (FSM50)，75% (FSM75)和100% (FSM100)的发酵豆粕替代鱼粉，并分别添加0%、0.10%、0.22%、0.35%和0.45%的赖氨酸及0%、0.14%、0.27%、0.41%和0.54%的蛋氨酸。饲料原料及营养组成见表1，原料及饲料必需氨基酸组成见表2。所有饲料原料粉碎后过40目筛，原料混匀后依次加入脂肪源、大豆卵磷脂和水，经过制粒机(华南理工大学)制成2.5 mm的沉性饲料颗粒，4 ℃密封备用。
表 1 饲料原料与营养组成Table 1. Ingredients and proximate composition of experimental diets% 原料
ingredient组别 group FM FSM25 FSM50 FSM75 FSM100 鱼粉 fish meal 42 31.5 21 10.5 0 发酵豆粕 fermented soybean meal 0 14 28 42 56 玉米蛋白粉 corn gluten meal 19 20 22 24 26 麦麸 wheat bran 24 20 14 5 0 鱼油 fish oil 6 6.5 7.4 8.6 9.5 α-纤维素 α-cellulose 2.5 1.26 0.61 2.64 1.01 大豆卵磷脂 soybean lecithin 2 2 2 2 2 磷酸二氢钙 calcium dihydrogen phosphate 2 2 2 2 2 氯化胆碱 choline chloride 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 维生素预混料1 vitamin premix 1 1 1 1 1 矿物质预混料2 mineral premix 1 1 1 1 1 赖氨酸 lysine 0 0.10 0.22 0.35 0.45 蛋氨酸 methionine 0 0.14 0.27 0.41 0.54 总计 total 100 100 100 100 100 营养水平/% nutrition level 粗蛋白 protein 42.2 42 43.8 43.4 44.1 粗脂肪 lipid 9.5 9.8 10.4 9.9 9.9 水分 moisture 10.5 10.9 9 9 9.4 灰分 ash 9.2 8.4 7.7 6.9 5.9 注：1. 维生素预混料(每kg含量)：维生素A 8 000 000 IU，维生素D3 2 000 000 IU，维生素K3 10 000 mg，维生素E 40 000 mg，维生素B1 7 000 mg，维生素B2 15 000 mg，维生素B6 12 000 mg，维生素B12 100 mg，烟酰胺 90 000 mg，叶酸 1 000 mg，D-泛酸 35 000 mg，生物素 200 mg，肌醇 80 000 mg；2. 矿物质预混料(每kg含量)：铁 10 000 mg，铜1 200 mg，锰 5 500 mg，锌 7 000 mg，钴 250 mg，碘 250 mg，硒 50 mg，钾 60 000 mg，钠 24 000 mg，镁 60 000 mg Note: 1. vitamin premix (per kilogram content): Vitamin A 8 000 000 IU, Vitamin D3 2 000 000 IU, Vitamin K3 10 000 mg, Vitamin E 40 000 mg, Vitamin B1 7 000 mg, Vitamin B2 15 000 mg, Vitamin B6 12 000 mg, Vitamin B12 100 mg, nicotinamide 90 000 mg, folic acid 1 000 mg, D-pantothenic acid 35 000 mg, biotin 200 mg, inositol 80 000 mg; 2. mineral premix (per kilogram content): Fe 10 000 mg, Cu 1 200 mg, Mn 5 500 mg, Zn 7 000 mg, Co 250 mg, I2 250 mg, Se 50 mg, K 60 000 mg, Na 24 000 mg, Mg 60 000 mg 表 2 原料及饲料必需氨基酸组成Table 2. Essential amino acids composition of ingredient and experimental diets% 必需氨基酸
essential amino acid鱼粉
fish meal发酵豆粕
fermented soybean meal玉米蛋白粉
corn gluten meal麦麸
wheat bran组别 group FM FSM25 FSM50 FSM75 FSM100 苏氨酸 Thr 2.69 1.92 1.99 1.14 1.54 1.50 1.52 1.52 1.51 缬氨酸 Val 3.12 2.32 2.64 0.80 1.87 1.85 1.86 1.88 1.88 蛋氨酸 Met 1.76 0.25 1.27 0.12 0.85 0.85 0.79 0.77 0.75 异亮氨酸 Ile 2.61 2.18 2.18 0.53 1.61 1.62 1.66 1.73 1.77 亮氨酸 Leu 4.65 3.76 10.11 1.05 4.00 4.05 4.26 4.50 4.67 苯丙氨酸 Phe 2.62 2.59 3.73 0.68 1.93 1.97 2.12 2.27 2.39 赖氨酸 Lys 4.96 3.13 0.97 0.79 2.48 2.35 2.38 2.41 2.38 色氨酸 Try 0.61 0.44 0.26 0.21 0.36 0.35 0.34 0.38 0.36 1.2 实验材料和实验设计
将750尾大小均一、体质健康的卵形鲳鲹[体质量 (42.64±4.68) g]分成5组，每组设3个重复，随机放入15个网箱 (1 m×1 m×1.5 m)，每个网箱放50尾。实验鱼采自中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心，养殖实验在海南陵水新村港进行。饲养8周，日饱食投喂2次(7:00和16:00)，每天准确记录每个网箱的采食量。实验期间，海水盐度约35，温度28~31 ℃，pH 7.4~8.1，溶氧大于5 mg·L–1。
1.3 样品采集
养殖结束后，将鱼饥饿24 h，麻醉后称取各网箱鱼的总质量，计算增重率和特定生长率。从每个网箱中随机取6尾鱼，测量体长、体质量用于计算肥满度，并取内脏和肝脏称质量，计算脏体比和肝体比。从每个网箱中随机取6尾，鱼尾静脉取血用于测定血清生化指标，离心后(3 000×g，4 ℃，10 min)取血清放于–20 ℃保存。取血后，在低温下取出肝脏组织放于1.5 mL无RNA酶冻存管，放入液氮随后放于–80 ℃保存，用于测定肝脏类胰岛素生长因子-1 (insulin-like growth factor-1，IGF-1)和生长激素(growth hormone，GH)基因的表达。
1.4 样品测定
鱼体肌肉水分含量采用105 ℃烘干法测定；灰分含量在马弗炉中550 ℃灼烧8 h后测定；粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定；粗脂肪采用索氏提取法测定；原料和饲料氨基酸含量委托广东省质量监督食品检验站测定。
参照酶活试剂盒 (南京建成生物工程研究所) 说明书，测定超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 活性和丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 含量；血清中的总蛋白 (total protein, TP)、高密度脂蛋白 (high density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白 (low density lipoprotein, LDL)、谷丙转氨酶 (alanine aminotrans, ALT) 和谷草转氨酶 (aspartate transaminase, AST) 活性委托北京华英生物技术研究所采用迈瑞BS-420全自动生化仪测定。
1.5 RNA提取和实时荧光定量PCR
参照总RNA提取试剂盒(广州美基生物科技有限公司)说明书提取肝脏总RNA，用Nanodrop2000检测RNA浓度，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。参照PrimeScript™ with gDNA Erase逆转录试剂盒说明书，对RNA样品进行逆转录，逆转录完成的cDNA放于–80 ℃冰箱中保存。
利用Beacon Designer 7设计IGF-1和GH特异性引物，以卵形鲳鲹ef-1α (elongation factor 1 alpha)作为内参，引物序列见表3。肝脏组织cDNA模板浓度稀释至 (50±5) ng·μL–1作为荧光定量模板，qPCR反应根据SYBR Pre-mix ExTaqTM试剂盒 (TaKaRa) 说明书进行。qPCR反应体系为12.5 μL，1 μL cDNA模板，0.5 μL正向引物，0.5 μL反向引物，4.25 μL ddH2O和6.25 μL SYBR Pre-mix ExTaq。qPCR反应条件为：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环40次。每个样品和内参设4个重复。实验数据使用△CT法(2–△△CT)进行分析。
表 3 免疫相关基因及内参引物Table 3. Real-time quantitative PCR primers for immune related genes and ef-1α引物名称
primer name引物序列 (5'−3')
primer sequence用途
applicationIGF-1-F CGCAATGGAACAAAGTCGG qRT-PCR IGF-1-R AGGAGATACAGCACATCGCACT GH-F GGACGGAGCAGAGATGTT GH-R GCAAGCCAGCAATTCATAGT ef-1α-F CCCCTTGGTCGTTTTGCC 内参 ef-1α-R GCCTTGGTTGTCTTTCCGCT 1.6 计算与统计分析
$$ \begin{array}{*{20}{c}} {{{\text{增重率}}}\left( {{\rm{WGR}}} \right) = \left( {{W_{t}}-{W_{0}}} \right)/{W_{0}} \times 100\% }\\ {{{\text{特定生长率}}}({\rm{SGR}}) =\left( {{{\ln}}{W_{t}}-{{\ln}}{W_{0}}} \right)/t \times 100\% }\\ {{{\text{饲料系数}}}\left( {{\rm{FCR}}} \right) =F/({W_{t}}-{W_{0}}) \times 100\% }\\ {{{\text{肥满度}}}\left( {{\rm{CF}}} \right) = {W_{t}}/l \times 100\% }\\ {{{\text{脏体比}}}\left( {{\rm{VSI}}} \right) = {m_{\rm{V}}}/{W_{t}} \times 100\% }\\ {{\text{肝体比}}}\left( {{\rm{HSI}}} \right) = {m_{\rm{H}}}/{W_{t} \times 100\% } \end{array} $$ 式中W0为实验开始时体质量(g)；Wt为实验结束时体质量(g)；F为饲料摄入量干质量(g)；t为饲养天数(d)；mV为鱼内脏质量(g)；mH为鱼肝脏质量(g)；l为鱼体长 (cm)。采用Excel 2010、SPSS 23.0统计软件进行数据处理分析，进行单因素方差(One-Way ANOVA)分析，若处理有显著差异则进行多重比较(Tukey's)检验，实验结果用“平均值±标准差(
$\overline X \pm {\rm{SD}} $ )”表示。2. 结果
2.1 发酵豆粕替代鱼粉对卵形鲳鲹生长性能及形体指标的影响
FSM25和FSM50组增重率、特定生长率、采食量和肥满度与FM组相比无显著差异(P>0.05)，FSM75和FSM100组增重率、特定生长率、采食量和肥满度显著低于FM组(P<0.05)；FSM25、FSM50和FSM75组饲料系数与FM组相比无显著差异(P>0.05)，FSM100组的饲料系数最高，且显著高于其他各组(P<0.05，表4)。各实验组脏体比和肝体比无显著性差异(P>0.05)。
表 4 发酵豆粕替代鱼粉对卵形鲳鲹生长性能的影响Table 4. Effects of substitution of fish meal by fermented soybean meal on growth performance of T. ovatus项目
item组别 group FM FSM25 FSM50 FSM75 FSM100 增重率/% WGR 209±10a 225±10a 201±10a 163±1b 128±6b 特定生长率/% SGR 1.73±0.05a 1.81±0.04a 1.69±0.05a 1.49±0.01b 1.27±0.04b 饲料系数 FCR 1.99±0.02b 1.73±0.05b 1.83±0.08b 1.96±0.04b 2.40±0.14a 采食量/kg FI 8.94±0.44a 8.45±0.26a 8.01±0.18a 6.76±0.14b 6.67±0.21b 脏体比/% VSI 5.47±0.09 6.72±0.50 6.62±0.54 5.99±0.23 6.15±0.26 肝体比/% HSI 0.88±0.20 1.75±0.40 2.12±0.64 1.05±0.17 1.61±0.26 肥满度/% CF 3.90±0.09a 3.96±0.24a 3.62±0.26ab 2.95±0.21b 2.94±0.12b 注：同行数据不同字母表示差异显著(P<0.05)，下表同此 Note: Values in the same row with the different superscript are significant different (P< 0.05). The same case in the following tables. 根据发酵豆粕替代水平与卵形鲳鲹特定生长率进行回归分析，以发酵豆粕替代鱼粉水平为横坐标，卵形鲳鲹特定生长率为纵坐标，得出y=–8E–05x2+0.002 8x+1.748 9 (R2=0.982 7)的方程，求一元二次曲线最高点所对应的横坐标，得出发酵豆粕替代鱼粉为17.5%时卵形鲳鲹能获得最佳的生长性能。卵形鲳鲹特定生长率与发酵豆粕替代量的关系见图1。
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图 1 卵形鲳鲹特定生长率与发酵豆粕替代水平的关系Figure 1. Relation between specific growth rate and percentage of FSM to replace FM for T. ovatus2.2 发酵豆粕替代鱼粉对卵形鲳鲹肌肉营养成分的影响
发酵豆粕各组肌肉水分含量与FM组无显著差异(P>0.05)，但FSM100组显著高于FSM25和FSM50组(P<0.05)；灰分、粗脂肪和粗蛋白含量在各组之间无显著差异(P>0.05，表5)。
表 5 发酵豆粕替代鱼粉对卵形鲳鲹肌肉营养成分的影响Table 5. Effects of Effects of substitution of fish meal by fermented soybean meal on proximate composition in muscle of T. ovatus% 项目
item组别 group FM FSM25 FSM50 FSM75 FSM100 水分 moisture 72.93±0.47ab 71.93±0.68b 71.60±0.46b 73.60±0.45ab 74.30±0.42a 灰分 ash 1.43±0.03 1.43±0.03 1.40±0.00 1.33±0.07 1.43±0.03 粗蛋白 crude protein 4.00±0.15 3.53±0.32 4.07±0.29 3.60±0.30 2.93±0.13 粗脂肪 crude lipid 20.47±0.09 20.67±0.27 20.57±0.15 20.70±0.32 20.47±0.15 2.3 发酵豆粕替代鱼粉对卵形鲳鲹血清生化指标的影响
FSM75和FSM100组AST活性和TP含量分别显著高于和低于FM组(P<0.05)，FSM25和FSM50组与FM组无显著差异(P>0.05，表6)；FSM100组ALT和SOD活性最高且显著高于FM组(P<0.05)，其他各组与FM组无显著差异(P>0.05)；发酵豆粕各组血清中MDA含量与FM组无显著差异(P>0.05)，各组HDL和LDL无显著差异(P>0.05)。
表 6 发酵豆粕替代鱼粉对卵形鲳鲹血清生化的影响Table 6. Effects of substitution of fish meal by fermented soybean meal on serum biochemistry of T. ovatus项目
item组别 group FM FSM25 FSM50 FSM75 FSM100 总蛋白/g·L–1 TP 19.26±0.13a 19.15±0.29a 17.99±0.46a 14.83±0.54b 14.89±0.49b 高密度脂蛋白/mmol· L–1 HDL 0.92±0.01 0.85±0.02 0.83±0.00 0.86±0.03 0.86±0.04 低密度脂蛋白/mmol· L–1 LDL 0.36±0.10 0.17±0.04 0.28±0.13 0.26±0.02 0.24±0.10 谷草转氨酶/U·L–1 AST 36.44±1.11c 31.54±5.91c 46.3±2.43bc 57.12±2.89b 76.69±5.93a 谷丙转氨酶/U·L–1 ALT 7.86±0.07b 7.32±0.50b 7.34±0.33b 8.65±1.53b 13.07±0.56a 超氧化物歧化酶/U·mL–1 SOD 30.49±0.72b 31.33±1.08ab 34.23±1.38ab 34.59±0.47ab 35.52±1.14a 丙二醛/nmol·mL–1 MDA 2.66±0.16ab 2.39±0.07b 2.45±0.22ab 2.51±0.09ab 3.05±0.05a 2.4 发酵豆粕替代鱼粉对卵形鲳鲹肝脏生长相关基因表达的影响
FSM75和FSM100组IGF-1表达量显著低于FM和FSM25组(P<0.05)，FM、FSM25和FSM50组IGF-1基因表达量无显著差异(P>0.05，图2)。FSM75和FSM100组GH表达量显著低于FM、FSM25和FSM50组(P<0.05)，FSM25和FSM50组GH表达量与FM组无显著差异(P>0.05)。
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图 2 IGF-1和GH基因在卵形鲳鲹肝脏中mRNA表达量柱上不同小写字母表示不同组织间差异显著(P<0.05)Figure 2. Relative expression of IGF-1 and GH in liver of T. ovatusDifferent letters indicate significant difference among different tissues (P<0.05).3. 讨论
近年来，发酵豆粕在动物饲料中的应用越来越广泛，研究表明适量的发酵豆粕替代鱼粉可以提高猪[14]、鸡[15]、花鲈(Lateolabrax japonicus)[16]、黑鲷[17]等动物的生长性能、饲料转化率等。在未添加限制性氨基酸的发酵豆粕替代鱼粉实验中，刘兴旺等[13]研究表明发酵豆粕替代鱼粉不超过60.8%时不会对卵形鲳鲹生长和饲料利用率产生影响，而赵丽梅等[18]研究表明发酵豆粕替代鱼粉不超过25%时对卵形鲳鲹的生长性能不会产生不利影响。本实验在添加限制性氨基酸后，发现发酵豆粕替代量小于50%对卵形鲳鲹的生长无不利影响，且替代量为17.5%时获得最佳生长。类似实验的结果不同可能与饲料组成、氨基酸组成以及实验环境有关；此外，实验中鱼的大小不同也可能造成实验结果存在差异，如刘兴旺等[13]研究中实验鱼为112 g，赵丽梅等[18]研究中实验鱼为60 g，本研究中实验鱼为42 g。本实验中适量发酵豆粕替代鱼粉后对生长的改善可能主要归功于发酵豆粕营养价值的升高和抗营养因子的消除，且本研究中平衡的氨基酸含量使得发酵豆粕更容易被动物利用[19]。赖氨酸和蛋氨酸是限制鱼类生长的2种氨基酸，为消除限制性氨基酸产生的不利影响，在本实验饲料中添加了适量的赖氨酸和蛋氨酸，结果表明在25%发酵豆粕替代水平下可获得比FM组更优的生长。在鲫(Carassius auratus)[20] 饲料中添加蛋氨酸可显著提高其生长和饲料利用率，在黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[21]豆粕饲料中添加蛋氨酸可促进其生长。在本研究中，高水平的发酵豆粕替代量使得卵形鲳鲹生长性能、饲料利用率和肥满度显著降低，可能是因为当发酵豆粕的使用量过高或者完全替代鱼粉时，发酵豆粕适口性较差、存在少量抗营养因子的缺点会显现出来，这也与采食量结果相对应。大豆球蛋白会破坏肠道结构[22]，影响饲料的吸收和利用，进而影响生长。本研究结果与大黄鱼(Larimichthys crocea)[23]、黑鲷[9]、圆斑星鲽(Verasper variegatus)[24]等鱼类的研究结果类似，即发酵豆粕替代量在一定范围内可促进鱼类生长，超过则会抑制。
有研究表明鱼体肌肉组成不受植物蛋白水平的影响，在大黄鱼[25]幼鱼中用发酵豆粕替代鱼粉发现，鱼体肌肉粗蛋白、粗脂肪和灰分含量在各组之间无显著差异。在花鲈[16]中用发酵豆粕替代鱼粉发现，鱼体肌肉粗蛋白和粗脂肪含量不受发酵豆粕水平的影响，这与本实验结果类似。说明在实验养殖期间发酵豆粕替代鱼粉对卵形鲳鲹肌肉营养成分的影响还未表现出来，可能与养殖周期有关。刘兴旺等[13]在卵形鲳鲹中以豆粕和发酵豆粕替代鱼粉也发现了类似结果。
转氨酶是蛋白质合成中重要的酶，在血清中的活性通常被用做脊椎动物肝功能的一般指标。正常血清中的AST和ALT活性较低，当肝功能受损时，细胞膜通透性增加，AST和ALT会由肝释放进入血清，故引起血清中转氨酶活性增强[26]。彭翔等[27]在黑鲷中发现，随着发酵豆粕水平的提高，AST和ALT活性逐渐升高。这与本实验结果一致，表明饲料中高水平的发酵豆粕会引起鱼体肝功能损伤。血清中TP含量也能反映肝脏功能，在本研究中TP在FSM75和FSM100组中显著降低，表明高豆粕水平组卵形鲳鲹对蛋白质的吸收利用率下降，该结果与石斑鱼(Epinephelus coioides)[28]结果类似，但也有研究表明TP含量不受发酵豆粕比例的影响[29]，这可能与发酵豆粕来源、饲料组成和鱼的种类有关。SOD是一种重要的抗氧化酶，主要分布于胞浆和细胞质基质中，属于鱼类的内源性抗氧化防御系统，有助于抵消自由基的活动。在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[30]中发现，随着发酵豆粕替代水平的增加，SOD活性逐渐上升。在本研究中，FSM100组SOD活性显著高于FM组，而其他发酵豆粕各组与FM组之间无显著差异，说明发酵豆粕能清除鱼体内的自由基，使鱼体保持正常免疫状态。有研究表明，发酵豆粕中含有较高含量的大豆异黄酮，大豆异黄酮可通过调节机体的抗氧化性来增强机体的免疫能力[31]，这可能是SOD活性随发酵豆粕水平增加而上升的原因。
鱼类机体的生长发育主要靠生长激素/胰岛素样生长因子(GH/IGFs)轴来控制[32]。GH可以通过与鱼肝脏中相应的受体结合来促进肝脏IGF的产生，IGF能够随体液到达身体各个部位，促进营养物质的转化积累和调控细胞的分裂增殖，从而起到促进个体生长的作用[33]。同时，个体的营养状况也会对GH和IGF产生反馈性调节。本研究中FSM75和FSM100组IGF-1和GH基因的相对表达量显著低于FM组，这与卵形鲳鲹的生长结果一致。在黄姑鱼(Nibea albflora)幼鱼[34]、中国花鲈(L. maculatus)[35]和黄河鲤(Cyprinus carpio)[36]中植物蛋白替代鱼粉的研究也发现了类似的结果，即高水平的植物蛋白替代量会显著降低肝脏中IGF-1和GH的表达量，从而抑制生长。有研究表明，饲料中限制性氨基酸的不平衡是导致IGF-1和GH表达量下降的因素[37]。本实验各饲料中虽然添加了限制性氨基酸，但由于饲料中补充的氨基酸与蛋白质中的氨基酸吸收不平衡[37]，仍会导致饲料中限制性氨基酸不平衡，因此高水平发酵豆粕组中较低的限制性氨基酸吸收水平可能是导致生长相关基因表达量下降的原因。
本实验结果显示，在添加限制性氨基酸后，部分发酵豆粕替代鱼粉有利于卵形鲳鲹的生长，有利于保护肝脏健康，增强抗氧化能力，但较高水平的发酵豆粕替代量会阻碍其生长，损伤肝功能。因此，综合考虑生长和生理状况，在氨基酸平衡的条件下卵形鲳鲹的发酵豆粕替代鱼粉量应不超过50%，最佳替代量为17.5%。
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图 1 冷应激对黑鲷肝脏、腮、肌肉组织结构的影响 (10×40 倍)
注：a. 肝脏，15 ℃ 对照组；b. 肝脏，10 ℃ 处理组；c. 肝脏，5 ℃ 处理组；d. 腮，15 ℃ 对照组；e. 腮，10 ℃ 处理组；f. 腮，5 ℃ 处理组；g. 肌肉，15 ℃ 对照组；h. 肌肉，10 ℃ 处理组；i. 肌肉，5 ℃ 处理组。
Figure 1. Effects of cold stress on tissue structure of liver, gill and muscle of A. schlegelii (10×40 times)
Note: a. Liver, 15 ℃ control group; b. Liver, 10 ℃ treatment group; c. Liver, 5 ℃ treatment group; d. Gill, 15 ℃ control group; e. Gill, 10 ℃ treatment group; f. Gill, 10 ℃ treatment group; g. Muscle, 15 ℃ control group; h. Muscle, 10 ℃ treatment group; i. Muscle, 5 ℃treatment group.
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图 2 冷应激对黑鲷肝脏组织的谷草转氨酶、谷丙转氨酶、甘油三酯和总胆固醇的影响
注：方柱上相同字母表示组间差异不显著 ( P>0.05)，不同字母表示组间差异显著 (P<0.05)；图3同此。
Figure 2. Effects of cold stress on AST, ALT, TG and T-CHO in liver tissue of A. schlegelii
Note: The same letters above the column indicate no significant difference between groups (P>0.05), while different letters indicate significant difference between groups (P<0.05). The same case in Fig. 3.
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图 3 冷应激下黑鲷肝脏中apaf-1、bax、bcl-2、caspase-1、caspase-3和diablo基因的 mRNA 相对表达量
Figure 3. mRNA relative expression changes of apaf-1, bax, bcl-2, caspase-1, caspase-3 and diablo genes in liver of A. schlegelii under cold stress
表 1 引物信息
Table 1 Primer information
引物
Primer引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')产物长度
Length of product/bp退火温度
Annealing temperature/℃β-actin-F CGACGGTCAGGTCATCAC 91 β-actin-R GCCAGCAGACTCCATTCC apaf-1-F AGACTACGAAGCTGCACACGTCCT 135 59 apaf-1-R ATCCCGTCCTGCCATCACGTACC bax-F AAGGCGCTGACCACCAACC 150 58 bax-R GGCTACTGTCCTCCACCGAGA bcl-2-F ACCATCGTCACCTCCGACTCC 115 56 bcl-2-R ACTTTGGGCGAGTTCTTTGTCGT caspase-1-F GAGACAGCCCGATCCACTCCCAC 150 58 caspase-1-R AGCAGAGACCCTTTGACCGAGTGT caspase-3-F ATGGACTACCCCAGCCTCGGAAC 101 57 caspase-3-R GCAGCATCAACATCCGTCCCGTT diablo-F CAATGCTGTCAACCTGTG 146 55 diablo-R TCTTATCTGCGTCTGCTG 
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