Mixotrophic and carbon fixation culture of nervonic acid-producing microalgae Mychonastes afer
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摘要: 微藻是水体中重要的生产者和环境调节因素，作为饵料和调水剂在水产养殖中起着重要作用。微藻的培养方式多样，探究了微藻Mychonastes afer和小球藻Chlorella sorokiniana在不同营养方式及通气情况的生长与光合能力。在自养、兼养和异养，以及不同浓度二氧化碳 (CO2) 通气的条件下，分别测定了两株藻的生长曲线、光合电子传递效率、有机碳源利用率、光合放氧和呼吸耗氧速率，并着重对M. afer的油脂组分进行分析。结果表明小球藻C. sorokiniana可以摆脱对光能的依赖，完全依靠有机碳源营异养生长，而在此条件下M. afer几乎不能生长。有机碳源的加入，对两株藻的光合系统活性均产生了一定程度的抑制作用，使光合电子传递效率以及光合放氧水平下降；同时发现在兼养条件下，高浓度CO2最有利于M. afer生长，促进了细胞对葡萄糖的利用效率，且油脂和神经酸产量提高。研究表明两株藻在协同利用外源有机碳源和自身光合系统方面存在显著差异，并探究出一种用于生产天然神经酸的M. afer最佳兼养条件。
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关键词:
- 微藻Mychonastes afer /
- 兼养培养 /
- 二氧化碳 /
- 呼吸作用 /
- 光合作用
Abstract: Microalgae are a group of single cell microorganism, which play an important role in aquatic production such as aquatic feeding and water regulating. This research focuses on the growth and photosynthetic capacity of Mychonastes afer and Chlorella sorokiniana under different nutrition and aeration conditions. The microalgae were cultivated under autotrophic, mixotrophic or heterotrophic conditions, respectively. And the influence of CO2 concentration was also investigated. The growth curve, photosynthetic electron transfer rate, organic carbon source utilization, photosynthetic oxygen evolution and respiratory oxygen consumption rate were measured to inflect the differences between M. afer and C. sorokiniana, and the emphasis was given to lipid components of M. afer. The results show that C. sorokiniana could grow under heterotrophic condition without light, while M. afer could not. The photosynthetic system of the two species were both inhibited by organic carbon sources, displaying lower efficiency of photosynthetic electron transfer rates and slower photosynthetic oxygen evolution rates. Besides, it is found that under mixotrophy condition, high concentration of CO2 was beneficial to the growth of M. afer, which promoted cell utilization of glucose, and increased the production of lipid and nervonic acid. The study explores a mixotrophic condition for M. afer to produce natural nervonic acid, shows significant differences between the two algae species in photosynthetic system, and explores the cooperative utilization of external organic carbon sources.-
Keywords:
- Mychonastes afer /
- Mixotrophy /
- CO2 /
- Respiration /
- Photosynthesis
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岩藻黄质是一种类胡萝卜素，在自然界中分布广泛，主要存在于藻类、贝类中，尤其在褐藻、硅藻中含量较高。岩藻黄质可以与叶绿素、蛋白质形成捕光复合体，是硅藻中发挥捕光作用的重要化合物[1]。目前有关岩藻黄质活性的报道较多，研究表明岩藻黄质具有抑菌、抗炎、抗肥胖、抗糖尿病、抗肿瘤、调节肠道菌群和抗器官纤维化等生理活性[2-6]。
目前岩藻黄质的最主要来源依旧是海藻[7]，例如海带 (Laminaria japonica)、三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum)[8]。岩藻黄质是一种优质的海洋来源功能因子，但由于其合成途径目前尚未得到完全解析，其生产及产量调控尚缺乏理论依据[9-12]，合成生物学是发掘未知合成途径的重要手段，通常需要首先在微生物中异源构建目标化合物的上游已知中间物的合成途径，然后利用合成该中间物的工程菌株探索下游未知途径[13]。目前已知合成途径且结构上最接近岩藻黄质的中间物是新黄质[14]。作为岩藻黄质的可能前体物质，新黄质的结构与岩藻黄质很相似 (图1)，两者均含有1条多烯链，2个六元环和1个累积双键，但存在着双键、羟基和羰基、乙酰氧基的区别。
新黄质的合成途径见图2。甲羟戊酸 (MVA) 途径主要存在于真核生物、古生菌和植物的细胞质中，甲基赤藓糖醇-4-磷酸 (MEP) 途径主要存在于细菌和植物叶绿体中，丙酮酸、甘油醛-3-磷酸和乙酰辅酶A分别通过MEP途径和MVA途径生成MEP和MVA，再经由其他酶催化生成异戊烯焦磷酸 (IPP) 和二甲基烯丙基焦磷酸 (DMAPP)[15-17]。大肠杆菌中含有MEP途径，并有法尼基焦磷酸 (FPP) 可以作为岩藻黄质的底物[15,18]。
目前尚未见以微生物宿主生产新黄质的报道，因此构建合成新黄质的微生物细胞工厂成为发掘岩藻黄质的未知途径，并进一步成为海藻高效生产岩藻黄质提供理论依据的关键环节。本研究以大肠杆菌 (Escherichia coli ) 为宿主，按照代谢途径逐步构建番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质、紫黄质的合成途径，最终实现了新黄质的代谢工程合成，为进一步发掘岩藻黄质合成的未知途径奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 试剂材料
1.1.1 菌株及质粒
本文所用菌株的基因型、功能及来源见表1，质粒的基因型、功能及来源见表2。
表 1 本文所用菌株Table 1. Strains in this study菌株
Strain基因型
Genotype功能
Function来源
SourceTreliefTM5α化学感受态细胞
TreliefTM5α Chemically competent cellF−, φ80dlacZ Δ M15, Δ (lacZYA-argF) U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17 (rK−, mK+), phoA, supE44, λ−, thi-1, gyrA96, relA1 质粒克隆 擎科生物 BL21 (DE3) 化学感受态细胞
BL21 (DE3) Chemically competent cellF−, ompT, hsdSB (rB−, mB−), gal, dcm (DE3) 高效表达 擎科生物 菠萝泛菌 Pantoea ananatis crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ 获取crtE、crtB、
crtI、crtY和crtZ基因中国工业微生物菌
种保藏管理中心E. coli BL21 pTrc99a-crtEBI lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-TrrnB, AmpR 生产番茄红素 本实验构建 E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIY lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-TrrnB, AmpR 生产β-胡萝卜素 本实验构建 E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, AmpR 生产玉米黄质 本实验构建 E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3 lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, PT7-QZEP3-TT7, AmpR, CmR 生产紫黄质 本实验构建 E. coli BL21 NEO lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, PT7-QZEP3-NSY-TT7, AmpR, CmR 生产新黄质 本实验构建 注：crtE. 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因；crtB. 八氢番茄红素合成酶基因；crtI. 八氢番茄红素脱氢酶基因；crtY. 番茄红素环化酶基因；crtZ. β-胡萝卜素羟化酶基因；ZEP3. 玉米黄质环氧化酶基因；QZEP3. 去除叶绿体转运肽的玉米黄质环氧化酶基因；NSY. 新黄质合酶基因；后表同此。 Note: crtE. The gene of Geranylgeranyl diphosphate synthase; crtB. The gene of phytoene synthase; crtI. The gene of phytoene desaturase; crtY. The gene of Lycopene cyclase; crtZ. The gene of β-carotene hydroxylase; ZEP3. The gene of zeaxanthin epoxidase; QZEP3. The gene of zeaxanthin epoxidase without chloroplast transport peptide; NSY. The gene of neoxanthin synthase. The same case below. 表 2 本文所用质粒Table 2. Plasmids in this study质粒
Plasmid基因型
Genotype功能
Function来源
SourcepTrc99a lacI, Ptrc-TrrnB, AmpR 载体 本实验室 pTrc99a-crtEBI lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-TrrnB, AmpR 在E. coli BL21中生产番茄红素 本实验构建 pTrc99a-crtEBIY lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-TrrnB, AmpR 在E. coli BL21中生产β-胡萝卜素 本实验构建 pTrc99a-crtEBIYZ lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, AmpR 在E. coli BL21中生产玉米黄质 本实验构建 pACYCDuet-1 lacI, PT7-TT7, CmR 载体 本实验室 pACYCDuet-1-ZEP3 lacI, PT7-ZEP3-TT7, CmR 在E. coli BL21中生产紫黄质 本实验构建 pACYCDuet-1-QZEP3 lacI, PT7-QZEP3-TT7, CmR 在E. coli BL21中生产紫黄质 本实验构建 pACYCDuet-1-QZEP3-NSY lacI, PT7-QZEP3-NSY-TT7, CmR 在E. coli BL21中生产新黄质 本实验构建 1.1.2 生化试剂及药品
番茄红素标准品、β-胡萝卜素标准品、玉米黄质标准品、紫黄质标准品和新黄质标准品购于Sigma-Aldrich公司。高保真DNA聚合酶试剂Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、DNA聚合酶试剂2×Taq Master Mix (Dye Plus)、重组克隆试剂ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit购于诺唯赞生物公司。凝胶萃取试剂盒E.Z.N.A® Gel Extraction Kit购于Omega Bio-Tek公司。细菌基因组DNA提取试剂盒、快速质粒小提试剂盒购于天根生化科技公司。酵母粉、蛋白胨、琼脂粉、氨苄青霉素、氯霉素购于索莱宝科技公司。SSCS Solution感受态制备液购于上海捷瑞生物公司。其他试剂及药品未作特殊说明均为国药化试分析纯。PCR引物合成及测序由青岛擎科公司提供。
1.1.3 试剂及培养基配方
LB培养基：0.5%酵母粉，1%蛋白胨，1%的氯化钠(NaCl，固体培养基中加入2%琼脂粉)，115 ℃灭菌30 min。
ZYP-5052培养基：0.5%酵母粉，1%蛋白胨，8.1 g·L−1 磷酸氢钠 (Na2HPO4)，6.8 g·L−1 磷酸二氢钾 (KH2PO4)，3.3 g·L−1 磷酸铵 [(NH4)2SO4]，0.2%的0.5 mol·L−1 硫酸镁(MgSO4)，2%的50×5052母液 (50×5052母液：25%甘油，2.5%葡萄糖，10%的α-乳糖)，115 ℃灭菌30 min。
氨苄青霉素溶液：溶剂为水，在培养基中使用的终质量浓度为100 µg·mL−1。
氯霉素溶液：溶剂为乙醇，在培养基中使用的终质量浓度为25 µg·mL−1。
1.2 方法
1.2.1 DNA目的片段PCR扩增
考虑到一个质粒上需要加入多个目的片段，为了保证每个片段能够正确表达，本研究在构建质粒的过程中会在2个目的片段的中间加入一段核糖体结合位点 (RBS)。在NCBI查找了菠萝泛菌中crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ目的片段的CDS序列[19]。设计引物见表3，从菠萝泛菌基因组中通过PCR扩增得到了这5个基因。ZEP3基因来自三角褐指藻[20]，NSY基因来源于番茄[21]，由华大基因全基因合成。
表 3 引物序列Table 3. Primer sequence引物名称
Primer序列 (5'—3')
Sequence (5'—3')crtE-F CCGGAATTCATGACGGTCTGCGCAAAA crtE-R TCCCCCGGGTTAACTGACGGCAGCGAG crtB-F TCCCCCGGGCAGGAACAGATGAATAATCCGTCGTTA crtB-R CTAGTCTAGACTAGAGCGGGCGCTGCCA crtI-F CTAGTCTAGACAGGAACAGATGAAACCAACTACGGTA crtI-R CCCAAGCTTTCATATCAGATCCTCCAG crtY-F GAGGATCTGATATGAAAGCTTCACAGGAAACAGACCATGCAACCGCATTAT crtY-R GGTCTGTTTCCTGTGTTAACGATGAGTCGT crtZ-F CACAGGAAACAGACCATGTTGTGGATTTGG crtZ-R TCCGCCAAAACAGCCAAGCTTTTACTTCCCGGATGCGG ZEP3-F CACCACAGCCAGGATCCTATGAGTGAAGAAAAAGTGGA ZEP3-R TGCGGCCGCAAGCTTTTACAGGCCTGCTGC NSY-F AGATATACATATGGCAGATCTATGGAAACCCTGCTGAAAC NSY-R GGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTACAGGCTTTCAATTGC 1.2.2 质粒的构建
同源重组法构建质粒：利用高保真DNA聚合酶PCR扩增目的基因片段与质粒片段，使得各片段连接处留有15~20 bp同源序列，使用重组克隆试剂进行重组连接，将重组产物转入E. coli Trelief™5α感受态中，涂布至对应抗生素的LB固体培养基上。12 h后对固体培养基上生长的转化子进行菌落PCR验证并选取样品进行测序。LB培养基培养测序正确的菌株，使用快速质粒小提试剂盒提取质粒。
1.2.3 工程菌的构建
单质粒工程菌的构建：将pTrc99a-crtEBI、pTrc99a-crtEBIY和pTrc99a-crtEBIYZ质粒分别利用热激法直接转入E. coli BL21感受态细胞中。
双质粒工程菌的构建：将E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ工程菌制备成感受态细胞，再利用热激法将pACYCDuet-1-QZEP3、pACYCDuet-1-QZEP3-NSY质粒转入。感受态制备方法为：将需制成感受态的菌株在LB培养基中培养4~5 h (OD600达到0.6左右)，取菌液在4 000 r·min−1、4 ℃条件下离心5 min，弃上清后加入10%原菌液体积的10%无菌甘油洗涤菌体，再次离心弃上清，再重复一次甘油洗涤和离心弃上清，加入2%原菌液体积的SSCS Solution感受态制备液，即得到感受态细胞。
1.2.4 工程菌株的发酵培养
将工程菌在含有对应抗生素的LB固体培养基上培养，再挑取菌落在含有抗生素的LB培养基中培养12 h，得到种子液。按2%接菌量将种子液接入50 mL ZYP-5052培养基，20 ℃发酵48 h。
1.2.5 产物提取
大肠杆菌类胡萝卜素提取[22]：取2.0 mL的菌液，8 000 r·min−1离心10 min留菌体，加入1 mL丙酮，在40 ℃条件下，萃取至菌体颜色全部变成白色，12 000 r·min−1离心2 min留丙酮上清。萃取液采用氮吹法进行吹干，获得类胡萝卜素产物，用200 μL丙酮复溶，0.22 µm尼龙滤膜去除杂质，得到待检测样品。
1.2.6 高效液相色谱 (HPLC) 和质谱法 (MS) 对产物的鉴定及定量分析
C30检测方法[23]：使用YMC Carotenoid类胡萝卜素分析色谱柱 (250×4.6 mm) 对提取产物进行分析，进样量20 μL，吸光值476 nm，柱温35 ℃，流速1.0 mL·min−1。具体的液相检测条件见表4。用该方法绘制标准曲线 [y为峰面积，x为质量浓度 (mg·L−1)]。番茄红素：y=52.505x−1.670 7, R2=0.999；β-胡萝卜素：y=1 312.9x−12.668, R2=0.999；玉米黄质：y=129.92x−39.204, R2=0.999；紫黄质：y=130.76x−33.414, R2=0.999。
表 4 YMC Carotenoid流动相条件Table 4. YMC Carotenoid mobile phase conditionst/min 甲醇比例
Methanol proportion/%甲基叔丁醚比例
Methyl tertiary butyl ether/%0 90 10 15 90 10 25 40 60 35 90 10 上述C30色谱柱检测方法无法分离紫黄质和新黄质，所以我们采用了另一种C18检测方法来达到分离目的。C18检测方法[24]：使用C18 (250×4.6 mm, 5 μm)色谱柱检测，流动相是V(乙腈)∶V(乙酸乙酯)∶V(水)=74∶16∶10，采用等度洗脱，进样量20 μL，吸光值440 nm，柱温42 ℃，流速1.0 mL·min−1。用该方法绘制标准曲线 [y为峰面积，x为质量浓度 (µg·L−1)]。紫黄质：y=76.889 x−140.93，R2=0.997；新黄质：y=357.07x+2.392，R2=0.991。
四极杆飞行时间质谱条件：离子源为电喷雾电离源 (ESI)；电离化方式为ESI+；毛细管温度为350 ℃；雾化器压力为276 kPa；干燥气流速为10 L·min−1；扫描范围为m/z 20~1 000。
1.2.7 细胞干质量的测量方法
取2 mL发酵后的菌液，12 000 r·min−1离心3 min，置于85 ℃烘箱烘干24 h，测量细胞干质量[25]。根据产物浓度与细胞干质量，计算出产量单位 (细胞干质量，下同) 为mg·g−1或µg·g−1。
2. 结果与分析
2.1 番茄红素、 β-胡萝卜素和玉米黄质工程菌的构建
质粒pTrc99a-crtEBI、pTrc99a-crtEBIY和pTrc99a-crtEBIYZ成功转入E. coli BL21后，对应的工程菌E. coli BL21 pTrc99a-crtEBI、E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIY和E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ发酵后菌体发生了颜色变化，对菌体内物质进行HPLC分析 (图3)，结果表明成功产出了番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄质。根据标准曲线及细胞干质量计算出各产物浓度，其中E. coli BL21 pTrc99a-crtEBI的番茄红素产量为3.20 mg·g−1；E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIY的β-胡萝卜素产量为1.35 mg·g−1；E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ的玉米黄质产量为0.70 mg·g−1。
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图 3 番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄质工程菌的构建Figure 3. Construction of lycopene, β-carotene and zeaxanthin engineered bacteria在T7启动子的作用下，基因crtE、crtB、crtI、crtY和crtZ成功表达，产出目标产物。根据HPLC结果，E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIY和E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ中并没有发现中间产物的积累，可能原因是产物浓度较低，CRTI、CRTY和CRTZ蛋白水平相较于低浓度产物来说催化能力较强，导致没有中间产物的积累，也可能与菌株本身以及生长状况有关，不同菌株在不同生长状况下产物积累量存在差异。
2.2 紫黄质和新黄质工程菌株的构建
以产玉米黄质的菌株E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ为宿主菌株，转入pACYCDuet-1-ZEP3质粒，构建产紫黄质菌株E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-ZEP3。但HPLC检测结果显示并无紫黄质产生。分析原因可能为ZEP3基因来源于三角褐指藻，是真核生物来源的基因，可能存在信号肽或叶绿体转运肽的编码区，但原核生物无法实现真核生物对蛋白的加工，导致蛋白折叠错误，使活性减弱甚至消失。
因此利用网站http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/预测叶绿体转运肽，预测前54个氨基酸为cTP区域。去除ZEP3基因的cTP后得到QZEP3，重新构建pACYCDuet-1-QZEP3质粒再转入产玉米黄质的工程菌中，HPLC分析菌体内产物有紫黄质存在 (图4)，进一步证实了以上猜想。
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图 4 E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3工程菌发酵产物HPLC结果Figure 4. HPLC results of fermentation products of E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3根据标准曲线及细胞干质量计算出产物浓度，E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3的紫黄质的产量为114.70 μg·g−1, 玉米黄质产量为289.45 μg·g−1。该工程菌中不仅有紫黄质生成，还有β-胡萝卜素和玉米黄质中间产物的积累，但并未检测到番茄红素的积累，可能原因是QZEP3的蛋白水平并不高，使得玉米黄质有较多积累，而番茄红素和β-胡萝卜素的积累可能与菌株生长状况相关，在不同生长状况下产物积累量存在差异，致使菌体内存在中间产物的积累。进一步分析HPLC结果，该工程菌不仅产出预期的β-胡萝卜素、玉米黄质和紫黄质，还有未知的产物 (保留时间6.2和10.6 min) 被检测到，猜测可能是QZEP3催化玉米黄质生成紫黄质时还生成了中间体产物。
以产紫黄质的菌株E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3为宿主菌株，转入pACYCDuet-1-QZEP3-NSY质粒，构建产新黄质菌株E. coli BL21 NEO。用C30和C18色谱柱的方法对E. coli BL21 NEO菌体内产物进行检测 (图5)。紫黄质与新黄质是同分异构体，分子式为C40H56O4，分子量为600.417 9。E. coli BL21 NEO中的新黄质和紫黄质质谱结果 (图6) 显示，新黄质对应分子离子峰的m/z为600.414 6，紫黄质对应分子离子峰的m/z为600.413 8，这与紫黄质和新黄质分子量基本相当。HPLC与MS结果表明E. coli BL21 NEO成功产出新黄质。根据标准曲线及细胞干质量计算出各产物浓度，其中新黄质的产量为99.27 μg·g−1，紫黄质的产量为150.30 μg·g−1，玉米黄质的产量为119.77 μg·g−1。E. coli BL21 NEO不仅产出预期的新黄质，还有β-胡萝卜素、玉米黄质和紫黄质的积累，也有未知的中间体产物生成。
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图 6 E. coli BL21 NEO工程菌新黄质 (a) 和紫黄质 (b) 的质谱检测结果Figure 6. Detection results of neoxanthin (a) and violaxanthin (b) in E. coli BL21 NEO by MS本文以产玉米黄质的工程菌为宿主，并将QZEP3和NSY导入，实现了新黄质的合成，但是QZEP3和NSY基因导入后的紫黄质和新黄质产量浓度不高，可能是上游途径的底物含量少，酶的催化效果不高，后续可以通过理性设计或定向进化对QZEP3和NSY进行改造，提高QZEP3和NSY在大肠杆菌中的活性来提高紫黄质和新黄质的产量，或者通过更换启动子，调节MEP上游通路途径，基因的过表达等方法[26-29]，进一步提升紫黄质和新黄质的产量。
3. 结论
本文以大肠杆菌为表达菌株，进行了新黄质合成途径的构建。以含有crtEBIYZ基因的产玉米黄质的E. coli BL21为宿主，引入了QZEP3和NSY基因，成功在大肠杆菌中建立了新黄质合成途径。有关新黄质本身的生理活性研究并不多[30-32]，以微生物生产新黄质可提供新的生产途径，为研究新黄质的生理活性等提供便利，也为进一步探究岩藻黄质的合成途径奠定了基础。岩藻黄质的合成途径可以指导褐藻等海藻中岩藻黄质等物质的高值化利用，如通过理性设计改造获得高产岩藻黄质的藻类。
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图 1 不同培养条件下M. afer (a, c)和小球藻C. sorokiniana (b, d) 的生长曲线和光合电子传递效率变化情况
Figure 1. Growth curves and ETR of M. afer (a, c) and C. sorokiniana (b, d) under different culture conditions
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图 2 溶解氧测定示意图及M. afer与小球藻 C. sorokiniana 耗放氧情况
Figure 2. Schematic diagram of dissolved oxygen determination and oxygen release, consumption rate of M. afer and C. sorokiniana
表 1 培养基中葡萄糖剩余量 (
$\overline {\boldsymbol X}{\bf \pm } {\bf {SD}}$ )Table 1 Residual glucose in culture medium
g·L−1 时间
t/dC. sorokiniana M. afer 兼养-空气
Mixotrophy-air兼养-二氧化碳
Mixotrophy-CO2兼养-空气
Mixotrophy-air兼养-二氧化碳
Mixotrophy-CO23 1.50±0.001 2.86±0.010 0.45±0.030 ND 6 0.03±0.001 3.60±0.001 1.50±0.320 ND 8 6.00±0.530 10.99±0.270 4.02±0.620 1.19±0.050 注：ND为未检测出葡萄糖，即培养过程中每次添加的2 g·L−1葡萄糖在检测时已全部利用。 Note: ND indicates that no glucose was detected, which means that 2 g·L−1 glucose had been fully utilized. 
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表 2 不同条件下M. afer细胞生物量、脂肪酸和神经酸质量分数 (
$\overline {\boldsymbol X}{\bf {\pm} } {\bf{SD}}$ )Table 2 Biomass, mass fraction of fatty acids and nervonic acids of M. afer cells under different conditions
生物量
Biomass/(g·L−1)脂肪酸质量分数
Mass fraction of fatty acid/(mg·g−1)神经酸质量分数
Mass fraction of nervonic acid/(mg·g−1)自养-二氧化碳 Autotrophy-CO2 2.458 3±0.000 4 132.20±9.68 0.93±0.02 兼养-空气 Mixotrophy-air 2.620 0±0.000 3 154.01±16.63 2.59±0.01 兼养-二氧化碳 Mixotrophy-CO2 3.261 7±0.000 1 253.02±6.33 5.93±0.15
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