Metabolic engineering synthesis of neoxanthin, a key precursor of fucoxanthin
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摘要: 岩藻黄质是海洋藻类中常见的叶黄素之一，尤其在褐藻中含量较高，具有抑菌、抗炎、抗肥胖、抗糖尿病、抗肿瘤、调节肠道菌群和抗器官纤维化等多种生理活性。新黄质是岩藻黄质的可能前体物质，首次在大肠杆菌 (Escherichia coli) 中构建新黄质合成途径，首先构建了pTrc99a-crtEBIYZ质粒，该质粒携带5个来自于菠萝泛菌 (Pantoea ananatis) 的基因crtE、crtB、crtI、crtY和crtZ，编码的蛋白分别是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素环化酶和β-胡萝卜素羟化酶。将该质粒转入大肠杆菌中，得到了产玉米黄质的工程菌E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ，玉米黄质产量 (细胞干质量，下同) 为0.70 mg·g−1。以产玉米黄质工程菌为宿主，将来自三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum) 的ZEP3基因去信号肽之后转入，得到产紫黄质的工程菌E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3。在紫黄质工程菌E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3的基础上转入新黄质合酶基因NSY，成功获得了产新黄质的工程菌E. coli BL21 NEO，新黄质产量为99.27 μg·g−1 ，紫黄质产量为150.30 μg·g−1，玉米黄质产量为119.77 μg·g−1。Abstract: Fucoxanthin is one of the common luteins in marine algae, especially in brown algae, which has antibacterial, anti-inflammatory, anti-obesity, anti-diabetes, anti-cancer, regulating intestinal flora, anti-organ fibrosis and other physiological activities. Neoxanthin is a possible precursor of fucoxanthin. In this paper, we constructed a neoxanthin synthesis pathway in Escherichia coli for the first time and the plasmid pTrc99a-crtEBIYZ, which carries five genes (crtE, crtB, crtI, crtY and crtZ) from Pantoea ananatis, and codes for proteins (geranylgeranyl pyrophosphate synthase, phytoene synthase, lycopene cyclase and β-carotene hydroxylase). We transferred the plasmid into E. coli, and obtained the zeaxanthin-producing E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ. The yield of zeaxanthin (dry cell mass) was 0.70 mg·g−1. We obtained E. coli pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3 strain by transferring ZEP3 gene from Phaeodactylum tricornutum without signal peptide, and obtained E. coli BL21 NEO successfully by transferring the neoxanthin synthase gene NSY into E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3. The concentrations of neoxanthin, violaxanthin and zeaxanthin were 99.27, 150.30 and 119.77 μg·g−1 dry cell mass, respectively.
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Keywords:
- Escherichia coli /
- Fucoxanthin /
- Zeaxanthin /
- Violaxanthin /
- Neoxanthin /
- Metabolic engineering
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黑素皮质素受体(melanocortin receptors, mcrs)是黑素细胞皮质激素(melanocortin, mc)参与多种调控和发挥功能的重要受体[1-2]。该受体家族属于G蛋白偶联受体 (GPCR)，含有7个跨膜α螺旋结构[3]，该家族包含了5种类型的基因，分别是MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R[4]。Mcrs功能多样，在色素沉淀[5]、脂质和能量代谢[6]、摄食[7-9]等方面均起到重要作用。MC5R参与脂质代谢和外分泌功能等过程，MC5R基因在人体内普遍存在，在卵巢、乳腺、肾脏、脂肪细胞、肝脏和骨髓中均有表达，但MC5R在皮肤中的表达最高[10-11]。研究表明MC5R对肌肉和肝脏中的脂质代谢有调节作用[12]，在人的皮脂细胞开始分化的时候表达较高，因此也可以作为人类皮脂细胞分化的标志性物质[13]。MC5R不仅调节脂质代谢，而且对分泌腺的分泌也有调节作用，例如泪腺和皮脂腺等[14]。目前对MC5R的研究，多集中于人 (Homo sapiens)、猪 (Sus domesticus)[15]、家鼠 (Mus musculus)[16]等物种。在鱼类中尚未发现有关mc5r对摄食影响的报道。
在自然环境中，鱼类经常会受到饥饿胁迫，恢复摄食后其摄食量增加，会出现饲料转化效率升高、生长速率显著加快等现象，此现象被称为生长补偿[17-19]。另外，哺乳动物基因组中存在5%~10%的生物钟基因，该类基因能够表现出以24 h为一个周期的昼夜节律性波动[20]，与细胞增殖、凋亡、免疫应答、激素分泌和能量代谢等生命活动均有密切联系[21]。但生物钟基因在鱼类中的研究较少，研究与生长相关基因的昼夜节律变化，可以指导正确的投喂，改善鱼体的生长状态。
光倒刺鲃 (Spinibarbus hollandi) 属于硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、倒刺鲃属 ，主要分布于我国长江、珠江等水系，其生长快且肉质鲜美，是我国重要的经济鱼类[22]。目前有关光倒刺鲃的研究主要集中于繁殖生物学[23]、遗传多样性[24]等方面，有关光倒刺鲃生长、摄食相关基因的功能研究并不多见，笔者已对光倒刺鲃的mc4r和mstn基因进行了克隆，并且对这2个基因与生长性状关联的SNPs筛选和验证进行了初步研究，筛选出与生长显著关联的SNPs[25-26]，同为Mcrs家族的mc5r基因是否具有相似的功能？本研究对光倒刺鲃mc5r基因进行了同源克隆和功能分析，以期为光倒刺鲃的摄食、生长发育及相关研究提供基础资料和新的思路。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验用光倒刺鲃120尾，体质量为 (37.45±7.23) g，取自广东省韶关市水产研究所。在广州大学水产养殖室饲养。每天8:00对光倒刺鲃进行足量投喂，适应环境2周后进行实验。
1.2 实验设计
1.2.1 昼夜节律实验
把光倒刺鲃分为2组 (投喂组和非投喂组)，每组50尾，置于100 cm×60 cm×60 cm的水族箱中，水温22~26 ℃，实验时间为2017年10月，实验用鱼置于室内自然光照和自然昼夜节律下，水面光照强度为0~430 lx。非投喂组不喂食，投喂组每天8:00投喂。两组分别在实验开始第1天的9:00、11:00、15:00、20:00以及第2天的8:00 (投喂后)对光倒刺鲃进行取样，每次6尾，使用MS-222麻醉后迅速解剖，将脑组织保存于RNA keeper溶液中，取样时间点参考赵建等[27]对鱼类昼夜摄食节律的研究确定。
1.2.2 饥饿再投喂实验
把光倒刺鲃分为对照组、饥饿4 d组、饥饿7 d组、饥饿7 d再投喂4 d组和饥饿7 d再投喂7 d组，每组10尾，置于100 cm×60 cm×60 cm的水族箱中，每天8:00进行投喂，水温22~26 ℃，实验时间为2017年10月，实验用鱼置于室内自然光照和自然昼夜节律下，水面光照强度为0~430 lx。在实验结束当天11:00取脑组织，每次取6尾用于RNA表达量检测。
1.3 克隆与测序
取25 mg光倒刺鲃肌肉组织，使用生物工程 (上海)股份有限公司 (简称生工)的Ezup柱式DNA试剂盒提取DNA，使用Prep柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA。根据金线鲃 (Sinocyclocheilus grahami)的编码区序列设计引物F1和R1 (表1)，以光倒刺鲃基因组DNA为模板进行扩增，根据扩增出的光倒刺鲃mc5r中间序列片段，正向和反向各设计3条特异性染色体步移引物，分别为F2、F3、F4、R2、R3和R4，与Genome Walking Kit (TaKaRa)试剂盒提供的兼并引物进行热不对称PCR反应，反应步骤和反应条件按试剂盒说明书进行操作，送生工测序，得到正向和反向序列片段。
表 1 光倒刺鲃mc5r基因克隆和表达分析的引物Table 1. Primers for cloning and expression analysis of mc5r gene in S. hollandi引物
primer引物序列 (5'−3')
primer sequence用途
application产物大小/bp
product sizeF1 AAGATGCCCTGTCTACCAACCC 克隆 850 R1 GGTCCAAATCCCTCCAATGATG 克隆 F2 GGAGGGAAAACAACAGCACAAGC 克隆 750 R2 GGTCCAAATCCCTCCAATGATG 克隆 800 F3 GGTTAAAGATGCCCAACCCACC 克隆 800 R3 GGATGAGGTGGAGAAAGAACGG 克隆 800 F4 CTACTTACTCACCAACCGCCAG 克隆 850 R4 CTTTGATCGACAGCGTGTCCC 克隆 900 F AACACTTCAGAGGCCACCCTG qRT-PCR 150 R TGAGCTGCTCGCATGCTTTGG qRT-PCR 18sF TGATCGTCTTCGAGCCTCTGAC 内参 150 18sR AATTCTTGGACCGGCGCAAGAC 内参 1.4 光倒刺鲃mc5r基因序列拼接与分析
将测序获得的中间、正向和反向序列片段用SeqMan软件进行拼接比对，把拼接所获得的序列在NCBI的Blast工具上进行比对，确认所获得序列是mc5r基因序列，用软件DNAMAN对光倒刺鲃mc5r序列的CDs区进行翻译，得到其编码的氨基酸序列。利用在线工具TMHMM Service v.2.0对光倒刺鲃mc5r的跨膜蛋白进行预测。使用MEGA 5.0软件中Neighbor-Joining法构建系统发育树，Bootstrap method检测重复1 000次。
1.5 光倒刺鲃mc5r基因的组织表达分析
取5尾光倒刺鲃的15个组织：大脑、小脑、中脑、间脑、延脑、肝、肾、肠、胃、脾、肌肉、鳃、心脏、性腺、眼，保存于RNA keeper溶液中。使用Trizol法提取RNA，用1%琼脂糖电泳检测RNA质量。根据PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 说明书对所得的RNA进行反转录。按照SYBR® Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus) 试剂盒的要求，使用ABI7000荧光定量PCR仪进行Real-time PCR检测mRNA的表达量，每个组织样品设置3个重复。用18S作为内参基因。实验数据使用2−ΔΔCt方法进行计算分析。
2. 结果
2.1 光倒刺鲃mc5r基因的序列分析
光倒刺鲃mc5r基因的序列长度为1 947 bp，编码区长987 bp，编码329个氨基酸 (图1、图2)，含有7个跨膜α螺旋结构。
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图 1 光倒刺鲃mc5r基因组扩增序列结果1. 引物F1和R1的PCR扩增产物；M. DL2 000Figure 1. Sequence results of S. hollandi mc5r genome DNA1. the product of PCR amplification with primers F1 and R1; M. DL2 000![]()
图 2 光倒刺鲃mc5r核苷酸序列以及推测的氨基酸序列图中加粗并划线的氨基酸表示预测的跨膜结构；星号表示终止密码子Figure 2. mc5r nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of S. hollandiThe coarsened and underlined amino acids represent the predicted transmembrane structure; the asterisk represents the termination codon.分析该蛋白的理论等电点为8.60；相对分子质量为37 213.62，其中亮氨酸 (Leu)的含量最高 (11.3%)；色氨酸 (Trp)的含量最低 (1.2%)。分析显示，该蛋白的不稳定指数为47.09，属于不稳定蛋白。水合性的总平均值 (GRAVY)为0.803，表示该蛋白为疏水蛋白。
2.2 光倒刺鲃mc5r基因的系统进化分析
在GenBank上和其他物种的mc5r氨基酸序列比对发现，光倒刺鲃与鲤 (Cyprinus carpio)、犀角金线鲅 (S. rhinocerous)的同源性高达98%，与人的同源性仅为70.72%。将所得的光倒刺鲃mc5r基因预测的氨基酸序列与GenBank中的33个已知mc5r氨基酸序列利用MEGA 5.0软件进行比对得出 (图3)，光倒刺鲃和斑马鱼 (Danio rerio) 聚为一支，说明其与斑马鱼的亲缘关系最近；然后与鲤科的鲤、武昌鱼 (Megalobrama amblycephala)、犀角金线鲅、金线鲃和鲫 (Carassius auratus)组成的分支聚为一支，说明其与鲤形目鱼类的亲缘关系较近；再与鲶形目斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus)、鲑形目大鳞大麻哈鱼 (Oncorhynchus tshawytscha)和虹鳟 (O. mykiss)、鲀形目红鳍东方鲀 (Takifugu rubripes)、鲈形目大黄鱼 (Larimichthys crocea)等鱼类聚为一大支，光倒刺鲃与鲶形目和鲑形目鱼类亲缘关系较近，与鲀形目和鲈形目鱼类的亲缘关系较远；最后和哺乳类(人等)聚为一支。
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图 3 光倒刺鲃与其他物种mc5r氨基酸序列构建的系统发育树Figure 3. Phylogenetic tree constructed from mc5r amino acid sequence of S. hollandi and other species2.3 光倒刺鲃mc5r在不同组织中的表达分析
通过qRT-PCR对光倒刺鲃mc5r在不同组织中的表达量进行研究。结果显示，光倒刺鲃mc5r在脑中的表达量较高，尤其是在大脑中的表达量最高；间脑与心脏的表达量次之；中脑和小脑的表达量较少，而在胃、肾、肌肉、脾、鳃、肠、性腺、肝、延脑和眼中仅微量表达(图4)。
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图 4 光倒刺鲃mc5r在不同组织中的表达方柱上不同字母表示差异显著 (P<0.05)，后图同此Figure 4. Expression of S. hollandi mc5r in different tissuesDifferent letters on the bar indicate significant difference (P<0.05). The same case in the following figures.2.4 光倒刺鲃mc5r基因的日周期表达分析
光倒刺鲃禁食组和投喂组，在当天11:00 (投喂后3 h)大脑mc5r的表达量最高；15:00 (投喂后7 h)已经呈显著下降趋势，20:00 (投喂后12 h)大脑mc5r的表达量最低；次日8:00 (投喂后24 h)大脑mc5r的表达量有所升高(图5)。此外，在投喂后7 h，光倒刺鲃mc5r投喂组的表达量显著高于禁食组，而在其他时间段禁食组和投喂组大脑mc5r的表达量没有显著差异。
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图 5 光倒刺鲃大脑mc5r的日周期表达Figure 5. Daily periodicitye expression of mc5r in brain of S. hollandi2.5 光倒刺鲃mc5r对饥饿的响应
光倒刺鲃饥饿再投喂实验中，大脑mc5r的表达情况见图6。第0~第7天由于光倒刺鲃处于饥饿状态，大脑mc5r微量表达；在第8天开始投喂后，其大脑mc5r的表达量显著升高；但在第11和第14天，与第8天相比其大脑mc5r的表达量呈下降趋势。
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图 6 光倒刺鲃mc5r mRNA饥饿再投喂的表达情况Figure 6. Expression profiles of mc5r at starvation and refeeding condition in S. hollandi3. 讨论
本研究通过同源克隆和染色体步移得到光倒刺鲃mc5r的基因序列，对所获得的氨基酸序列与其他物种进行同源性和系统进化分析，得出光倒刺鲃与鲤、犀角金线鲅的同源性高达98%，与人的同源性为70.72%，表明其与斑马鱼、武昌鱼和鲤等鲤科鱼类的亲缘关系较近，而与鸟类、两栖类和哺乳类等亲缘关系较远，有着较大差异。
光倒刺鲃mc5r主要在脑中表达，其中在大脑的表达量最高，中脑、间脑和小脑表达较高，在胃、肾、肌肉、脾、鳃、肠、性腺、肝和眼中仅微量表达。研究表明mc5r对于脂质代谢和分泌腺的分泌有调节作用[10-14]，mc5r对能量平衡也有调节作用[28]，而在鱼类中，脑与其脂质代谢和能量平衡的调节作用也密切相关，所以光倒刺鲃脑中mc5r的表达量相对较高。mc5r在心脏中表达也较高，这可能与心脏供血需要一定能量，而mc5r在能量稳态中起重要作用[28]有关，也表明光倒刺鲃mc5r可能对能量平衡有一定调节作用。光倒刺鲃mc5r在不同组织的表达结果与其他鱼相似。在团头鲂中，mc5r在大脑的表达最高，其次是表皮、眼等与外分泌相关的组织[29]；在金鱼中，mc5r在脑、眼和表皮有较高表达，肠、肝和肌肉中微量表达[30]；在斑马鱼中，mc5r在脑、卵巢、胃肠道有较高表达，同时心脏中也有表达[31]。表明mc5r在不同鱼类各组织中的功能相似，在脂质代谢和能量平衡方面有重要作用。
生物钟能够影响多种生理活动，例如内分泌、食物消化吸收和肝脏新陈代谢等[32]。mc5r对于脂质代谢[12-13]和能量平衡[16]有一定调节作用。在光倒刺鲃中，不管投喂与否，光倒刺鲃mc5r的表达量会随着日周期的变化而变化，表明mc5r的表达受昼夜节律影响，同样光倒刺鲃的摄食、代谢等生理活动也可能会受到昼夜节律的影响。在日周期实验中，投喂后7 h光倒刺鲃mc5r的表达量显著高于未投喂组，说明摄食同样能够影响mc5r的表达。
在光倒刺鲃饥饿再投喂实验中，当光倒刺鲃遭受饥饿时，其大脑中mc5r的表达量较低，而再投喂后大脑中mc5r的表达量显著升高，随后逐渐降低。有研究表明激活mc5r能够促进肌肉对葡萄糖的摄取[16]，并与皮脂腺代谢相关[33]。饥饿再投喂后，光倒刺鲃大脑中mc5r的表达量显著升高，推测mc5r基因可能在光倒刺鲃的摄食中有重要调节作用，并在饥饿再投喂后的补偿生长中扮演一定角色。
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图 3 番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄质工程菌的构建
Figure 3. Construction of lycopene, β-carotene and zeaxanthin engineered bacteria
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图 4 E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3工程菌发酵产物HPLC结果
Figure 4. HPLC results of fermentation products of E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3
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图 6 E. coli BL21 NEO工程菌新黄质 (a) 和紫黄质 (b) 的质谱检测结果
Figure 6. Detection results of neoxanthin (a) and violaxanthin (b) in E. coli BL21 NEO by MS
表 1 本文所用菌株
Table 1 Strains in this study
菌株
Strain基因型
Genotype功能
Function来源
SourceTreliefTM5α化学感受态细胞
TreliefTM5α Chemically competent cellF−, φ80dlacZ Δ M15, Δ (lacZYA-argF) U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17 (rK−, mK+), phoA, supE44, λ−, thi-1, gyrA96, relA1 质粒克隆 擎科生物 BL21 (DE3) 化学感受态细胞
BL21 (DE3) Chemically competent cellF−, ompT, hsdSB (rB−, mB−), gal, dcm (DE3) 高效表达 擎科生物 菠萝泛菌 Pantoea ananatis crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ 获取crtE、crtB、
crtI、crtY和crtZ基因中国工业微生物菌
种保藏管理中心E. coli BL21 pTrc99a-crtEBI lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-TrrnB, AmpR 生产番茄红素 本实验构建 E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIY lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-TrrnB, AmpR 生产β-胡萝卜素 本实验构建 E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, AmpR 生产玉米黄质 本实验构建 E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3 lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, PT7-QZEP3-TT7, AmpR, CmR 生产紫黄质 本实验构建 E. coli BL21 NEO lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, PT7-QZEP3-NSY-TT7, AmpR, CmR 生产新黄质 本实验构建 注：crtE. 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因；crtB. 八氢番茄红素合成酶基因；crtI. 八氢番茄红素脱氢酶基因；crtY. 番茄红素环化酶基因；crtZ. β-胡萝卜素羟化酶基因；ZEP3. 玉米黄质环氧化酶基因；QZEP3. 去除叶绿体转运肽的玉米黄质环氧化酶基因；NSY. 新黄质合酶基因；后表同此。 Note: crtE. The gene of Geranylgeranyl diphosphate synthase; crtB. The gene of phytoene synthase; crtI. The gene of phytoene desaturase; crtY. The gene of Lycopene cyclase; crtZ. The gene of β-carotene hydroxylase; ZEP3. The gene of zeaxanthin epoxidase; QZEP3. The gene of zeaxanthin epoxidase without chloroplast transport peptide; NSY. The gene of neoxanthin synthase. The same case below. 
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表 2 本文所用质粒
Table 2 Plasmids in this study
质粒
Plasmid基因型
Genotype功能
Function来源
SourcepTrc99a lacI, Ptrc-TrrnB, AmpR 载体 本实验室 pTrc99a-crtEBI lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-TrrnB, AmpR 在E. coli BL21中生产番茄红素 本实验构建 pTrc99a-crtEBIY lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-TrrnB, AmpR 在E. coli BL21中生产β-胡萝卜素 本实验构建 pTrc99a-crtEBIYZ lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, AmpR 在E. coli BL21中生产玉米黄质 本实验构建 pACYCDuet-1 lacI, PT7-TT7, CmR 载体 本实验室 pACYCDuet-1-ZEP3 lacI, PT7-ZEP3-TT7, CmR 在E. coli BL21中生产紫黄质 本实验构建 pACYCDuet-1-QZEP3 lacI, PT7-QZEP3-TT7, CmR 在E. coli BL21中生产紫黄质 本实验构建 pACYCDuet-1-QZEP3-NSY lacI, PT7-QZEP3-NSY-TT7, CmR 在E. coli BL21中生产新黄质 本实验构建
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表 3 引物序列
Table 3 Primer sequence
引物名称
Primer序列 (5'—3')
Sequence (5'—3')crtE-F CCGGAATTCATGACGGTCTGCGCAAAA crtE-R TCCCCCGGGTTAACTGACGGCAGCGAG crtB-F TCCCCCGGGCAGGAACAGATGAATAATCCGTCGTTA crtB-R CTAGTCTAGACTAGAGCGGGCGCTGCCA crtI-F CTAGTCTAGACAGGAACAGATGAAACCAACTACGGTA crtI-R CCCAAGCTTTCATATCAGATCCTCCAG crtY-F GAGGATCTGATATGAAAGCTTCACAGGAAACAGACCATGCAACCGCATTAT crtY-R GGTCTGTTTCCTGTGTTAACGATGAGTCGT crtZ-F CACAGGAAACAGACCATGTTGTGGATTTGG crtZ-R TCCGCCAAAACAGCCAAGCTTTTACTTCCCGGATGCGG ZEP3-F CACCACAGCCAGGATCCTATGAGTGAAGAAAAAGTGGA ZEP3-R TGCGGCCGCAAGCTTTTACAGGCCTGCTGC NSY-F AGATATACATATGGCAGATCTATGGAAACCCTGCTGAAAC NSY-R GGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTACAGGCTTTCAATTGC
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表 4 YMC Carotenoid流动相条件
Table 4 YMC Carotenoid mobile phase conditions
t/min 甲醇比例
Methanol proportion/%甲基叔丁醚比例
Methyl tertiary butyl ether/%0 90 10 15 90 10 25 40 60 35 90 10
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