Preliminary construction and comparative analysis of environmental DNA metabarcoding reference database of freshwater fishes in Hainan Island
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摘要: 为确定海南岛淡水鱼类环境DNA研究的最优参考数据库及最优目标基因，比较了自建数据库与公共数据库在COI、12S、16S 3个条形码片段上的物种覆盖度、注释准确率及种间差异阈值。结果表明：1) 实地采集鱼类72种，其中有16 (COI)、20 (12S) 和22 (16S) 种鱼类的参考序列为该研究首次提供；2) 仅有68.06% (COI)、66.67% (12S) 和69.44% (16S) 的鱼类在公共数据库比对到高相似度序列；3) 自建数据库对两个数据库共有鱼类的物种注释准确率显著高于公共数据库 (COI: 100% vs 69.64%; 12S: 96.15% vs 67.30%; 16S: 96% vs 70%)；4) COI基因是判别海南岛淡水鱼类的最优目标基因，16S次之；5) 基于K2P遗传距离确定的种间差异阈值分别为0.006 9 (COI)、0.005 6 (12S) 和0.007 5 (16S)，其物种判别准确率为94.96% (COI)、89.05% (12S)和92.70% (16S)。结果表明自建数据库优于公共数据库，建议使用COI、16S作为海南岛淡水鱼类环境DNA宏条形码基因。Abstract: In order to determine the optimal reference database and target genes for environmental DNA study of freshwater fishes in Hainan Island, we compared the species coverage, annotation accuracy and threshold values of interspecific difference of COI, 12S and 16S between the self-built database and the public database. The results show that: 1) Seventy-two fish species were collected, among which 16 (COI), 20 (12S) and 22 (16S) species' reference sequences were provided for the first time. 2) Only 68.06% (COI), 66.67% (12S) and 69.44% (16S) of the fish had high similarity sequence in the public database. 3) The annotation accuracy based on the self-built database was significantly higher than that on the public database (COI: 100% vs 69.64%; 12S: 96.15% vs 67.30%; 16S: 96% vs 70%). 4) COI gene was the best target gene for identifying freshwater fishes in Hainan Island, followed by 16S gene. 5) The threshold values of interspecific difference based on K2P genetic distance were 0.006 9 (COI), 0.005 6 (12S) and 0.007 5 (16S), respectively, and the accuracy rates were 94.96% (COI), 89.05% (12S) and 92.70% (16S), respectively. This study reveals that the sequence annotation accuracy of the self-built database is significantly higher than that of the public database, and it is suggested that COI and 16S should be used as the environmental DNA metabarcoding genes of freshwater fishes in Hainan Island.
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柔鱼(Ommastrephes bartramii)是西北太平洋的重要经济头足类，20世纪70年代初由日本鱿钓船首先开发和利用。中国于1994年对该资源进行规模化商业化捕捞，并成为中国远洋鱿钓渔业的重要捕捞对象之一[1]。陈新军等[2-4]、沈新强等[5]、CAO等[6]、ICHII等[7]对柔鱼渔场形成、渔获量变动以及其与海洋环境之间的关系做了相关研究。北太平洋柔鱼渔场由黑潮和亲潮交汇形成，其空间分布与海洋环境关系密切，其中心渔场空间分布随月份迁移。地统计学是空间分析统计的重要手段，并被广泛应用到相关领域[8-10]，其中以普通克里格插值法应用最为广泛。为了解和掌握北太平洋柔鱼中心渔场时空分布特征，以及随时间的迁移规律，该文尝试采用普通克里格插值法等5种地统计学方法，根据中国鱿钓船提供的实际生产数据，分析比较何种插值方法能很好地表征柔鱼中心渔场及其空间分布规律，同时以最优插值方法来预测柔鱼中心渔场的分布，为研究和掌握柔鱼中心渔场空间分布提供新手段。
1. 材料与方法
1.1 研究数据
渔获生产统计为2012年7月~10月中国鱿钓船捕捞生产数据，数据内容包括时间、经度、纬度和单船产量等。作业渔船数量为225艘。作业海域为150°E~160°E、38°N~46°N海域(图 1)。假设单位渔船日捕捞产量(CPUE)可作为资源丰度的指标，其空间分布情况用来表征中心渔场的分布。空间分辨率为0.5°×0.5°，并设为一个渔区。每一个作业渔区即为一个样本。
1.2 研究方法
1.2.1 原始数检验
为了满足地统计学空间分析的要求，研究数据需要满足正态分布。为此，该文采用K-S(Kolmogorov-Smirnov)检验法，对各月CPUE进行正态分布检验。对不符合正态分布的CPUE数据进行转换。K-S检验方法为：假设H0为样本所来自的总体分布服从正态分布，H1所来自的总体分布不服从正态分布。F0(x)表示理论分布的分布函数，Fn(x)表示一组随机样本的累计频率函数。设D为F0(x0)与Fn(x)差距的最大值，定义如下式：
$$ \mathrm{D}=\max \left|\mathrm{F}_n(x)-\mathrm{F}_0(x)\right| $$ 标准显著性水平α设置为0.05，若显著性概率P[Sig.(2-tailed)]＞0.05，表明接受假设H0，样本服从正态分布，反之则不服从。
1.2.2 空间插值法介绍
空间插值是利用已知的部分空间样本信息对未知的地理空间特征进行估计，也是GIS的重要功能模块之一[11]。常用的5种插值方法[12]为：1)反距离权重插值法(inverse distance weighted，IDW)，以插值点与样本点间的距离为权重进行加权平均，离插值点越近的样本点赋予的权重越大；2)径向基函数插值法(radial basis function，RBF)，是多个数据插值方法的组合，即经过各个已知样点生成一个圆滑曲面，并使表面的总曲率最小；3)全局多项式插值法(global polynomial，GP)，以整个研究区的样点数据集为基础，用一个多项式计算预测值；4)局部多项式插值法(local polynomial，LP)，采用处在特定重叠邻近区域内的多个多项式进行插值，其产生的曲面更依赖于局部数据的变异；5)普通克里格插值法(ordinary Kriging，OK)，是区域化变量的线性估计，但其考虑了空间相关性，更加符合空间数据的特点[12]。
1.2.3 插值方法优劣评价
对7月~10月各月栅格化后的数据分别用不同的插值方法进行预测计算，在各样本中随机选取75%为分析样本，剩余25%为检验样本[12]。将预测得到的各月均方根值(root-mean-square)与检验值进行回归分析，得到相关系数R2，以此判别其插值方法的优劣[12]。
2. 结果
2.1 CPUE数据描述性统计与正态分布检验
统计分析发现，渔汛期间各月CPUE为0.01~10 t · d-1。其中，7月平均CPUE最低，仅0.67 t · d-1；8月最高，达到2.15 t · d-1(表 1)。各月CPUE的变异系数介于0.6~0.9 t · d-1，均表现为中等变异。分析认为样本总体上具有较好的代表性。
表 1 描述统计量及K-S检验值Table 1. Descriptive statistics and K-S test value月份
month最小值/t·d-1
Min.最大值/t·d-1
Max.平均值/t·d-1
Mean标准差
Std.变异系数
CVK-S检验
P7 0.01 7.00 0.67 0.60 0.89 0.51 8 0.01 9.50 2.15 1.65 0.76 0.42 9 0.02 10.00 1.77 1.21 0.68 0.10(经平方根转换) 10 0.01 8.00 1.09 0.80 0.73 0.80 各月CPUE的K-S检验表明，7月~10月各月的P值分别为0.51、0.42、0.01和0.80，因此9月CPUE数据不服从正态分布的假设(P＜0.05)。经对9月CPUE数据进行对数、平方根、倒数以及Cox-Box等转换，转换后检验结果分别为0、0.10、0、0，只有平方根转换后的数据接受假设(P＞0.05)，因此各月CPUE数据(包括经过9月平方根转换的数据)均符合正态分布的要求(表 1)。
2.2 不同插值方法比较
比较RMS值发现，7月和10月RMS最小值为普通克里格插值法，8月和9月最小值为局部多项式插值方法(表 2)。各月预测CPUE与实际CPUE的变异程度从小到大排序依次为：普通克里格插值法＞反距离权重插值法＞径向基函数插值法＞局部多项式插值法＞全局多项式插值法。
表 2 不同插值方法对柔鱼CPUE模拟建模评价指标Table 2. Simulation modeling evaluation of O.bartramii CPUE by different interpolations插值方法
interpolation月份
month预测 predict 检验 test 样本数
number of sample均方根
RMS样本数
number of sample均方根
RMS反距离权重插值法 IDW 7 83 0.30 28 0.32 8 82 1.18 28 1.56 9 83 0.42 28 0.46 10 67 0.38 24 0.65 径向基函数插值法 RBF 7 83 0.30 28 0.32 8 82 1.18 28 1.56 9 83 0.43 28 0.47 10 67 0.38 24 0.65 全局多项式插值法 GP 7 83 0.32 28 0.27 8 82 1.22 28 1.16 9 83 0.41 28 0.46 10 67 0.42 24 0.73 局部多项式插值法 LP 7 83 0.32 28 0.25 8 82 1.25 28 1.24 9 83 0.43 28 0.45 10 67 0.40 24 0.69 普通克里格插值法 OK 7 83 0.31 28 0.32 8 82 1.18 28 1.56 9 83 0.42 28 0.47 10 67 0.40 24 0.65 2.3 CPUE空间分布预测
以普通克里格插值法进行计算，7月~10月各月柔鱼中心渔场的预测位置分别为151°E~154°E、38°N~40°N，153°E~158°E、41.5°N~45.5°N，157°E~158°E、41.5°N~42.5°N，153°E~158°E、42°N~43.5°N海域(图 2)。这些预测位置与实际作业海域基本上重叠。
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图 2 7月~10月柔鱼预测渔场分布及实际CPUE分布图Figure 2. Actual distribution and prediction of fishing ground for O.bartramii from July to October统计分析可知，7月平均CPUE实际值和预测值分别为0.53 t · d-1和0.51 t · d-1，相对误差为3.4%；8月分别为1.95 t · d-1和1.83 t · d-1，相对误差为6.1%；9月分别为1.28 t · d-1和1.27 t · d-1，相对误差为0.8%；10月分别为0.81 t · d-1和0.76 t ·d-1，相对误差为6.2%。分析认为，各月实际CPUE和预测值的均值相差不大，平均相对误差为4.4%。
3. 分析与讨论
3.1 中心渔场空间分布分析
西北太平洋柔鱼渔场是中国鱿钓船的传统作业海域，以捕捞西部冬春生群为主[13-15]。7月~10月柔鱼中心渔场随着月份的推移，其中心渔场由西南向东北方向迁移，但10月迁移范围不是很明显，这是由于10月柔鱼性腺基本成熟，开始准备南下产卵洄游[2, 4]，从而导致柔鱼在北部海域多逗留一段时间(图 2)。从经度上看，7月中心渔场分布在152°E~154°E，8月主要分布在153°E~158°E，9月分布在158°E附近海域，10月主要分布在154°E、156°E和158°E附近海域。与陈新军等[16]比较，7月中心渔场的位置与1995年~1997年相似，8月~10月基本与1998年~2001年作业渔场重心吻合；从纬度上看，7月中心渔场在39.5°N附近海域，8月分布在41.5°N~45.5°N海域，9月分布在42°N附近海域，10月分布在42°N~43.5°N海域，与1995年~2001年柔鱼渔场重心分布极为相似[16]。该研究说明，利用克里格插值法基于CPUE来研究柔鱼中心渔场空间分布特征是可行的。另外，从图 2中发现10月在150°E~152°E海域有一个小范围的中心渔场，这可能是有新的群体补充到作业渔场[17]，因为柔鱼的产卵时间为12月至翌年6月，主要产卵时间为2月，因此后期不断有小个体柔鱼补充到作业海域[4, 13]。
3.2 渔场空间分布与水温之间的关系分析
表温与柔鱼中心渔场存在密切联系，往往是寻找中心渔场的重要指标之一。渔汛期间，7月~9月随着时间的推移，柔鱼作业渔场的表温逐渐升高，锋区逐渐向北推进。7月中心渔场表温为15~22 ℃，锋区分布在151°E~155°E海域；8月表温为15~23 ℃，锋区分布在152°E~156°E海域；9月表温为15~25 ℃，锋区分布在153°E~160°E；10月上旬表温为13~23 ℃，锋区分布在157°E~160°E海域，中旬以后表温发生骤降，下旬表温低至10 ℃[18]。有研究认为，2009年柔鱼低产是因为传统渔场的冷水涡使得表温以及深层水温偏低而导致，2012年虽然水温偏高，但渔获总量却比往年偏低，为1995年以来最低值[19]，这说明除了水温外可能还有影响柔鱼渔获量的其他重要因素，如厄尔尼诺等大尺度环境变化[20]。陈新军[21]、铃木史纪和赤羽光秋[22]一致认为，柔鱼鱼群的分布密度还与水温的垂直分布关系密切，0~100 m的水温差与CPUE基本上成正比。但在该研究中，没有考虑水温垂直结构的因素。
3.3 不同插值法的比较分析及展望
该文利用地统计学中常用的5种空间插值方法分别以经纬度值为X和Y坐标，CPUE值为Z坐标，模拟了并预测柔鱼中心渔场空间分布，发现5种插值方法中克里格插值法建立的模型最为理想，预测的CPUE和实际值相差不大，这说明克里格插值法可用来分析和预测柔鱼中心渔场的空间分布。今后的研究中，应该进一步结合作业海域的温度、盐度、叶绿素浓度等海洋环境因子以及不同空间结构[23-27]，采用地统计学方法准确地分析柔鱼渔场分布与各环境因子之间的适应性关系，以便更好掌握其渔场分布的空间特征及其规律。
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图 1 本研究中自建数据库及公共数据库的鱼类种数
Figure 1. Number of fish species in self-built database and public database in this study
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图 2 可注释到种的鱼类的候选物种数 (序列相似度≥99%)
Figure 2. Number of candidate species of fish that can be annotated at species level (with≥99% sequence similarity)
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图 3 基于152条线粒体COI序列构建的NJ系统发育树
Figure 3. NJ phylogenetic tree constructed based on 152 mitochondrial COI sequences
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图 5 基于150条线粒体16S序列构建的NJ系统发育树
Figure 5. NJ phylogenetic tree constructed based on 150 mitochondrial 16S sequences
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图 4 基于150条线粒体12S序列构建的NJ系统发育树
Figure 4. NJ phylogenetic tree constructed based on 150 mitochondrial 12S sequences
表 1 公共数据库和自建数据库参考序列简介
Table 1 Summary of metabarcoding reference sequence in public database and self-built database
数据来源
Data source目标基因
Target gene鱼类总数Total number
of fish序列总数
Total number of sequences标注采样地点的序列总数Total number of sequences with sampling location information 标注样品采集于海南的序列总数*
Total number of sequences collected from Hainan标注样品采集于海南的鱼类种数*
Total number of fish collected from Hainan公共数据库
Public databaseCOI 123 2 704 181 8 3 12S 117 648 75 2 1 16S 115 736 59 0 0 自建数据库
Self-built databaseCOI 72 85 85 85 72 12S 72 85 85 85 72 16S 72 85 85 85 72 注：凡是没有明确标注采样地点的序列 (包括海南特有种) 一律不纳入*统计范围。Note: The sequences without sampling location information (including endemic species in Hainan) will not be included in the statistical scope of *. 
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表 2 可注释到种的序列在不同阈值范围内的候选物种数 (
$\overline {\boldsymbol X}{\bf {\pm} } {\bf{SD}} $ )Table 2 Number of candidate species of sequence that can be annotated at species level within different threshold values
序列相似度
Sequence similarity候选物种数 Number of candidate species 基于公共数据库 Based on public database 基于自建数据库 Based on self-built database COI 12S 16S COI 12S 16S 100% 0~9 (1.43±1.64) 0~9 (1.01±1.51) 0~9 (1.00±1.46) 1~2 (1.03±0.18) 1~2 (1.08±.028) 1~2 (1.07±.025) 100%>X≥99% 0~15 (1.04±1.88) 0~7 (0.53±0.98) 0~7 (0.85±1.22) 0~1 (0.13±0.34) 0~1 (0.03±0.18) 0~1 (0.03±0.18) 99%>X≥98% 0~10 (1.07±1.74) 0~11 (0.85±1.42) 0~11 (1.03±1.67) 0~3 (0.19±0.63) 0~3 (0.13±0.37) 0~2 (0.10±0.29) 100%≥X≥99% 0~21 (2.47±3.06) 0~16 (1.53±2.06) 0~15 (1.85±2.27) 1~3 (1.14±0.47) 1~2 (1.10±0.30) 1~2 (1.09±0.28) 100%≥X≥98% 0~31 (3.53±4.31) 0~27 (2.38±2.99) 0~23 (2.88±3.24) 1~4 (1.31±0.98) 1~4 (1.20±0.65) 1~3 (1.16±0.45)
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表 3 两种数据库共有物种的注释结果
Table 3 Annotation results of common fish species in two databases
参考数据库
Reference database目标基因
Target gene共有物种数
Number of shared species低相似度物种数
Number of species with low sequence similarity不确定物种数或错误注释物种数Number of uncertain species or incorrectly annotated species 正确注释物种数
Number of correctly annotated species注释准确率
Annotation accuracy/%公共数据库
Public databaseCOI 56 14 3 39 69.64 12S 52 12 5 35 67.30 16S 50 11 4 35 70 自建数据库
Self-built databaseCOI 56 0 0 56 100 12S 52 0 2 50 96.15 16S 50 0 2 48 96 注：不确定物种是注释到的多个候选物种序列完全相同 (序列相似度=100%)，且皆有历史分布记录，难以排除错误物种；低相似度物种指序列相似度<98%。Note: Uncertain species refer to multiple candidate species whose sequences are identical (sequence similarity=100%) and all of them have historical distribution records in Hainan, so it is difficult to exclude the wrong species. Low similarity species refer to the species whose sequence similarity<98%.
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表 4 两两序列的遗传距离 (K2P)
Table 4 Pairwise distance of genetic divergences (K2P) within various sequences
物种 Species 遗传距离 Pairwise distance COI 12S 16S 南方波鱼 Rasbora steineri (A, B) 0 0 0.007 66 海南马口鱼 Opsariichthys hainanensis、南方马口鱼 O. bidens (A) 0.008 43 — — 蒙古鲌 Culter mongolicus mongolicus、鳊 Parabramis pekinensis 0.006 94 — — 海南鲌 C. recurviceps (A, B) 0 0 0 海南鲌 C. recurviceps (A, B)、红鳍鲌 Chanodichthys erythropterus 0.006 95 0.005 64 — 红鳍鲌 C. erythropterus、海南似鱎 Toxabramis houdemeri 0.009 44 — — 海南拟䱗 Pseudohemiculter hainanensis、䱗 Hemiculter leucisculus 0.006 94 — 0.007 54 鳊 Parabramis pekinensis、三角鲂 Megalobrama terminalis 0.008 87 — — 鳊 P. pekinensis、斯氏鲂 (疑似) M. skolkovii (Suspected) 0.008 87 — — 三角鲂 M. terminalis、斯氏鲂 (疑似) M. skolkovii (Suspected) 0 — — 黄尾鲴 Xenocypris davidi、银鲴 X. macrolepis — 0 0 疏斑小鲃 Puntius paucimaculatus、条纹小鲃 P. semifasciolatus 0.006 95 0 — 细尾白甲鱼 Onychostoma lepturum (A, B) 0 0 0 厚唇光唇鱼 Acrossocheilus paradoxus (A, B) 0 0 0 间䱻 Hemibarbus medius (A, B) 0 0 0 尖鳍鲤 Cyprinus acutidorsalis、鲤 C. carpio 0 0 0.007 54 鳙 Hypophthalmichthys nobilis、鲢 H. molitrix 0.006 94 — — 美丽小条鳅 Micronemacheilus pulcher、齐氏小条鳅 M. zispi 0.006 94 0.005 74 — 泥鳅 Misgurnus anguillicaudatus、大鳞副泥鳅 Paramisgurnus dabryanus 0.008 03 0 0 越南隐鳍鲇 Pterocryptis cochinchinensis (A, B) 0.006 94 — 0 中间黄颡鱼 Pelteobagrus intermedius (A, B) 0 0 0.004 46 黑首阿胡虾虎鱼 Awaous melanocephalus (A, B) 0 0.008 04 0 黑首阿胡虾虎鱼 A. melanocephalus (A, C) 0 0.001 01 0 黑首阿胡虾虎鱼 A. melanocephalus (B, C) 0 0.009 05 0 子陵吻虾虎鱼 Rhinogobius giurinus、吻虾虎鱼sp. 3 Rhinogobius sp. 3 — 0 0 陵水吻虾虎鱼 R. linshuiensis (A, B) 0 0 0 陵水吻虾虎鱼 R. linshuiensis、吻虾虎鱼sp. 2 Rhinogobius sp. 2 0.006 94 0 0 攀鲈 Anabas testudineus (A, B) 0.006 94 0 0 黑体塘鳢 Eleotris melanosoma (A, B) 0 0 0 南方马口鱼 O. bidens (A, B) 0.006 94 0.006 28 — 注：遗传距离在0.01以上的物种均能正确鉴定，故本表只展示遗传距离在0.01以下的物种。—. 遗传距离≥0.01；A、B、C. 种内不同个体。Note: All species with a genetic distance above 0.01 can be correctly identified, so only the results with a genetic distance below 0.01 are shown. —. Genetic distance ≥0.01; A, B, C. Intraspecific samples.
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