扑草净 (Prometryn) 属三嗪类除草剂，曾广泛用于农业生产活动^[1]，在水产养殖中用于清除水草和有害藻类^[2]。但扑草净会引起生物机体的内分泌紊乱、肿瘤产生等不良危害^[3-4]。因此，欧盟自2004年1月1日起，禁止扑草净作为农药在欧盟销售及使用^[5]，美国仅将扑草净作为除草剂使用，并制定了胡萝卜等19种植物中扑草净的最大残留限量^[6]，中国也于2010年在中华人民共和国公告1435中将其列入《兽药试行标准废止目录》，但当前仍有扑草净违规使用等问题，近年来中国养殖水产品中多次检出扑草净残留^[7-9]；2020年的“山东省海参事件”更将扑草净污染问题推向食品安全的风口浪尖，对此中国迅速开展“海参养殖中违法使用扑草净和甲氰菊酯两种农药专项整治行动”；2021年，扑草净被正式纳入“国家产地水产品兽药残留监控计划”，由原无公害渔业产品认证分中心牵头的水产品中扑草净残留隐患排查的专项行动也已开展^[7]，可见水产品中扑草净残留问题已引起社会的高度关注。

当前有关水产品中扑草净的检测方法较少，更无相关的检测标准。现行标准SN/T 1968—2007《进出口食品中扑草净残留量检测方法 气相色谱-质谱法》适用于食品中扑草净的检测，但该标准适用范围并不包括水产品，且方法采用串联固相萃取柱净化样品，完成一次前处理需10 h，存在有机溶剂消耗量大、操作繁琐、耗时、工作效率低等缺点，不利于样品批量化检测。朱晓华等^[10]建立的水产品中扑草净残留固相萃取-气相色谱串联质谱法虽可用于鱼、虾及紫菜中扑草净的检测，但并不涉及海参及双壳贝类等重点品种，且同样存在前处理操作繁琐的问题；报道的其他检测方法，更只涉及一种或两种水产品^[11-13]。由于水产品种类繁多，基质差异大，若直接采用文献报道的方法可能得不到理想的萃取效率。鉴于目前中国水产品已出现因扑草净超标而被废弃或退货的现象^[14]，故为保障水产品质量安全，维护大国形象，避免贸易壁垒，丞需建立适用于多种水产品中的扑草净快速筛查方法。

扑草净的检测方法主要有气相色谱-质谱法 (GC-MS) 和液相色谱-质谱法 (HPLC-MS-MS)等^{[10-13,15-17]}，其中液相色谱-质谱联用仪价格昂贵，而气相色谱-质谱仪价格相对适中，因此GC-MS更易于普及。当前，创新开发快速、精准的筛查方法是食品检测技术的发展趋势。QuEChERS法利用基质分散萃取机理来吸附样品中的杂质，达到保留目标物和净化样品的目的，其与传统固相萃取法相比，具有快速、简单、廉价及适用范围广等优点^[18]，因此被广泛用于蔬菜^[19-20]、畜禽^[21-22]及水产品^[23-25]等食品中药物残留检测的前处理。本文结合QuEChERS法及GC-MS技术的优点，针对多种水产品 [草鱼 (Ctenopharyngodon idellus)、鳜 (Siniperca chuatsi)、中国对虾 (Penaeus chinensis)、海参 (Holothuria sp.) 和文蛤 (Meretrix meretrix)]的检测需求，建立了扑草净残留的快速检测方法。该方法与行业标准SN/T 1968—2007相比，完成一次前处理仅需2 h，极大提高了检测效率，具有普及性强、适用范围广、有机溶剂损耗少、操作简单、高效、价格低廉等优点。方法的建立对扑草净在养殖水产品中违禁使用的监管监测、水产品中扑草净残留检测标准的制定及开展扑草净在水生生物体内的降解代谢、安全性评价等研究工作提供了重要的理论依据和技术支撑，有助于促进我国水产品质量提升和扩大出口需求。

1.   材料与方法

1.1   仪器与试剂

Agilent 7890A-5975C气相色谱质谱联用仪[配电子轰击源 (EI)，美国安捷伦]；AIKA MS3 basic涡旋振荡仪 (德国IKA)；TDL-5-A飞鸽牌离心机 (上海安亭)；氮吹仪 (美国organomation)。

扑草净 (纯度99%)、D₆-扑草净 (质量浓度100 mg·L⁻¹，德国Dr. Ehrenstorfor公司)；乙腈、二氯甲烷 (色谱纯，美国霍尼韦尔)；乙二胺-N-丙基硅烷PSA、石墨化炭黑GCB、中性氧化铝Alumina-N (美国Agela)；纳米二氧化锆 (上海麦克林)；无水硫酸钠 (Na₂SO₄)、氯化钠 (NaCl，分析纯，广州化学试剂厂)。

1.2   标准溶液的配制

1.2.1   标准储备溶液

称取适量的扑草净标准物质用乙腈溶解，配制成1 000 mg·L⁻¹的标准储备液，使用时用乙腈稀释成1 mg·L⁻¹的标准使用液，现用现配。

1.2.2   内标储备溶液

移取适量的D₆-扑草净标准溶液，用乙腈溶解配制成10 mg·L⁻¹的内标储备液，使用时用乙腈稀释成1 mg·L⁻¹的标准使用液，现用现配。

1.2.3   标准曲线的配制

用乙腈稀释标准使用液配制成质量浓度分别为5、10、20、80、100和200 μg·L⁻¹的系列标准曲线工作液，内标工作液质量浓度为80 μg·L⁻¹，现用现配。

1.3   样品处理方法

1.3.1   样品制备

鱼、海参取肌肉可食部分，文蛤、对虾去壳取可食部分，均质后 −20 ℃贮存备用。

1.3.2   提取

鱼、虾、文蛤：称取 (5±0.01) g样品于50 mL离心管中，加入内标储备液40 µL，8 mL去离子水，涡旋30 s，加入12 mL 乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2)，涡旋2 min，加入1 g NaCl和6 g无水Na₂SO₄，涡旋1 min，5 000 r·min⁻¹离心5 min，取上清液于25 mL比色管中，重复提取 1 次，合并上清液并用乙腈定容至刻度线，混匀。

海参：称取 (5±0.01) g样品于50 mL离心管中，加入内标储备液40 µL，加入12 mL 乙腈-二氯甲烷(V∶V=8∶2)，涡旋2 min，加入5 g无水Na₂SO₄，涡旋1 min，5 000 r·min⁻¹离心5 min，取上清液于25 mL比色管中，重复提取 1 次，合并上清液并定容至刻度线，混匀。

1.3.3   净化

分取上清液5 mL，于50 ℃水浴氮吹至干，1 mL乙腈定容，将定容液于2 mL离心管中，加入200 mg中性氧化铝、200 mg二氧化锆、50 mg PSA及20 mg GCB，漩涡震荡1 min，以10 000 r·min⁻¹离心5 min，取上清液，供GC-MS检测。

1.4   仪器条件

1.4.1   色谱柱

HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 µm)；升温程序：初始柱温70 ℃，保持1 min，以25 ℃·min⁻¹升至180 ℃，以5 ℃·min⁻¹升至220 ℃，以15 ℃·min⁻¹升至280 ℃，保持3 min。高纯氦气载气，流速1.0 ℃·min⁻¹；进样口温度260 ℃；不分流进样；进样体积1 µL。

1.4.2   质谱

电离方式为EI源；电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；辅助加热温度280 ℃；检测方式选择离子监测模式 (SIM)，溶剂延迟3 min，监测离子 (m/z)：扑草净为m/z 184、m/z 199、m/z 226、m/z 241，其中m/z 241为定量离子，D₆-扑草净为m/z 190、m/z 205、m/z 232、m/z 247，其中m/z 247为定量离子。

2.   结果与分析

2.1   色谱条件的优化

为获得较佳的峰型、灵敏度及分离效果，实验以标准工作液0.2 mg·L⁻¹，从进样口温度、流速等方面优化色谱条件。进样口是样品完成气化的地方，其温度显著影响目标物灵敏度、重现性及峰型。温度过低，目标物气化速度慢，灵敏度低、重现性差，样品峰扩展；温度过高可导致目标物分解，灵敏度下降。通过实验，发现进样口温度为260 ℃时，目标物灵敏度、重现性均最佳，峰型尖锐；进样口温度为250和270 ℃时，目标物灵敏度均低于260 ℃时的灵敏度 (图1)。因此，本文确定最佳进样口温度为260 ℃。

图  1  进样口不同温度对扑草净灵敏度的影响

Figure  1.  Effect of different temperatures of injection port on sensitivity of prometryn

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此外，流速过低会使样品峰扩展，流速过高，目标物与杂质得不到较好分离，通过实验，本文确定最佳流速为1.0 mL·min⁻¹。

2.2   质谱条件的确定

在ｍ/z介于50~550内进行全扫描，确定各组分的保留时间和特征离子。为降低干扰、提高灵敏度，采用选择离子监测模式，每个化合物选择１个定量离子、３个定性离子。扑草净及D₆-扑草净的定性与定量离子见1.4仪器条件，扑草净保留时间为11.057 min，D₆-扑草净保留时间为11.009 min。

2.3   样品前处理条件的优化

2.3.1   提取溶剂的选择

乙腈具有穿透力强可沉淀蛋白并对脂类干扰物溶解度小的优点，是多数农药萃取首选的提取液^[23,26]，扑草净属中等极性化合物^[27]与乙酸乙酯极性相近，故实验选用草鱼样品比较上述两种溶剂对扑草净的萃取效果。结果显示，采用乙酸乙酯提取目标物时基线噪音大、杂峰多，这是由于乙酸乙酯具有较强的脂溶性，其溶解了样品中大量脂肪，表现为乙酸乙酯提取液氮吹后玻璃管壁附有一层淡黄色油脂 (图2)，导致样品的后续净化不彻底，彭捷等^[28]也指出乙酸乙酯能溶解水产品中大量脂肪，给后续净化增加了困难。而草鱼中直接加入乙腈后其表面凝结成团，阻碍了乙腈与样品接触，回收率仅为45.8%。水缓冲剂可提高样品分散性^[29]，故实验先用去离子水分散样品再用乙腈提取扑草净，回收率提升至80%左右，但仍偏低，分析回收率偏低的原因可能与乙腈极性较强有关。鉴于此，实验采用二氯甲烷混合乙腈的方式降低提取液极性，结果表明，乙腈-二氯甲烷 (V∶V=6∶4)、乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2) 溶液的提取效率均优于乙腈，回收率在90%左右 (图3)，但乙腈-二氯甲烷 (V∶V=6∶4) 对样品脂肪的提取效率大，提取液颜色偏黄。

图  2  不同提取溶剂提取效果的比较

Figure  2.  Comparison of extraction effects of different extraction solvents

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图  3  不同提取溶剂对扑草净回收率的影响

Figure  3.  Effects of differents extraction solvent on recoveries of prometryn

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然而当实验采用乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2) 溶液萃取海参样品中扑草净残留时发现，海参样品与去离子水涡旋后，表面形成了一层乳白色胶状物，这层胶状物是海参样品中的胶原蛋白与水形成的胶冻，胶冻阻碍了提取液与样品的接触，导致萃取效率下降，故海参样品前处理时不可加入去离子水。实验又比较了乙腈、乙腈-二氯甲烷 (V∶V=6∶4)、乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2) 溶液对海参中扑草净的提取效率，结果显示 (图3)，乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2) 溶液是提取海参中扑草净的最佳提取剂。

因此实验选择乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2) 溶液作为水产品中扑草净残留的提取溶剂。

2.3.2   净化条件的优化

实验涉及的水产品种类丰富，包括鱼、虾、海参及贝类，基质差异大，包含脂肪、蛋白、磷脂、碳水化合物、有机酸、色素等杂质，仅使用一种吸附剂很难兼顾全部水产品基质的净化。QuEChERS方法能快速高效地去除水产品中各类杂质，常用的吸附剂有PSA、石墨化炭黑 (GCB)、二氧化锆、C₁₈粉、中性氧化铝及佛罗里硅土等^{[22-23,25,30-31]}，其中PSA能吸附提取液中的极性物质、有机酸及金属离子等杂质，GCB去除色素、甾醇等，二氧化锆去除磷脂，由于C₁₈粉、中性氧化铝及佛罗里硅土均可去除脂肪等干扰物，因此实验先比较了C₁₈粉、中性氧化铝及佛罗里硅土的净化效果，以筛选出三者中净化效果最佳的吸附剂。提取离子色谱图 (图4) 显示，中性氧化铝粉对5种水产品基质的净化能力均最佳，表现为杂质干扰峰少、基线平整，佛罗里硅土的净化能力一般，C₁₈粉最差。

图  4  3种吸附剂净化效果的比较

Figure  4.  Comparison of purification effects of three adsorbents

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之后实验采用中性氧化铝、PSA、二氧化锆及GCB共同净化样品，并比较了PSA (50、100和150 mg)、中性氧化铝 (100、150和200 mg)、二氧化锆 (100、150和200 mg)、GCB (10、15、20、25和30 mg) 不同用量、不同组合对回收率的影响，发现上述吸附剂对扑草净均无吸附，但分散剂的不同配比可影响提取液的净化效果及方法精密度。当PSA为50 mg、GCB为20 mg时，色谱图基线干扰及方法精密度随中性氧化铝及二氧化锆加入量增加而减小，加入量为200 mg时达最佳；当中性氧化铝为200 mg、二氧化锆为200 mg、GCB为20 mg时，50 mg PSA的加入量已能获得较好的净化效果；当中性氧化铝为200 mg、二氧化锆为200 mg、PSA为50 mg时，提取液的颜色随GCB含量的增加变浅，加入量为20 mg时，提取液中色素被完全吸附。实验最终确定复合吸附剂组合为中性氧化铝200 mg+二氧化锆200 mg+PSA 50 mg+GCB 20 mg，并将其用于水产品中扑草净残留的加标回收实验，获得了满意的回收率 (85.8%~111.8%)及较好的净化效果，如虾提取液经复合吸附剂净化后，溶液变得清澈透亮，色谱图干扰峰显著减少，基线噪音变小、较平整 (图5)。

图  5  虾已净化与未净化基质的提取离子色谱图比较

Figure  5.  Comparison of extracted ion diagrams of purified and unpurified shrimp

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2.4   方法验证

2.4.1   基质效应

质谱在电离和扫描过程中存在基质效应，为考察扑草净在虾、草鱼、鳜、海参、文蛤5种水产品中的基质效应，实验配制浓度为100 µg·L⁻¹的基质标样，与同等浓度的溶剂标准溶液进行对比测定，依照公式ME=(A_ι)_基质标样/(A_ι)_溶液标样(A_ι为扑草净的峰面积) 计算基质效应^[30]。若ME>1，表示基质对分析物的响应产生增强效应；若ME<1，表示基质对分析物的响应产生抑制效应；若ME=1，表示不存在基质效应。当ME介于0.8~1.2时，基质干扰程度较低；当0.5<ME<0.8或1.2<ME<1.5时，表现为中等干扰程度；当ME<0.5或ME>1.5，表示干扰强烈^[32]。结果表明，5种水产品基质的基质效应介于0.91~0.96，表明水产品基质对扑草净响应干扰程度较低，说明该方法对水产品基质的净化效果良好。

2.4.2   线性范围、检出限与定量限

按1.2配制标准曲线，在选定的色谱条件和质谱参数下测定分析，以目标物定量离子峰面积和相应内标物定量离子峰面积之比 (y) 为纵坐标，以目标物浓度 (x) 为横坐标，绘制标准曲线，实验分别以3倍信噪比 (S/N≥3) 和10倍信噪比 (S/N≥10) 确定方法的检出限 (LOD) 和定量限 (LOQ)。结果为扑草净质量浓度介于5~200 µg·L⁻¹，线性良好，线性方程为y=0.0131x+0.0279，线性相关系数 (R²) 为0.999 9，检出限为5 µg·kg⁻¹，定量限为10 µg·kg⁻¹；方法检出限低于SN/T 1968—2007 《进出口食品中扑草净残留量检测方法　气相色谱-质谱法》的检出限 (10 µg·kg⁻¹)，低于日本规定的水产品中扑草净残留10 µg·kg⁻¹的基准值^[7]，同时与朱晓华等^[10]建立的水产品中扑草净残留固相萃取-气相色谱串联质谱法相比，本研究建立的方法减少了有机溶剂的用量，具有操作简单、高效、价格低廉，样品完成一次前处理仅需2 h，适用于批量样品的检测。

2.5   精密度与回收率

选择对虾、草鱼、鳜、海参、文蛤开展加标回收实验。草鱼为草食性鱼类含脂量低，鳜为肉食性鱼类含脂量高，对虾含大量色素，而海参、贝类是目前扑草净监测重点关注的水产品且与鱼、虾基质差异较大，表明实验所选品种有较好的代表性。向实验样品中分别添加10、20、40和200 µg·kg⁻¹的扑草净标准溶液，每个添加水平设6个平行，并做空白实验，计算回收率和相对标准偏差，方法加标回收率为85.8%~111.8%，相对标准偏差为1.2%~8.8%，说明方法的准确度与精密度较好，能满足国标GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中实验室质量控制规范 (表1)。就方法适用范围而言，行标SN/T 1968—2007适用范围不包括水产品，而目前报道的扑草净检测方法^[11-13]存在水产品覆盖面不全、应用性不强等不足，本研究建立的方法不仅涵盖5种不同基质类型的水产品，还包含国家重点检测的水产品种，具有适用范围广的优点，可满足我国水产品质量安全的监测需求。

表  1  水产品中扑草净的加标回收率和相对标准偏差 (N=6)

Table  1.  Spiked recoveries and relative standard deviations of aquatic product (N=6)

样品　　　　　 Sample	回收率 Average recovery/%					相对标准偏差 RSD/%
	10 μg·kg−1	20 μg·kg−1	40 μg·kg−1	200 μg·kg−1		10 μg·kg−1	20 μg·kg−1	40 μg·kg−1	200 μg·kg−1
海参 Holothuria sp.	107.2	97.2	94.2	103.9		8.3	4.5	4.3	3.1
中国对虾 Penaeus chinensis	88.4	97.2	111.8	101.2		5.5	2.3	5.0	2.1
草鱼 Ctenopharyngodon idellus	86.6	106.4	102.7	100.2		5.6	3.3	8.8	4.1
鳜 Siniperca chuatsi	91.6	95.1	95.3	103.9		7.9	1.2	2.4	1.5
文蛤 Meretrix meretrix	92.2	85.8	101.5	100.0		7.0	3.9	3.7	2.7

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2.6   实际样品

将建立的方法用于30份水产品中扑草净检测，其中15份养殖水产品采集于广西、湖南、福建等地的农贸市场，15份捕捞水产品采集于中国南海海域，检测结果显示：养殖水产品中无扑草净检出，捕捞水产品中有2份样品检出扑草净，分别为脊尾白虾 (Palaemon carinicauda, 20.4 µg·kg⁻¹) 和僧帽牡蛎 (Ostrea cucullate, 24.3 µg·kg⁻¹，图6)。据有关报道，扑草净在中国长江、黄河等重点流域水体^[33] 及热带海域海南^[34]亦有不同程度的检出，表明中国部分自然水域已受到扑草净残留的影响，可能对水生生物健康和水产品质量安全产生潜在威胁，因此建议进一步加强扑草净环境残留及捕捞水产品残留的监控。

图  6  僧帽牡蛎样品提取离子色谱图

Figure  6.  Extracted ion chromatograms of S. cucullata

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3.   结论

本实验建立了快速检测水产品中扑草净残留的QuEChERS-气相色谱-质谱法。方法用乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2) 混合溶液提取，提取液经吸附剂中性氧化铝、N-丙基乙二胺 (PSA)、纳米二氧化锆结合石墨化炭黑 (GCB) 净化后上机检测，内标法定量，加标回收率为85.8%~111.8%，相对标准偏差为1.2%~8.8%，检出限为5 µg·kg⁻¹，定量限为10 µg·kg⁻¹。方法可满足草食性鱼类、肉食性鱼类、虾类、海参及贝类中扑草净残留的检测需求，具有操作简便、回收率高、重复性好等优点，可实现水产品中扑草净残留的批量化检测，有利于扑草净残留风险监测、预警及评估项目的开展。