Preliminary construction and comparative analysis of environmental DNA metabarcoding reference database of freshwater fishes in Hainan Island
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摘要: 为确定海南岛淡水鱼类环境DNA研究的最优参考数据库及最优目标基因，比较了自建数据库与公共数据库在COI、12S、16S 3个条形码片段上的物种覆盖度、注释准确率及种间差异阈值。结果表明：1) 实地采集鱼类72种，其中有16 (COI)、20 (12S) 和22 (16S) 种鱼类的参考序列为该研究首次提供；2) 仅有68.06% (COI)、66.67% (12S) 和69.44% (16S) 的鱼类在公共数据库比对到高相似度序列；3) 自建数据库对两个数据库共有鱼类的物种注释准确率显著高于公共数据库 (COI: 100% vs 69.64%; 12S: 96.15% vs 67.30%; 16S: 96% vs 70%)；4) COI基因是判别海南岛淡水鱼类的最优目标基因，16S次之；5) 基于K2P遗传距离确定的种间差异阈值分别为0.006 9 (COI)、0.005 6 (12S) 和0.007 5 (16S)，其物种判别准确率为94.96% (COI)、89.05% (12S)和92.70% (16S)。结果表明自建数据库优于公共数据库，建议使用COI、16S作为海南岛淡水鱼类环境DNA宏条形码基因。Abstract: In order to determine the optimal reference database and target genes for environmental DNA study of freshwater fishes in Hainan Island, we compared the species coverage, annotation accuracy and threshold values of interspecific difference of COI, 12S and 16S between the self-built database and the public database. The results show that: 1) Seventy-two fish species were collected, among which 16 (COI), 20 (12S) and 22 (16S) species' reference sequences were provided for the first time. 2) Only 68.06% (COI), 66.67% (12S) and 69.44% (16S) of the fish had high similarity sequence in the public database. 3) The annotation accuracy based on the self-built database was significantly higher than that on the public database (COI: 100% vs 69.64%; 12S: 96.15% vs 67.30%; 16S: 96% vs 70%). 4) COI gene was the best target gene for identifying freshwater fishes in Hainan Island, followed by 16S gene. 5) The threshold values of interspecific difference based on K2P genetic distance were 0.006 9 (COI), 0.005 6 (12S) and 0.007 5 (16S), respectively, and the accuracy rates were 94.96% (COI), 89.05% (12S) and 92.70% (16S), respectively. This study reveals that the sequence annotation accuracy of the self-built database is significantly higher than that of the public database, and it is suggested that COI and 16S should be used as the environmental DNA metabarcoding genes of freshwater fishes in Hainan Island.
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为推进我国水产养殖方式的转变，近年来封闭式工厂化养殖已逐渐成为对虾养殖的重要发展方向，但由于该模式以人工投饵为主，而且养殖密度高、投饵量大，养殖过程中易产生并积累大量的残饵、粪便和生物残体等物质。这些污染物长期处于水体下层，在厌氧的环境中分解产生氨氮、亚硝酸氮、硫化氢、有机酸、胺类、低级脂肪酸和甲烷等对养殖动物有毒的中间产物，成为养殖水体污染的重要内源[1]。如何调控好养殖水质，降低养殖污染，尽可能利用少的空间，获得高产优质的产品，成为对虾养殖中的焦点问题。
一般的理化方法控制水质技术存在种种弊端。从可持续发展的要求来说，利用微生物制剂对养殖水质因子进行生物调控是改善养殖生态环境，减少病害发生及保持水产养殖健康、稳定发展的重要手段。微生物制剂在虾塘方面使用情况的研究进行得较多，但对工厂化养殖水体研究的报道还较少[2-5]。
本实验研究了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheni-formis, BL)、荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulata, RC)和乳酸杆菌(Lactobacillus spp.，LB)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)封闭式高密度养殖水质的调控效果。探索实际生产中对虾养殖水质的调控方法，为进一步研究构建具有南方特色的对虾工厂化养殖模式及对虾工厂化高密度养殖水质调控提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
荚膜红假单胞菌为液体型，活菌数为5×108CFU · mL-1; 地衣芽孢杆菌为粉末型，活菌数为2×109CFU · g-1；乳酸杆菌为液体型，活菌数为2×109CFU · mL-1。3种微生物制剂均由中国水产科学研究院南海水产研究所健康养殖中心提供。凡纳滨对虾初始平均体长3.1 cm，平均体重0.87 g。
1.2 实验系统
实验于2005年8月15日至2005年10月3日在广东省湛江市东海岛国家863海水养殖种子工程南方基地进行。实验海水经二级沙滤后72 h暗处静止备用。实验容器为玻璃钢桶，容积0.3 m3，水深0.65 m，有独立的给排水系统及完善的供气系统，室内自然光照，全程充气。
1.3 实验设计
实验历时45 d。实验前用高锰酸钾消毒玻璃钢桶，养殖用水经二氧化氯消毒剂消毒，其后采用曝气24 h方式去除水体中的余氯。对虾暂养7 d后开始实验。具体实验设计见表 1，各组均设置3个重复。每组随机放养凡纳滨对虾100尾。每日投饵4次，投喂量根据对虾的具体摄食情况而定。实验过程中适量添加淡水补充蒸发水量，其余管理措施各组均一致。每天虹吸残饵和粪便。
表 1 各组施用微生物制剂的情况Table 1 The method of using microbiological preparation in each group组别
group对照组
control group地衣芽孢杆菌+ 荚膜红假单胞菌(G1)
B.licheniformis +R.capsulate地衣芽孢杆菌+ 荚膜红假单胞菌(G2)
B.licheniformis +R.capsulata地衣芽孢杆菌+ 乳酸杆菌(G3)
B.licheniformis +Lactobacillus spp.地衣芽孢杆菌+ 乳酸杆菌(G4)
B.licheniformis +Lactobacillus spp.施用频率
frequency- 1次/7 d 1次/3 d 1次/7 d 1次/3 d 施用配比
ratio- 2：1 2：1 1：2 1：2 施用量
quantity-1.5 g +3 mL 3 g+6 mL 1.5 g+3 mL 3 g+6 mL 总活菌量
total quantity of bacteriums- 4.5×109CFU 9×109CFU 9×109CFU 1.8×1010CFU 1.4 水质分析方法
本实验主要监测水体中硝酸氮(NO3-)、氨氮(NH4+)、亚硝酸氮(NO2-)、化学耗氧量(COD)、活性磷酸盐(PO43-)等各项水质指标的变化情况。水样现场采集后立即进行测定。测定方法参考《海洋监测规范》(BG 17378.4-1998)[6]。
2. 结果
2.1 对水体中NO3-含量的影响
各处理组间NO3-含量除28 d外差异不显著(P>0.05)。实验开始时各组水体中的NO3-含量基本一致；到第7天各处理组NO3-含量均低于对照组，但差异不显著(P>0.05);在第28天低于对照组，且差异显著(P＜0.05)。实验结束时G2组NO3-较高，其余各处理组硝酸氮含量与对照组间有差异但不显著(P>0.05)。各组NO3-含量均在21 d达到峰值，随后略有降低(图 1)。
2.2 对水体中NH4+含量的影响
如图 2所示，仅G1、G3组在28 d略有降低，各处理组NH4+浓度整体呈积累趋势，但均达到良好水质标准，且始终低于对照组。第7~35天各组NH4+含量差异显著(P＜0.05)，第14天时各处理组间差异显著(P＜0.05)。第7天NH4+降低到最低值，其中G1低达0.009 mg · L-1。在第28天水体中NH4+含量急剧增加，对照组上升较快。处理组G1、G2、G3、G4的NH4+的相对降解率[(对照组-处理组) /对照组×100%]分别为62%、60%、65%、49%。实验前21 d，G2组NH4+含量波动较小，相对降低解为79%。
2.3 对水体中NO2-含量的影响
实验开始的1~7 d各处理组水体中NO2-的含量较低，随实验的进行含量有所升高，但始终明显低于对照组。G1组的NO2-含量最低，并一直保持至实验结束(图 3)。处理组G1、G2、G3、G4的相对降解率46%、22%、22%、40%。第7、14、21、和35天时各处理组NO2-含量显著低于对照组(P＜0.05)，在第14天各处理组间差异显著(P＜0.05)。NO2-含量实验中呈先上升后降低的趋势，到第21天对照组NO2-的浓度已达0.725 mg · L-1。
2.4 对水体中PO43-含量的影响
实验期间水中的PO43-含量随养殖时间的推移而增加，各处理方法都不能很好的缓解水体中PO43-的积累。各组PO43-的含量在第7、21、28天有差异，但差异不显著(P>0.05)(表 2)。
表 2 水中活性磷酸盐含量变化Table 2 The change of PO43-in waterMean±SD; mg · L-1 时间/d
time对照
control groupG1 G2 G3 G4 0 0.029±0.002c 0.042±0.003a 0.035±0.002b 0.034±0.000b 0.034±0.001b 7 0.340±0.010c 0.398±0.010a 0.391±0.012ab 0.366±0.016abc 0.372±0.020abc 14 0.677±0.003 0.710±0.018 0.707±0.012 0.711±0.017 0.719±0.019 21 1.008±0.022ia 0.990±0.031ab 0.945±0.021ab 0.920±0.013b 0.926±0.022ab 28 1.464±0.012a 1.424±0.022ab 1.310±0.065b 1.418±0.029ab 1.424±0.014ab 35 1.916±0.036 1.966±0.060 1.833±0.077 1.986±0.088 1.989±0.070 注: 同行数据中上标具不同字母者标记的值表示存在显著差异(P＜0.05)
Note: Different letters in the same rows show significant difference.2.5 对水体中COD的影响
COD随着养殖时间的推移呈上升趋势。各组COD在第21天上升至较高值，但从结果来看，组间无显著差异(P>0.05)，其中G1、G2组COD相对较低(表 3)。
表 3 水中COD的变化Table 3 The change of COD in waterMean±SD; mg · L-1 时间/d
time对照
control groupG1 G2 G3 G4 0 1.097±0.012 1.076±0.048 1.105±0.002 1.104±0.034 1.108±0.028 7 2.113±0.140a 1.921±0.112ab 1.704±0.108b 1.940±0.023ab 2.029±0.191ab 14 2.899±0.248 3.093±0.058 2.908±0.136 2.985±0.136 2.860±0.046 21 3.944±0.431bc 6.384±0.522a 6.618±0.062a 3.218±0.417c 5.873±0.386a 28 19.023±0.510ab 7.584±0.213c 13.185±0.783bc 20.362±6.443ab 24.755±1.456a 35 38.848±0.841a 29.020±4.370bc 32.020±0.470b 29.982±0.524bc 24.438±1.629c 注: 同行数据中上标具不同字母者标记的值表示存在显著差异(P＜0.05)
Note: Different letters in the same rows show significant difference.3. 讨论
3.1 微生物制剂对对虾养殖水体中氮化合物含量的影响
处理组NH4+含量显著低于对照组，均达到良好水质标准(NH4+ ＜0.6 mg · L-1)，表明微生物制剂对养殖水体氨氮的去除有较明显的效果。实验前期0~7 d内氨氮、亚硝酸盐的含量比较低是因为幼虾摄食量低，排泄物较少，这同祁真等[7]的研究结论一致。到第21天各组水质变差，表明水体中有机物积累已超过微生物制剂的处理限度，提示微生物制剂分解有机物的能力有一定的限度，与王彦波等[8]和朱忠琴等[9]的结论一致。
在本实验中，各实验组的NH4+整体呈上升的趋势，这可能是亚硝酸盐的还原产物中含有NH4+ [10]，导致了NH4+的积累。水体NO2-向NH4+和NO3-转化反应中，会表现出较低的NO2-浓度，较高的NO3-浓度。曝气条件下的游离混合微生物可以将氨氧化成硝态氮与亚硝态氮。实验过程中连续充氧，溶解氧的存在，反硝化脱氮会受到影响，也会造成水中硝态氮的积累。
在实验中氮化合物均呈现出随养殖时间积累的趋势。对虾工厂化养殖中，提高了水的利用率，减少了养殖废水的排放; 但投饵量的增加和养殖密度的增大，致使饵料和对虾排泄物等在养殖水体中积累。如果在养殖中后期长期不换水，这些物质溶解在水体中，分解后可产生大量氨氮、亚硝酸氮等有害物质，导致水质氮化合物含量上升。
3.2 微生物制剂对水体中PO43-和COD的影响
本实验中COD和PO43-均较高，呈现出上升趋势。在高密度、高投饵的对虾工厂化养殖水体中，作为主要营养元素的无机磷含量普遍较高，且随时间增加而升高。在水环境中有机物的分解产生磷，浮游植物的生长消耗磷。本实验是室内小水体实验，水中浮游植物含量极少，造成磷酸盐含量升高。邱德全等[11]研究表明在高密度对虾养殖中活性磷的含量都比较高。胡菊香等[12]测定的养殖水中COD也较高，达11~23 mg · L-1。由测定结果来看，实验中各微生物制剂对降低COD的作用没有显著差异，这同马江耀等[13]研究光合细菌、水产EM原液、益生菌(主要为芽孢杆菌Bacillus sp.)对COD无明显效果的结论是一致的。在长期不换水的情况下，水中的残饵、粪便等随养殖时间的推移不断积累，从而造成了各实验组COD和活性磷酸盐随养殖时间推进，不同程度的升高。
3.3 多种微生物的协同作用
光合细菌能够分解小分子有机物，具有降低养殖水体中氨氮、亚硝态氮和COD等有害物质，净化水质等重要作用，它可以促进异养菌的生长。芽孢杆菌能够将大分子有机物分解成小分子有机物和氨基酸等，促进H2S、亚硝酸盐氧化，对水体中氨氮和有机物的分解作用比较明显[14]。乳酸菌能降解亚硝酸盐的含量，但研究较多的是通过饵料添加以中和动物体内的毒性物质，如抑制胺和氨的合成。荚膜红假单胞菌与地衣芽孢杆菌、乳酸杆菌与地衣芽孢杆菌之间在机理上可形成协同作用的关系。多种微生物联合使用，菌群在其生长过程中可直接吸收利用水体中的小分子含氮化合物，迅速分解水中的有机物，同时依靠协同作用，可以降低水中耗氧量、氮化合物含量，调控养殖水质。
实验结果表明，本实验在虾池中添加微生物制剂，可以减少换水量，缓解氨氮、亚硝酸盐积累的问题，减少由换水带入的病菌，从而达到净化水质的目的。其他学者的研究也表明多种微生物能较好地调控养殖水质，如宫兴文等[15]将玉垒菌和光合细菌联用，结果表明可以增加水体溶氧、起到降低NH4+的作用; 李卓佳等[16]研究表明以芽抱杆菌为主体的复合微生物可改善鱼塘水质条件，降低氨氮和亚硝酸盐浓度; 叶乐等[17]将芽孢杆菌和光合细菌用于对虾育苗池可降低H2S、NH4+的含量。
使用不同的微生物制剂，其作用效果各不相同。在实验进行的前21 d，降低水体中氨氮的最佳组为地衣芽孢杆菌+荚膜红假单胞菌3 d使用1次，21 d后地衣芽孢杆菌+乳酸杆菌7 d使用1次的作用较为明显; 降低亚硝酸氮的最佳方案是地衣芽孢杆菌+荚膜红假单胞菌组合7 d使用1次。但各处理组对PO43-均无明显效果，而在降低水体COD的方面地衣芽孢杆菌+荚膜红假单胞菌组合相对较好。在水中施用地衣芽孢杆菌和荚膜红假单胞菌制剂，可以明显降低养殖水体的氨氮等物质的含量。
对水质的调控效果综合分析表明，微生物制剂3 d施用1次与7 d施用1次无显著差异。增加微生物制剂的使用频率并不能更好地改善养殖水质。对微生物制剂的使用间隔时间并非越短越好，微生物制剂的浓度也并非越高越好。从节约养殖成本考虑，使用微生物制剂的时间间隔可在1周以上。粉末状的地衣芽孢杆菌在水中的沉积系数大于液体制剂的乳酸杆菌、荚膜红假单胞菌，前者更适合于净化塘底，而后两者对富营养化养殖池水质的净化更为理想。不同季节、不同品种对虾养殖的环境条件不相同，对微生物制剂的使用方法、比例、用量和施用频率有待进一步研究。
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图 1 本研究中自建数据库及公共数据库的鱼类种数
Figure 1. Number of fish species in self-built database and public database in this study
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图 2 可注释到种的鱼类的候选物种数 (序列相似度≥99%)
Figure 2. Number of candidate species of fish that can be annotated at species level (with≥99% sequence similarity)
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图 3 基于152条线粒体COI序列构建的NJ系统发育树
Figure 3. NJ phylogenetic tree constructed based on 152 mitochondrial COI sequences
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图 5 基于150条线粒体16S序列构建的NJ系统发育树
Figure 5. NJ phylogenetic tree constructed based on 150 mitochondrial 16S sequences
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图 4 基于150条线粒体12S序列构建的NJ系统发育树
Figure 4. NJ phylogenetic tree constructed based on 150 mitochondrial 12S sequences
表 1 公共数据库和自建数据库参考序列简介
Table 1 Summary of metabarcoding reference sequence in public database and self-built database
数据来源
Data source目标基因
Target gene鱼类总数Total number
of fish序列总数
Total number of sequences标注采样地点的序列总数Total number of sequences with sampling location information 标注样品采集于海南的序列总数*
Total number of sequences collected from Hainan标注样品采集于海南的鱼类种数*
Total number of fish collected from Hainan公共数据库
Public databaseCOI 123 2 704 181 8 3 12S 117 648 75 2 1 16S 115 736 59 0 0 自建数据库
Self-built databaseCOI 72 85 85 85 72 12S 72 85 85 85 72 16S 72 85 85 85 72 注：凡是没有明确标注采样地点的序列 (包括海南特有种) 一律不纳入*统计范围。Note: The sequences without sampling location information (including endemic species in Hainan) will not be included in the statistical scope of *. 
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表 2 可注释到种的序列在不同阈值范围内的候选物种数 (
$\overline {\boldsymbol X}{\bf {\pm} } {\bf{SD}} $ )Table 2 Number of candidate species of sequence that can be annotated at species level within different threshold values
序列相似度
Sequence similarity候选物种数 Number of candidate species 基于公共数据库 Based on public database 基于自建数据库 Based on self-built database COI 12S 16S COI 12S 16S 100% 0~9 (1.43±1.64) 0~9 (1.01±1.51) 0~9 (1.00±1.46) 1~2 (1.03±0.18) 1~2 (1.08±.028) 1~2 (1.07±.025) 100%>X≥99% 0~15 (1.04±1.88) 0~7 (0.53±0.98) 0~7 (0.85±1.22) 0~1 (0.13±0.34) 0~1 (0.03±0.18) 0~1 (0.03±0.18) 99%>X≥98% 0~10 (1.07±1.74) 0~11 (0.85±1.42) 0~11 (1.03±1.67) 0~3 (0.19±0.63) 0~3 (0.13±0.37) 0~2 (0.10±0.29) 100%≥X≥99% 0~21 (2.47±3.06) 0~16 (1.53±2.06) 0~15 (1.85±2.27) 1~3 (1.14±0.47) 1~2 (1.10±0.30) 1~2 (1.09±0.28) 100%≥X≥98% 0~31 (3.53±4.31) 0~27 (2.38±2.99) 0~23 (2.88±3.24) 1~4 (1.31±0.98) 1~4 (1.20±0.65) 1~3 (1.16±0.45)
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表 3 两种数据库共有物种的注释结果
Table 3 Annotation results of common fish species in two databases
参考数据库
Reference database目标基因
Target gene共有物种数
Number of shared species低相似度物种数
Number of species with low sequence similarity不确定物种数或错误注释物种数Number of uncertain species or incorrectly annotated species 正确注释物种数
Number of correctly annotated species注释准确率
Annotation accuracy/%公共数据库
Public databaseCOI 56 14 3 39 69.64 12S 52 12 5 35 67.30 16S 50 11 4 35 70 自建数据库
Self-built databaseCOI 56 0 0 56 100 12S 52 0 2 50 96.15 16S 50 0 2 48 96 注：不确定物种是注释到的多个候选物种序列完全相同 (序列相似度=100%)，且皆有历史分布记录，难以排除错误物种；低相似度物种指序列相似度<98%。Note: Uncertain species refer to multiple candidate species whose sequences are identical (sequence similarity=100%) and all of them have historical distribution records in Hainan, so it is difficult to exclude the wrong species. Low similarity species refer to the species whose sequence similarity<98%.
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表 4 两两序列的遗传距离 (K2P)
Table 4 Pairwise distance of genetic divergences (K2P) within various sequences
物种 Species 遗传距离 Pairwise distance COI 12S 16S 南方波鱼 Rasbora steineri (A, B) 0 0 0.007 66 海南马口鱼 Opsariichthys hainanensis、南方马口鱼 O. bidens (A) 0.008 43 — — 蒙古鲌 Culter mongolicus mongolicus、鳊 Parabramis pekinensis 0.006 94 — — 海南鲌 C. recurviceps (A, B) 0 0 0 海南鲌 C. recurviceps (A, B)、红鳍鲌 Chanodichthys erythropterus 0.006 95 0.005 64 — 红鳍鲌 C. erythropterus、海南似鱎 Toxabramis houdemeri 0.009 44 — — 海南拟䱗 Pseudohemiculter hainanensis、䱗 Hemiculter leucisculus 0.006 94 — 0.007 54 鳊 Parabramis pekinensis、三角鲂 Megalobrama terminalis 0.008 87 — — 鳊 P. pekinensis、斯氏鲂 (疑似) M. skolkovii (Suspected) 0.008 87 — — 三角鲂 M. terminalis、斯氏鲂 (疑似) M. skolkovii (Suspected) 0 — — 黄尾鲴 Xenocypris davidi、银鲴 X. macrolepis — 0 0 疏斑小鲃 Puntius paucimaculatus、条纹小鲃 P. semifasciolatus 0.006 95 0 — 细尾白甲鱼 Onychostoma lepturum (A, B) 0 0 0 厚唇光唇鱼 Acrossocheilus paradoxus (A, B) 0 0 0 间䱻 Hemibarbus medius (A, B) 0 0 0 尖鳍鲤 Cyprinus acutidorsalis、鲤 C. carpio 0 0 0.007 54 鳙 Hypophthalmichthys nobilis、鲢 H. molitrix 0.006 94 — — 美丽小条鳅 Micronemacheilus pulcher、齐氏小条鳅 M. zispi 0.006 94 0.005 74 — 泥鳅 Misgurnus anguillicaudatus、大鳞副泥鳅 Paramisgurnus dabryanus 0.008 03 0 0 越南隐鳍鲇 Pterocryptis cochinchinensis (A, B) 0.006 94 — 0 中间黄颡鱼 Pelteobagrus intermedius (A, B) 0 0 0.004 46 黑首阿胡虾虎鱼 Awaous melanocephalus (A, B) 0 0.008 04 0 黑首阿胡虾虎鱼 A. melanocephalus (A, C) 0 0.001 01 0 黑首阿胡虾虎鱼 A. melanocephalus (B, C) 0 0.009 05 0 子陵吻虾虎鱼 Rhinogobius giurinus、吻虾虎鱼sp. 3 Rhinogobius sp. 3 — 0 0 陵水吻虾虎鱼 R. linshuiensis (A, B) 0 0 0 陵水吻虾虎鱼 R. linshuiensis、吻虾虎鱼sp. 2 Rhinogobius sp. 2 0.006 94 0 0 攀鲈 Anabas testudineus (A, B) 0.006 94 0 0 黑体塘鳢 Eleotris melanosoma (A, B) 0 0 0 南方马口鱼 O. bidens (A, B) 0.006 94 0.006 28 — 注：遗传距离在0.01以上的物种均能正确鉴定，故本表只展示遗传距离在0.01以下的物种。—. 遗传距离≥0.01；A、B、C. 种内不同个体。Note: All species with a genetic distance above 0.01 can be correctly identified, so only the results with a genetic distance below 0.01 are shown. —. Genetic distance ≥0.01; A, B, C. Intraspecific samples.
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