Preliminary construction and comparative analysis of environmental DNA metabarcoding reference database of freshwater fishes in Hainan Island
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摘要: 为确定海南岛淡水鱼类环境DNA研究的最优参考数据库及最优目标基因，比较了自建数据库与公共数据库在COI、12S、16S 3个条形码片段上的物种覆盖度、注释准确率及种间差异阈值。结果表明：1) 实地采集鱼类72种，其中有16 (COI)、20 (12S) 和22 (16S) 种鱼类的参考序列为该研究首次提供；2) 仅有68.06% (COI)、66.67% (12S) 和69.44% (16S) 的鱼类在公共数据库比对到高相似度序列；3) 自建数据库对两个数据库共有鱼类的物种注释准确率显著高于公共数据库 (COI: 100% vs 69.64%; 12S: 96.15% vs 67.30%; 16S: 96% vs 70%)；4) COI基因是判别海南岛淡水鱼类的最优目标基因，16S次之；5) 基于K2P遗传距离确定的种间差异阈值分别为0.006 9 (COI)、0.005 6 (12S) 和0.007 5 (16S)，其物种判别准确率为94.96% (COI)、89.05% (12S)和92.70% (16S)。结果表明自建数据库优于公共数据库，建议使用COI、16S作为海南岛淡水鱼类环境DNA宏条形码基因。Abstract: In order to determine the optimal reference database and target genes for environmental DNA study of freshwater fishes in Hainan Island, we compared the species coverage, annotation accuracy and threshold values of interspecific difference of COI, 12S and 16S between the self-built database and the public database. The results show that: 1) Seventy-two fish species were collected, among which 16 (COI), 20 (12S) and 22 (16S) species' reference sequences were provided for the first time. 2) Only 68.06% (COI), 66.67% (12S) and 69.44% (16S) of the fish had high similarity sequence in the public database. 3) The annotation accuracy based on the self-built database was significantly higher than that on the public database (COI: 100% vs 69.64%; 12S: 96.15% vs 67.30%; 16S: 96% vs 70%). 4) COI gene was the best target gene for identifying freshwater fishes in Hainan Island, followed by 16S gene. 5) The threshold values of interspecific difference based on K2P genetic distance were 0.006 9 (COI), 0.005 6 (12S) and 0.007 5 (16S), respectively, and the accuracy rates were 94.96% (COI), 89.05% (12S) and 92.70% (16S), respectively. This study reveals that the sequence annotation accuracy of the self-built database is significantly higher than that of the public database, and it is suggested that COI and 16S should be used as the environmental DNA metabarcoding genes of freshwater fishes in Hainan Island.
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鳞鳍叫姑鱼 (Johnius distinctus) 和皮氏叫姑鱼 (J. belangerii) 同为石首鱼科、叫姑鱼属常见的小型经济鱼类，两者生活史特征相似，个体大小较为接近 (体长200 mm以下)，是生活在泥沙底质的中下层暖水性鱼类，以底栖生物为主要食物来源，夏季为其主要产卵繁殖期；捕捞方式以底拖网为主，春、夏季为其主要捕捞季节[1-5]。
目前国内外关于这2种鱼类生态学和生活史特征的研究较少，主要集中在群落结构中的重要性指数[6-9]、资源密度[10-12]以及食性分析[13]、耳石形态[14]、环境污染对其生活史的影响[15-16]等方面。近年来对皮氏叫姑鱼的基础生物学研究较多，如马鞍列岛皮氏叫姑鱼体长分布、雌雄比例、性腺成熟度随月份的变化[17]，流沙湾皮氏叫姑鱼肥满度随月份的变化[18]，厦门海域皮氏叫姑鱼优势体长组的季节变化、雌雄比例与体长的关系、繁殖特性及生长死亡参数[19]等。然而，对鳞鳍叫姑鱼的研究匮乏，仅见部分学者对台湾省西南海域、闽江口、北部湾鳞鳍叫姑鱼体长-体质量关系的研究[20-22]。
皮氏叫姑鱼和鳞鳍叫姑鱼是我国东海、南海等多个海域生物群落中的重要鱼类，也是生态系统中的饵料生物[6-9,23-29]，在生态学研究上具有重要意义。近年来，由于捕捞强度加大、环境污染和气候变化等因素的综合影响，浙江南部近海等海域传统经济性鱼类资源出现显著衰退，皮氏叫姑鱼和鳞鳍叫姑鱼等小型鱼类在生态系统中的重要性上升，在渔业中的占比逐渐增加[17,30]。目前我国大力推进海洋经济种类的科学管理，研究分析这2种叫姑鱼的生物学特征对理解东海生态系统和促进其渔业科学管理有重要意义。本文研究了浙江南部近海皮氏叫姑鱼和鳞鳍叫姑鱼的生长、年龄、性成熟和死亡等生物学特征，以期为浙江南部近海渔业资源的合理开发和科学管理提供基础参考资料。
1. 材料与方法
1.1 数据来源
2种叫姑鱼的生物学样品于2015—2018年采自浙江南部温州、台州近海水域(图1)，各季度调查中每个站点随机选取30尾留样，不足30尾的全取。在实验室对采集的样品按照《海洋调查规范》(海洋生物调查GB/T 12763.6—2007) 进行生物学测定，测定内容包括体长、体质量、性别、性腺发育程度等，其中体长精确到1 mm，体质量精确到0.1 g。13个航次调查共采集鳞鳍叫姑鱼1 020尾，皮氏叫姑鱼874尾 (表1)。
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图 1 2015—2018年浙江南部近海渔业资源调查站位图Figure 1. Sampling stations of fishery resources survey in offshore waters of southern Zhejiang Province from 2015 to 2018表 1 2015—2018年浙江南部近海鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼的样本数量Table 1. Sample size of J. distinctus and J. belangerii in offshore waters of southern Zhejiang Province from 2015 to 2018种类
Species年份
Year春季
Spring夏季
Summer秋季
Autumn冬季
Winter总计
Total鳞鳍叫姑鱼
J. distinctus2015 — — 125 — 125 2016 54 123 160 1 338 2017 123 21 162 1 307 2018 120 28 99 3 250 总计 Total 297 172 546 5 1 020 皮氏叫姑鱼
J. belangerii2015 — — 69 — 69 2016 124 54 124 17 319 2017 37 33 150 35 255 2018 21 13 101 96 231 总计 Total 182 100 444 148 874 1.2 体长和体质量关系
鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼的体长和体质量关系用幂指数公式[31]描述：
$$W = {{a}}{L^b}$$ (1) 对数化后为：
$$ \mathrm{l}\mathrm{o}\mathrm{g}W=\mathrm{l}\mathrm{o}\mathrm{g}a+b\mathrm{l}\mathrm{o}\mathrm{g}L $$ (2) 式中：W为体质量；L为体长；a为生长条件因子；b为异速生长因子。为探讨体长和体质量关系的年份、季节和性别异质性，本文使用广义线性模型 (Generalized linear model, GLM) 和21个线性混合效应模型 (Linear mixed effects model, LMEM) 分别研究鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼的体长-体质量关系。21个LMEM模型在截距loga和斜率b上分别加入季节、年份和性别随机效应 (表2)。因鳞鳍叫姑鱼冬季样本数量较少 (仅5尾)，不具有代表性，因此分析季节异质性时，只有春、夏、秋3季。赤池信息量准则 (Akaike information criterion, AIC )和均方根误差 (Root mean square error, RMSE) 最小的模型为最优模型。
表 2 浙江南部近海鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼体长体质量关系的拟合模型及其评价指标Table 2. Candidate models to describe length-mass relationship for J. distinctus and J. belangerii in offshore waters of southern Zhejiang Province and their AIC and RMSE values模型编号
Model ID截距的随机效应
Random effects for loga斜率的随机效应
Random effects for b鳞鳍叫姑鱼 J. distinctus 皮氏叫姑鱼 J. belangerii 赤池信息量准则
AIC均方根误差
RMSE/%赤池信息量准则
AIC均方根误差
RMSE/%1 — — −759 16.60 −298 20.33 2 性别 — −757 16.53 −302 20.34 3 — 性别 −757 16.52 −301 20.34 4 性别 性别 −795 16.85 −298 20.33 5 年份 — −777 16.33 −298 20.26 6 — 年份 −775 16.36 −298 20.26 7 年份 年份 −812 15.96 −294 20.23 8 季节 — −848 15.75 −320 19.91 9 — 季节 −848 15.75 −320 19.91 10 季节 季节 −844 15.75 −317 19.86 11 性别、年份 — −775 16.34 −301 20.34 12 — 性别、年份 −773 16.32 −301 20.33 13 性别、年份 性别、年份 −813 16.24 −295 20.27 14 季节、性别 — −846 16.20 −322 19.54 15 — 季节、性别 −846 16.20 −322 19.54 16 季节、性别 季节、性别 −841 16.19 −316 19.63 17 季节、年份 — −860 15.58 −318 19.91 18 — 季节、年份 −860 15.58 −318 19.91 19 季节、年份 季节、年份 −868 15.39 −312 19.80 20 季节、性别、年份 — −858 15.42 −320 19.61 21 — 季节、性别、年份 −858 15.43 −320 19.61 22 季节、性别、年份 季节、性别、年份 −862 15.48 −311 19.59 1.3 年龄和体长关系
使用von Bertalanffy生长方程[32]分别描述鳞鳍叫姑鱼与皮氏叫姑鱼的年龄-体长关系：
$$ {L}_{t}={L}_{\infty }\left[1-{\mathrm{e}}^{-k\left(t-{t}_{_0}\right)}\right] $$ (3) 式中：L∞为极限体长；t0为理论生长起始年龄；k为趋近极限体长的相对速率。分别按10 mm体长分组，采用FiSAT II 软件中的ELEFAN I方法[33]进行体长频率分析，估算L∞和k。使用Pauly经验公式[34]估算t0：
$$ \mathrm{l}\mathrm{n}\left(-{t}_{0}\right)=-0.392\;2-0.275\;2\mathrm{l}\mathrm{n}{L}_{\infty }-1.038\mathrm{l}\mathrm{n}k $$ (4) 1.4 性成熟特征
分别将鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼繁殖期性腺成熟度Ⅲ期及以上个体视为性成熟个体，采用Logistic曲线[35]，拟合性成熟概率与体长关系：
$${\pi _L} \sim {\rm{Bernoulli}}\left( {{P_L}} \right)\;\;\;{\rm{logit}}\left( {{P_L}} \right) = r\left( {L - {L_{50\% }}} \right)$$ (5) 式中：π为个体性成熟与否；Bernoulli为伯努利分布；P为性成熟概率；r为瞬时性成熟速度；L50%为初次性成熟体长 (50%性成熟体长)。
1.5 死亡特征
使用FiSAT II 软件中的长度变换渔获曲线法，分别估算鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼的总死亡系数 (Z)。使用Pauly经验公式[34]估算自然死亡系数 (M)：
$$ \mathrm{l}\mathrm{n}M=0.006\;6-0.279\mathrm{l}\mathrm{n}{L}_{\infty }+0.456\;3\mathrm{l}\mathrm{n}k+0.463\;4\mathrm{l}\mathrm{n}T $$ (6) 式中：T为鱼类栖息海域年平均温度；根据调查海域表层温度数据，对鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼渔获物加权求平均温度，分别为21.1和19.7 ℃。根据式 (7) 和 (8) 计算捕捞死亡系数 (F) 和开发率 (E)：
$$ Z=F+M $$ (7) $$ E=F/Z $$ (8) 2. 结果
2.1 体长体质量组成
浙江南部近海鳞鳍叫姑鱼样品体长介于32.9~209.0 mm，平均为 (115.7±27.1) mm，优势体长组为88.6~142.8 mm，占样本总数的72.5% (图2-a)。皮氏叫姑鱼样品体长介于43.0~202.0 mm，平均为 (136.3±36.5) mm，优势体长组为99.9~172.8 mm，占样本总数的67.0% (图2-b)。鳞鳍叫姑鱼体质量介于0.4~188.2 g，平均为 (37.8±24.7) g，优势体质量组为13.2~62.6 g，占样本总数的82.8% (图2-c)；皮氏叫姑鱼体质量介于1.5~183.9 g，平均为 (63.8±39.3) g，优势体质量组为24.5~103.1 g，占样本总数的59.4% (图2-d)。
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图 2 2015—2018年浙江南部近海鳞鳍叫姑鱼 (a、c) 和皮氏叫姑鱼 (b、d) 的体长与体质量分布Figure 2. Distribution of body length and body mass of J. distinctus (a, c) and J. belangerii (b, d) in offshore waters of southern Zhejiang Province from 2015 to 20182.2 体长与体质量关系
浙江南部近海鳞鳍叫姑鱼的体长与体质量关系为W=4.02×10−6L3.34 (R2=0.98)。模型中，截距loga和斜率b上同时加入季节和年份随机效应的LMEM模型AIC和RMSE最小，拟合效果最优 (表2，模型19)。该模型中，a和b的固定效应分别为8.57×10−6和3.18，加入随机效应后a和b分别介于1.51×10−6~4.09×10−6和3.06~3.33。该模型结果显示，在浙江南部近海鳞鳍叫姑鱼体长-体质量关系中，季节影响最显著，年份次之，性别无显著影响。在体长-体质量关系曲线中，体长大于150.0 mm后，相同体长情况下，鳞鳍叫姑鱼的增重率春季最快，秋季次之，夏季最慢；2016年最快，2015年最慢 (图3-a1、3-a2)。
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图 3 浙江南部近海鳞鳍叫姑鱼 (a) 和皮氏叫姑鱼 (b) 的体长-体质量关系异质性Figure 3. Variations of length-mass relationship of J. distinctus (a) and J. belangerii (b) in offshore waters of southern Zhejiang Province皮氏叫姑鱼体长与体质量关系为W=5.63×10−6L3.26 (R2=0.98)。模型中，截距loga加入季节和性别随机效应的LMEM模型AIC和RMSE最小，拟合效果最优 (表2，模型14)。该模型中，a和b的固定效应值分别为6.65×10−6和3.22，加入随机效应后a介于6.19×10−6~6.91×10−6。该模型结果显示，在浙江南部近海皮氏叫姑鱼体长-体质量关系中，季节影响最显著，性别影响较小。在体长-体质量关系曲线中，相同体长情况下，皮氏叫姑鱼的增重率春季最快，其次为秋季和夏季，冬季最慢，雌性的增重率快于雄性 (图3-b1、图3-b2)。总体上，在相同体长下，鳞鳍叫姑鱼的增重率快于皮氏叫姑鱼 (图4)。
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图 4 2015—2018年浙江南部近海鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼的体长-体质量关系Figure 4. Length-mass relationship of J. distinctus and J. belangerii in offshore waters of southern Zhejiang Province from 2015 to 20182.3 生长参数
估算得出鳞鳍叫姑鱼的L∞=216.83 mm，k=0.84；皮氏叫姑鱼的L∞=207.38 mm，k=0.63。由Pauly经验公式估算理论生长起始年龄，鳞鳍叫姑鱼t0=−0.18，皮氏叫姑鱼t0=−0.25。根据求得的生长参数，绘制了2种叫姑鱼的von Bertalanffy生长曲线 (图5)。
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图 5 2015—2018年浙江南部近海鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼生长曲线Figure 5. Growth curve of J. distinctus and J. belangerii in offshore waters of southern Zhejiang Province from 2015 to 20182.4 性腺与性成熟特征
864尾鳞鳍叫姑鱼有性腺数据，雄雌比为1∶0.38，性腺成熟度Ⅱ期的占53.4%，Ⅲ期及以上的仅24.2%。782尾皮氏叫姑鱼有性腺数据，雄雌比为1∶0.91，性腺成熟度为Ⅱ期的占47.4%，Ⅲ期及以上的仅占39.1% (图6)。鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼初次性成熟体长分别为133.1和128.9 mm，两者体长和性成熟概率关系 (图7) 为：
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图 6 2015—2018年浙江南部近海鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼性腺成熟度的季节组成Figure 6. Seasonal variation of maturity of J. distinctus and J. belangerii in offshore waters of southern Zhejiang Province from 2015 to 2018![]()
图 7 2015—2018年浙江南部近海鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼体长和性成熟概率关系灰色横线为50%的性成熟概率。Figure 7. Relationship between length and maturity rate of J. distinctus and J. belangerii in offshore waters of southern Zhejiang Province from 2015 to 2018The grey horizonal line represents the 50% maturity rate.$$ {\text{鳞鳍叫姑鱼：}}P=\dfrac{1}{1+{{\rm{e}}}^{-0.054\left(L-133.1\right)}} $$ (9) $$ {\text{皮氏叫姑鱼：}} P=\dfrac{1}{1+{{\rm{e}}}^{-0.045\left(L-128.9\right)}} $$ (10) 2.5 死亡特征
根据长度变换渔获曲线法估算出鳞鳍叫姑鱼总死亡系数Z=3.80 (95%置信区间为3.09~4.50，R2=0.91)，拟合的直线方程为
$ \mathrm{ln}\left(\dfrac{N}{\mathrm{d}t}\right)=-3.80t+10.60 $ ；皮氏叫姑鱼Z=1.88 (95%置信区间为1.54~2.22，R2=0.96)，拟合的直线方程为$ \mathrm{ln}\left(\dfrac{N}{{\rm{d}}t}\right)=-1.88t+9.94 $ (图8)。鳞鳍叫姑鱼的M=1.53，皮氏叫姑鱼的M=1.24，E分别为0.60和0.34。![]()
图 8 根据体长变换渔获曲线估算鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼总死亡系数Figure 8. Estimation of total morality based on length-converted catch curve of J. distinctus and J. belangerii3. 讨论
3.1 体长-体质量关系分析
本研究通过比较2种叫姑鱼的各项生物学特征，发现栖息地环境和繁殖模式相似的鳞鳍叫姑鱼与皮氏叫姑鱼的体质量差异较大，相同体长条件下，鳞鳍叫姑鱼体质量更大。在鱼类体长-体质量关系方程中，生长条件因子a和异速生长因子b共同决定了鱼类的生长模式。其中a与鱼类饵料基础、栖息地水文条件等环境因素有关[32]，a越大，说明该水域生活环境条件越利于鱼类生长。
本研究通过线性混合效应模型得到的皮氏叫姑鱼a介于6.19×10−6~6.91×10−6，相对其他区域的研究结果较小 (表3)，这可能由环境因素影响所致。马鞍列岛、闽江口、厦门海域、珠江口、北部湾等处于岛礁区，有大型河流入海、影响较大的河口、湾区域及低纬度区域，水文条件、饵料生物数量等生长栖息环境均优于浙江南部近海[6,36]。b一般介于2.5~3.5，可以判断鱼类是否为等速生长[37]。本研究得到的皮氏叫姑鱼b为3.22，说明浙江南部近海皮氏叫姑鱼为正异速生长，除了珠江口与台湾西南部外，与其他研究结果一致，数值和福建沿岸较为接近。种群差异可能是导致不同海域皮式叫姑鱼生长模式出现差异的原因[17]，浙江南部近海皮氏叫姑鱼和福建沿岸皮氏叫姑鱼同属东海南部种群，b较为接近。对鳞鳍叫姑鱼生物学、体长-体质量关系的研究相对较少，且各研究结果差异较大，本研究得到的a、b与台湾西南部[20] (W=3.95×10−5L2.88)、闽江口[21] (W=1.33×10−5L3.1)、北部湾[22] (W=1.75×10−5L3.03)均不同，相关的地域差异还需要更多的研究和分析。
表 3 不同海域皮氏叫姑鱼生长、死亡参数Table 3. Growth and mortality parameters of J. belangerii in different China's seas生长条件
因子
a异速生长
因子
b极限
体长
L∞相对
生长速率
k生长起始
年龄
t0总死亡
系数
Z自然死亡
系数
M捕捞死亡
系数
F开发率
E马鞍列岛[17] Ma'an Archipelago 1.35×10–5 3.09 福建沿岸[38] Fujian Coastal 8.47×10–6 3.2 200 0.56 –0.29# 2.01 0.63 1.38 0.69 台湾西南部*[20] Southwestern Coast of Taiwan 4.44×10–5 2.83 闽江口*[21] Min River Estuary 1.02×10–5 3.16 厦门海域[19] Xiamen Sea Area 3.44×10–5 3.08 220.5 0.56 –0.61 2.25 0.63 1.62 0.72 厦门湾[28] Xiamen Bay 1.14×10–5 3.11 210 0.81 –0.19 1.09 0.61 0.48 0.44 流沙湾*[18] Liusha Gulf 9.02×10–6 3.17 珠江口[23] Pearl River Estuary 3.44×10–5 2.88 北部湾*[22] Beibu Gulf 1.67×10–5 3.05 注：*. 原文计算单位为cm，本研究进行对比时a已按mm换算；#. 原文中无t0，本研究根据公式 (4) 计算得出t0。 Note: *. The unit in the references is cm, and the value of a has been converted in this study; #. There is no t0 estimate in the references, and t0 was estimated according to Formula (4) in this study. 以往对鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼体长-体质量关系的研究侧重于整体分析，忽略了其生长过程中的时空差异，本研究通过线性混合效应模型发现2种叫姑鱼体长-体质量关系有显著的季节差异，增重率均在春季最高。皮氏叫姑鱼产卵期为4—7月[5,23]，本研究春季航次为5月，此时性腺成熟度较高，增重率最高；秋季为两者索饵洄游期，摄食利用率较高；夏季为产卵后期，群体中有大量幼体补充，整体生长速度较快，增重率也较高。而皮氏叫姑鱼越冬洄游阶段，摄食较少，增重率较低。为全面了解鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼生长特征的时空差异，今后应从生长空间差异性、幼鱼成鱼差异性入手，进一步分析研究这2种叫姑鱼体长-体质量关系。
3.2 生长死亡参数分析
鱼类生长、死亡参数是分析其群体资源动态的重要指标。通过比较发现，浙江南部近海与其他海域皮氏叫姑鱼的极限体长、生长速率、理论生长起始年龄、总死亡系数等参数有一定差异 (表3)，极限体长与厦门湾接近，总死亡系数介于厦门湾和厦门海域、福建沿岸之间，自然死亡系数大于其他海域，显示了不同海域栖息地环境和种群结构的差异性。捕捞死亡系数和开发率反映了各海域皮氏叫姑鱼捕捞强度的差异，总体来看，厦门湾、福建沿岸和厦门海域开发强度接近，而浙江南部近海开发强度最低。Gullan[39]提出开发率为0.5是渔业资源群体开发的临界点，本研究中皮氏叫姑鱼开发率E低于该临界点，即资源未过度开发，因此该渔业目前可在实施养护和管理的基础上适度开发。
3.3 性成熟特征分析
浙江南部近海皮氏叫姑鱼雄雌比 (1∶0.91) 与厦门海域[19] (1∶0.87) 接近，与马鞍列岛[17] (0.59∶1)、胶州湾[40] (1∶0.7) 的差异较大，这需要结合营养条件、生长、年龄、季节、捕捞方式等进一步研究。50%性成熟体长值在渔业管理中有着广泛应用，是确定开捕体长的重要生物学参考点[41-43]，本研究中由繁殖期皮氏叫姑鱼样本求得的50%性成熟体长为128.9 mm，接近于马鞍列岛[17] (雌性124.8 mm，雄性136.4 mm)。因本研究未考虑性腺成熟度、性比的季节和体长组的差异，今后需从不同海域环境条件、繁殖特征等进行更多相关研究。
对不同海域皮氏叫姑鱼与鳞鳍叫姑鱼的生活史特征参数进行直接对比，会受样本数量、采样时间跨度、站点数量、样本捕捞获取方式等因素的影响。如台湾西南海域鳞鳍叫姑鱼样本数量为151尾，本研究为1 020尾；皮氏叫姑鱼流沙湾样本数为541尾，本研究为874尾；采样时间跨度马鞍列岛皮氏叫姑鱼为1年月度调查，厦门海域和福建沿岸为2年4个季度调查航次，北部湾为2年8个季度调查航次，本研究为4年13个季度调查航次；厦门海域皮氏叫姑鱼设7个调查站位，福建沿岸为24个，本研究为42个。因此，相较而言，本研究的时空跨度更长，样本采集更多，有助于获得准确性和精确性更高的研究结果。此外，马鞍列岛皮氏叫姑鱼样本用底拖网和刺网获取，珠江口用尖尾罟网，本研究用底拖网，不同网具的选择性差异可能导致样本对种群结构的代表性不同。
4. 结论
本文分析了浙江南部近海鳞鳍叫姑鱼和皮氏叫姑鱼的生长、繁殖和死亡等生物学特征。总体上，2种叫姑鱼的生物学特征既有相似性又有差异性。2种鱼的体长-体质量关系均有显著季节差异，春季增重率最高，均为异速生长鱼类，性腺成熟度组成均以Ⅱ期为主；相同体长下，鳞鳍叫姑鱼体质量更大；相同年龄下，鳞鳍叫姑鱼体长更大，生长速度也更快；鳞鳍叫姑鱼初次性成熟的体长更大，自然死亡系数更高，开发率高于皮氏叫姑鱼。本研究结果为该海域2种鱼类的生物学研究提供了基础资料，并可为其资源评估和渔业可持续开发利用提供参考依据。
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图 1 本研究中自建数据库及公共数据库的鱼类种数
Figure 1. Number of fish species in self-built database and public database in this study
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图 2 可注释到种的鱼类的候选物种数 (序列相似度≥99%)
Figure 2. Number of candidate species of fish that can be annotated at species level (with≥99% sequence similarity)
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图 3 基于152条线粒体COI序列构建的NJ系统发育树
Figure 3. NJ phylogenetic tree constructed based on 152 mitochondrial COI sequences
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图 5 基于150条线粒体16S序列构建的NJ系统发育树
Figure 5. NJ phylogenetic tree constructed based on 150 mitochondrial 16S sequences
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图 4 基于150条线粒体12S序列构建的NJ系统发育树
Figure 4. NJ phylogenetic tree constructed based on 150 mitochondrial 12S sequences
表 1 公共数据库和自建数据库参考序列简介
Table 1 Summary of metabarcoding reference sequence in public database and self-built database
数据来源
Data source目标基因
Target gene鱼类总数Total number
of fish序列总数
Total number of sequences标注采样地点的序列总数Total number of sequences with sampling location information 标注样品采集于海南的序列总数*
Total number of sequences collected from Hainan标注样品采集于海南的鱼类种数*
Total number of fish collected from Hainan公共数据库
Public databaseCOI 123 2 704 181 8 3 12S 117 648 75 2 1 16S 115 736 59 0 0 自建数据库
Self-built databaseCOI 72 85 85 85 72 12S 72 85 85 85 72 16S 72 85 85 85 72 注：凡是没有明确标注采样地点的序列 (包括海南特有种) 一律不纳入*统计范围。Note: The sequences without sampling location information (including endemic species in Hainan) will not be included in the statistical scope of *. 
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表 2 可注释到种的序列在不同阈值范围内的候选物种数 (
$\overline {\boldsymbol X}{\bf {\pm} } {\bf{SD}} $ )Table 2 Number of candidate species of sequence that can be annotated at species level within different threshold values
序列相似度
Sequence similarity候选物种数 Number of candidate species 基于公共数据库 Based on public database 基于自建数据库 Based on self-built database COI 12S 16S COI 12S 16S 100% 0~9 (1.43±1.64) 0~9 (1.01±1.51) 0~9 (1.00±1.46) 1~2 (1.03±0.18) 1~2 (1.08±.028) 1~2 (1.07±.025) 100%>X≥99% 0~15 (1.04±1.88) 0~7 (0.53±0.98) 0~7 (0.85±1.22) 0~1 (0.13±0.34) 0~1 (0.03±0.18) 0~1 (0.03±0.18) 99%>X≥98% 0~10 (1.07±1.74) 0~11 (0.85±1.42) 0~11 (1.03±1.67) 0~3 (0.19±0.63) 0~3 (0.13±0.37) 0~2 (0.10±0.29) 100%≥X≥99% 0~21 (2.47±3.06) 0~16 (1.53±2.06) 0~15 (1.85±2.27) 1~3 (1.14±0.47) 1~2 (1.10±0.30) 1~2 (1.09±0.28) 100%≥X≥98% 0~31 (3.53±4.31) 0~27 (2.38±2.99) 0~23 (2.88±3.24) 1~4 (1.31±0.98) 1~4 (1.20±0.65) 1~3 (1.16±0.45)
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表 3 两种数据库共有物种的注释结果
Table 3 Annotation results of common fish species in two databases
参考数据库
Reference database目标基因
Target gene共有物种数
Number of shared species低相似度物种数
Number of species with low sequence similarity不确定物种数或错误注释物种数Number of uncertain species or incorrectly annotated species 正确注释物种数
Number of correctly annotated species注释准确率
Annotation accuracy/%公共数据库
Public databaseCOI 56 14 3 39 69.64 12S 52 12 5 35 67.30 16S 50 11 4 35 70 自建数据库
Self-built databaseCOI 56 0 0 56 100 12S 52 0 2 50 96.15 16S 50 0 2 48 96 注：不确定物种是注释到的多个候选物种序列完全相同 (序列相似度=100%)，且皆有历史分布记录，难以排除错误物种；低相似度物种指序列相似度<98%。Note: Uncertain species refer to multiple candidate species whose sequences are identical (sequence similarity=100%) and all of them have historical distribution records in Hainan, so it is difficult to exclude the wrong species. Low similarity species refer to the species whose sequence similarity<98%.
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表 4 两两序列的遗传距离 (K2P)
Table 4 Pairwise distance of genetic divergences (K2P) within various sequences
物种 Species 遗传距离 Pairwise distance COI 12S 16S 南方波鱼 Rasbora steineri (A, B) 0 0 0.007 66 海南马口鱼 Opsariichthys hainanensis、南方马口鱼 O. bidens (A) 0.008 43 — — 蒙古鲌 Culter mongolicus mongolicus、鳊 Parabramis pekinensis 0.006 94 — — 海南鲌 C. recurviceps (A, B) 0 0 0 海南鲌 C. recurviceps (A, B)、红鳍鲌 Chanodichthys erythropterus 0.006 95 0.005 64 — 红鳍鲌 C. erythropterus、海南似鱎 Toxabramis houdemeri 0.009 44 — — 海南拟䱗 Pseudohemiculter hainanensis、䱗 Hemiculter leucisculus 0.006 94 — 0.007 54 鳊 Parabramis pekinensis、三角鲂 Megalobrama terminalis 0.008 87 — — 鳊 P. pekinensis、斯氏鲂 (疑似) M. skolkovii (Suspected) 0.008 87 — — 三角鲂 M. terminalis、斯氏鲂 (疑似) M. skolkovii (Suspected) 0 — — 黄尾鲴 Xenocypris davidi、银鲴 X. macrolepis — 0 0 疏斑小鲃 Puntius paucimaculatus、条纹小鲃 P. semifasciolatus 0.006 95 0 — 细尾白甲鱼 Onychostoma lepturum (A, B) 0 0 0 厚唇光唇鱼 Acrossocheilus paradoxus (A, B) 0 0 0 间䱻 Hemibarbus medius (A, B) 0 0 0 尖鳍鲤 Cyprinus acutidorsalis、鲤 C. carpio 0 0 0.007 54 鳙 Hypophthalmichthys nobilis、鲢 H. molitrix 0.006 94 — — 美丽小条鳅 Micronemacheilus pulcher、齐氏小条鳅 M. zispi 0.006 94 0.005 74 — 泥鳅 Misgurnus anguillicaudatus、大鳞副泥鳅 Paramisgurnus dabryanus 0.008 03 0 0 越南隐鳍鲇 Pterocryptis cochinchinensis (A, B) 0.006 94 — 0 中间黄颡鱼 Pelteobagrus intermedius (A, B) 0 0 0.004 46 黑首阿胡虾虎鱼 Awaous melanocephalus (A, B) 0 0.008 04 0 黑首阿胡虾虎鱼 A. melanocephalus (A, C) 0 0.001 01 0 黑首阿胡虾虎鱼 A. melanocephalus (B, C) 0 0.009 05 0 子陵吻虾虎鱼 Rhinogobius giurinus、吻虾虎鱼sp. 3 Rhinogobius sp. 3 — 0 0 陵水吻虾虎鱼 R. linshuiensis (A, B) 0 0 0 陵水吻虾虎鱼 R. linshuiensis、吻虾虎鱼sp. 2 Rhinogobius sp. 2 0.006 94 0 0 攀鲈 Anabas testudineus (A, B) 0.006 94 0 0 黑体塘鳢 Eleotris melanosoma (A, B) 0 0 0 南方马口鱼 O. bidens (A, B) 0.006 94 0.006 28 — 注：遗传距离在0.01以上的物种均能正确鉴定，故本表只展示遗传距离在0.01以下的物种。—. 遗传距离≥0.01；A、B、C. 种内不同个体。Note: All species with a genetic distance above 0.01 can be correctly identified, so only the results with a genetic distance below 0.01 are shown. —. Genetic distance ≥0.01; A, B, C. Intraspecific samples.
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