Preliminary construction and comparative analysis of environmental DNA metabarcoding reference database of freshwater fishes in Hainan Island
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摘要: 为确定海南岛淡水鱼类环境DNA研究的最优参考数据库及最优目标基因，比较了自建数据库与公共数据库在COI、12S、16S 3个条形码片段上的物种覆盖度、注释准确率及种间差异阈值。结果表明：1) 实地采集鱼类72种，其中有16 (COI)、20 (12S) 和22 (16S) 种鱼类的参考序列为该研究首次提供；2) 仅有68.06% (COI)、66.67% (12S) 和69.44% (16S) 的鱼类在公共数据库比对到高相似度序列；3) 自建数据库对两个数据库共有鱼类的物种注释准确率显著高于公共数据库 (COI: 100% vs 69.64%; 12S: 96.15% vs 67.30%; 16S: 96% vs 70%)；4) COI基因是判别海南岛淡水鱼类的最优目标基因，16S次之；5) 基于K2P遗传距离确定的种间差异阈值分别为0.006 9 (COI)、0.005 6 (12S) 和0.007 5 (16S)，其物种判别准确率为94.96% (COI)、89.05% (12S)和92.70% (16S)。结果表明自建数据库优于公共数据库，建议使用COI、16S作为海南岛淡水鱼类环境DNA宏条形码基因。Abstract: In order to determine the optimal reference database and target genes for environmental DNA study of freshwater fishes in Hainan Island, we compared the species coverage, annotation accuracy and threshold values of interspecific difference of COI, 12S and 16S between the self-built database and the public database. The results show that: 1) Seventy-two fish species were collected, among which 16 (COI), 20 (12S) and 22 (16S) species' reference sequences were provided for the first time. 2) Only 68.06% (COI), 66.67% (12S) and 69.44% (16S) of the fish had high similarity sequence in the public database. 3) The annotation accuracy based on the self-built database was significantly higher than that on the public database (COI: 100% vs 69.64%; 12S: 96.15% vs 67.30%; 16S: 96% vs 70%). 4) COI gene was the best target gene for identifying freshwater fishes in Hainan Island, followed by 16S gene. 5) The threshold values of interspecific difference based on K2P genetic distance were 0.006 9 (COI), 0.005 6 (12S) and 0.007 5 (16S), respectively, and the accuracy rates were 94.96% (COI), 89.05% (12S) and 92.70% (16S), respectively. This study reveals that the sequence annotation accuracy of the self-built database is significantly higher than that of the public database, and it is suggested that COI and 16S should be used as the environmental DNA metabarcoding genes of freshwater fishes in Hainan Island.
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杂交是指遗传组成不同的个体或群体间的交配，包括种内杂交和种间杂交[1-2]。杂交是鱼类育种中的常用方法之一，旨在获得成活率高、生长率快、抗病性强等优良养殖性状[3-5]。回交属于杂交方式的一种，通过轮回亲本的轮回效应，使得某些性状在杂交后代中得以加强，如生长快[6]、耐粗饲[7]、起捕率[8]等特性。而体型特征在鱼类回交中也被广泛关注，如闫学春等[9]利用传统测量方法表明回交鲫｛[鲤 (Cyprinus carpio haematopterus)♀×鲫 (Carassius auratus gibelio)♂]×鲫♂｝的体型特征偏向于鲫，而回交鲤[(鲤♀×鲫♂) ×鲤♂]更偏向于鲤；[白鲫 (Carassius cuvieri)♀×红鲫 (C. auratus red var.)♂]杂交F1♀与白鲫♂的回交子代具有与白鲫相似的较小头部和较高背的体型[10]。体斑特征在杂交子一代中也有所研究，如红妃七彩神仙鱼 (Symphysodon aequifasciatus Ruby red)♀与万宝路 七彩神仙鱼(S. aequifasciatus Marlboro)♂杂交F1表现出了亲本所没有的黑纱体斑和不明显的黑色纵条纹体斑[11]；在石斑鱼中，如斜带石斑鱼 (Epinephelus coioides)♀×鞍带石斑鱼 (E. lanceolatus)♂杂交子代青龙斑的斜带体斑清晰连贯，棕点石斑鱼 (E. fuscoguttatus)♀×鞍带石斑鱼♂杂交子代虎龙斑出现了不同于亲本的大型环状体斑[12]。
鳜 (Siniperca chuatsi) 和斑鳜 (S. scherzeri) 是我国鳜鱼养殖的主要种类，鳜生长速度快，但易发生病害；斑鳜肉质鲜美、病害少，但生长速度慢[13-14]。目前，已采用杂交方式获得了新品种“秋浦杂交斑鳜” (斑鳜♀×鳜♂) 和“长珠杂交鳜” (鳜♀×斑鳜♂)[15-16]。鉴于杂交在鳜育种中取得了较明显的进展，在杂交鳜 (斑鳜♀×鳜♂) 基础上，继续开展了斑鳜 (♀)×杂交鳜 (♂) 回交试验。前期研究结果表明，该回交子代早期 (45日龄) 形态上偏向斑鳜，生长、日均摄食量和饵料系数偏杂交鳜[17]。
体型和体斑是鳜鱼杂交育种的重要性状[18]。杂交鳜生长性能明显优于斑鳜，但体型、体斑均介于斑鳜与鳜之间[19]。鱼类可量性状和框架分析能精确反映鱼体体型差异[20]，主成分分析和判别分析是体型差异分析的主要方法[21-22]。本文利用多重比较和杂种指数比较了回交子代与亲本子代的体型特征，利用主成分分析和判别分析对回交子代与亲本子代进行主要形态学区分，并对回交子代体斑进行了初步统计分析，旨在为鳜鱼杂交育种与杂交后代鉴定提供基础资料。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验材料为鳜鱼回交子代、斑鳜和杂交鳜，均取自安徽省池州市秋浦特种水产开发有限公司。“秋浦杂交斑鳜” (以下简称“杂交鳜”) 是由斑鳜♀×鳜♂杂交而得，回交子代由斑鳜♀×杂交鳜♂回交而得。3个群体均为同年8月龄鱼，平均体质量分别为回交子代166.75 g、斑鳜121.90 g、杂交鳜426.89 g，样本数量分别为回交子代92尾、斑鳜33尾、杂交鳜37尾。
1.2 形态参数测量和体斑观察
可数性状有背鳍条、胸鳍条、腹鳍条、臀鳍条。
可量性状[23]有头部隆角 (头后背前与鱼体长轴间夹角)、全长、体长、体高、体宽、头长、头高、吻长、眼径、尾柄长、尾柄高。使用游标卡尺测量，精确度为0.01 mm。
框架结构性状[24]包括A (1-2)、B (1-11)、C (2-3)、D (2-10)、E (2-11)、F (3-4)、G (3-9)、H (3-10)、I (3-11)、J (4-5)、K (4-8)、L (4-9)、M (4-10)、N (5-6)、O (5-7)、P (5-8)、Q (5-9)、R (6-7)、S (6-8)、T (7-8)、U (8-9)、V (9-10)、W (10-11，图1)。使用游标卡尺测量，精确度为0.01 mm。
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图 1 鳜鱼框架结构性状示意图1. 吻前端；2. 隅骨后端；3. 腹鳍起点；4. 臀鳍起点；5. 臀鳍末端；6. 尾鳍腹部起点；7. 尾鳍背部起点；8. 背鳍末端；9. 背鳍棘末端；10. 背鳍起点；11. 后背部末端Figure 1. Diagram of frame structure of mandarin fish1. Anterior extremity of snout; 2. Posterior part of angulare; 3. Start of ventral fin; 4. Start of anal fin; 5. End of anal fin; 6. Abdomen start of caudal fin; 7. Back start of caudal fin; 8. End of dorsal fin; 9. End of spinous dorsal; 10. Start of dorsal fin; 11. End of back体斑观察为观察回交子代背部鞍状斑和体侧斑纹形状，统计不同体斑组合。
1.3 数据处理
1.3.1 多重比较
除头部隆角外，将可量性状转化为比例性状 (体高/体长、头高/头长、吻长/头长、眼径/头长、体宽/体长、头长/体长、尾柄长/体长、尾柄高/体高)，框架结构性状除以体长进行校正[25]。使用IBM SPSS Satastics 24.0软件进行数据处理分析。
1.3.2 杂种指数
利用多重比较分析后得到的差异性状，按照如下公式计算杂种指数，再计算所有性状的平均杂种指数HI (Hybrid index)[26]：
HI=100×(Hi–Mi1)/(Mi2–Mi1)
式中Hi为杂交种平均值；Mi1为母本平均值；Mi2为父本平均值，45<HI<55属中间性状，HI<45为偏母本性状，HI>55为偏父本性状，HI>100或HI<0为超亲偏离性状。
1.3.3 主成分分析和判别分析
通过建立相关系数矩阵，获得主成分的特征值和贡献率，根据因子得分，绘制主成分散点图；通过筛选出的形态性状，拟合出3个群体的典型判别函数和分类判别函数[27]。
2. 结果
2.1 多重比较分析
对3个群体的4项可数性状、9项常规可量比例性状和23项框架比例性状进行单因素方差分析，得到群体间的差异结果。结果显示：1) 可数性状。回交子代鳍条数目与斑鳜、杂交鳜间无显著差异 (表1)。2) 常规可量性状。除眼径/头长外，回交子代与斑鳜、杂交鳜的其他常规可量比例性状都有显著性差异 (表2)。其中回交子代与亲本子代群体间在头部隆角、吻长/头长、尾柄高/体高上都存在显著性差异 (P<0.05)；回交子代在头高/头长上与斑鳜间差异明显 (P<0.05)，与杂交鳜间无显著差异 (P>0.05)；回交子代在体高/体长、尾柄长/体长、体宽/体长与杂交鳜间差异显著 (P<0.05)，与斑鳜间无显著差异 (P>0.05)。3) 框架比例性状中，回交子代和斑鳜、杂交鳜间均有明显差异的参数有C/体长、J/体长、V/体长 (P<0.05)；回交子代的G/体长、H/体长、I/体长、K/体长、L/体长、M/体长、Q/体长与杂交鳜间差异明显 (P<0.05)，与斑鳜间无显著差异 (P>0.05)；回交子代的B/体长与斑鳜间有显著差异 (P<0.05)，与杂交鳜间无明显差异 (P>0.05，表2)。
表 1 鳜回交子代与其亲本子代可数性状比较Table 1. Comparison of countable traits between backcross progenies and their parents性状
Trait回交子代
Backcross斑鳜
S. scherzeri杂交鳜
Hybrid背鳍 Dorsal fin XI-XIII，13~15 XI-XII，12~14 X-XII，13~15 胸鳍 Pectoral fin 1，12~15 1，12~15 1，12~15 腹鳍 Ventral fin I，5 I，5 I，5 臀鳍 Anal fin III，9~11 III，9~10 III，9~11 表 2 鳜回交子代与其亲本子代可量性状差异分析Table 2. Different analysis of quantitative traits between backcross progenies and their parents性状
Trait回交子代
Backcross斑鳜
S. scherzeri杂交鳜
Hybrid头部隆角 AH 27.90±2.250b 25.36±1.140c 29.37±1.100a 吻长/头长 LS/LH 0.288±0.037a 0.348±0.037b 0.237±0.029c 头长/体长 LH/LB 0.354±0.022ab 0.350±0.015b 0.364±0.021bc 头高/头长 HH/LH 0.653±0.057a 0.557±0.020b 0.665±0.108a 体高/体长 HB/LB 0.298±0.026b 0.283±0.013b 0.326±0.021a 体宽/体长 HB/LB 0.148±0.014a 0.152±0.014a 0.140±0.017b 尾柄长/体长 LCP/LB 0.149±0.020a 0.160±0.009a 0.136±0.022b 尾柄高/体高 HCP/HB 0.347±0.036a 0.372±0.027b 0.346±0.034b B (1-11)/体长 B/LB 0.276±0.010a 0.252±0.023b 0.269±0.010a C (2-3)/体长 C/LB 0.211±0.014a 0.157±0.014b 0.168±0.013b D (2-10)/体长 D/LB 0.307±0.013ab 0.286±0.024b 0.320±0.027a E (2-11)/体长 E/LB 0.222±0.008ab 0.213±0.020b 0.238±0.020a G (3-9)/体长 G/LB 0.403±0.019b 0.397±0.029b 0.441±0.024a H (3-10)/体长 H/LB 0.280±0.014b 0.270±0.025b 0.311±0.032a I (3-11)/体长 I/LB 0.269±0.014b 0.264±0.017b 0.291±0.024a J (4-5)/体长 J/LB 0.171±0.006a 0.154±0.020b 0.152±0.008b K (4-8)/体长 K/LB 0.252±0.011b 0.247±0.018b 0.275±0.011a L (4-9)/体长 L/LB 0.268±0.015b 0.259±0.019b 0.301±0.024a M (4-10)/体长 M/LB 0.404±0.022b 0.424±0.029b 0.464±0.025a Q (5-9)/体长 Q/LB 0.234±0.013b 0.238±0.014b 0.260±0.011a V (9-10)/体长 V/LB 0.375±0.021a 0.337±0.033b 0.345±0.014b 注：同行数据不同上标字母表示差异显著 (P<0.05) Note: Different superscript letters indicate significant difference (P<0.05). 2.2 回交子代的杂种指数
8项常规可量比例性状中，头部隆角值、体高/体长、头高/头长、头长/体长4项的HI<45，为偏母性状；体宽/体长、尾柄长/体长2项的HI>55，为偏父性状；吻长/头长1项45<HI<55，为中间性状；尾柄高/体高1项的HI>100，为超亲偏离性状。13项框架比例性状中，有H/体长、I/体长、K/体长、L/体长、M/体长、Q/体长6项的HI<55，为偏母性状；G/体长、B/体长2项HI>55，为偏父性状；C/体长、J/体长、V/体长3项45<HI<55，为中间性状；D/体长、E/体长2项的HI>100，为超亲偏离性状。综合杂种指数平均值为38.73。
2.3 主成分分析
将多重比较所得数据进行Pearson相关性分析，最终获得12个参数进行主成分分析和判别函数分析，分别为头部隆角 (X1)、体高/体长 (X2)、头高/头长 (X3)、吻长/头长 (X4) 体宽/体长 (X5)、头长/体长 (X6)、尾柄长/体长 (X7)、尾柄高/体高 (X8)、B/体长 (X9)C/体长 (X10)、J/体长 (X11)、V/体长 (X12)。主成分分析结果显示，前4项主成分的特征值大于1.0，累计贡献率达75.216% (表3)。
表 3 主成分总方差变异率分析Table 3. Analysis of variation rate of total variance of principal components成分
Component初始特征值 Initial eigenvalue 提取载荷平方和 Extraction load sum of squares 总计
Total方差百分比
Variance percentage/%累积
Cumulation/%总计
Total方差百分比
Variance percentage/%累积
Cumulation/%1 3.654 30.452 30.452 3.654 30.452 30.452 2 2.431 20.258 50.710 2.431 20.258 50.710 3 1.734 14.450 65.160 1.734 14.450 65.160 4 1.207 10.057 75.216 1.207 10.057 75.216 5 0.753 6.278 81.494 6 0.657 5.479 86.973 7 0.499 4.161 91.133 8 0.426 3.551 94.684 9 0.261 2.174 96.858 10 0.180 1.504 98.362 11 0.137 1.141 99.503 12 0.060 0.497 100.000 第一主成分主要解释头部隆角、体高/体长、头高/头长、尾柄高/体高、C/体长、V/体长6个性状的贡献率，主要反映头部隆角及高度、体背高低、尾柄高度等造成的形态差异；第二主成分主要解释吻长/头长、J/体长2个性状的贡献率，主要反映吻部长短和臀鳍起末间距造成的形态差异；第三主成分、第四主成分主要解释头长/体长、B/体长2个性状的贡献率，主要反映头部大小和吻部至头后背部间距造成的形态差异。
根据前3个主成分绘制出3个群体的三维空间分布图 (图2)，可以将3个群体进行有效区分。
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图 2 3个群体在前3个主成分上的三维空间分布图Figure 2. Three-dimensional spatial distribution of three groups on first three principal components2.4 判别分析
通过逐步判别分析，筛选出具有极显著差异的8个生物学性状：头部隆角 (X1)、体高/体长 (X2)、头高/头长 (X3)、吻长/头长 (X4)、体宽/体长 (X5)、B/体长 (X9)、C/体长 (X10)、J/体长 (X11)。进而拟合出两个典型判别函数：
F1=0.151X1+0.216X2+0.355X3−0.323X4−0.330X5−0.377X9+0.751X10+0.391X11
F2=−0.399X1−0.533X2−0.241X3+0.732X4+0.441X5−0.525X9+0.166X10+0.364X11
两个判别函数的贡献率分别为55.3%和44.7%，将3个群体的8个性状带入典型判别函数中，绘制出二维平面上的分布图 (图3)。
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图 3 依据判别函数所得3个群体二维空间分布图Figure 3. Two-dimensional spatial distribution of three groups based on discriminant function同时，依据极显著差异的8个生物学性状，拟合出3个群体的分类判别函数：
回交群体：Y1=8.135X1+265.921X2+95.556X3+24.429X4+330.025X5+1 332.942X9+918.925X10+940.928X11
斑鳜群体：Y2=7.366X1+178.379X2+61.131X3+106.673X4+506.013X5+1 443.162X9+620.952X10+769.083X11
杂交鳜群体：Y3=8.792X1+335.719X2+94.744X3−35.487X4+269.032X5+1 615.562X9+694.262X10+654.415X11
用上述公式对现有群体的测量性状变量进行回代分析，比较计算出以上函数值及判别准确率，判别准确率平均为99.4%。
2.5 回交子代体斑特征
回交子代躯干有4类体斑：背部鞍状斑、体侧空心斑、地图斑、点状斑。回交子代全部个体都具有点状斑和地图斑，部分个体具有背部鞍状斑和体侧空心斑。与回交亲本斑鳜相比，总样本中，有41尾出现背部鞍状斑，但空心斑分布有差异，其中有空心斑个体30尾 (图4-a)、无空心斑个体11尾 (图4-b)；其余51尾不具明显背部鞍状斑，其中有空心斑个体37尾 (图4-c)、无空心斑个体14尾 (图4-d)。
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图 4 回交子代体斑分类箭头指为：a. 背部鞍状斑，b. 点状斑，c. 空心斑，d. 地图斑Figure 4. Body spots classification of backcross progeniesArrows are: a. Back saddle spots; b. Punctate spots; c. Hollow spots; d. Map spot3. 讨论
3.1 回交子代体型特征
传统的形态学分析结合框架结构能更有效的反映形态差异，可为种质鉴定、物种分类及遗传变异提供大量的性状数据[28-29]。本研究中21项可量性状比值显著性差异分析结果显示，回交子代与斑鳜存在显著性差异的有8项 (P<0.05)，与杂交鳜存在显著性差异的有13项 (P<0.05)。杂种指数可以对后代性状变异与亲本性状进行评价[30]，回交子代偏母性状有10项，偏父性状为4项，中间性状有4项，超亲偏离性状为3项，平均杂种指数为38.73，综合表现为偏斑鳜。结合多重比较分析和杂种指数分析结果，表明回交子代在可量形态性状上偏斑鳜。
在一代杂交中，斑鳜 (♀)×鳜 (♂) 杂交子代与母本的显著性差异可量性状比值多于父本，聚类分析中杂交子代与父本鳜聚为一支[19]；反交子代 (鳜♀×斑鳜♂) 可量性状比值的杂种指数显示出反交子代偏向母本鳜的趋势[18]，正、反杂交子一代的体型特征均偏向鳜。本研究中，正杂交子代与斑鳜回交，回交子代体型特征偏斑鳜。这可能是由于斑鳜既作为轮回亲本，又作为杂交母本的缘故，回交子代中除了斑鳜遗传物质组成比例增加、产生轮回效应外，一定程度上也受母系效应影响[31-33]。轮回亲本效应可使得回交子代偏轮回亲本，如[团头鲂 (Megalobrama amblycephala)♀×翘嘴红鲌 (Culter alburnus)♂]♀×翘嘴红鲌♂回交子代的体高/体长值 (体型) 偏向于轮回亲本翘嘴红鲌[6]，回交鲤和回交鲫的轮回亲本分别为鲫和鲤，两者在体型、体色、口须有无、口径大小等偏轮回亲本[9]。鳜鱼育种中，若要实现后代性状更接近于轮回亲本，可考虑进行二次回交。
本研究中对回交子代和亲本子代的12个参数进行主成分分析，发现头部隆角、体高/体长、头高/头长、尾柄高/体高、C/体长、V/体长6个性状对3个群体体型差异的贡献较大，前3个主成分的总方差积累贡献率达65.16%，能够明显区分3个群体。逐步判别分析筛选出的8个性状：头部隆角、体高/体长、头高/头长、吻长/头长、体宽/体长、B/体长、C/体长、J/体长，判别准确率为99.4%，说明头部隆角、体高/体长、头高/头长、C/体长是3个群体形态差异的关键性状。由此可见，回交子代与亲本子代可以通过头部隆角、体高/体长、头高/头长、C/体长等关键性状进行数值鉴定。
3.2 回交子代体斑特征
前人研究发现斑鳜体侧有明显、排列较规则的点状斑块和空心状斑块，背部有4块鞍状斑[19]；杂交鳜头部至眼后无斜带，背鳍下方有黑色纵带，但不明显，体侧有空心斑，但不规则，介于鳜和斑鳜之间[18]。本研究中回交子代群体中有45.5%的个体表现出与斑鳜类似的背部鞍状斑，同时具有体侧空心斑、地图斑、点状斑3种斑纹，根据不同斑纹类型组合，回交子代体斑可分为4类：有背部鞍状斑有空心斑、有背部鞍状斑无空心斑、无背部鞍状斑有空心斑、无背部鞍状斑无空心斑。杂交鳜中来源于父本鳜的体斑特征呈弱化趋势，体现在头部至眼后的斜带消失，背鳍下方黑色纵带变淡，同时，来源于斑鳜的体斑特征呈增强趋势，体现在体侧出现了母本斑鳜的空心斑和点状斑，但无背部鞍状斑，杂交鳜的体斑特征介于双亲之间[34]；回交子代中，躯干纵带完全消失，空心斑和点状斑继续保留，且出现背部鞍状斑，即体斑也表现有明显的轮回亲本效应。本研究中有1/3的回交子代同时出现背部鞍状斑和空心斑，与轮回亲本斑鳜更为相似。就体斑回交效应而言，可继续选择具有背部鞍状斑和规则空心斑的子代进行自交或与斑鳜再次回交，以期培育出特定体斑的新品系。
综上所述，回交子代体型特征偏向轮回亲本斑鳜，利用形态多元分析方法对回交子代和亲本子代进行形态鉴定，回交后代部分个体体斑与斑鳜相似，出现背部鞍状斑和规则空心斑，以上结果可为今后鳜鱼杂交育种和子代种质鉴定提供依据和参考。
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图 1 本研究中自建数据库及公共数据库的鱼类种数
Figure 1. Number of fish species in self-built database and public database in this study
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图 2 可注释到种的鱼类的候选物种数 (序列相似度≥99%)
Figure 2. Number of candidate species of fish that can be annotated at species level (with≥99% sequence similarity)
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图 3 基于152条线粒体COI序列构建的NJ系统发育树
Figure 3. NJ phylogenetic tree constructed based on 152 mitochondrial COI sequences
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图 5 基于150条线粒体16S序列构建的NJ系统发育树
Figure 5. NJ phylogenetic tree constructed based on 150 mitochondrial 16S sequences
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图 4 基于150条线粒体12S序列构建的NJ系统发育树
Figure 4. NJ phylogenetic tree constructed based on 150 mitochondrial 12S sequences
表 1 公共数据库和自建数据库参考序列简介
Table 1 Summary of metabarcoding reference sequence in public database and self-built database
数据来源
Data source目标基因
Target gene鱼类总数Total number
of fish序列总数
Total number of sequences标注采样地点的序列总数Total number of sequences with sampling location information 标注样品采集于海南的序列总数*
Total number of sequences collected from Hainan标注样品采集于海南的鱼类种数*
Total number of fish collected from Hainan公共数据库
Public databaseCOI 123 2 704 181 8 3 12S 117 648 75 2 1 16S 115 736 59 0 0 自建数据库
Self-built databaseCOI 72 85 85 85 72 12S 72 85 85 85 72 16S 72 85 85 85 72 注：凡是没有明确标注采样地点的序列 (包括海南特有种) 一律不纳入*统计范围。Note: The sequences without sampling location information (including endemic species in Hainan) will not be included in the statistical scope of *. 
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表 2 可注释到种的序列在不同阈值范围内的候选物种数 (
$\overline {\boldsymbol X}{\bf {\pm} } {\bf{SD}} $ )Table 2 Number of candidate species of sequence that can be annotated at species level within different threshold values
序列相似度
Sequence similarity候选物种数 Number of candidate species 基于公共数据库 Based on public database 基于自建数据库 Based on self-built database COI 12S 16S COI 12S 16S 100% 0~9 (1.43±1.64) 0~9 (1.01±1.51) 0~9 (1.00±1.46) 1~2 (1.03±0.18) 1~2 (1.08±.028) 1~2 (1.07±.025) 100%>X≥99% 0~15 (1.04±1.88) 0~7 (0.53±0.98) 0~7 (0.85±1.22) 0~1 (0.13±0.34) 0~1 (0.03±0.18) 0~1 (0.03±0.18) 99%>X≥98% 0~10 (1.07±1.74) 0~11 (0.85±1.42) 0~11 (1.03±1.67) 0~3 (0.19±0.63) 0~3 (0.13±0.37) 0~2 (0.10±0.29) 100%≥X≥99% 0~21 (2.47±3.06) 0~16 (1.53±2.06) 0~15 (1.85±2.27) 1~3 (1.14±0.47) 1~2 (1.10±0.30) 1~2 (1.09±0.28) 100%≥X≥98% 0~31 (3.53±4.31) 0~27 (2.38±2.99) 0~23 (2.88±3.24) 1~4 (1.31±0.98) 1~4 (1.20±0.65) 1~3 (1.16±0.45)
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表 3 两种数据库共有物种的注释结果
Table 3 Annotation results of common fish species in two databases
参考数据库
Reference database目标基因
Target gene共有物种数
Number of shared species低相似度物种数
Number of species with low sequence similarity不确定物种数或错误注释物种数Number of uncertain species or incorrectly annotated species 正确注释物种数
Number of correctly annotated species注释准确率
Annotation accuracy/%公共数据库
Public databaseCOI 56 14 3 39 69.64 12S 52 12 5 35 67.30 16S 50 11 4 35 70 自建数据库
Self-built databaseCOI 56 0 0 56 100 12S 52 0 2 50 96.15 16S 50 0 2 48 96 注：不确定物种是注释到的多个候选物种序列完全相同 (序列相似度=100%)，且皆有历史分布记录，难以排除错误物种；低相似度物种指序列相似度<98%。Note: Uncertain species refer to multiple candidate species whose sequences are identical (sequence similarity=100%) and all of them have historical distribution records in Hainan, so it is difficult to exclude the wrong species. Low similarity species refer to the species whose sequence similarity<98%.
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表 4 两两序列的遗传距离 (K2P)
Table 4 Pairwise distance of genetic divergences (K2P) within various sequences
物种 Species 遗传距离 Pairwise distance COI 12S 16S 南方波鱼 Rasbora steineri (A, B) 0 0 0.007 66 海南马口鱼 Opsariichthys hainanensis、南方马口鱼 O. bidens (A) 0.008 43 — — 蒙古鲌 Culter mongolicus mongolicus、鳊 Parabramis pekinensis 0.006 94 — — 海南鲌 C. recurviceps (A, B) 0 0 0 海南鲌 C. recurviceps (A, B)、红鳍鲌 Chanodichthys erythropterus 0.006 95 0.005 64 — 红鳍鲌 C. erythropterus、海南似鱎 Toxabramis houdemeri 0.009 44 — — 海南拟䱗 Pseudohemiculter hainanensis、䱗 Hemiculter leucisculus 0.006 94 — 0.007 54 鳊 Parabramis pekinensis、三角鲂 Megalobrama terminalis 0.008 87 — — 鳊 P. pekinensis、斯氏鲂 (疑似) M. skolkovii (Suspected) 0.008 87 — — 三角鲂 M. terminalis、斯氏鲂 (疑似) M. skolkovii (Suspected) 0 — — 黄尾鲴 Xenocypris davidi、银鲴 X. macrolepis — 0 0 疏斑小鲃 Puntius paucimaculatus、条纹小鲃 P. semifasciolatus 0.006 95 0 — 细尾白甲鱼 Onychostoma lepturum (A, B) 0 0 0 厚唇光唇鱼 Acrossocheilus paradoxus (A, B) 0 0 0 间䱻 Hemibarbus medius (A, B) 0 0 0 尖鳍鲤 Cyprinus acutidorsalis、鲤 C. carpio 0 0 0.007 54 鳙 Hypophthalmichthys nobilis、鲢 H. molitrix 0.006 94 — — 美丽小条鳅 Micronemacheilus pulcher、齐氏小条鳅 M. zispi 0.006 94 0.005 74 — 泥鳅 Misgurnus anguillicaudatus、大鳞副泥鳅 Paramisgurnus dabryanus 0.008 03 0 0 越南隐鳍鲇 Pterocryptis cochinchinensis (A, B) 0.006 94 — 0 中间黄颡鱼 Pelteobagrus intermedius (A, B) 0 0 0.004 46 黑首阿胡虾虎鱼 Awaous melanocephalus (A, B) 0 0.008 04 0 黑首阿胡虾虎鱼 A. melanocephalus (A, C) 0 0.001 01 0 黑首阿胡虾虎鱼 A. melanocephalus (B, C) 0 0.009 05 0 子陵吻虾虎鱼 Rhinogobius giurinus、吻虾虎鱼sp. 3 Rhinogobius sp. 3 — 0 0 陵水吻虾虎鱼 R. linshuiensis (A, B) 0 0 0 陵水吻虾虎鱼 R. linshuiensis、吻虾虎鱼sp. 2 Rhinogobius sp. 2 0.006 94 0 0 攀鲈 Anabas testudineus (A, B) 0.006 94 0 0 黑体塘鳢 Eleotris melanosoma (A, B) 0 0 0 南方马口鱼 O. bidens (A, B) 0.006 94 0.006 28 — 注：遗传距离在0.01以上的物种均能正确鉴定，故本表只展示遗传距离在0.01以下的物种。—. 遗传距离≥0.01；A、B、C. 种内不同个体。Note: All species with a genetic distance above 0.01 can be correctly identified, so only the results with a genetic distance below 0.01 are shown. —. Genetic distance ≥0.01; A, B, C. Intraspecific samples.
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