Recombinant expression of Bacillus licheniformis chitinase in B. subtilis and preparation of amino-oligosaccharides
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摘要: 将地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis) 来源的几丁质酶基因blchiA在枯草芽孢杆菌 (B. subtilis) 中进行重组表达，构建了枯草芽孢杆菌工程菌株 (B.subtilis WS9/pHY300PLK-blchiA)，发酵上清液的酶活为0.73 U·mL−1。对重组酶BLCHIA的酶学性质进行表征，其在pH 6.0和60 ℃时表现出最佳活性，比活为3.68 U·mg−1。10 mmol·L−1的铜离子 (Cu2+) 和亚铁离子 (Fe2+) 对其活性有一定促进作用，在pH 5.0~8.0和50~60 ℃下稳定性较好。此外，研究表明重组酶对脱乙酰度>95%的壳聚糖的催化能力明显优于胶体几丁质，并且水解胶体几丁质和壳聚糖的产物类型具有明显差异，以胶体几丁质为底物主要生成几丁二糖，以壳聚糖为底物可生成聚合度为2~7的壳寡糖。研究获得的重组酶BLCHIA在壳聚糖降黏和制备不同聚合度的低聚糖方面具有良好的应用前景。Abstract: In this study, a chitinase blchiA from Bacillus licheniformis was recombinantly expressed in B. subtilis, and the B. subtilis engineering strain (B. subtilis WS9/pHY300PLK-blchiA) was constructed. The enzyme activity in the fermentation supernatant was 0.73 U·mL−1. The enzymatic properties of recombinant enzyme BLCHIA were characterized, and its best activity was obtained at pH 6.0 and 60 ℃, and the specific activity was 3.68 U·mg−1. 10 mmol·L−1 Cu2+ and Fe2+ could promote its activity, and its stability was good at pH 5.0−8.0 and 50−60 ℃. In addition, the catalytic ability of the recombinant enzyme on chitosan with a degree of deacetylation> 95% was significantly better than that of colloidal chitin, and the types of hydrocolloid chitin and chitosan were significantly different. Using colloidal chitin as substrate, the recombinant enzyme could mainly produce chitobiose, but using chitosan as substrate, it could produce chitosan oligosaccharide with polymerization degree of 2−7. The results have a good application prospect for viscosity reduction of chitosan and preparation of oligosaccharides with different polymerization degrees.
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Keywords:
- Chitinase /
- Bacillus subtilis /
- Recombinant expression /
- Amino oligosaccharide
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热带海参具有丰富的物种多样性，是中国经济海参养殖开发的物种资源库。迄今全球被开发利用的50多种食用经济海参中21种在中国海域有分布记录，除温带种仿刺参(Apostichopus japonicus) 和海地瓜 (Acaudina molpadioides) 外，中国的食用经济海参种类多分布于南海，且主要分布于雷州半岛以南海域，西南中沙海域是中国食用经济海参种类的集中分布区[1]。热带食用经济海参种类主要属于刺参科和海参科，包括5个属：刺参属 (Stichopus)、梅花参属 (Thelenota)、海参属 (Holothuria)、辐肛参属 (Actinopyga) 和白尼参属 (Bohadschia)[2]。
海参没有复杂的消化系统，也无独立的消化腺，其消化道仅由口、咽、食道、胃、肠和排泄腔组成[3]。刺参 (S. japonicus) 的消化道管壁结构主要由黏膜层、黏膜下层、肌层和外膜组成。其中，消化道黏膜层为单层或假复层上皮 (包含柱状细胞、黏液细胞和立方细胞)；黏膜下层为疏松的结缔组织；肌层由外环和内纵两部分组成；而扁平细胞及其下方薄层结缔组织组成了外膜[4-6]。研究表明，多种海参具有夏眠现象，在此期间，其消化道的形态学和肠道功能发生显著变化，进而影响其自身生理指标的变化[6]。温度是诱导海参进入休眠状态的主要因素。通过对热带海参不同季节消化道指标和组织学特征的研究，可以初步判断热带海参是否具有冬眠现象。另外，海参的养殖池塘通常建在沿岸浅水区域，围堰塘的面积较小、水体交换量有限，当天气发生剧烈变化时，养殖水体的环境条件 (如温度、盐度等) 会发生较大变化，严重抑制海参的生长，可能出现排脏反应或化皮现象，甚至导致海参大面积死亡[7-8]。通过调控养殖环境 (如温度) 可以减少或消除海参因强烈应激所带来的不利影响，缩短休眠周期[9]。有研究指出，海参在休眠状态下，除形态学发生变化外，其体内消化和免疫相关酶活性也会发生显著变化，如淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化氢酶 (CAT) 等，进而对消化道功能产生影响[10-11]。
中国的红腹海参 (H. edulis) 主要分布在海南岛和东、中、西、南沙群岛，栖息于岸礁沙底，为沉积食性海参，以珊瑚沙为食，偏好生境存在季节变化[12]。红腹海参的生境也受水深的影响，如9月在水深6~10 m水域种群密度较大(2.65 头·m−2)，相比水深3~6 m水域显著增加[13]。斯里兰卡海域的红腹海参主要分布在10 m以浅水域，在水深12~15 m处减少，超过25 m又显著增加[14]。红腹海参在珊瑚礁中具有扰动底质生物、加速营养盐再生和保护、清洁珊瑚礁以及为其他生物提供栖息场所等作用[12]。然而，过度捕捞已导致热带海参的数量急剧下降，人工养殖迫在眉睫。为了揭示热带海参消化道应对不同季节的响应特性，本文探究了红腹海参的摄食和生理状况随时间的变化，通过监测不同季节海参的消化道指标 (活动、饮食、湿质量和消化道内容物)、消化道组织学特征和相关酶活性的变化，为研究其环境适应调节机制及人工增养殖提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
本研究所用红腹海参于2019年7月采捕自三亚西岛，采捕时水温为25 ℃。采捕后暂养于海南省陵水县新村热带水产研究开发中心。红腹海参养殖过程中水质参数：盐度33±0.8，溶解氧质量浓度大于6.5 mg·L−1，pH 8.0±0.2，亚硝酸盐质量浓度小于0.03 mg·L−1，氨氮质量浓度小于0.01 mg·L−1。暂养期间每天按时定量投喂由鼠尾藻粉、马尾藻粉、海泥、细沙和海参配合饵料按等比例配制而成的人工配合饲料，定期换水并及时清理粪便及残饵，定时检查水温和海参的生长状况。测定各种酶活性所用的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.2 实验方法
分别在春 (3月)、夏 (6月)、秋 (9月)、冬 (12月) 4个季节对红腹海参的消化道组织进行取样。
1.2.1 消化道指标
定期称取海参的湿质量 (用毛巾吸干体表水分后称质量)、检测消化道形态学变化 (消化道长度、消化道和内含物质量)，并根据公式 (1) 计算消化道相对湿质量。平均湿质量、消化道相对湿质量和消化道与体长比均是当季度所取海参的平均值 (N≥30)。
$$ R=M_{1} / M_{2} $$ (1) 式中：R为消化道相对湿质量；M1为去内容物的消化道质量；M2为消化道湿质量。
1.2.2 组织学分析
对消化道组织取样进行切片，HE染色观察：依次将切片放入二甲苯 (C8H10)Ⅰ 20 min、C8H10 Ⅱ 20 min、无水乙醇Ⅰ 10 min、无水乙醇Ⅱ 10 min，再用95%、90%、80%、70%乙醇清洗5 min，最后蒸馏水洗；将切片入Harris苏木素 (C16H14O6) 染3~8 min，自来水冲洗，1%的盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗；切片入伊红 (C20H6Br4Na2O5) 染液中染色1~3 min后，将切片依次放入95% 乙醇 Ⅰ、95% 乙醇 Ⅱ、无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ 5 min，而后放入C8H10 Ⅰ和C8H10 Ⅱ中各5 min脱水透明，将切片拿出来稍晾干，中性树胶封片，显微镜镜检，图像采集分析。
1.2.3 酶活性测定
取红腹海参肠道组织，用0.2 mol·L−1生理盐水将样品按质量体积为1∶3的比例进行研磨，研磨液于4 ℃、5 000 r·min−1离心10 min，取上清液1 mL 于洁净EP管中，置于–80 ℃冰箱待测。利用相应试剂盒测定淀粉酶、胃蛋白酶、纤维素酶、溶菌酶、CAT、碱性磷酸酶(ALP)、总超氧化物歧化酶 (T-SOD) 和过氧化物酶 (POX) 活性，各组均设3个平行。
1.3 数据处理与分析
利用SPSS 21.0软件对实验数据进行统计分析，通过单因素方差分析 (One-way ANOVA) 判断处理组之间是否具有显著差异，均值间的差异显著性 (P<0.05) 采用Duncan's法进行比较。
2. 结果
2.1 红腹海参湿质量与消化道等质量的季节变化
红腹海参在春、夏、秋季 (3、6和9月) 的湿质量均有所上升，冬季 (12月) 可能因水温影响了摄食而呈现轻微下降的趋势 (图1-a)。从湿质量看，其生长极其缓慢；红腹海参消化道相对湿质量在夏、秋季分别为0.62和0.29，而在冬季上升至0.73 (图1-b)。说明夏、秋季红腹海参摄食比较旺盛，未出现像刺参一样的夏季休眠现象；不同季节红腹海参消化道与体长比呈现先上升后下降的趋势 (图1-c)，说明不同季节温度下热带海参肠道会发生变化，但未出现严重萎缩等退化现象。
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图 1 不同季节热带红腹海参消化道指标变化Figure 1. Change of digestive tract indexes of H. edulis in different seasons2.2 不同季节红腹海参的消化道组织学特征
红腹海参消化道前肠横切组织HE染色切片显示了不同季节下海参肠壁的形态学变化过程 (图2)。肠壁结构中的柱状上皮 (Columnar epithelium, CE)、横行皱襞 (Circular fold, CF)、纹状缘 (Striated border, SB)、浆膜层 (Serosa, SE)、黏膜上皮层 (Mucosa, MU)、肌层 (Muscular layer, ML)、体腔上皮层 (Coelomic lining, CL) 和凋亡空腔 (Apoptosis antrum, AA) 等结构清晰可见。不同季节实验组红腹海参消化道组织结构发生了变化，春季实验组消化道肠壁结构的横行皱襞中出现部分凋亡空腔 (图2-a)；而夏季空腔减少 (图2-b)；秋季时，凋亡空腔增加、横行皱襞厚度和柱状上皮密集程度也较夏季减弱 (图2-c)；而到冬季时，横行皱襞中出现较多凋亡空腔 (图2-d)，肠壁细胞出现严重凋亡，柱状上皮和浆膜层变薄。
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图 2 红腹海参消化道在不同季节下前肠横切组织HE染色切片光学显微照片注：a、b、c、d 分别为实验组 3、6、9、12 月取样，-1 和-2 分别为组织纵切面和横切面。Figure 2. Micrographs of HE-stained sections of transected tissues of foregut of digestive tract of H. edulis in different seasonsNote: The a, b, c and d represent the samples in March, June, September and December, respectively. The -1 and -2 represent the ongitudinal and transverse sections of the tissue, respectively.2.3 不同季节红腹海参消化道组织消化酶活性变化
红腹海参消化道溶菌酶活性在6月最高，全年呈现“先升后降”的变化趋势 (图3-a)。消化道胃蛋白酶和纤维素酶均在3月表现出最高活性，分别为15.55和12.64 U·mg−1，分别在9和12月降至最低 (图3-b、图3-d)，这可能与3月海参摄食逐渐恢复有关。而淀粉酶却在9月表现出最高活性，这可能由海参的摄食状态发生改变所致。
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图 3 不同季节红腹海参肠道组织消化酶活性变化Figure 3. Change of digestive enzyme activity in intestinal tissues of H. edulis in different seasons2.4 不同季节红腹海参消化道组织免疫酶活性变化
红腹海参消化道CAT活性由春季至冬季呈下降的变化趋势 (图4-a)；而ALP活性却呈现波动性上升趋势 (图4-b)。另外，T-SOD (图4-c) 和POX (图4-d) 活性呈现一致的变化趋势，均在6月活性最高，但T-SOD活性在春季 (3月) 最低，而POX活性却在冬季 (12月) 最低。
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图 4 不同季节热带红腹海参肠道组织免疫酶活性变化Figure 4. Change of immune enzyme activity in intestinal tissues of H. edulis in different seasons3. 讨论
海参为适应不同季节水温和食物的变化会做出相应的生理生化反应。本研究发现，红腹海参在春、夏、秋三季湿质量均有所上升，而冬季可能因水温降低影响了摄食而略有下降。红腹海参消化道相对湿质量在夏、秋季有所下降，冬季再次上升，这可能是春、冬季温度较低影响了摄食，导致消化道内容物较少。消化道相对湿质量的变化进一步印证了冬季低温会影响海参的摄食和状态。陈世波[9]研究指出，刺参在夏季休眠状态下体质量显著下降。而本研究中夏季红腹海参摄食比较旺盛，并未像刺参一样出现夏眠现象。可见红腹海参不存在夏眠，可能存在冬眠现象，但目前并无研究佐证。为了进一步探明热带海参的休眠期，本研究对红腹海参消化道前肠形态学变化过程进行观察，发现夏季凋亡空腔最少，而冬季海参消化道肠壁结构的横行皱襞中出现较多凋亡空腔，肠壁细胞出现严重的凋亡，柱状上皮和浆膜层变薄。这种变化特征与刺参夏眠时候极其相似，因此初步判断热海红腹海参可能存在冬眠现象。
研究表明，外部环境的改变会影响水生动物的生长状态和机体酶活变化，进而影响其摄食、生长和健康[15-17]。因此，海参在休眠状态下，除了形态学发生变化外，其体内消化和免疫相关的酶活性也会发生显著变化，如淀粉酶、纤维素酶、SOD和CAT等[10-11]。水生动物在缺少食物时，主要通过改变机体各种酶的活性来调节代谢水平、能量分配和能源物质消耗，以适应食物缺乏造成的胁迫，维持机体生理活动[18-21]。本研究发现，红腹海参消化道组织在6月具有较高的溶菌酶活性，全年呈现“先升后降”的变化趋势，进一步说明红腹海参在夏季生长依然良好，其消化道组织通过分泌大量溶菌酶来消化摄食过程中所带入的微生物等致病因子。杨宁等[22]研究显示，当水温较高时，环境中的致病因子相对活力上升，促使海参机体溶菌酶活性上升以保证其生长良好。这也解释了红腹海参在夏季具有较高溶菌酶活性的原因。然而，消化道组织中的胃蛋白酶和纤维素酶均在3月表现出最高活性，这可能是由于3月海参从冬季的休眠萎缩逐渐恢复摄食所致。研究指出，消化酶活性与机体的摄食量和所处的状态有关[23-24]。任庆印[25]在研究海参夏眠过程中的生理代谢调控时发现，温度变化对蛋白酶活性影响显著，并在基因的调控下与温度呈一定的正相关。春季水温逐渐上升，红腹海参的生理活动逐渐恢复并受到外界食物刺激，但此时的食物仍无法满足其生长需求，从而刺激机体胃蛋白酶和纤维素酶活性显著上升[10]。饥饿胁迫可促进肠道胃蛋白酶的分泌及其活性[26]。然而，夏季食物充足，其机体的应激反应下降，导致胃蛋白酶和纤维素酶活性有所降低。这可能是因为机体尽可能将代谢保持在一定水平，以保证在重新获取食物或面临其他环境胁迫时能承受相应的应激反应[27]。消化道中淀粉酶活性发生了与机体生长相适应的变化，前3个月缓慢上升，冬季时受环境温度影响而呈下降趋势。Bao等[28]指出，在休眠状态下，海参主要通过消耗体内蛋白质和脂肪来获取代谢底物或能量。Chen等[29]对休眠状态下的刺参进行了蛋白质组学分析，同样表明蛋白质和磷脂可能是低代谢期间的主要能量来源。而且在休眠状态下，海参肠道组织的糖酵解发生抑制，进而影响其生长和代谢[30]。红腹海参湿质量的下降和消化酶活性的降低均表明其在冬季处于休眠状态。
另外，本研究还测定了不同时期红腹海参消化道组织免疫酶活性的变化。其中，CAT可以将机体产生的过氧化氢 (H2O2) 分解成无毒、无害的水 (H2O) 和氧气 (O2)[31]。红腹海参消化道组织中的CAT活性变化规律表明，春季 (3月) 细胞内CAT的底物H2O2浓度显著增加，进而刺激CAT活性被诱导。而夏季 (6月) CAT活性显著降低，可能与SOD浓度有关。有研究指出，饥饿胁迫下机体CAT活性随着时间的延长而逐渐降低，这可能是机体超氧阴离子自由基在SOD的作用下被还原为 H2O2的含量下降，致使相应CAT活性降低[32]。这与本研究中夏季高SOD活性的结果相吻合。ALP是机体对新陈代谢进行调节以保护自身的另一重要调节酶，通过寡糖磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上的结合蛋白，使生物体可以直接参与磷酸基团的转移和代谢，且参与体内的钙 (Ca)、磷 (P) 代谢[17,33]。本研究中，ALP呈现波动上升趋势，表明代谢较旺盛或较弱均会导致机体ALP活性上升，以调节机体代谢的平衡。另外，POX和T-SOD活性表现出一致的变化规律，均在6月最高。而POX以H2O2为电子受体，直接催化酚类或胺类化合物氧化的酶。随着水温的上升，机体的耗氧率也增加，进而促使活性氧类物质的生成，导致抗氧化酶活性的上升[22,34]。肠道内POX活性在冬季最低，可能是机体抗氧化体系不能及时清除自由基，使其氧化与抗氧化平衡被破坏所致[35]。
中国东南沿海是经济海参养殖开发的物种资源库。中国热带海参资源开发利用的当务之急是大力开展热带刺参等高值种类的资源恢复，发展玉足海参 (H. leucospilota) 和红腹海参等中低值海参的人工增养殖，发展热带海参人工增养殖新产业。然而，红腹海参的养殖、培育却受到各种环境因子影响，阐明其应对不同环境因子的响应及调控机制具有重要意义。本研究中红腹海参应对不同季节的生理生化反应有所不同，夏季其生长、摄食较为旺盛，而冬季出现冬眠迹象，体质量下降、消化道萎缩、细胞凋亡，相应的消化酶和免疫酶活性在冬季均处在低值，这种性状与刺参的夏眠特性相一致。因此，判断热带红腹海参具有冬眠现象，但是其对季节的适应机制和休眠机理仍需要进一步研究。
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图 1 pHY300PLK-blchiA表达载体的鉴定
Figure 1. Identification of pHY300PLK-blchiA expression vector
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图 2 重组几丁质酶BLCHIA摇瓶发酵过程的酶活
Figure 2. Enzyme activity of recombinant chitinase BLCHIA in shake flask fermentation
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图 4 重组几丁质酶BLCHIA的最适pH (a) 和pH稳定性 (b)
Figure 4. Optimal pH (a) and pH stability (b) of recombinant chitinase BLCHIA
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图 5 重组几丁质酶BLCHIA的最适温度 (a) 和热稳定性 (b)
Figure 5. Optimal temperature (a) and thermal stability (b) of recombinant chitinase BLCHIA
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图 6 金属离子对重组几丁质酶BLCHIA酶活的影响
Figure 6. Effect of metal ions on activity of recombinant chitinase BLCHIA
表 1 BLCHIA水解壳聚糖的产物峰面积占比
Table 1 Proportion of peak area of BLCHIA hydrolyzed chitosan %
产物类型
Product type反应时间 Reaction time 30 min 1 h 3 h 5 h 氨基葡萄糖 Aminoglucose 0.00 0.42 0.80 0.79 壳二糖 Chitobiose 12.87 17.35 22.65 26.54 壳三糖 Chitotriose 24.37 30.63 36.70 38.44 壳四糖 Chitotetraose 27.73 27.49 26.26 24.94 壳五糖 Chitopentaose 21.27 17.26 7.98 4.21 壳六糖 Chitosan 8.85 4.56 2.99 2.67 壳七糖 Chitoheptaose 3.37 2.28 2.61 2.40 
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1. 王逗，游锦若，申铉日，李永成，夏光华，何燕富，张雪莹. 橙黄小单孢菌(Micromonospora aurantiaca)几丁质酶基因的克隆、表达、鉴定及应用. 南方水产科学. 2023(05): 143-153 . 
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2. 权淑静，杨文玲，雷高，王佰涛，刁文涛，梁博，刘德海. 产几丁质酶高原菌的分离鉴定及酶学性质初步研究. 中国酿造. 2023(11): 152-156 . 百度学术
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