Effect of trichloroisocyanouracic acid on antibiotic resistance genes in aquaculture water of shrimp
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摘要: 为探讨渔用氧化剂——强氯精 (三氯异氰脲酸，C3Cl3N3O3) 对养殖水体环境中抗生素抗性基因 (Antibiotic resistant genes, ARGs) 的去除并控制其传播的可行性，采用实时荧光定量PCR技术，分别对近海水源水、蓄水沉淀池水体、氧化消毒后养殖备用水中的ARGs浓度进行为期29 d的监测分析，其中氧化消毒时的强氯精使用质量浓度为40 mg·L−1。测定的ARGs包括sul1、sul2、tetX、tetM、floR、cmlA和qnrA 7种养殖环境中常见的ARGs。结果显示，sul1、sul2、floR及tetX为上述3种水样中的优势ARGs。近海水源水中ARGs的种类数量及总浓度均最高；蓄水沉淀池水体中ARGs的总浓度低于水源水，sul2和floR的浓度分别较水源水降低了0.86和0.34 lg；经氧化消毒后水体中ARGs的总浓度也有所下降，sul2和floR的浓度与水源水相比分别降低了1.58和1.30 lg。可见，近海水源水是池塘环境中ARGs的主要来源，使用强氯精对其进行氧化消毒，可明显降低水体中常见ARGs水平，有助于防控ARGs在养殖环境中的传播。Abstract: In order to explore the feasibility of removing and controlling the spread of antibiotic resistant genes (ARGs) by the fishing oxidant trichloroisocyanuric acid (C3Cl3N3O3) in the aquaculture water environment, we applied the real-time quantitative PCR to monitor and determine the ARGs concentrations in the offshore source water, storage water of sedimentation tank and reserved water after oxidation and disinfection for 29 d. The final concentration of trichloroisocyanuric acid used for oxidation and disinfection was 40 mg·L−1. The target ARGs were commonly found in the aquaculture environments, including sul1, sul2, tetX, tetM, floR, cmlA and qnrA. The results show thatsul1, sul2, floR and tetX were the dominant ARGs among the above mentioned water samples. The number of types and total concentration of ARGs were the highest in offshore source water. The total concentrations of ARGs in the storage water of sedimentation tank were lower than those in the offshore source water, especially that the concentrations of sul2 andfloR were 0.86 and 0.34 lg lower than those in the offshore source water, respectively. After the oxidation and disinfection by trichloroisocyanuric acid, the total concentrations of ARGs in the reserved water decreased, and compared with the offshore source water, the concentrations of sul2 and floR decreased by 1.58 and 1.30 lg, respectively. The results indicate that offshore source water is the main source of ARGs in the aquaculture environment. Oxidation and disinfection treatment on offshore source water with trichloroisocyanuric acid can reduce the concentrations of common ARGs in the aquaculture water significantly, which is helpful to prevent and control the spread of ARGs in aquaculture environments.
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抗生素的广泛应用及其在生物体内的不完全代谢，使其容易残留在自然环境中，这是造成抗生素抗性基因 (Antibiotic resistant genes, ARGs) 和抗性菌 (Antibiotic resistant bacteria, ARB) 产生的主要原因[1]。近年来ARGs作为新型污染物受到广泛关注，它借助可移动遗传元件转移到病原菌的基因组中，使其产生抗生素耐药性，对养殖动物乃至人体健康均造成潜在威胁[2-3]。ARGs在污水处理厂、禽畜养殖场、水产养殖场，以及其他一些自然水体环境中均曾被检出[4-6]，并且在部分水产品中磺胺类、四环素类和链霉素类的ARGs亦有检出[7-8]。Su等[9]研究发现养殖水源水中的ARGs含量及种类数量均远高于养殖池塘水体，并且未经处理的养殖尾水被重复利用也会导致ARGs在养殖环境中传播[10]；因此，从源头上防控ARGs在水产养殖环境中的传播尤为重要。科学使用渔用氧化剂对池塘环境进行消毒，可有效防治养殖病害，还可改善养殖环境[11]。含氯氧化剂因价格低廉、杀菌效果好在水产养殖中使用广泛[12-13]。三氯异氰尿酸 (C3O3N3Cl3)俗称强氯精，是养殖生产常用的含氯氧化剂之一，它的有效氯质量分数高达90%，杀菌效果好，对水中大部分真菌、芽孢及病毒均具有杀灭作用[14]。
采用传统的污水消毒工艺所产生的细胞碎片中大多仍含有完整的DNA残余物，这将会给下游细菌种群带来ARGs[15]。因而，除了杀灭目标微生物之外，还应关注消毒技术对微生物DNA的破坏能力。活性氯、臭氧、紫外线或过渡金属离子参与的高级氧化作用均可对ARGs产生较强的去除效果[10,16-18]。Yoon等[19]发现有效氯质量浓度高于37 mg·L−1时对环境中的ARGs具有明显的消除效果。可见，科学应用氧化消毒方法可有效消减养殖水环境中的ARGs进而防控其传播。
目前有关渔用氧化剂与氧化消毒处理对水环境中 ARGs 消除效果的研究报道较少。本研究选择水产养殖生产中常用的强氯精，分析其对近海水源水中常见ARGs的去除效果，探讨从源头上控制ARGs在水产养殖环境中传播的可行性，为进一步建立养殖环境质量安全控制技术提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验试剂及仪器
TB Green Real Time qPCR Kit 购自TaKaRa公司，FastDNATM SPIN Kit for Soil购自MQBIO公司，实验用水为屈臣氏蒸馏水。实验过程中使用的主要仪器包括荧光定量 PCR 仪 qTOWER3 (Analytikjena，德国)，冷冻离心机 (Sigma，德国)，恒温金属浴锅 (上海一恒)，研磨仪 (上海净信)。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组与样品采集
实验在广东省茂名市电白区广东冠利达海洋生物有限公司养殖基地开展。根据水样来源实验分为近海水源水 (SY组)、蓄水沉淀池水体 (XSC组)、氧化消毒处理后的养殖备用水 (XD组) 3组。其中，SY组的水体取自茂名电白鸡打港闸口，XSC组水体取自养殖场的蓄水沉淀池，XD组水体取自养殖场棚内的消毒池。2021年5月31日对养殖备用水进行消毒处理，消毒水体为500 m3，水体中消毒剂强氯精的质量浓度为40 mg·L−1；添加消毒剂后的第二天开始取样，此时氧化剂基本溶解；实验期间蓄水池和消毒处理后的养殖备用水不进行换水操作，尽量维持实验环境稳定。水样采集时间为2021年6月1、15和29日的9:00—10:00 (该地区6月13日左右有过降雨)，每隔14 d取样1次，分别对以上3处水体进行3次采样。使用 3 L 有机玻璃采水器在距离水面30 cm 处采集水样，每个采样点包括3个不同位置的取水点，每隔20 m分别采样，将每个采样点的水样注入20 L的聚乙烯桶内充分混合后分装到1 L的聚乙烯样品瓶内，低温保存并带回实验室。取200 mL水样经0.22 μm 孔径的无菌滤膜过滤，获得的滤膜置于无菌封口袋内−80 ℃保存。3次采集的水体样品分别命名为水源水 SY1、SY2、SY3，蓄水沉淀池水体 XSC1、XSC2、XSC3，消毒后池塘养殖备用水 XD1、XD2、XD3。
1.2.2 总DNA的提取
无菌条件下将滤膜剪碎，使用土壤 DNA 提取试剂盒 FastDNATM SPIN Kit for Soil并按照试剂盒说明书步骤对水样中的总 DNA 进行提取与纯化。提取的总 DNA 使用 NanoDrop 2000 进行纯度检测，要求 260/280介于1.8~1.9。
1.3 RT-qPCR
1.3.1 标准曲线的建立
将克隆有目标抗性基因的大肠杆菌 (Escherichia coli) 标准菌株SFEC1， 37 ℃培养 20 h 后使用天根质粒提取试剂盒 (上海) 提取标准质粒，并于NanoDrop 2000下测定浓度及纯度后，计算出目的基因拷贝数，使用超纯水对标准质粒进行10倍梯度稀释，设定7个浓度梯度，进行RT-qPCR测定，根据回归系数R2、扩增效率及溶解曲线确定扩增良好性及特异性。以拷贝数的对数lg copies为横坐标，Ct值为纵坐标，建立标准曲线，要求标准曲线满足以下条件：R2>0.99，扩增效率介于 90%~110%。分装后−20 ℃保存。大肠杆菌标准菌株SFEC1由中国水产科学研究院南海水产研究所提供。
1.3.2 水样的RT-qPCR定量检测
监测的目标ARGs共7种，包括2种磺胺类抗性基因 (sul1和sul2)，2种氯霉素类抗性基因 (cmlA和floR)，1种喹诺酮类抗性基因 (qnrA) 和2种四环素类抗性基因 (tetW和tetX)。样品qPCR检测使用 TB Green Real Time qPCR Kit 在qTOWER3荧光定量 PCR 仪上完成。qPCR的反应体系为10 μL，各组分加样量见表1。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s，退火20 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环。按qTOWER3 PCR仪默认熔解曲线程序进行溶解曲线分析。各目的基因引物序列及退火温度见表2。
表 1 qPCR 反应体系Table 1. qPCR reaction solutionqPCR反应试剂
qPCR reaction solution各组分加样量
Amount of usage/μL荧光定量染料 TB® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus) (2×) 5 前置引物 (50 μmol·L‒1) Forward primer (50 μmol·L‒1) 0.04 后置引物 (50 μmol·L‒1) Reverse primer (50 μmol·L‒1) 0.04 样品DNA Templatea 2 超纯水 dd H2O 2.92 体系总量 Total 10 注：a. 每次定量均设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为建立标曲所用标准质粒，阴性对照为dd H2O。 Note: a. Positive control and negative control were set for each run. The positive control was the standard plasmid used to establish the standard curve, and the negative control was dd H2O. 表 2 本研究中qPCR 所需引物Table 2. Primers used for quantitative PCR in this study基因
Gene引物对
Primer pair序列 (5'—3')
Sequence (5'−3')退火温度
Annealing temperature/℃片段大小
Amplicon size/bp参考文献
Referencesul1 FW CGCACCGGAAACATCGCTGCAC 62 163 [20] RV TGAAGTTCCGCCGCAAGGCTCG sul2 FV TCCGGTGGAGGCCGGTATCTGG 62 191 [20] RV CGGGAATGCCATCTGCCTTGAG tetX FW AGCCTTACCAATGGGTGTAAA 55 280 [21] RV TTCTTACCTTGGACATCCCG cmlA FW GCCAGCAGTGCCGTTTAT 55 158 [22] RV GGCCACCTCCCAGTAGAA floR FW CGGTCGGTATTGTCTTCACG 56 171 [22] RV TCACGGGCCACGCTGTAT qnrA FW AGGATTTCTCACGCCAGGATT 57 124 [22] RV CCGCTTTCAATGAAACTGCA tetW FW GAGAGCCTGCTATATGCCAGC 55 168 [23] RV GGGCGTATCCACAATGTTAAC 注：FW. 上游引物；RV. 下游引物。 Note: FW. Forward primer; RV. Reverse primer. 1.4 水质因子检测方法
同时监测水样中的8种常见水环境指标，包括活性磷酸盐(PO4 3−)、化学需氧量(COD)、悬浮物(SS)、无机氮(IN)、总氮 (TN)、氨氮(NH3-N)、亚硝酸盐氮 (NO2 ‒-N)和硝酸盐氮 (NO3 ‒-N)。除NO3 ‒-N采用GB/T 12763.4—2007 方法测定外，其余指标均采用GB 17378.4—2007方法进行测定。
1.5 数据分析
文中的对数取值时底数为10，浓度降低量为lg(C0·C−1)，其中C0表示处理前水源水中ARGs浓度；C表示处理后水体中ARGs浓度。实验数据采用 Excel 2010 软件处理，绘制标准曲线，并使用 SPSS 22.0软件分析数据差异，显著性水平设为P<0.05。
2. 结果
2.1 沉淀和氧化处理对水质因子的影响
如表3所示，水样中SS和COD的质量浓度最高，其在水源水中的质量浓度分别为9~36 mg·L−1和9.2~22.2 mg·L−1，经沉淀处理后分别降至2~12 mg·L−1和2.9~4.9 mg·L−1，氧化处理后分别降至2~6 mg·L−1和≤0.8 mg·L−1。其他水质因子在各水样中始终保持在较低水平。
表 3 样品中环境因子检测结果Table 3. Monitoring results of environmental factors in samplesmg·L−1 检测样品
Sample固体悬浮物
SS氨氮
NH3-N硝酸盐氮
NO3 −-N亚硝酸盐氮
NO2 −-N无机氮
IN总氮
TN磷酸盐
PO4 3−化学需氧量
CODSY1 36 0.019 0.012 <0.003 0.034 1.18 0.15 22.2 SY2 9 0.014 <0.006 <0.003 0.016 1.15 0.023 11.2 SY3 10 0.025 <0.006 <0.003 0.025 0.67 0.017 9.2 XSC1 2 0.037 <0.006 0.003 0.043 0.39 0.069 2.9 XSC2 12 0.009 0.009 <0.003 0.019 0.43 0.063 3.2 XSC3 9 <0.006 0.011 <0.003 0.015 0.75 0.074 4.9 XD1 4 <0.006 0.25 <0.003 0.255 0.55 0.047 0.8 XD2 2 0.008 0.311 <0.003 0.322 0.81 0.026 <0.5 XD3 6 <0.006 0.009 <0.003 0.013 0.69 0.017 <0.5 注：<. 检测结果小于检出限以，加粗数值代表检出限。 Note: <. Detection result is less than the detection limit, and value in bold represent the detection limit. 2.2 优势ARGs
在所有检测的样品中sul1、sul2、floR 和 tetX 等ARGs的Ct值较小 (表4)，表明其在样品中的含量较高，为样品中的绝对优势ARGs，因而将它们作为目标ARGs用于后续分析比较沉淀及氧化处理前后不同样品中ARGs的变化情况。
表 4 样品中ARGs的Ct值检测结果Table 4. Ct value of ARGs in samples抗生素抗性基因
ARGCt值 Ct value 样品
Sample空白
Blanksul1 19.24~25.18 29.33~29.85 sul2 12.4~17.5 26.53~27.39 floR 26.99~30.32 33.2~33.93 cmlA 31.21~34.25 33.65~34.79 tetw 29.02~31.8 30.21~30.48 tetX 23.19~30.76 31.7~32.36 qnrA — 33.61~34.05 2.3 水样中ARGs的浓度变化
水源水中ARGs浓度最高为2.3×107~4.7×107 copies·mL−1，其次为蓄水沉淀池水体(2.1×106~1.1×107 copies·mL−1），最低为氧化消毒水体 (6.7×105~1.2×106 copies·mL−1，图1)。
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图 1 各样品中ARGs总浓度变化注：不同字母代表显著差异 (P<0.05)。Figure 1. Total ARGs concentrations in samplesNote: Different letters indicate significant difference (P<0.05).如图2所示，在所检测样品中sul1、sul2、floR和tetX 4种ARGs的浓度较高，且各个采样时间点的样品中以上4种ARGs均被检出。其中，sul2的浓度为6.6×105~4.1×107 copies·mL−1，sul1为3.0×103~2.2×105 copies·mL−1，tetX为7.4×101~2.0×104 copies·mL−1，floR为1.4×101~1.5×102 copies·mL−1。
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图 2 不同时刻相同采样点各种优势ARGs的浓度Figure 2. Concentrations of various dominant ARGs at same sampling point at different time对比同一取样点的3次取样可知水源水和蓄水沉淀池水体中ARGs浓度随时间变化较大 (图3)，其浓度范围分别介于2.3×107~4.7×107 copies·mL−1 和 2.1×106~1.1×107 copies·mL−1。氧化消毒水体中ARGs浓度维持在较低水平，3次取样的ARGs总浓度随时间变化不明显，分别为3.5×107、5.0×107和4.7×107 copies·mL−1。
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图 3 3次取样时ARGs总浓度对比Figure 3. Comparison of total ARGs concentrations for three samplings2.4 沉淀和氧化处理对水体ARGs去除效果
蓄水池水经沉淀处理后的水样和氧化消毒处理后水体中sul2的浓度分别较水源水下降了3.1×107和3.6×107 copies·mL−1，去除效果为0.86 lg (P<0.05) 和1.58 lg (P<0.05)。其中氧化消毒对水体中sul1和tetX去除能力较强，分别达到0.94 lg (P<0.05) 和1.30 lg (P<0.05)。各水样中sul2的浓度高出floR、sul1和tetX几个数量级，sul2浓度与水样中总ARGs的浓度接近，水样中总ARGs的浓度下降程度与sul2在水样中的浓度变化相近。
3. 讨论
3.1 养殖水体中ARGs的来源及浓度
在自然水体环境中ARB是ARGs的主要传播介质，细胞内的ARGs浓度要远高于细胞外[24]，养殖水环境中ARGs的去除主要针对胞内。Su等[9]研究发现，在养殖期间水样中ARGs浓度呈下降趋势，水源水中ARGs总浓度显著高于虾池。本结果显示近海水源水中ARGs的浓度远高于蓄水池水体，表明养殖环境中ARGs主要来自养殖水源水。而Wang等[25]的研究结果却显示虾池水中ARGs总浓度高于水源水和养殖尾水。可能由于该池养殖年限久导致ARGs在池塘沉积物中累积，又因未对沉积物进行氧化消毒处理，致使沉积物中的ARGs不断迁移到养殖水环境中，因而被大量检出。
该养殖用水中主要的ARGs是磺胺类，其中在近海水源水中sul2浓度介于2.3×107~4.7×107 copies·mL−1 (图2)，有研究表明，磺胺类药物的广泛使用会导致环境中各种细菌对磺胺类抗生素的抗性显著增加[26]，说明该地区历史上常用的抗生素可能是磺胺类药物。Luo等[27]对海河中ARGs的调查也发现sul2水平显著高于sul3和四环素类等其他种类。在关于珠江水产养殖环境ARGs 的研究中，同样发现磺胺类 ARGs 在养殖水体和沉积物中普遍存在，且检出率和水平均高于其他种类[28]。上述结果与本研究结果一致，说明磺胺类的宿主菌对这些环境的耐受能力强，有利于这类基因在环境中的广泛传播。
图3显示，对比同一取样点3次采样的ARGs，水源水和蓄水沉淀池水体中ARGs的浓度变化均较大。Liu等[29]的研究表明，在人为干扰少的环境中，ARGs在雨季的检出浓度低于旱季，推测降雨可能会稀释水环境中的ARGs。然而有研究显示，生活污水等的排放不仅增加了地表水中抗生素的浓度，还会直接增加ARGs的浓度[30]。Ahmed等[31]和Li等[32]在对人类活动频繁的流域及城市排水系统等的研究中也发现，雨季的水样和沉积物样品中ARGs的浓度和种类均高于旱季。推测雨季可能给ARB提供了适宜的增殖环境，同时雨水将积累在生活社区内的ARGs及ARB输入开阔水域。本实验中的水源水位于开放水域，且该水域受自然和人为活动影响大，其水体中ARGs浓度的变化受多种因素影响。蓄水池水体属于半开放水体且面积较小，主要受天气变化影响，且影响较大。在本次实验的采样周期中遇到降雨，导致蓄水池中ARGs浓度明显下降。而氧化消毒水体中ARGs浓度变化小，可能是由于该养殖备用水位于养殖大棚内，因而不受外界环境变化影响。由此可知，养殖用水经氧化处理后在无外界干扰时，环境中的ARGs可以维持在低浓度且相对稳定的水平。
3.2 沉淀和氧化处理对水体中ARGs的影响
沉淀处理后的水体中总ARGs浓度与近海水源水相比下降了0.86 lg，其中floR下降了0.34 lg，sul1下降了0.17 lg，sul2下降了0.86 lg，tetA下降了−0.32 lg (表5)。由于在该地区磺胺类抗性基因sul2是养殖水体中主要的ARGs，其浓度最高，且在沉淀处理后下降比例最大，因此沉淀处理对sul2的去除最明显。养殖前期提前向蓄水池进水，经沉淀可有效降低水体中ARGs的浓度，这与Su等[33]和Wang等[25]的研究结果相似。其中，tetA的去除效果不明显，根据Nolvak等[34]的研究结果显示，可能是由于tetA在此环境中具有更广的宿主范围。此外，Huang等[35]的研究表明水体中ARGs含量降低主要是由水体中ARB向沉积物中迁移导致。养殖用水虽然可以经蓄水池沉淀而降低水体中ARB和ARGs的含量，但同时也会造成沉积物中ARGs含量升高。同时，沉积物与水体中的ARGs关联性很强，在高温时会促进ARB的繁殖和水力扰动均会使ARGs进入水体[36]，因此需要开发适合的技术方法来去除沉积物中的ARGs。
表 5 沉淀及氧化处理对水体中ARGs去除量比较Table 5. Comparison of removal effects of ARGs in water by sedimentation and oxidation treatment lg处理
Treatment总 ARGs
Total ARGsfloR sul1 sul2 tetX 沉淀 Precipitation 0.86* 0.34 0.17 0.86* −0.32 氧化 Oxidation 1.58* 0.71* 0.94* 1.58* 1.30* 注：*. 表示处理后较水源水中ARGs浓度的差异性显著 (P<0.05)。 Note: *. There is a significant difference in ARGs concentrations in the treated water compared with that in the source water (P<0.05). 目前，关于氯制剂对海水水体中ARGs去除的相关研究较少，本研究旨在探究海水养殖中氯制剂对养殖水体中ARGs的去除效果。由于氯制剂中的有效成分为次氯酸 (HClO) 和次氯酸根离子 (ClO−)，其中HClO的氧化能力强于ClO−，pH会通过影响HClO的含量来影响氯制剂的氧化能力[37]；因而，在海水养殖中应考虑消毒后pH变化对后续养殖生产的可能影响。Stange等[38]的研究表明使用氯制剂30 min，可使ARGs减少0.8~2.8 lg，与本实验经强氯精氧化消毒处理后水体中总的ARGs与蓄水池水体相比下降了0.72 lg的结果类似。据报道在低浓度的氯化作用下细胞会产生应激反应，促进质粒在细菌细胞中的复制，增加存活细菌细胞中质粒的拷贝数，从而导致水中ARGs的相对丰度增加[39]。Sullivan等[40]的研究表明氯制剂可完全去除水体中的ARB，但无法完全除去ARGs，因而不能控制氧化处理后ARB的再生。有关氯制剂对水体中ARB携带ARGs的氧化去除作用机制还有待进一步研究。
3.3 影响养殖水环境中ARGs去除的因素
水环境中的有机质还原性物质能与氧化剂发生反应，消耗氧化剂[41]，在污水处理系统中上述还原性物质的含量显著影响水体中ARGs的氧化去除率[19]。本研究结果显示水源水中的COD远高于经沉淀池和氧化消毒池水体，表明在进行氧化消毒处理时会由于水体中还原性物质的存在而导致氧化剂的消耗。此外，Sharma等[42]的研究显示氯制剂对鸟嘌呤和胸腺嘧啶有更强的氧化作用，而对腺嘌呤和胞嘧啶的氧化作用较弱。本实验中，不同ARGs的去除效果不同，可能与各种ARGs中腺嘌呤和胞嘧啶的占比有关。此外，具有不同种类抗性基因的同类细菌对氯制剂的耐受程度也不同，如红霉素抗性菌对氯有更强的耐受能力[37]，可能与其抗性机制有关。由此可知，氯制剂对ARGs的去除作用有一定的局限性，因而，需要相关技术手段配合以达到最优效果。Zhao 等[43]的研究表明，在水产养殖中就氯制剂、溴制剂及高锰酸钾等而言，氯制剂对ARGs的氧化去除效果最好，高锰酸钾在水体中氧化效果更持久。本研究中所使用强氯精的质量浓度为40 mg·L−1，它不仅可高效去除养殖水体中的ARGs，且其价格相对低廉，具有明显的市场优势[43]。
总而言之，在养殖前池塘清理和消毒时使用强氯精对水源水进行氧化消毒，可有效降低水体中ARGs的含量，从源头防控ARGs在养殖环境中的传播。通常水源水中存在一定量的还原性物质，这有可能对氧化剂的氧化性能产生一定的影响，因此，在对水源水进行氧化消毒前应测定其COD浓度，再根据所需处理的水体容量和所选择氧化剂的氧化性能准确测算氧化剂用量。此外，对虾养殖绝大多数为海水养殖，其水环境pH值一般在8左右，碱性环境对一些氧化剂的氧化能力有削弱作用。在使用氧化剂进行消毒时，这些环境因素都应被考虑到，以确保其对ARGs的去除效果。
4. 结论
近海的养殖水源水是养殖环境中ARGs的主要来源；在该地区近海水源水、蓄水池水体及消毒处理后的池塘养殖备用水中磺胺类抗性基因最高；经蓄水池沉淀及强氯精氧化消毒处理，可明显降低水体中常见ARGs的含量。水体中的COD含量及其他还原性物质会影响氧化剂的氧化效果，对不同环境应选取不同的氧化剂，或将几种氧化剂搭配使用，有利于提高渔用氧化剂对水体中ARGs的去除效果。
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图 1 各样品中ARGs总浓度变化
注：不同字母代表显著差异 (P<0.05)。
Figure 1. Total ARGs concentrations in samples
Note: Different letters indicate significant difference (P<0.05).
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图 2 不同时刻相同采样点各种优势ARGs的浓度
Figure 2. Concentrations of various dominant ARGs at same sampling point at different time
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图 3 3次取样时ARGs总浓度对比
Figure 3. Comparison of total ARGs concentrations for three samplings
表 1 qPCR 反应体系
Table 1 qPCR reaction solution
qPCR反应试剂
qPCR reaction solution各组分加样量
Amount of usage/μL荧光定量染料 TB® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus) (2×) 5 前置引物 (50 μmol·L‒1) Forward primer (50 μmol·L‒1) 0.04 后置引物 (50 μmol·L‒1) Reverse primer (50 μmol·L‒1) 0.04 样品DNA Templatea 2 超纯水 dd H2O 2.92 体系总量 Total 10 注：a. 每次定量均设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为建立标曲所用标准质粒，阴性对照为dd H2O。 Note: a. Positive control and negative control were set for each run. The positive control was the standard plasmid used to establish the standard curve, and the negative control was dd H2O. 
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表 2 本研究中qPCR 所需引物
Table 2 Primers used for quantitative PCR in this study
基因
Gene引物对
Primer pair序列 (5'—3')
Sequence (5'−3')退火温度
Annealing temperature/℃片段大小
Amplicon size/bp参考文献
Referencesul1 FW CGCACCGGAAACATCGCTGCAC 62 163 [20] RV TGAAGTTCCGCCGCAAGGCTCG sul2 FV TCCGGTGGAGGCCGGTATCTGG 62 191 [20] RV CGGGAATGCCATCTGCCTTGAG tetX FW AGCCTTACCAATGGGTGTAAA 55 280 [21] RV TTCTTACCTTGGACATCCCG cmlA FW GCCAGCAGTGCCGTTTAT 55 158 [22] RV GGCCACCTCCCAGTAGAA floR FW CGGTCGGTATTGTCTTCACG 56 171 [22] RV TCACGGGCCACGCTGTAT qnrA FW AGGATTTCTCACGCCAGGATT 57 124 [22] RV CCGCTTTCAATGAAACTGCA tetW FW GAGAGCCTGCTATATGCCAGC 55 168 [23] RV GGGCGTATCCACAATGTTAAC 注：FW. 上游引物；RV. 下游引物。 Note: FW. Forward primer; RV. Reverse primer.
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表 3 样品中环境因子检测结果
Table 3 Monitoring results of environmental factors in samples
mg·L−1 检测样品
Sample固体悬浮物
SS氨氮
NH3-N硝酸盐氮
NO3 −-N亚硝酸盐氮
NO2 −-N无机氮
IN总氮
TN磷酸盐
PO4 3−化学需氧量
CODSY1 36 0.019 0.012 <0.003 0.034 1.18 0.15 22.2 SY2 9 0.014 <0.006 <0.003 0.016 1.15 0.023 11.2 SY3 10 0.025 <0.006 <0.003 0.025 0.67 0.017 9.2 XSC1 2 0.037 <0.006 0.003 0.043 0.39 0.069 2.9 XSC2 12 0.009 0.009 <0.003 0.019 0.43 0.063 3.2 XSC3 9 <0.006 0.011 <0.003 0.015 0.75 0.074 4.9 XD1 4 <0.006 0.25 <0.003 0.255 0.55 0.047 0.8 XD2 2 0.008 0.311 <0.003 0.322 0.81 0.026 <0.5 XD3 6 <0.006 0.009 <0.003 0.013 0.69 0.017 <0.5 注：<. 检测结果小于检出限以，加粗数值代表检出限。 Note: <. Detection result is less than the detection limit, and value in bold represent the detection limit.
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表 4 样品中ARGs的Ct值检测结果
Table 4 Ct value of ARGs in samples
抗生素抗性基因
ARGCt值 Ct value 样品
Sample空白
Blanksul1 19.24~25.18 29.33~29.85 sul2 12.4~17.5 26.53~27.39 floR 26.99~30.32 33.2~33.93 cmlA 31.21~34.25 33.65~34.79 tetw 29.02~31.8 30.21~30.48 tetX 23.19~30.76 31.7~32.36 qnrA — 33.61~34.05
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表 5 沉淀及氧化处理对水体中ARGs去除量比较
Table 5 Comparison of removal effects of ARGs in water by sedimentation and oxidation treatment lg
处理
Treatment总 ARGs
Total ARGsfloR sul1 sul2 tetX 沉淀 Precipitation 0.86* 0.34 0.17 0.86* −0.32 氧化 Oxidation 1.58* 0.71* 0.94* 1.58* 1.30* 注：*. 表示处理后较水源水中ARGs浓度的差异性显著 (P<0.05)。 Note: *. There is a significant difference in ARGs concentrations in the treated water compared with that in the source water (P<0.05).
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