Preliminary construction and comparative analysis of environmental DNA metabarcoding reference database of freshwater fishes in Hainan Island
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摘要: 为确定海南岛淡水鱼类环境DNA研究的最优参考数据库及最优目标基因，比较了自建数据库与公共数据库在COI、12S、16S 3个条形码片段上的物种覆盖度、注释准确率及种间差异阈值。结果表明：1) 实地采集鱼类72种，其中有16 (COI)、20 (12S) 和22 (16S) 种鱼类的参考序列为该研究首次提供；2) 仅有68.06% (COI)、66.67% (12S) 和69.44% (16S) 的鱼类在公共数据库比对到高相似度序列；3) 自建数据库对两个数据库共有鱼类的物种注释准确率显著高于公共数据库 (COI: 100% vs 69.64%; 12S: 96.15% vs 67.30%; 16S: 96% vs 70%)；4) COI基因是判别海南岛淡水鱼类的最优目标基因，16S次之；5) 基于K2P遗传距离确定的种间差异阈值分别为0.006 9 (COI)、0.005 6 (12S) 和0.007 5 (16S)，其物种判别准确率为94.96% (COI)、89.05% (12S)和92.70% (16S)。结果表明自建数据库优于公共数据库，建议使用COI、16S作为海南岛淡水鱼类环境DNA宏条形码基因。Abstract: In order to determine the optimal reference database and target genes for environmental DNA study of freshwater fishes in Hainan Island, we compared the species coverage, annotation accuracy and threshold values of interspecific difference of COI, 12S and 16S between the self-built database and the public database. The results show that: 1) Seventy-two fish species were collected, among which 16 (COI), 20 (12S) and 22 (16S) species' reference sequences were provided for the first time. 2) Only 68.06% (COI), 66.67% (12S) and 69.44% (16S) of the fish had high similarity sequence in the public database. 3) The annotation accuracy based on the self-built database was significantly higher than that on the public database (COI: 100% vs 69.64%; 12S: 96.15% vs 67.30%; 16S: 96% vs 70%). 4) COI gene was the best target gene for identifying freshwater fishes in Hainan Island, followed by 16S gene. 5) The threshold values of interspecific difference based on K2P genetic distance were 0.006 9 (COI), 0.005 6 (12S) and 0.007 5 (16S), respectively, and the accuracy rates were 94.96% (COI), 89.05% (12S) and 92.70% (16S), respectively. This study reveals that the sequence annotation accuracy of the self-built database is significantly higher than that of the public database, and it is suggested that COI and 16S should be used as the environmental DNA metabarcoding genes of freshwater fishes in Hainan Island.
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稻渔综合种养模式是在我国传统稻田养鱼的基础上，利用互利共生原则建立起来的多物种共栖、多层次利用的一种新型农业模式[1-2]。这种养殖模式可以减少农药化肥的使用，提高水稻和鱼类品质，实现“一田两用”。金背鲤 (Cyprinus carpio var. Jinbei，暂定名) 因具有独特的“金背金额”外观特征而得名，是湘西地区在长期稻田养鱼过程中形成的鲤鱼地域性品种，其生长速度快于本地鲤，而且肉质厚实、口感鲜美，深受消费者的喜爱。
稻田养殖实现了多物种共栖，既可为养殖鱼类提供天然饵料，且其低养殖密度也可改善水质，促进鱼类生长，并提升鱼类的品质[3-4]。有研究报道，鱼类肠道微生物是动态变化的，其群落结构受养殖模式和水体环境等因素的影响[5]。良好的养殖模式会提升水产动物的营养与风味品质[6]。如张艳霞等[7]研究发现普通网箱养殖的大黄鱼 (Larimichthys crocea) 鱼腥味、哈喇味及青草味较重，而大围网箱养殖的则蘑菇味、脂香味、果香味较强。水产品的风味由气味和滋味两部分组成，它们可以通过复杂的气味协同、累加、掩盖、融合作用以及滋味的变调、对比、消杀、相乘作用相互影响，形成独特的风味[8]。目前有关金背鲤的研究报道非常有限，探讨不同养殖模式下金背鲤肠道菌群和鱼肉风味品质的差异，对下一步金背鲤的繁殖优化具有重要意义。
本文采用高通量测序技术，对稻田和池塘养殖模式下金背鲤肠道微生物进行测序，同时利用液相色谱 (LC) 测定滋味物质、顶空固相微萃取-气相色谱-离子迁移谱联用技术 (HS-SPME-GC-IMS) 测定挥发性风味物质，结合感觉阈值与呈味、气味特征，计算滋味活性值和相对气味活度值，分析不同养殖模式下金背鲤的肠道菌群结构和菌群的差异及主要风味物质特征差异性，以为金背鲤下一步的选育繁殖提供研究方向，并为完善和推广稻田养殖模式提供参考数据。
1. 材料与方法
1.1 试剂
核苷酸标准物质 (纯度≥99%，美国药典 USP 标准品)；24种氨基酸标准品 (17种氨基酸为混合标准品 2.5 μmol·mL−1，其他为分析纯，Sigma)；DNA凝胶回收试剂盒 (Qiagen公司) ；TruSeq文库构建试剂盒、MiSeq测序试剂盒 (美国Illumina公司)；溶菌酶 (美国BBI公司)。
1.2 主要仪器设备
SynergyHTX 多功能酶标仪 (美国 BioTe Tek公司)；Illumina HiSeq测序仪 (美国 Illumina 公司)；1200 高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司)；1100 液相色谱仪 (美国安捷伦公司)；FlavourSpec®风味分析仪 (山东海能科学仪器有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 样品采集与处理
样品采集辰溪县凤凰山农业公司池塘养殖 (FGP) 组和稻田基地养殖 (FGF) 组，同一批次放养、体型大小相似的金背鲤，用冲氧袋运送至实验室，在FGP和FGF组随机各选5尾，在无菌状态下取出整个肠道，采集肠道内容物置于无菌的离心管中，液氮速冻，−80 ℃保存， 用于提取总DNA。另外鱼放入塑料桶中静养 12 h后，各取5尾，剖杀后去鳞、内脏、皮等，手工取全鱼肌肉，搅碎机绞碎成均匀肉糜后分装，−40 ℃冻藏备用。
1.3.2 肠道微生物高通量测序分析
取肠道样本 (–80 ℃ 冰箱冻存) 放置在冰块上解冻，放入研钵后加入液氮研磨至粉末，使用预先冷冻处理的2 mL离心管，称量约100 mg样本进行总DNA提取。然后用乙醇沉淀纯化和1% (质量分数) 琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA浓度和纯度，送百迈客生物公司使用Illumina Hiseq2500高通量测序平台进行测序分析。采用软件USEARCH version 10.0[9]进行OTU分析，Mothurversionv.1.30[10] 进行Alpha指数分析。通过RDP Classifier[11] (置信度阈值为0.8) 进行物种注释，并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成。使用LefSe进行组间差异显著性分析。
1.3.3 核苷酸分析
采用高效液相色谱仪分析核苷酸。样品采用10% (质量分数) 高氯酸溶液提取，提取液调节pH为 6.8，过0.22 µm滤膜上机测定，记录峰面积，响应值均应在仪器检测的线性范围之内，根据标准品的保留时间定性，外标法定量。
1.3.4 游离氨基酸分析
采用Agilent1100 液相色谱仪进行分析。称取0.50 g 样品于10 mL离心管中，加0.01 mol·L−1 盐酸 5 mL ，混匀，沸水浴30 min，离心取上清液，沉淀再加2 mL 0.01 mol·L−1 盐酸悬浮超声5 min后离心，合并上清液，定容至10 mL，过膜上机， 通过安捷伦公司自动在线衍生化方法，比较游离氨基酸标准品的保留时间和峰面积来计算样品中游离氨基酸含量。
1.3.5 滋味活性值 (Taste activity value, TAV) 的计算
TAV 表示各呈味物质的浓度与该物质的阈值之比。 参考徐永霞等[12]的方法，计算不同养殖模式下金背鲤肌肉中各游离氨基酸和核苷酸的 TAV。
1.3.6 挥发性化合物分析
称取2.0 g 金背鲤肌肉样品置于一个20 mL顶空进样瓶中，在60 ℃下孵育15 min，随即用配置CTC多功能自动进样器和注射器的GC-IMS (Flavour Spec®-G.A.S.，德国) 在不分流模式下进行后续分析。
测试条件：采用FS-SE-54-C4-CB-1 (15 m×0.53 mm) 色谱柱，柱温60 ℃，N2为载气，流速150 mL·min−1，IMS温度45 ℃；2 mL·min−1维持至20 min，100 mL·min−1维持至30 min，总运行30 min。采用LAV软件2.2.1 (G.A.S., 德国) 采集和处理GC-IMS数据，NIST和IMS数据库来对挥发物进行定性。
每个样品中加入10 μL 4-甲基-2戊醇 (20×10−6) 内标物计算各挥发性成分的相对含量。
1.3.7 相对气味活度值(Relative odor activityvalue, ROAV)法评价
采用ROAV法 [13]的计算公式如下：
$$ \mathrm{R}\mathrm{O}\mathrm{A}\mathrm{V}_i\approx \frac{{{{C}}_{\rm{ri}}}}{{{C}}_{\rm{rstan}}}\times \frac{T_{\rm{stan}}}{T_{{\rm{i}}}} \times 100{\text{%}} $$ (1) 式中：Cri 为各挥发性组分的相对百分含量 (%，质量比)；Crstan为对样品总体风味贡献最大组分的相对含量 (%，质量比)；Tstan 为对样品总体风味贡献最大组分相对应的感觉阈值 (μg·kg−1)；Ti 为各挥发性组分相对应的感觉阈值 (μg·kg−1)。
1.4 数据处理
通过 Excel 2010 和 SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析，分析结果以“平均值±标准误 (
$ \overline X $ ±SE)”表示。 采用SPSS Statistics 23.0 软件的方差分析 (ANO-VA, P<0.05)；使用Origin 2018软件作微生物菌群箱线图和风味柱形图；微生物菌群与风味物质的相关性采用斯皮尔曼 (Spearman) 相关性系数计算。2. 结果
2.1 不同养殖模式下金背鲤肠道菌群组成分析
2.1.1 OTU聚类及多样性分析
采用韦恩图对不同养殖模式相关特征进行分析，结果见图1 。两组样本共获得787个OTUs，稻田放养FGF组和池塘养殖FGP组共享的特征OTU有469个，占总数的59.6%。在特有的OTU中，FGF组196个(占比24.9%)，高于FGP组 (122个，占比15.5%)，主要分布于变形杆菌门、厚壁菌门和拟杆菌门。其Alpha多样性及差异如图2所示，FGF组的ACE指数、Chao1指数、香农-威纳指数 (Shannon-Wiener) 和辛普森指数 (Simpson) 均高于FGP组，但差异不显著 (P>0.05)。说明稻田放养组在物种丰富度和均匀度上优于池塘养殖组，但无显著性差异。
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图 1 两种养殖模式的金背鲤肠道菌的特征韦恩图Figure 1. Venn diagram of features of intestinal bacteria in C. carpio var. Jinbei of FGF and FGP groups![]()
图 2 两种养殖模式的金背鲤肠道微生物Alpha多样性指数Figure 2. Alpha diversity of intestinal microorganisms in C. carpio var. Jinbei of FGF and FGP groups2.1.2 菌群结构组成差异性分析
对样本中相对丰度大于1%的OTU进行相对丰度和差异分析。如图3 所示，在生物学分类门水平上，两组养殖模式检出4个门水平，分别为变形菌门、梭杆菌门、厚壁菌门和拟杆菌门，相对丰度大于96%，这与黄颡鱼 (Pseudobagrus vachell)[14]、草鱼 (Ctenopharyngodon idella)[15]和罗非鱼 (Oreochromis mossambicus)[16]肠道菌的结果一致。虽然养殖模式未改变优势菌门的种类，但影响了其相对丰度[14]。根据图3 的单因素方差分析可知，除厚壁菌门无显著性差异 (P>0.05) 外，其变形菌门 (45.7% vs. 69.6%)、梭杆菌门 (42.8% vs. 19.5%)和拟杆菌门 (2.27% vs. 0.98%) 的相对丰度均存在显著性差异 (P<0.05)。
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图 3 门水平上的物种相对丰度及差异分析注：*. 差异显著 (P<0.05)。图4同此。Figure 3. Relative abundance and differences of species at phylum levelNote: *. Significant differences (P<0.05). The same case in Fig. 4.属水平上的生物学分类如图4所示。优势菌属结构不变，其丰度值有差异，相对丰度大于1%的属有6个：嗜水气单胞菌 (Aeromonas)、鲸杆菌属 (Cetobacterium)、肠杆菌 (Enterobacteriaceae)、弧菌属 (Vibrio)、乳球菌属 (Lactococcus) 和克雷伯菌属 (Klebsiella)；根据图4的单因素方差分析，除乳球菌属外，其他5个属之间存在显著性差异 (P<0.05)。
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图 4 属水平上的物种相对丰度及差异分析Figure 4. Relative abundance and differences of species at genus level为进一步了解不同养殖模式下金背鲤肠道细菌群落结构的差异性，采用组间LEfSe分析，在不同组间寻找具有统计学差异的Biomarker，更清晰地筛选出了两组中有显著性差异的微生物 (LDA阈值为3)。由图5 可知，在FGF组主要为弧菌、拟杆菌 (Bacteroides)、交替单胞菌 (Alteromonadales) 、 希瓦氏菌 (Shewanella)、嗜冷假单胞菌 (Pseudomonas psychrophila) 和Brevinema；FGP组主要为莫拉克斯氏菌 (Moraxella) 和克雷伯菌属。
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图 5 两种养殖模式的金背鲤肠道微生物菌群的差异性分析Figure 5. Difference analysis of microbial flora in intestine of C. carpio var. Jinbei of FGF and FGP groups2.2 不同养殖模式下金背鲤鱼肌肉中滋味组成分析
2.2.1 核苷酸及其关联产物分析
采用高效液相色谱分析两种养殖模式金背鲤肌肉中的核苷酸及其关联化合物，结果见表1。可以看出，两种养殖模式中ATP及其关联物的含量差异显著 (P<0.05)，FGF组中鲜味肌苷酸IMP含量 (1.676 g·kg−1) 远远高于FGP组 (0.246 g·kg−1)；而呈苦味的次黄嘌呤核苷HXR、次黄嘌呤HX却低于FGP组。其呈味物质含量高但贡献率不一定大，贡献率通常用TAV表示，其值等于样品中非挥发性滋味活性物质的浓度除以该化合物的阈值。当TAV>l时，表示该化合物对整体滋味存在贡献；当TAV<l时，表示该滋味物质对于整体滋味贡献不大[16]。FGF组中肌苷酸的TAV高达 6.705 ，FGP组仅有 0.985；FGF组和FGP组的腺苷酸TVA值分别为0.349和0.291；此外，稻田放养FGF组的K值 (8.805%) 小于池塘养殖FGP组 (21.305%)。由此推测，稻田放养组的金背鲤肉质鲜味和鲜度优于池塘养殖组。
表 1 两种养殖模式的金背鲤肌肉中核苷酸及其关联产物含量及K值 (N=3)Table 1. Nucleotides contents, their related products and K value in muscle of C. carpio var. Jinbei of FGF and FGP groups (N=3)核苷酸种类
Nucleotide阈值[17]
Threshold/
(g·kg−1)呈味特征
Taste characteristics核苷酸含量
Nucleotide content/(g·kg−1)滋味活性值
TAV稻田放养
FGF池塘养殖
FGP稻田放养
FGF池塘养殖
FGP腺苷三磷酸 ATP — — 0.051±0.0066a 0.07686±0.0012b 腺苷二磷酸 ADP — — 0.885±0.0271b 1.935±0.0163a 腺苷酸 AMP 0.50 鲜甜味 0.1747±0.0173a 0.146±0.00026b 0.349 0.291 肌苷酸 IMP 0.25 鲜味 1.676±0.1109a 0.246±0.0055b 6.705 0.985 次黄嘌呤核苷 HXR — 苦味 0.0162±0.0021b 0.0342±0.0017a 次黄嘌呤 HX — 苦味 0.0826±0.0062b 0.193±0.0035a Σ呈味核苷酸 ΣFlavoring nucleotide 2.885±0.17a 2.63±0.028b K值 K value/% 8.805 21.305 注：“—”表示未查到相关阈值和呈味特征；同行中不同字母间存在显著性差异 (P<0.05)；下同。 Note: "—" indicates that the relevant threshold and flavor characteristics are not found; values with different letters within the same line are signifi-cantly different (P<0.05). The same case in the following tables. 2.2.2 游离氨基酸组成分析
从表2可以看出，两种模式共检出23种游离氨基酸，包括8种必需氨基酸、2种半必需氨基酸和13种非必需氨基酸。除羟脯氨酸、肌氨酸、天冬酰胺含量无显著性差异外 (P<0.05)，其余氨基酸均有显著性差异 (P>0.05)。在游离氨基酸、必需氨基酸、半必需氨基酸和非必需氨基酸总量上，两组养殖模式有显著性差异 (P<0.05)。在两组养殖模式中，苦味氨基酸总量占比较高，分别占游离氨基酸总量的50.19%和53.74%，两组间具有显著性差异 (P<0.05)；其次是甜味氨基酸，两组间差异不显著 (P>0.05)，占比分别为32.26%和28.46%；鲜味和芳香族氨基酸比例较低，但差异显著 (P<0.05)，尤其FGF组鲜味氨基酸高于FGP组，分别为2.24%和1.53%。
表 2 两种养殖模式下金背鲤肌肉中游离氨基酸与滋味活性值Table 2. Amino acid and taste activity value in muscle of C. carpio var. Jinbei of FGF and FGP groups氨基酸
Amino acid阈值[18-19]
Threshold/
(g·kg−1)呈味特征[20-22]
Taste characteristics游离氨基酸含量
Free amino acid content/(g·kg−1)滋味活性值
TAV稻田放养
FGF池塘养殖
FGP稻田放养
FGF池塘养殖
FGP苏氨酸 Thr★ 2.60 甜 (+) 0.312±0.0042b 0.362±0.0041a 0.119 0.138 赖氨酸 Lys★ 0.50 甜/苦 (−) 0.254±0.0081b 0.495±0.011a 0.495 0.991 缬氨酸 Val▲ 0.40 甜/苦 (−) 0.297±0.0031b 0.357±0.0023a 0.737 0.888 蛋氨酸 Met▲ 0.30 苦/甜/硫 (−) 0.031±0.00002b 0.0459±0.0002a 0.103 0.153 色氨酸 Trp◆ 0.90 苦/芳香 (−) 0.0284±0.0004a 0.0256±0.0002b 0.035 0.031 苯丙氨酸 Phe◆ 0.90 苦/芳香 (−) 0.091±0.0004b 0.119±0.0027a 0.101 0.13 异亮氨酸 Ile▲ 0.90 苦 (−) 0.0501±0.0006b 0.819±0.0003a 0.055 0.091 亮氨酸 Leu▲ 1.90 苦 (−) 0.0982±0.0026b 0.137±0.00007a 0.051 0.072 Σ必需氨基酸 ΣEAA 1.162±0.019b 1.623±0.021a 1.69 2.49 组氨酸 His▲ 0.20 酸/苦 (−) 1.825±0.002b 2.139±0.016a 9.117 10.64 精氨酸 Arg▲ 0.50 甜/苦 (−) 0.0816±0.0018b 0.181±0.001a 0.161 0.36 Σ半必需氨基酸 ΣSEAA 1.907±0.0038b 2.32±0.017a 9.28 11.00 天冬氨酸 Asp● 0.03 鲜/酸 (+) 0.0281±0.0005a 0.0143±0.0003b 0.923 0.483 谷氨酸 Glu● 0.05 鲜/酸 (+) 0.114±0.0014a 0.0949±0.004b 2.268 1.954 丙氨酸 Ala★ 0.60 鲜/甜 (+) 0.315±0.015a 0.251±0.014b 0.542 0.401 丝氨酸 Ser★ 1.50 甜 (+) 0.131±0.0027b 0.159±0.0001a 0.086 0.106 甘氨酸 Gly★ 1.30 甜 (+) 1.088±0.017a 0.905±0.0018b 0.827 0.697 脯氨酸 Pro★ 3.00 甜/苦 (+) 0.124±0.0016b 0.174±0.012a 0.041 0.055 肌氨酸 Sar — — 0.125±0.012a 0.122±0.001a 酪氨酸 Tyr◆ 0.91 苦/芳香 (−) 0.0693±0.0015b 0.0869±0.001a 0.075 0.095 半胱氨酸 Cys▲ — 苦/甜/硫 (−) 0.639±0.027a 0.550±0.007b Σ非必需氨基酸 ΣNEAA 2.689±0.083a 2.357±0.041b 4.279 2.868 羟脯氨酸 Hyp — — 0.575±0.01a 0.604±0.02a 谷氨酰胺 Gln — — 0.08±0.0019b 0.102±0.0009a 天冬酰胺 Asn — — 0.0031±0.0001a 0.0034±0.0004a 瓜氨酸 Cit — — 0.0357±0.0006b 0.0654±0.0001a 游离氨基酸总量 Total free amino acid 6.361±0.12b 7.137±0.098a ● 鲜味氨基酸总量/占比 Total delicious amino acid/Proportion 0.1425±0.0019a/2.24% 0.109±0.0042b/1.53% ★ 甜味氨基酸总量/占比 Total Sweet amino acid/Proportion 2.052±0.013a/32.26% 2.031±0.033a/28.46% ▲ 苦味氨基酸总量/占比 Total bitter amino acid/Proportion 3.193±0.01b/50.19% 3.836±0.0071a/53.74% ◆ 芳香氨基酸总量/占比 Total aromatic amino acids/Proportion 0.189±0.0021b/2.96% 0.232±0.0039a/3.25% 呈味氨基酸含量高时，是否其贡献率也高，通常还要看滋味活度值的大小，因呈味氨基酸的滋味活度值及其含量高低直接影响鱼肉的滋味[18-21]，FGF组，谷氨酸TVA大于1，高于FGP组，对鲜味贡献大。组氨酸是苦味氨基酸，两组TAV均大于1，但有研究表明，呈味氨基酸对风味的贡献，还需看游离氨基酸与其他风味成分的相互作用[23-24]。所以，结合呈味核苷酸的分析结果，在FGF组中高含量的IMP 能与谷氨酸和天冬氨酸产生协同效应，使产品更具鲜味[25-26] 。
2.3 不同养殖模式下金背鲤鱼肌肉中挥发性化合物组成分析
本研究首次采用HS-GC-IMS技术，在两种养殖模式的金背鲤肌肉中检测到43个峰，40种化合物，其中定性出37种物质，包括10种醛、14种醇、6种酮、3种酸、2种酯、1种芳香烃、1种醚 (表3、图6) 。两种养殖模式的金背鲤肌肉中主要挥发性化合物为醛类 (9.54%~21.42%)、醇类(12.79%~19.19%)、酮类 (55.46%~58.01%) ，与Lu等[27]检测的新鲜鲤肌肉中主要挥发性化合物的结果一致。在10种醛类化合物中，两种养殖模式的金背鲤除丁醛无显著性差异外 (P>0.05)，其余的醛类化合物均存在显著性差异 (P<0.05)；在14种醇类化合物中，1-丁醇、乙醇、芳樟醇、2-甲基-1-丁醇无显著性差异 (P>0.05)，其他的存在显著性差异 (P<0.05)；在6种酮类化合物中均存在显著性差异 (P<0.05)。而且从图4的指纹图谱可以明显看出，两组金背鲤肌肉中挥发性化合物的差异性，FGF组以壬醛、辛醛、庚醛、己醛、戊醛、E-2-己烯醛、苯甲醛、1-庚醇、1-戊烯-3-醇、芳樟醇、3-羟基-2-丁酮、3-辛酮、1-戊烯-3-酮、2-戊酮、甲酸丁酯、乙酸乙酯、β-罗勒烯、二甲基硫醚等化合物为主，FGP组以2-丙酮、2-甲基丙酸、3-甲基丁酸、丙酸、1-辛烯-3-醇、Z-3-己烯醇、1-己醇、1-戊醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、1-丁醇、异丁醇、1-丙醇、2-丙醇、乙醇、2-丁酮、丙酮等为主。
表 3 两组养殖模式的金背鲤肌肉中挥发性化合物相对含量及其ROVA值Table 3. Volatile compounds and relative odor activity value in muscle of C. carpio var. Jinbei of FGF and FGP groups μg·kg−1化合物
Compound阈值[28-29]
Threshold/
(μg·kg−1)气味特征[28]
Odour characteristics稻田放养 FGF 池塘养殖 FGP 相对含量
Relative content相对气味
活度值
ROAV相对含量
Relative content相对气味
活度值
ROAV醛类 Aldehydes 21.42% 9.54% 壬醛 Nonanal 1 脂香、青草味 12.07±2.45a 100 4.384±0.63b 100 辛醛 Octanal 0.7 果香叶 6.32±1.1a 74.80 3.633±0.49b 43.01 庚醛 Heptanal 3 鱼腥、烤鱼、哈喇味 9.67±1.43a 26.71 5.641±1.34b 15.58 E-2-己烯醛 (E)-2-Hexenal 17 青香、脂香、果香味 3.42±1.48a 1.67 2.54±0.26b 1.24 己醛-M Hexanal-M 4.5 鱼腥、青草味 44.35±3.09a 81.56 30.11±4.64b 55.44 己醛-D Hexanal-D 4.5 鱼腥、青草味 31.66±3.85a 58.29 11.60±4.72b 21.36 戊醛 Pentanal 20 果香味 13.1±0.77a 5.43 6.623±0.85b 2.74 2-甲基丁醛2-Methylbutanal 1 果香味 4.08±0.29b 33.8 6.80±1.2a 56.34 3-甲基丁醛 3-Methylbutanal 1.1 巧克力味、腐臭味 2.71±0.14b 20.41 4.84±1.11a 36.45 丁醛 Butanal 1.3 花香、水果香味 5.07±0.72a 32.31 5.66±0.53a 36.07 苯甲醛 Benzaldehyde 350 苦杏仁味 2.6±0.44a 0.062 1.63±0.42b 0.038 醇类 Alcohols 12.79% 19.19% 1-庚醇 1-Heptanol 330 脂味、酒香 2.07±0.33a 0.052 1.35±0.31b 0.034 1-辛烯-3-醇 1-Octen-3-ol 10 蘑菇味、泥土味 3.64±0.54b 3.16 5.80±2.38a 4.81 1-己醇 1-Hexanol 5.6 青草味 3.38±0.54b 5.00 6.22±2.01a 9.20 正戊醇 1-Pentanol 150.2 面包酒香、果香 3.29±0.19b 0.18 5.33±0.3a 0.29 1-戊烯-3-醇 1-Penten-3-ol 358.1 肉香味、鱼腥味 10.68±1.09a 0.25 9.03±2.05b 0.021 1-丁醇 1-Butanol 5 000 温和的杂醇油气息 1.21±0.08a <0.01 1.04±0.07a <0.01 乙醇 Ethanol 100 000 酒味 29.21±6.39a <0.01 26.75±2.58a <0.01 异丙醇 2-Propanol — — 2.85±0.09b 21.92±3.37a 3-甲基-1-丁醇 3-Methyl-1-butanol 250 发酵味、油脂味、 1.26±0.12b 0.04 3.34±0.69a 0.11 正丙醇 1-Propanol 8 505 — 18.04±1.36b 0.018 80.69±4.78a 0.079 异丁醇 Isobutanol 7 000 — 1.26±0.09b <0.01 2.16±0.27a <0.01 Z-3-己烯-1-醇 (Z)-3-Hexen-1-ol 250 — 0.39±0.06b 0.013 1.15±0.04a 0.038 芳樟醇 Linalool 30 000 热带香辛料味 1.96±0.14a <0.01 1.46±0.36a <0.01 2-甲基-1-丁醇 2-Methyl-1-butanol 1 200 — 1.4±0.04a <0.01 1.65±0.25a 0.01 酮类 Ketones 55.46% 58.01% 3-辛酮 3-Octanone 28 酮香、青香 2.35±0.15a 0.70 1.76±0.31b 0.52 3-羟基-2-丁酮 3-Hydroxy-2-butanone 800 脂香味 24.67±1.85a 0.26 16.73±0.34b 0.17 1-戊烯-3-酮 1-Penten-3-one 1 蘑菇味、烤焦味 4.54±1.32a 37.61 1.72±0.16b 14.25 2-戊酮 2-Pentanone 13 800 果味 4.7±0.2a <0.01 4.27±0.42b <0.01 2-丁酮-D 2-Butanone-D 50 000 醚香、果香、樟脑香 18.42±1.83b <0.01 72.65±3.42a 0.012 2-丁酮-M 2-Butanone-M 50 000 醚香、果香、樟脑香 35.87±0.82b <0.01 40.29±1.69a <0.01 2-丙酮 2-Propanone — 青草味 259.14±7.81b 370.14±8.67a 酯类 Esters 2.06% 0.94% 甲酸丁酯 Butyl formate — 2.95±0.45a 1.841±0.11b 乙酸乙酯-M Ethyl Acetate-M 5 醚香、果香 7.65±0.9a 12.68 4.70±0.37b 7.79 乙酸乙酯-D Ethyl Acetate-D 5 醚香、果香 2.36±0.5a 3.91 1.72±0.29a 2.85 酸类 Acids 1.25% 3.36% 2-甲基丙酸 2-Methylpropanoic acid — — 2±0.12a 2.14±0.15a 3-甲基丁酸 3-Methylbutanoic acid — — 0.57±0.07b 1.44±0.12a 丙酸 Propanoic acid — — 5.29±0.75b 25.86±0.47a 烃类 Hydrocarbon 0.77% 0.19% β-罗勒烯 beta-Ocimene 34 脂香、甜味 4.85±0.69a 1.18 1.65±0.77b 0.40 醚类 Ethers 5.47% 1.86% 二甲基硫醚 Dimethyl sulfide 300 果香、青香味 34.46±2.78a 0.95 16.28±0.45b 0.045 其他类 Others 0.78% 6.89% 未鉴定物质1 Unidentified substance 1 — — 2.49±0.34b 7.76±0.33a 未鉴定物质2 Unidentified substance 2 — — 2.04±0.04b 50.80±4.06a 未鉴定物质3 Unidentified substance 3 — — 0.41±0.03b 1.71±0.06a ![]()
图 6 两种养殖模式的金背鲤肌肉中挥发性化合物GC-IMS 指纹图谱Figure 6. GC-IMS gallrey plot of volatile compounds in muscle of C. carpio var. Jinbei of FGF and FGP groups由于挥发性化合物对总体风味的贡献大小取决于挥发性组分在风味体系中的浓度和感觉阈值。根据挥发性成分的相对百分含量和感觉阈值数值，计算得出挥发性风味化合物的ROAV，ROAV≥1的化合物为样品的关键气味成分，0.1≤ROAV<1的化合物对整体风味具有修饰作用。如表3中所示，FGF组中关键气味化合物 (ROAV≥1) 有14种：壬醛、辛醛、庚醛、E-2-己烯醛、己醛、戊醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、丁醛、1-辛烯-3-醇、1-己醇、1-戊烯-3-酮、乙酸乙酯和β-罗勒烯；对整体风味具有修饰作用的化合物 (0.1≤ROAV<1) 有正戊醇、1-戊烯-3-醇、3-辛酮、3-羟基-2-丁酮和二甲基硫醚。FGP组中关键气味化合物 (ROAV≥1) 与FGF组比，缺β-罗勒烯，共13种；而对整体风味具有修饰作用的化合物 (0.1≤ROAV<1) 有正戊醇、3-甲基1-丁醇、3-辛酮、3-羟基-2-丁酮和β-罗勒烯。
2.4 不同养殖模式下金背鲤肠道细菌与肌肉中风味化合物的相关性分析
对主要菌群和风味物质进行相关性分析，结果如图7 所示，肌苷酸、腺苷酸和甜味氨基酸与弧菌属、拟杆菌属、鲸杆菌属呈正相关，与狭义梭状芽孢杆菌1 (Clostridium_sensu_stricto 1)、嗜水气单胞菌、摩根菌属 (Morganella) 和克雷伯菌属呈负相关。芳香氨基酸与弧菌属、拟杆菌属存在极显著负相关性 (0.001≤P<0.01)，与摩根菌属和克雷伯菌属存在极显著正相关性 (0.001≤P<0.01)。苦味和鲜味氨基酸与拟杆菌属呈显著负相关性 (P<0.05)，与克雷伯菌属呈显著正相关性 (P<0.05)。酯类化合物 (COO)、醛类化合物 (CHO)、芳烃类化合物 (AH)、二甲基硫醚 (DS) 与拟杆菌属和弧菌属呈极显著正相关性 (P<0.01)，与克雷伯菌属和摩根菌属呈显著负相关性 (P<0.05)。酮类化合物 (CO)、醇类化合物 (OH)、酸类化合物 (COOH) 与克雷伯菌属和摩根菌属呈显著正相关性 (P<0.05)，与拟杆菌属和弧菌属呈极显著负相关性 (P<0.01)。
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图 7 肠道菌群结构与风味物质的相关性热图分析Figure 7. Correlation heat map analysis of intestinal flora structure and flavor substances3. 讨论
鱼类肠道微生物起源于水体环境和饵料，其原始菌的建立则取决于水体及鱼卵表面的微生物种类[30]，水体和饵料中的微生物通过鱼类的生活和摄食过程进入体内，经过适应后定殖下来，与宿主形成整体。多项研究发现鱼类等水生动物的遗传背景、饲养环境、饲料类型等因素显著影响了其肠道菌群结构[31-32] 。肠道菌群对鱼类的营养循环具有强烈的促进作用，如变形菌门对多糖、蛋白质和其他有机物的降解和发酵极其重要[33]。厚壁菌门中的乳酸菌可以降低肠道的pH，增强水生动物的抗菌能力[34]。气单胞菌可以阻止病原菌在肠道和养殖环境中过多繁殖，从而改善水体环境并提高宿主免疫力 [35]。本研究对两种不同养殖模式下金背鲤的肠道菌群进行分析，发现两组样本虽然在物种丰富度和均匀度上无显著性差异，但其特征OTU值和菌落结构组成存在一定的差异，稻田放养组主要为弧菌、拟杆菌、交替单胞菌、希瓦氏菌和嗜冷假单胞菌，而池塘养殖组主要为莫拉克斯氏菌和克雷伯菌属。微生物与风味物质的相关性分析结果显示，弧菌、拟杆菌、克雷白氏杆菌和摩根菌属与不同的风味物质呈显著相关性 (0.01≤P<0.05 ＆ 0.001≤P<0.01 ＆ P<0.001)，从而引起鱼肉风味的差异，这可能是由于稻田环境给金背鲤提供了更加丰富多样的饵料，以及水质环境和微生物等综合作用的结果。
核苷酸和游离氨基酸是水产品中重要的滋味物质[36]，鲜味肌苷酸IMP具有较强的鲜味，腺苷酸AMP具有鲜甜味[37-38]，且两种核苷酸还能与谷氨酸和天冬氨酸产生协同效应，使产品更具鲜味[23-24]，其典型的滋味组分类型差异和共有组分含量差异会导致水产品不同的特征滋味[39]。本研究中两组养殖模式金背鲤的呈味核苷酸组成差异明显，稻田放养组呈味核苷酸IMP高达1.676 g·kg−1，TAV为 6.705，远超池塘养殖组；游离氨基酸组成也存在显著性差异 (P<0.05)，稻田放养组的谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等关键氨基酸明显高于池塘养殖组。这可能是因为与单一的池塘养殖相比，稻田放养的鱼类活动频率增加，为鱼类提供了更多、更丰富的浮游生物和昆虫类天然饵料，增加了其高蛋白质营养补给，从而提升了鱼肉的鲜味。有大量研究数据验证了这一说法，如吕敏等[40]报道稻田养殖黄颡鱼肌肉中的风味氨基酸含量显著高于池塘养殖组，段青源等[41]报道野生大黄鱼的呈味氨基酸优于人工养殖的。
水产品中挥发性化合物组成是一个极其复杂的体系，由各种风味前体物质经过酶解、自氧化和其他许多复杂的化学反应而生成[42]。通常认为醛类化合物主要来自于氨基酸的降解、多不饱和脂肪酸的氧化以及微生物的作用，其阈值较低，且具有气味加和作用 [43] 。两组养殖模式的醛类化合物的ROAV除苯甲醛小于0.1外，其余醛类的相对气味活度值均大于1，对整体风味具有重要贡献。如己醛、庚醛、壬醛、戊醛等化合物已被证明与鲜鱼的香味相关联[44]，而且在新鲜鱼中，己醛通常产生一种原生味、鲜香的特征香味[45]；E-2-己烯醛呈现出果香、青香和明显的脂香气[42]；2-甲基丁醛、3-甲基丁醛在鳕 (Gadus) 中呈现特殊气味[46]。醇类化合物是由脂肪酸的氧化分解或羰基化合物还原产生的[47] ，ROAV≥1的1-辛烯-3-醇类似蘑菇气味，是水生动物肌肉中重要的风味物质[48]。酮类化合物是由氨基酸降解、不饱和脂肪酸热氧化降解和微生物作用产生 [49]，有研究报道酮类对消减腥味有一定的贡献[50]。如1-戊烯-3-酮呈蘑菇味、烤焦味，ROAV远远大于1，对整体风味贡献较大。酯类化合物中的乙酸乙酯具有果香味。因为水产品风味相当复杂，并且能够与许多其他物质产生重叠的风味效应[51]。因此，人们闻到的鱼味有可能是几类化合物协同作用的结果。
据报道，鱼类肠道中某些微生物具有营养功能，可以生成维生素和挥发性脂肪酸，如Sugita等[52]发现淡水鱼类鲤、金鱼 (Carassias auratas)、罗非鱼等肠道菌群中有产生维生素 B12 的菌株；李学梅[53]发现鲤体内脂肪积累与肠道中的拟杆菌呈负相关，与厚壁菌呈正相关；Yang等[54]研究发现草鱼肠道菌群显著富集与脂质代谢相关的基因 (甘油脂代谢、脂肪酸代谢、脂质生物合成)。部分鱼类肠道微生物的新陈代谢产物包括胞外酶，可以对蛋白质和脂肪等起促进作用，如Asfie等[55]发现在牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 仔稚鱼消化道中分离出的弧菌有生产蛋白酶的能力。
本研究结果显示，不同养殖模式下，弧菌、拟杆菌、克雷白氏杆菌和摩根菌属与呈味核苷酸、游离氨基酸和挥发性化合物呈极显著相关性 (P<0.01)，推断养殖模式会影响鱼的肠道微生物及其风味品质，且稻田放养组的金背鲤品质特征优于池塘养殖组。
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图 1 本研究中自建数据库及公共数据库的鱼类种数
Figure 1. Number of fish species in self-built database and public database in this study
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图 2 可注释到种的鱼类的候选物种数 (序列相似度≥99%)
Figure 2. Number of candidate species of fish that can be annotated at species level (with≥99% sequence similarity)
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图 3 基于152条线粒体COI序列构建的NJ系统发育树
Figure 3. NJ phylogenetic tree constructed based on 152 mitochondrial COI sequences
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图 5 基于150条线粒体16S序列构建的NJ系统发育树
Figure 5. NJ phylogenetic tree constructed based on 150 mitochondrial 16S sequences
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图 4 基于150条线粒体12S序列构建的NJ系统发育树
Figure 4. NJ phylogenetic tree constructed based on 150 mitochondrial 12S sequences
表 1 公共数据库和自建数据库参考序列简介
Table 1 Summary of metabarcoding reference sequence in public database and self-built database
数据来源
Data source目标基因
Target gene鱼类总数Total number
of fish序列总数
Total number of sequences标注采样地点的序列总数Total number of sequences with sampling location information 标注样品采集于海南的序列总数*
Total number of sequences collected from Hainan标注样品采集于海南的鱼类种数*
Total number of fish collected from Hainan公共数据库
Public databaseCOI 123 2 704 181 8 3 12S 117 648 75 2 1 16S 115 736 59 0 0 自建数据库
Self-built databaseCOI 72 85 85 85 72 12S 72 85 85 85 72 16S 72 85 85 85 72 注：凡是没有明确标注采样地点的序列 (包括海南特有种) 一律不纳入*统计范围。Note: The sequences without sampling location information (including endemic species in Hainan) will not be included in the statistical scope of *. 
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表 2 可注释到种的序列在不同阈值范围内的候选物种数 (
$\overline {\boldsymbol X}{\bf {\pm} } {\bf{SD}} $ )Table 2 Number of candidate species of sequence that can be annotated at species level within different threshold values
序列相似度
Sequence similarity候选物种数 Number of candidate species 基于公共数据库 Based on public database 基于自建数据库 Based on self-built database COI 12S 16S COI 12S 16S 100% 0~9 (1.43±1.64) 0~9 (1.01±1.51) 0~9 (1.00±1.46) 1~2 (1.03±0.18) 1~2 (1.08±.028) 1~2 (1.07±.025) 100%>X≥99% 0~15 (1.04±1.88) 0~7 (0.53±0.98) 0~7 (0.85±1.22) 0~1 (0.13±0.34) 0~1 (0.03±0.18) 0~1 (0.03±0.18) 99%>X≥98% 0~10 (1.07±1.74) 0~11 (0.85±1.42) 0~11 (1.03±1.67) 0~3 (0.19±0.63) 0~3 (0.13±0.37) 0~2 (0.10±0.29) 100%≥X≥99% 0~21 (2.47±3.06) 0~16 (1.53±2.06) 0~15 (1.85±2.27) 1~3 (1.14±0.47) 1~2 (1.10±0.30) 1~2 (1.09±0.28) 100%≥X≥98% 0~31 (3.53±4.31) 0~27 (2.38±2.99) 0~23 (2.88±3.24) 1~4 (1.31±0.98) 1~4 (1.20±0.65) 1~3 (1.16±0.45)
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表 3 两种数据库共有物种的注释结果
Table 3 Annotation results of common fish species in two databases
参考数据库
Reference database目标基因
Target gene共有物种数
Number of shared species低相似度物种数
Number of species with low sequence similarity不确定物种数或错误注释物种数Number of uncertain species or incorrectly annotated species 正确注释物种数
Number of correctly annotated species注释准确率
Annotation accuracy/%公共数据库
Public databaseCOI 56 14 3 39 69.64 12S 52 12 5 35 67.30 16S 50 11 4 35 70 自建数据库
Self-built databaseCOI 56 0 0 56 100 12S 52 0 2 50 96.15 16S 50 0 2 48 96 注：不确定物种是注释到的多个候选物种序列完全相同 (序列相似度=100%)，且皆有历史分布记录，难以排除错误物种；低相似度物种指序列相似度<98%。Note: Uncertain species refer to multiple candidate species whose sequences are identical (sequence similarity=100%) and all of them have historical distribution records in Hainan, so it is difficult to exclude the wrong species. Low similarity species refer to the species whose sequence similarity<98%.
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表 4 两两序列的遗传距离 (K2P)
Table 4 Pairwise distance of genetic divergences (K2P) within various sequences
物种 Species 遗传距离 Pairwise distance COI 12S 16S 南方波鱼 Rasbora steineri (A, B) 0 0 0.007 66 海南马口鱼 Opsariichthys hainanensis、南方马口鱼 O. bidens (A) 0.008 43 — — 蒙古鲌 Culter mongolicus mongolicus、鳊 Parabramis pekinensis 0.006 94 — — 海南鲌 C. recurviceps (A, B) 0 0 0 海南鲌 C. recurviceps (A, B)、红鳍鲌 Chanodichthys erythropterus 0.006 95 0.005 64 — 红鳍鲌 C. erythropterus、海南似鱎 Toxabramis houdemeri 0.009 44 — — 海南拟䱗 Pseudohemiculter hainanensis、䱗 Hemiculter leucisculus 0.006 94 — 0.007 54 鳊 Parabramis pekinensis、三角鲂 Megalobrama terminalis 0.008 87 — — 鳊 P. pekinensis、斯氏鲂 (疑似) M. skolkovii (Suspected) 0.008 87 — — 三角鲂 M. terminalis、斯氏鲂 (疑似) M. skolkovii (Suspected) 0 — — 黄尾鲴 Xenocypris davidi、银鲴 X. macrolepis — 0 0 疏斑小鲃 Puntius paucimaculatus、条纹小鲃 P. semifasciolatus 0.006 95 0 — 细尾白甲鱼 Onychostoma lepturum (A, B) 0 0 0 厚唇光唇鱼 Acrossocheilus paradoxus (A, B) 0 0 0 间䱻 Hemibarbus medius (A, B) 0 0 0 尖鳍鲤 Cyprinus acutidorsalis、鲤 C. carpio 0 0 0.007 54 鳙 Hypophthalmichthys nobilis、鲢 H. molitrix 0.006 94 — — 美丽小条鳅 Micronemacheilus pulcher、齐氏小条鳅 M. zispi 0.006 94 0.005 74 — 泥鳅 Misgurnus anguillicaudatus、大鳞副泥鳅 Paramisgurnus dabryanus 0.008 03 0 0 越南隐鳍鲇 Pterocryptis cochinchinensis (A, B) 0.006 94 — 0 中间黄颡鱼 Pelteobagrus intermedius (A, B) 0 0 0.004 46 黑首阿胡虾虎鱼 Awaous melanocephalus (A, B) 0 0.008 04 0 黑首阿胡虾虎鱼 A. melanocephalus (A, C) 0 0.001 01 0 黑首阿胡虾虎鱼 A. melanocephalus (B, C) 0 0.009 05 0 子陵吻虾虎鱼 Rhinogobius giurinus、吻虾虎鱼sp. 3 Rhinogobius sp. 3 — 0 0 陵水吻虾虎鱼 R. linshuiensis (A, B) 0 0 0 陵水吻虾虎鱼 R. linshuiensis、吻虾虎鱼sp. 2 Rhinogobius sp. 2 0.006 94 0 0 攀鲈 Anabas testudineus (A, B) 0.006 94 0 0 黑体塘鳢 Eleotris melanosoma (A, B) 0 0 0 南方马口鱼 O. bidens (A, B) 0.006 94 0.006 28 — 注：遗传距离在0.01以上的物种均能正确鉴定，故本表只展示遗传距离在0.01以下的物种。—. 遗传距离≥0.01；A、B、C. 种内不同个体。Note: All species with a genetic distance above 0.01 can be correctly identified, so only the results with a genetic distance below 0.01 are shown. —. Genetic distance ≥0.01; A, B, C. Intraspecific samples.
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期刊类型引用(1)
1. 刘尊雷，杨林林，金艳，袁兴伟，张翼，张辉，许敏，程家骅，严利平. 基于CMSY和BSM的东海区重要渔业种类资源评估. 中国水产科学. 2023(06): 735-752 . 
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